专利名称：：Panton-valentine杀白细胞素用于治疗和预防葡萄球菌感染的用途的制作方法
技术领域：
：本发明大体上涉及治疗和预防细菌感染。特定来说，在本文中揭示使用包括Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原或与其特异性结合的抗体的组合物来治疗和预防金黄色葡萄球菌(S.感染(包含社区获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(CA-MSRA)感染)的组合物和方法。本发明也大体上涉及属于LukF-PV和LukS-PV蛋白的抗体和抗原，那些蛋白的突变形式，以及那些PVL亚单位的融合蛋白组合。技术背景金黄色葡萄球菌(S啤/i;yZococcws(W謹)细菌(通常被称作"staph，'、"S啤/z.a"r譜，，或mirew")通常携带于健康个体的皮肤上或鼻子中。在任何特定时间人口的约20%-30%上定居有金黄色葡萄球菌。这些细菌通常造成轻微感染，诸如丘疹和疖子。然而，金黄色葡萄球菌也造成严重且潜在致命的菌血症，其为特征在于在血流中存在活细菌的医学病状。金黄色葡萄球菌表达众多毒力因子(包含荚膜多糖和蛋白毒素)。PVL是属于synergohymenotropic毒素家族的金黄色葡萄球菌蛋白，其通过两个不相关种类的分泌蛋白或亚单位的协同作用破坏宿主防御细胞、白细胞和红细胞的膜。Supersac等人，/n/ert./wmm.61:580-7(1993)。此蛋白质家族包含a-溶血素(a-毒素)、(3-溶血素、5-溶血素、y-溶血素、杀白细胞素(Luk)和PVL蛋白(LukS-PV和LukF-PV)。通过观察白细胞毒性活性在金黄色葡萄球菌中首先发现PVL。VanderVelde,CeW"Ze，10:401-9(1894)。后来Panton和Valentine能够在来自患有慢性疖病的个体的'V8菌株中区分PVL与其它溶血素。PantonR,LtmcW，222:506-8(1932)。随后Woodin发现PVL是由两个亚单位LukS匿PV和LukF-PV组成。WoodinAM.，Bz'oc/iem.丄，73:225-37(1959)和WoodinAM.，肠c/iem./.'75:158-65(1960)。通过对兔和人类多形核细胞(PMN)和巨噬细胞的孔诱导已显示PVL具白细胞毒性。Finck-Barbancon等人,肠c/u'm.￡—一Acto,1182:275-82(1993)。当经皮内注射入兔中时，经纯化PVL诱发严重炎性病变，其导致毛细管扩张、趋化性、PMN渗透、PMN核破裂和皮肤坏死。Prevost等人,,Mc油'。Z'42:237-45(1995)和Ward等人，/"/e".//wn朋.，28:393-7(1980)。PVL的白细胞毒性和溶血性活性涉及两种PVL亚单位的连续结合和协同缔合。首先，LukS-PV与膜耙相互作用(Colin等人，/"/e"./画肌62:3184-8(1994))。其后，LukF-PV亚单位与LukS-PV亚单位结合。Woodin，AM和WienekeAA,肠c/z缀105:1029-1038(1967)和Colin等人，同上。尽管LukS-PV和LukF-PV仅表达于一小部分医院相关金黄色葡萄球菌分离物(Prevost等人，/ra/e"./mmim.，63:4121-9(1995))中，但PVL表达似乎在世界范围内普遍存在于社区获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株中。Dufour等人，/"/e".D^.'35:819-24(2002)禾口Vandenesch等人，五證g./打/e".流，9:978-84(2003)。实际上，CA-MRSA的出现和传播近来已导致各种疾病的爆发，这些疾病包含脓肿和疗病(Lina等人，C〃"./打/e".Dk,，29:1128-32(1999)和Kazakova等人，W.E"gZ./.MW.，352:468-75(2005)),以及严重毒血症(诸如坏死性肺炎)。Francis等人，/n/ert.Z)&，40:100-7(2005;)。据估计在美国50%以上的金黄色葡萄球菌菌株如今具甲氧西林抗性。举例来说，1999年，在美国国家医院感染监测系统(NationalNoscomialInfectionsSurveillanceSystem;NNISS)中所报导的全部金黄色葡萄球菌分离物的54.5%具甲氧西林抗性。疾病控制中心(TheCentersforDiseaseControl)估计在2002年美国约存在100,000例医院获得性MRSA感染且这些感染问题只会恶化。在某些亚洲和欧洲国家，甲氧西林抗性的比率甚至更大(例如，在日本MRSA比率为72%;在香港为74%)。因此，抗生素抗性菌株目前在治疗金黄色葡萄球菌感染时造成问题，且除非开发新颖治疗工具，否则这些问题只会变得恶化。因此，存在对于用于治疗通常金黄色葡萄球菌感染且尤其CA-MRSA感染的组合物和方法的需求。使用PVL抗原来制造疫苗的先前尝试遭受显著缺点，其包含经投与抗原的毒性和缺乏功效。举例来说，Banffer和Franken，尸威30:16-74(1967)报导用杀白细胞素类毒素(PVL)使怀孕女性免疫以及其对抗体含量和乳腺炎发病率的影响。作者发现在免疫个体中抗杀白细胞素抗体增加，但在乳腺炎发展中无统计学显著差异。作者指出，在153名免疫个体中，11名报导"注射部位处疼痛，具有摸得出的腋淋巴腺(中等)"且"在3起病例中认为反应严重"。Gladstone,/.Exp.Pa仇54:255-59(1973)对作者和其他人所作的研究进行评论依其申述展示经纯化杀白细胞素(包括LukF-PV与LukS-PV亚单位)抗葡萄球菌感染的治疗功效，但承认"其在健康人中的用途……由通常观测到的可变局部和全身反应显示治疗不当"。作者报导用使用福尔马林(formalin)去毒的经纯化杀白细胞素制剂免疫的结果，注意到在17名个体中有16名对免疫良好耐受，其中第17名个体经历发热、不适和呕吐。作者也报导在免疫个体中抗杀白细胞素抗体含量的相当大的可变性。文章未研究经福尔马林去毒的杀白细胞素制剂的预防或治疗功效。Ward和Turner,/"/e".&/m"说".27:393-97(1980)报导用LukF-PV制剂和LukS-PV制剂进行的实验，但其制剂的纯度并不明确，因为他们发现各制剂都产生LukF-PV与LukS-PV的抗体，表明缺乏纯度或抗原交叉反应性。作者发现用LukF-PV制剂免疫提供对投与LukF-PV、LukS-PV或两者产生的随后攻毒的保护，而用LukS-PV制剂免疫则不提供对任何攻毒的保护。然而，LukF-PV和LukS-PV攻毒诱发毒性反应的事实表明各制剂已经异种亚单位污染，因为单独一种亚单位为无毒的。关于抗PVL抗体的潜在有效性，Gauduchon等人，/./n/ert.D".189:346(2004)发现商业IVIG制剂可在活体外中和金黄色葡萄球菌PVL。作者使用经纯化重组PVL(rLukF-PV和rLukS-PV)来鉴别商业IVIG制剂中的抗PVL抗体。他们发现用IVIG对重组产生的抗原进行预培育会以IVIG浓度依赖性方式抑制细胞毒性。当两种不同的产生PVL的金黄色葡萄球菌菌株的培养物上层清液经IVIG预培育时，发现类似结果。然而，作者未证明所报导活性是由于抗PVL抗体本身引起，且未控制IVIG的全身免疫调控效应。因此，存在对于适用于治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的方法中的包括PVL抗原和PVL抗体的组合物的需求。
发明内容本发明提供PVL抗体和抗原组合物，制造其的方法，以及使用其来预防和治疗金黄色葡萄球菌感染的方法。茬一个实施例中，本发明提供一种与金黄色葡萄球齒的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原特异性结合的抗体，其选自由以下各抗体组成的群组(i)与LukF-PV亚单位特异性结合但不与LukS-PV亚单位特异性结合的抗体，和(ii)与LukS-PV亚单位特异性结合但不与LukF-PV亚单位特异性结合的抗体。所述抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。在一个特定实施例中，抗体是由以下方法制备，其包括(i)向个体投与组合物，所述组合物选自由以下各组合物组成的群组(a)包括作为PVL抗原的LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的组合物和(b)包括作为PVL抗原的LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的组合物；和(ii)自个体获得抗体。本发明也提供一种包括抗体和医药学上可接受的载剂的组合物，且在一个特定实施例中，所述组合物为IVIG组合物或超免疫特异性IVIG组合物。在一个特定实施例中，抗体组合物进一步包括一种或一种以上其它细菌抗原的一种或一种以上抗体，诸如一种或一种以上金黄色葡萄球菌抗原的抗体，所述金黄色葡萄球菌抗原选自由以下各抗原组成的群组5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.e/7:&7mV&)PS1、表皮葡萄球菌GPKa-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白和其组合。本发明也提供一种用于中和个体中PVL相关细胞毒性的方法，其包括向个体投与包括抗体的组合物。在一个实施例中，抗体与LukS-PV特异性结合。在另一个实施例中，抗体与LukF-PV特异性结合。本发明也提供一种检测样品中PVL抗原的方法，其包括使样品与抗体接触。本发明的另一方面涉及PVL抗原。在一个实施例中，本发明提供一种包括与另一种细菌抗原连结(conjugate)的金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原的PVL抗原。在一个实施例中，PVL抗原选自由以下各抗原组成的群组(a)包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的PVL抗原和(b)包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的PVL抗原。在一个实施例中，PVL抗原选自由经纯化野生型PVL抗原和重组PVL抗原组成的群组。在一个实施例中，另一种细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、tx-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。在另一个实施例中，另一种细菌抗原为另一种PVL亚单位，且PVL抗原包括选自由以下各连结物组成的群组的连结物(i)与LukS-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；(ii)与另一LukF-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；禾B(iii)与另一LukS-PV亚单位连结的LukS-PV亚单位。在一个实施例中，连结物为融合蛋白或化学连结物。在另一个实施例中，本发明提供相对于其野生型序列在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中包括突变(包括至少一个氨基酸取代、插入或缺失)的PVL抗原。在一个实施例中，突变选自由以下各突变组成的群组(i)防止PVL与细胞膜结合的突变，(ii)防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS或LukF而展开的突变，(iii)阻断LukF-PV与LukS-PV的装配的突变，(iv)阻断Ca+s通道活性的突变，(v)阻断PVL孔的活性的突变，(vi)改变LukS-PV的磷酸化位点的突变，(vii)破坏LukF-PV的膜结合槽的突变，(viii)产生PVL抗原的"氨基闩"的N末端缺失的突变，和(ix)产生防止主干前部展开且插入膜中的半胱氨酸双突变体的突变。在一个特定实施例中，PVL抗原包括LukF-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)E191A、(ii)R197A、(iii)W176A和(iv)Y179A组成的群组的突变。在另一个特定实施例中，PVL抗原包括LukS-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)T28F、(ii)T28N和(iii)T28D组成的群组的突变。在一个实施例中，PVL抗原选自由以下各PVL抗原组成的群组(a)包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的PVL抗原；(b)包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的PVL抗原；(c)包括突变型LukF-PV亚单位和野生型LukS-PV亚单位的PVL抗原；(d)包括野生型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原；禾口(e)包括突变型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原。本发明也提供一种包括金黄色葡萄球菌的PVL抗原和医药学上可接受的载剂的组合物。PVL抗原可为任何上述抗原。在一个实施例中，组合物包括LukF-PV亚单位和LukS-PV亚单位。在另一个实施例中，组合物包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位，或包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位。在一个实施例中，组合物进一步包括一种或一种以上其它细菌抗原。在一个特定实施例中，所述一种或一种以上其它细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(x-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。本发明也提供一种与任何上述PVL抗原特异性结合的抗体。本发明也提供一种用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的个体投与包括如本文中所述的抗体或抗原的组合物。所述方法可进一步包括投与选自由抗感染剂、抗生素和抗菌剂组成的群组的药剂。在一个实施例中，抗生素药剂选自由万古霉素(vancomycin)、克林霉素(clindamycin)和溶葡萄球菌素(lysostaphinO组成的群组。在一个实施例中，金黄色葡萄球菌感染选自由以下各感染组成的群组社区获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)感染、皮肤或软组织感染、坏死性肺炎、乳腺炎、坏死性筋膜炎、沃-弗综合征(WaterhouseFriderichsenSyndrome)、CA-MRSA败血症和由表达PVL抗原的金黄色葡萄球菌菌株引起的感染。在一个实施例中，所述方法进一步包括投与一种或一种以上其它细菌抗原的一种或一种以上抗体。在一个特定实施例中，所述一种或一种以上抗体选自由以下针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、oc-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白抗原的抗体组成的群组，所述金黄色葡萄球菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌组成的群组。在另一个实施例中，所述方法进一步包括投与一种或一种以上其它细菌抗原。在一个特定实施例中，所述一种或一种以上其它细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(X-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。本发明也提供一种用于制造超免疫特异性IVIG制剂的方法，其包括(i)向个体投与PVL抗原，(ii)自所述个体采集血浆，以及(iii)纯化来自个体的免疫球蛋白。在另一个实施例中，本发明提供一种用于制造超免疫特异性IVIG制剂的方法，其包括(i)对未经投与PVL抗原的个体筛检高滴度的抗PVL抗体，(ii)自所述个体采集血浆，以及(iii)纯化来自个体的免疫球蛋白。本发明也提供一种组合物，其包括(i)静脉内免疫球蛋白(IVIG)组合物，其包括与金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原特异性结合的抗体，和(ii)医药学上可接受的载剂，其中所述IVIG组合物包括比正常IVIG中所发现高至少两倍的抗PVL抗体滴度。本发明的其它方面更详细地描述于下文中。图1:用抗LukS-PV和抗LukF-PV兔抗血清进行rLukS-PV和rLukF-PV抗原的免疫扩散。具体实施方式本发明提供用于治疗和预防金黄色葡萄球菌感染(包含CA-MSRA感染)的组合物和方法。所述组合物包括如所定义且在下文更详细描述的PVL抗原，或与PVL抗原特异性结合的抗体。所述方法包括向有需要的患者投与根据本发明的PVL抗体或PVL抗原组合物。在以下论述中，除非另外说明，否则"一"和"所述"意谓"一个或一个以上"。另外，在关于替换物列表描述本发明的方面时，本发明包含替换物列表的任何个别成员或子群和其一种或一种以上的任何组合。I.组合物Po"to/1V^e打"we^A:^^,素f尸VTJ^f嚴本发明提供包括PVL抗原的组合物。如本文中所用，"PVL抗原"指的是经分离且经纯化的野生型PVL抗原、重组PVL抗原、仅包括LukS-PV亚单位或仅包括LukF-PV亚单位的PVL抗原和包括LukS-PV与LukF-PV亚单位的PVL抗原。举例来说，可使用一系列色谱步骤自金黄色葡萄球菌原型V8菌株(ATCC49775)来纯化包括LukS-PV和LukF-PV亚单位的野生型PVL抗原。Finck-Barbancon等人，S/oc/u'w.fi!'叩/z;^.Acto,1182:275-82(1993)和Prevost等人，/打/e"./mmw""63:4121-9(1995)。根据一个实施例，PVL抗原为重组PVL抗原。如本文中所用，术语"重组PVL抗原"表示由重组DNA方法制造的PVL抗原。所属
技术领域：
中众所周知这些重组DNA方法。一般来说，重组PVL抗原不含野生型PVL在天然状态下所缔合的其它蛋白质和细胞组分(例如，金黄色葡萄球菌细胞中所存在的蛋白质和细胞组分)。根据一个实施例，PVL抗原为经纯化PVL抗原。如本文中所用，术语"经纯化PVL抗原"表示已至少部分与野生型PVL在天然状态下所缔合的其它蛋白质和细胞组分(例如，金黄色葡萄球菌细胞中所存在的蛋白质和细胞组分)分离的PVL抗原。在本发明的特定实施例中，提供单一PVL亚单位的制剂，诸如不含LukS-PV的LukF-PV制剂，或不含LukF-PV的LukS-PV制剂。可通过(例如)展示对抗LukF-PV制剂而产生的抗体不与LukS-PV特异性结合或对抗LukS-PV制剂而产生的抗体不与LukF-PV特异性结合来确定这些制剂的纯度。在一些实施例中，通过单一PVL亚单位在不含(且未经改造以含有)编码其它PVL亚单位的功能基因的宿主中的重组表达来获得包括单一PVL亚单位的制剂。根据本发明的一个方面，LukF-PV和LukS-PV亚单位经重组表达于大肠杆菌(五.coZz')细胞中且随后使用两步柱流程自大肠杆菌纯化，所述两步柱流程包含离子交换色谱(例如使用SP-sepharose柱)，接着亲和色谱(例如使用陶瓷羟磷灰石(CHT)柱)。如本文中所述的PVL抗原也涉及PVL抗原片段、LukS-PV亚单位片段和LukF-PV亚单位片段。适用于本发明中的片段具有类似于野生型PVL抗原的抗原性质。举例来说，PVL抗原片段、LukS-PV亚单位片段和LukF-PV亚单位片段为诱导特异性识别野生型PVL抗原的抗体的片段。根据本发明的PVL抗原(包含LukS-PV禾B/或LukF-PV亚单位和PVL和亚单位片段)可在LukS-PV亚单位、LukS-PV亚单位中的至少一个或两个中包括一个或一个以上氨基酸插入、取代或缺失。举例来说，LukF-PV或LukS-PV序列内的一个或一个以上氨基酸残基可由相似极性的另一种氨基酸(其充当功能等价物)取代，产生沉默转变。序列内的氨基酸替代物可选自氨基酸所属种类的其它成员。举例来说，非极性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。或者，可进行非保守性氨基酸改变，其包含在去毒的情形中在下文更详细论述的改变。因此，在一个实施例中，对PVL抗原进行非保守性氨基酸改变以使蛋白质去毒或稳定蛋白质且防止插入膜中。如本文中所用的"PVL抗原"也指已经历诸如以下修饰的PVL抗原，所述修饰(i)防止PVL与细胞膜结合，(ii)防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS-PV或LukF-PV而展开，(iii)阻断LukF-PV与LukS-PV的装配，(iv)阻断Ca+2通道活性，(v)阻断PVL孔的活性，(vi)改变LukS-PV的磷酸化位点，(vii)破坏LukF-PV的膜结合槽，(viii)产生PVL抗原的"氨基闩"的N末端缺失，或(ix)产生防止主干前部展开且插入膜中的半胱氨酸双突变体。如在下文更详细所述，可通过包含化学处理、连结和突变(诸如氨基酸缺失或取代)的方法来实现一种或一种以上这些修饰。在一个实施例中，PVL抗原经去毒。如本文中所用，"经去毒"PVL抗原不允许通过嗜中性粒细胞的细胞钙通道流入二价阳离子或通过PVL孔流入单价阳离子或形成PVL孔。可通过所属
技术领域：
中已知的技术(诸如光或荧光显微镜检查、流式细胞测量和荧光测定法)来测量对于人类多形核嗜中性粒细胞(PMN)的PVL毒性。参看Staali等人,JM缀6r匿肠Z.162:209-216(1998);Meunier等人，C声m,21:241-247(1995);Weraer等人，/"/ec"onawf/mmwm'fy.'70:(3)1310-1318(2002)。举例来说，PVL抗原诱导PMN膜上现有细胞钙通道的开放。可通过使用荧光指示剂Fura2、Fluo3、Fluo4或Calcium3来监控钙通道的开放和随后的钙流入，且已形成用于测量流入使用DMSO分化为成熟嗜中性粒细胞(PMN)的细胞中的Ca+的流入量的检定。另外，PVL通过将其亚单位插入细胞膜中而形成单独孔。可通过单价阳离子流入或流出细胞的流量来测量孔形成。溴化乙锭也能够通过这些孔进入细胞中，且因此，溴化乙锭可用于追踪单价阳离子的流入。当溴化乙锭进入细胞中时，其经核酸插入且产生荧光发射。可使用荧光显微镜视觉上检测或使用荧光计定量检测细胞内荧光。同样，诸如PBFI(结合磷酸根的荧光指示剂)和Na-Green(其与钾和钠螯合)的荧光指示剂可用于监控PVL孔的形成。在一个实施例中，PVL抗原经分子去毒，其可由所属
技术领域：
中已知的方法来实现，所述方法包含由原始Kunkel方法使用单链模板(Kunkel,TA，Proc.Acad.Sci.,USA,82:488-492(1985))或双链DNA模板(Papworth等人，S歸eg^'9(3):3-4(1996))以及通过PCR克隆(Braman,J.(编)，InVitroMutagenesisProtocols,第2版.HumanaPress,Totowa，NJ(2002);Ishii等人，Me仇Enzymo/i,293,53-71(1998);Kammann等人，TVwd"'c4dAi仏，17:5404(1989);Hemsley等人，M<de!'c17:6545-6551(1989);Giebel等人,iVwde/cAc/Ai".，18:4947(1990);Landt等人，Ge"e,96:125-128(1990);Stemmer等人，肠rec/m—s,13:214-220(1992);Marini等人，A^d"'cAd<iy21:2277-2278(1993);和Weiner等人，151:119-123(1994))在质粒模板上进行引物延伸。在另一个实施例中，PVL抗原是通过化学方式(例如，通过将PVL抗原与另一分子连结)去毒。此实施例涵盖未通过除与另一分子连结之外的任何方式去毒的PVL抗原。在另一个实施例中，PVL抗原与另一抗原(诸如另一PVL抗原)连结。举例来说，LukF-PV亚单位可与另一LukF-PV亚单位或LukS-PV亚单位连结。尽管不希望受限于任何理论，但本发明人相信LukS亚单位与Luk-F亚单位直接连结或通过连接子连结可通过防止抗原折叠为其毒性状态(例如，通过防止S和F亚单位以展现毒性所需的方式相互作用)来使抗原去毒。在另一个实施例中，PVL抗原是与另一抗原(诸如另一细菌抗原，其包含革兰氏阴性(gram-negative)或革兰氏阳性(gram-positive)抗原、另一葡萄球菌抗原和/或细菌多糖)连结。举例来说，PVL抗原可与一种或一种以上诸如选自由以下各抗原组成的群组的抗原的其它金黄色葡萄球菌抗原连结5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、LTA、MSCRAMM、其它保护性抗原或毒素和其组合。在另一个实施例中，PVL抗原是通过在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中突变(包括至少一个氮基酸取代、插'入或缺失)来去毒。组合物(诸如疫苗)可包括LukF-PV亚单位和LukS-PV亚单位中的一种或两种。根据一个实施例，组合物(诸如疫苗)也包括一种或一种以上金黄色葡萄球菌抗原，诸如选自由以下各抗原组成的群组的抗原5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(x-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白、其它保护性抗原或毒素和其组合。因此，例如，本发明的疫苗组合物可包括PVL-5型连结物、PVL-8型连结物、PVL-336型连结物、PVL-PS1连结物、PVL-GP1连结物、PVL-a-毒素连结物、PVL-LTA连结物或PVL-MSCRAMM连结物，其中这些连结物中的任一种都包括PVL抗原。在一个实施例中，PVL抗原经衍生且与另一细菌抗原连接，所述另一细菌抗原为诸如另一金黄色葡萄球菌抗原，诸如选自由以下各抗原组成的群组的抗原5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、oc-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白、其它保护性抗原或毒素和其组合。举例来说，5型或8型抗原可由l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)活化以形成半胱胺衍生物。PVL是经N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)修饰且随后通过硫醇置换与T5CP或T8CP的半胱胺衍生物连结。可由尺寸排阻色谱将所得连结物与未连结抗原分离。在另一个实施例中，(例如)通过使用溴化氰或四氟硼酸l-氰基-4-二甲基氨基-吡啶盐活化抗原上的羟基且通过含有亲核性基团的连接子或在不存在连接子的情况下与PVL结合而将PVL抗原与336型抗原连结。例如参看Kohn等人，F五5S￡ett.，154:209:210(1993);Schneerson等人，丄Med.，152:361-376(1980);Chu等人，/w/ecf./mmim.,40:245-256(1983);Kossaczka等人,/—f./mm肌,68:5037-5043(2000)。所得连结物随后可与未连结抗原分离。类似方法可用于将PVL抗原与LTA连结。在另一个实施例中，PVL抗原与cx-毒素(ot-溶血素)(一种由金黄色葡萄球菌的大多数病原性菌株产生的成孔且溶血外蛋白)连结。在另一个实施例中，(例如)通过经由EDC促进的反应用己二酸二酰肼(ADH)修饰表皮葡萄球菌PS1或GP1来制备PS1的己二酸酰肼衍生物(PS1AH)而将PVL抗原与PS1或GP1抗原连结。PVL抗原随后经琥珀酰化且PVL的琥珀酸衍生物(PVLsuc)与PS1AH连结，其是由EDC介导。类似方法可用于将PVL抗原与LTA连结。存在所属
技术领域：
中已知的'其它连结方法，例如高碘酸盐氧化接着还原性胺化'、碳化二亚胺处理和其它方法和/或其不同组合，其可提供PS与蛋白载体的直接或间接(通过连接子)共价结合且因此得到连结物。举例来说，可通过使用迅速与伯胺反应的不可逆同双官能交联剂(诸如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3))来处理PVL抗原和蛋白质而将PVL抗原与另一蛋白质连结。也参看Partis等人，J.Prot.Chem.2:263-77(1983)。不考虑用于将抗原与载体蛋白连结的方法，PS与蛋白载体的共价结合将PS自T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原。结果，与在单独投与PS后未观测到所述反应相反，PS-蛋白质连结物会在免疫动物中引起PS特异性抗体反应。如上所述，本发明涵盖包括LukS-PV和LukF-PV或包括两种LukF-PV亚单位或包括两种LukS-PV亚单位的融合蛋白。这些融合蛋白可重组产生或通过化学连结产生。在一个实施例中，本发明的融合蛋白是使用适当建构的DNA序列表达。举例来说，编码LukF-PV亚单位的核酸序列可直接或间接与编码LukS-PV亚单位的核酸序列连接，例如，LukF-PV核酸的一端可与LukS-PV核酸的一端直接连接，或编码亚单位的序列可由"连接子"或"间隔基"核酸序列分隔。本发明包含包括在其3'端与LukS-PV亚单位直接或间接连接的LukF-PV亚单位的融合蛋白。本发明也包含包括在其3'端与LukF-PV亚单位直接或间接连接的LukS-PV亚单位的融合蛋白。本发明涵盖LukF-PV和LukS-PV亚单位在相同或不同构筑体中、在相同或不同表达载体中的重组表达。因此，例如，编码LukF-PV的DNA序列和编码LukS-PV的DNA序列可存在于单一构筑体中，其与适当调控元件(例如，启动子和终止子)可操作地连接以进行表达。或者，本发明涵盖使用两种构筑体进行表达，一种用于表达LukF-PV且另一种用于表达LukS-PV。在所述实施例中，各亚单位序列可用(例如)驱动各亚单位的表达的不同启动子与其自身调控元件可操作地连接。表达构筑体可存在于相同或不同表达载体中。因此，本发明涵盖重组转录包括LukS-PV与LukF-PV亚单位的序列的单一mRNA，或重组转录至少两种mRNA转录产物，其中每一种都编码特定亚单位。当使用单一表达载体时，使用单一宿主细胞进行表达，且其将产生两种亚单位。当使用一种以上表达载体时，可使用一种或一种以上宿主细胞进行表达。举例来说，单一细胞可用于所有载体，或一种细胞可用于每一载体，或一种细胞可用于一种载体且另一种细胞可用于一种或一种以上载体。因此，本发明涵盖多种细胞系，其中每一种都重组表达特定亚单位。由一种细胞系表达的亚单位可经分离且随后与已经表达且自另一细胞系分离的另一亚单位连接。在这个实施例中，两种亚单位可经化学连接，诸如通过化学连结。当然，本发明也涵盖由非重组方法获得的PVL亚单位(诸如天然PVL的亚单位，或自细胞或模型葡萄球菌系统的基因组表达的亚单位)的化学连结。不考虑PVL融合蛋白是使用重组技术还是化学连结产生，LukF-PV和LukS-PV亚单位中的一种或两种可包括一种或一种以上氨基酸突变，其包含相对于野生型序列的氨基酸取代、插入或缺失，诸如在下文中所述的那些。因此，PVL融合蛋白可包括(i)突变型LukF-PV和野生型LukS-PV，(ii)突变型LukS-PV和野生型LukF-PV，或(iii)突变型LukF-PV和突变型LukS-PV。在本发明的一些实施例中，PVL抗原是通过修饰PVL抗原以在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列中的至少一个氨基酸中含有突变而去毒。例示性突变可防止PVL与细胞膜结合，防止跨膜域的"主干"或细胞质末端为LukS-PV或LukF-PV而展开，阻断LukF-PV亚单位和/或LukS-PV亚单位的装配，阻断Ca"通道活性，阻断PVL孔的活性，改变LukS-PV的磷酸化位点和/或破坏LukF-PV的膜结合槽。例示性突变可产生或消除内部二硫键，产生或消除磷酸化位点，或消除LukF-PV与Luks-PV亚单位之间的相互作用。突变可包含至少一个点突变、至少一个氨基酸缺失或其组合。在一个实施例中，LukS-PV亚单位的Thr28是经(例如)亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸或半胱氨酸取代。在此位置上的突变影响白细胞毒素的装配。参看Guillet等人，/.肠Z.C/z亂,279:41028-41037(2004)。在另一个实施例中，在来自Y-溶血素的LukS的Thr246处进行突变。已描述此氨基酸位置负责Y溶血素的白细胞溶解活性。参看Nariya等人，Z^to"，415:96-100(1997)，其是以引用的方式全部并入本文中。也可进行在假定磷酸化位点Thr244处的点突变或LukS-PV的残基Thr240-Thr244的缺失，因而破坏LukS-PV的白细胞溶解活性。本文中涵盖的其它突变包含在LukF-PV的跨膜域的"主干"或细胞质末端中(诸如在ValllO、Val114、Tyrl16、Tyrl18、Ilel22、Ilel24和/或Leul28处)的至少一个点突变和/或至少一个缺失，和在LukS-PV的主干中的类似突变，其包含Val103、Val105、Leul09、Tyrlll、Ilell3和/或Phel17。本发明也涵盖Leul28-Ser135、11el24-Ser129禾口/或Serl25-Leu128之间的一个或一个以上氨基酸缺失。这些突变能够促成PVL的成孔活性的Ca+2诱导的断开。参看Moussa等人，F￡BSLette"，461:280-286(1999)和Werner等人，/n/ecf./m附朋.,70:1310-1318(2002)，其是以引用的方式全部并入本文中。本发明中涵盖的其它突变包含产生PVL抗原的"氨基闩"的N末端缺失的那些突变，诸如在LukF-PV的Alal-Va112、LukF-PV的Uel24-Sef129禾口/或LukS-PV的Aspl-11e7、Phel17-Serl22处的缺失。另外，产生半胱氨酸双突变体以在(3-夹层核心与主干前部之间产生二硫键以防止主干前部展开且插入膜中的突变也适用于本发明中。举例来说，LukF-PV半胱氨酸突变体(诸如Vall3Cys-Lysl36Cys;Asp43Cys-Tyrll6Cys或Ser45Cys-Glyll9Cys)或LukS-PV半胱氨酸突变体(诸如11e7Cys-Asnl30Cys;和Asp38Cys-Uell3Cys)或类似突变体涵盖于本发明中。举例来说，本发明涵盖在LukS-PV的P-夹层接触区域中的突变。因此，在此区域中的某些突变包含(但不限于)T28F、T28N和T28D，例如，在LukS-PV的第28位或在对应于第28位的氨基酸位置处的苏氨酸经苯丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸置换。本发明也涵盖在LukS-PV的磷酸化位点中的突变，其消除或降低在那个位点处的磷酸化。因此，那个区域的一个特定突变包含(但不限于)T244A。本发明中涵盖的其它突变包含(例如)在假定磷脂酰胆碱结合槽中破坏LukF-PV的膜结合槽的那些突变。举例来说，在位置N173、W176、Y179、E191和R197处的LukF-PV突变体涵盖于本发明中。在这种情况下，本发明所涵盖的一个特定突变包含(但不限于)E191A，例如，在LukF-PV的第191位或在对应于第191位的氨基酸位置处的谷氨酸经丙氨酸置换。类似地，其它特定LukF-PV突变包含N173A、W176A、R197A和Y179A。本发明涵盖具有一个或一个以上上述突变的组合的PVL抗原，诸如，具有氨基闩缺失和在LukS-PV的磷酸化位点处的点突变体的PVL抗原。资合激/度劳本发明提供包括PVL抗原和医药学上可接受的载剂的组合物(包含疫苗)。PVL抗原可为任何上述PVL抗原，其包含经纯化野生型PVL抗原或重组PVL抗原。PVL抗原可包含LukF-PV亚单位、Luk-SPV亚单位或两者，或可包括LukF-PV亚单位的PVL片段、Luk-SPV亚单位的PVL片段或两种亚单位的PVL片段。PVL抗原可为如上所述的经修饰和/或去毒抗原，且可与另一PVL抗原或另一分子(诸如另一细菌抗原)连结。PVL抗原可包含一个或一个以上上述突变，诸如两个突变。所属
技术领域：
中通常已知用于制造疫苗的方法。例如参看DiTommaso等人，Vaccine,15:1218-24(1997)和Fattom等人，/w/e".tmd/mmw".58:2367-2374(1990)和64:1659-1665(1996)。根据本发明的疫苗通常包括医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂为可用作葡萄球菌抗原的媒剂的物质，因为在疫苗施用的情况下所述物质为惰性或另外医学上可接受，以及可与活性剂相容。除适合赋形剂之外，医药学上可接受的载剂可含有常规疫苗添加剂，如稀释剂、佐剂和其它免疫刺激剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂。举例来说，可添加聚山梨醇酯80以将聚集降到最低且充当稳定剂，且可添加缓冲剂以进行pH值控制。本文中所述的疫苗调配物允许相对容易地且在不改变组合物的情况下添加佐剂。另外，本发明的疫苗可经调配以包含"储槽"组分以增加抗原物质在投药位点处的滞留。举例来说，除佐剂(如果使用一种)之外，可添加明砜(氢氧化铝或磷酸铝)、QS-21、硫酸葡聚糖或矿物油来提供此储槽效应。贫沐本发明也提供包括与医药学上可接受的载剂一起调配的与金黄色葡萄球菌的PVL抗原(诸如任何上述PVL抗原)特异性结合的抗体("PVL抗体")的组合物。本发明的抗体组合物可包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或其组合。如本文中所述，"PVL抗体"指的是全长(即，天然存在或由正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分(包含抗体片段)。抗体片段为抗体的一部分，诸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。不考虑结构，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合，且在本发明的上下文中，与PVL抗原特异性结合。所属
技术领域：
中众所周知制造和筛检抗体片段的方法。可由众多不同方法来制备本发明的PVL抗体。举例来说，PVL抗体可从经投与PVL抗原的个体获得，或从如下文更详细论述的PVL抗体筛检血桨获得。根据另一个实施例，PVL抗体是由重组方法制造。可由所属
技术领域：
中众所周知的技术来制造重组单克隆抗体。可使用PVL抗原作为免疫原，由类似于美国专利申请案2002/0009453(Haurum等人)中所述方法的方法来制备重组多克隆抗体。根据本发明的PVL抗体可为鼠类、人类或人源化抗体。人源化抗体是一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重和轻可变链转移到人类重链和轻链可变域中。抗体分子的恒定域来源于人类抗体的恒定域。用于制造人源化抗体的方法已为所属
技术领域：
所熟知。在一个实施例中，与LukS-PV特异性结合的抗体不与LukF-PV特异性结合。在另一个实施例中，与LukF-PV特异性结合的抗体不与LukS-PV特异性结合。因此，例如，抗LukS-PV抗体可能不与LukF-PV交叉反应且抗LukF-PV抗体可能不与LukS-PV交叉反应。在一些实施例中，本^:明的抗体(例如)通过与天然或融合蛋白上的构象抗原决定部位特异性结合而与当其以天然状态(例如，其天然折叠状态和/或其与其它PVL亚单位复合的天然状态)存在时PVL上存在的PVL亚单位(例如，LukF-PV或LukS-PV)上的抗原决定部位、或与包括那个PVL亚单位的融合蛋白上存在的抗原决定部位特异性结合。在其它实施例中，本发明的抗体(例如)通过与线性抗原决定部位特异性结合而与一个PVL亚单位(无论其三维构型如何)特异性结合。在一些实施例中，本发明的抗体与一种或一种以上本文中所揭示的突变型PVL抗原特异性结合，但不与那种抗原的野生型形式交叉反应。因此，本发明包含与本文中所述的重组或化学连结融合蛋白中的一种特异性结合的抗体。此外，本发明的抗体可与一种或一种以上本文中所揭示的突变型PVL抗原特异性结合，但不与那种抗原的野生型形式交叉反应。在一些实施例中，突变型PVL抗原经设计以具有天然存在PVL突变体或变异体的突变，且对这种突变型PVL抗原具特异性的抗体适用于靶向天然存在PVL突变体或变异体的诊断和治疗方法中。本发明的一种方法需要向个体投与一种或一种以上这些抗体。在一个实施例中，抗体为抗LukS-PV抗体。在另一个实施例中，抗体为抗LukF-PV抗体。在另一个实施例中，一种或两种这些抗体(例如，抗LukF-PV抗体和/或抗LukS-PV抗体)是同时或依次投与。或者，仅向个体投与一种抗体。可由常规方法来获得上述抗体。举例来说，可向个体投与PVL抗原(如上所定义)且可由标准方法自从个体采集的血浆纯化所得IgG。用于获得PVL抗体的PVL抗原可为任何上述PVL抗原。在一个实施例中，根据上述教示(包含通过突变或连结)使用于获得PVL抗体的PVL抗原无毒。或者，可重组制备抗体。拔谬资^激本发明包含适于投药的抗体组合物，诸如包括抗体和医药学上可接受的载剂的组合物。可由所属
技术领域：
中已知的方法针对任何投药途径(包含静脉内、肌肉内、皮下和经皮)调配抗体组合物。在一个实施例中，抗体组合物为IVIG组合物。如本文中所述，"IVIG"指的是适于静脉内投药的免疫球蛋白组合物。如本文中所用的"特异性IVIG"指的是对一种或一种以上PVL抗原(诸如任何上述PVL抗原)具特异性的IVIG。根据一个实施例，本发明提供PVL抗体组合物，其包括包含与金黄色葡萄球菌的PVL抗原(诸如任何上述PVL抗原)特异性结合的抗体的IVIG组合物和医药学上可接受的载剂。根据一个实施例，包括PVL抗体的IVIG组合物是获自来源于经PVL抗原刺激的供体个体的血桨。根据此实施例，PVL抗原(诸如任何上述)经投与个体(诸如人类或其它动物(包含小鼠))以刺激PVL抗体的产生。在一个实施例中，PVL抗原是以疫苗形式投与。作为疫苗的组分，诸如通过任何上述方式将PVL抗原去毒。随后(例如)通过经由常规血浆分馏方法从血浆获得免疫球蛋白而从个体获得与PVL抗原特异性结合的抗体。在此实施例的一个特定方面中，获得呈超免疫特异性免疫球蛋白(IGIV)制剂形式的PVL抗体。"超免疫特异性IVIG"指的是含有高滴度的PVL抗体的IVIG制剂。可通过向个体投与PVL抗原，自个体采集血浆且经由常规血浆分馏方法从血浆获得超免疫特异性IVIG来获得超免疫特异性IVIG组合物。或者，可从自未经投与PVL抗原的个体(即，未经刺激个体)获得的血浆来获得超免疫特异性IVIG组合物。在这个实施例中，对来自未经刺激个体的血浆筛检PVL抗原(包含仅包括LukS-PV、LukF-PV中的一种或两种的PVL抗原)的高滴度抗体。根据一个实施例，对血浆筛检比在标准IVIG制剂中通常存在的含量高两倍或更高的PVL抗体滴度，且使用这种血浆来制备超免疫特异性IVIG组合物。此外，个体可为人或动物。用于获得PVL抗体组合物的PVL抗原可为任何上述PVL抗原，其包含经纯化野生型PVL抗原，重组PVL抗原，包括LukF-PV亚单位和LukS-PV亚单位中的一个或两个的PVL抗原，具有一个或一个以上氨基酸插入、取代的PVL抗原，在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中具有缺失的PVL抗原，经修饰PVL抗原，PVL抗原的片段或去毒PVL抗原(包含通过与另一PVL抗原或另一分子连结而去毒的PVL抗原)。根据一个实施例，本发明的PVL抗体组合物(包含IVIG和超免疫特异性IVIG组合物)进一步包括一种或一种以上葡萄球菌抗原(诸如下文所述的那些)的一种或一种以上抗体。如下所述，例示性金黄色葡萄球菌抗原包含5型、8型和336型葡萄球菌抗原。例示性表皮葡萄球菌抗原包含PS1和GP1。举例来说，组合物可包括选自由金黄色葡萄球菌抗原组成的群组的抗原的抗体，所述抗原为诸如选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白、其它保护性抗原或毒素和其组合组成的群组的抗原。因此，在一个实施例中，本发明的IVIG组合物包括至少一种与PVL抗原结合且也与不同葡萄球菌抗原结合的抗体，或至少一种与PVL抗原结合的抗体和至少一种与不同葡萄球菌抗原结合的抗体。^g^"遂贫嚴/贫伴邀分除上述PVL抗原或抗体之外，本发明的PVL抗原或PVL抗体组合物还可包括其它抗原或抗体，诸如一种或一种以上金黄色葡萄球菌荚膜多糖抗原(诸如在Fattom等人，/咖.cm"mm肌，58:2367-2374(1990)禾口Fattom等人，/"/ec.a/w/扁肌，64:1659-1665(1996)中所述的5型和8型抗原)或其抗体。另外或其它，组合物可包括美国专利第5,770,208号；第6,194,161号；第6,537,559号中所述的336型金黄色葡萄球菌抗原或美国专利第5，770，208号和第6,194,161号中所述的336型葡萄球菌CPS抗原，或其抗体。所属
技术领域：
中已知其它金黄色葡萄球菌抗原，例如参看Adams等人，/.C7/n.M!cwZ7!'0Z,26:1175-1180(1988);Rieneck等人，B!'oc/j!'m.历o/^;ys.Acfa.,1350:128-132(1977)和O'Riordan等人，C"".M!'craWoZZev.,17:218-34(2004)，且包括那些抗原或其抗体的组合物也适用于本发明中。类似地，也可根据本发明使用表皮葡萄球菌抗原(或其抗体)。表皮葡萄球菌II型抗原(也被称作PS1)揭示于美国专利第5,961,975号和第5,866,140号中。此抗原为酸性多糖抗原，其可由包括使凝集ATCC55254的抗血清的表皮葡萄球菌的分离物(II型分离物)的细胞生长的方法获得。适用于本发明中的另一种葡萄球菌抗原描述于WO00/56357中。此抗原包括呈a构型的氨基酸和N-乙酰化氨基己糖，不含O-乙酰基且不含己糖。其与以ATCC202176寄存的葡萄球菌菌株的抗体特异性结合。对抗原的氨基酸分析展示存在约39:25:16:10:7的摩尔比率的丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、缬氨酸和苏氨酸。氨基酸构成抗原分子的约32重量％。此抗原或其抗体可包含在本发明的PVL抗原(或PVL抗体)组合物中。用于本发明中的另一种葡萄球菌抗原描述于己公开美国专利申请案2005/0118190中，且被称作表皮葡萄球菌"GP1"抗原。许多凝固酶阴性葡萄球菌菌株(包含表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S啤/iyZococcw/zaemoZyn'CM)禾口人葡萄球菌(Stop/iytococci^Ao/m'm、))中常见这种抗原。该抗原可从以ATCC202176寄存的表皮葡萄球菌菌株获得。此抗原或其抗体可包含在本发明的PVL抗原(或PVL抗体)组合物中。抗原也包含属于脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白和其它保护性抗原或毒素的那些抗原。方法舒浙爾肺郝染敲兹.本发明提供使用包括PVL抗体或PVL抗原的组合物来治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法。本文中所述治疗和预防方法的目标患者群体包含已经感染细菌病原体(诸如金黄色葡萄球菌(包含CA-MSRA)或表皮葡萄球菌)或处于细菌病原体感染风险中的哺乳动物(诸如人类)。根据一个实施例，本发明提供使用包括PVL抗体的组合物来治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法。根据这种方法，向有需要的患者投与包括与金黄色葡萄球菌的PVL抗原特异性结合的抗体和医药学上可接受的载剂的组合物。抗体组合物可包括任何上述PVL抗体，且视情况可为IVIG组合物、超免疫特异性IVIG组合物、包括重组PVL抗体(包含包括PVL抗体片段的组合物)的组合物或包括人源化PVL抗体的组合物。PVL抗体组合物可与抗感染剂、抗生素或抗菌剂组合投与。例示性抗感染剂包含(但不限于)万古霉素、克林霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗菌剂包含(但不限于)青霉素酶抗性青霉素、头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯类(carbapenem)，其包含万古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨比西林；ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢氨节(cephalexin)、头孢拉定(cephradine)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、亚胺培南(imipenem)、美洛培南(meropenem)、庆大霉素(gentamycin)、替考拉宁(teicoplanin)、林可霉素(lincomycin)和克林霉素。所属
技术领域：
中众所周知这些抗生素的剂量。例如参看MerckManualofDiagnosisandTherapy,§13，Ch.157,第100版(Beers和Berkow编，2004)。抗感染剂、抗生素和/或抗菌剂可在投药之前组合，或与所揭示IVIG组合物同时或依次投与。在一些实施例中，投与相对较少剂量的PVL抗体组合物(诸如一个或两个剂量)，且使用常规抗生素疗法，其通常涉及在数天或数周时期内的多个剂量。因此，抗生素可在一段时期(诸如至少5天、10天或甚至14天或更多天)内每日服用一次、两次或三次或更多次，而PVL抗体组合物通常仅投与一次或两次。然而，所属领域的一般技术人员可选择且调节PVL抗体组合物和抗生素的不同剂量、给药时限和相对量。本发明的PVL抗体组合物适于治疗社区获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)感染，其包含(但不限于)坏死性肺炎、乳腺炎、坏死性筋膜炎、沃-弗综合征、CA-MRSA败血症和皮肤与软组织感染。所属领域的一般技术人员可由常规方法来确定适当剂量。剂量可取决于众多因素，诸如感染的严重性、所用特定PVL抗体组合物、投药频率和个体详情(诸如个体的年龄、体重和免疫状况)。在一些实施例中，剂量将为每公斤体重至少50mgPVL抗体组合物(mg/kg)，其包含至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg禾卩至少1000mg/kg。给药频率和给药次数也取决于众多因素，诸如感染的严重性和患者免疫状态。然而,熟练医师可使用所属
技术领域：
中已知的常规方法来确定适当给药方案。在一些实施例中，可至少每隔一天一次(包含至少每天一次和至少每天两次)投与剂量。有效治疗感染所需的剂量数也可改变。举例来说，可能需要投与一个、两个、三个、四个或更多剂量的PVL抗体组合物。具有弱化免疫系统或尤其严重感染的个体可能需要更多剂量和/或更频繁给药。本发明中也揭示使用本文中所述的抗原组合物来治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染的方法。这些方法包括向有需要的个体投与包括PVL抗原(如上所述)和医药学上可接受的载剂的组合物(诸如疫苗)。本文中所述治疗和预防方法的目标个体群体包含已经感染细菌病原体(诸如金黄色葡萄球菌)或处于感染其的风险中的哺乳动物(诸如人类)。这些方法包含预防CA-MRSA感染，其包含皮肤和软组织感染、坏死性肺炎、乳腺炎、坏死性筋膜炎、沃-弗综合征和CA-MRSA败血症。如上所述，根据本发明的疫苗包括PVL抗原和医药学上可接受的载剂。根据一个实施例，PVL抗原如上所述经去毒。根据一个特定实施例，PVL是通过与另一分子连结(包含通过与另一PVL抗原或另一细菌抗原连结)来去毒。本发明也提供使用包括与另一细菌抗原(诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌抗原，诸如葡萄球菌抗原或其它细菌多糖)连结的PVL抗原(如上所述)的抗原组合物(诸如疫苗)来治疗和/或预防细菌感染的方法。本文中所述治疗和预防方法的目标个体群体包含已经感染细菌病原体(诸如金黄色葡萄球菌)或处于感染其的风险中的哺乳动物(诸如人类)。根据一个实施例，PVL抗原如上所述经去毒。根据一个特定实施例，PVL是通过与另一分子连结(包含通过与另一PVL抗原或另一细菌抗原连结)来去毒。抗原组合物或疫苗可与诸如一种或一种以上金黄色葡萄球菌荚膜多糖抗原(诸如上述5型、8型和336型抗原)和/或所属
技术领域：
中已知的其它金黄色葡萄球菌的其它抗原一起投与。另外或其它，组合物或疫苗可与一种或一种以上表皮葡萄球菌抗原(诸如上述PS1抗原)或与任何其它葡萄球菌抗原(诸如在WO00/56357中所述的抗原和在已公开美国专利申请案2005/0118190中所述的抗原(GP1)(上述))一起投与。本发明的组合物或疫苗也可包括诸如ot'-毒素、脂磷壁酸(LTA)或微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白或其它保护性抗原或毒素的抗原。所述一种或一种以上其它抗原可与PVL疫苗组合物分别投与或可包含在PVL疫苗组合物中。在如上文所提供的组合疗法中，抗原组合物或疫苗可与抗感染剂、抗生素和/或抗菌剂组合投与。同样，可在存在或不存在佐剂的情况下投与根据本发明的组合物或疫苗。如果使用佐剂，那么其经选择以避免佐剂诱发的毒性。根据本发明的组合物或疫苗可另外包括(3-葡聚糖或粒细胞集落刺激因子(尤其，如在1999年9月14日申请且在2002年3月12日颁予的美国专利第6，355，625号中所述的(3-葡聚糖)。可由所属
技术领域：
中的常规方法来确定本发明的抗原组合物或疫苗的治疗有效量。熟练技术人员将了解量可随着疫苗的组成、特定个体的特性、所选投药途径和所治疗的细菌感染的性质而改变。通用指导可见于(例如)国际协调会议(InternationalConferenceonHarmonisation)的公开案禾卩Remington'sPharmaceuticalSciences,第27禾口28章，第484-528页(MackPublishingCompany1990)中。典型疫苗齐懂可在约1]ug至约400吗的范围内。组合物或疫苗可以任何所需剂型(包含可经静脉内、肌肉内、皮下或经皮投与人的剂型)提供。组合物或疫苗可以单一剂量投与或根据多剂量方案投与。投药可通过许多途径进行，其包含皮下、皮内和静脉内。在一个实施例中，使用肌肉内投药。熟练技术人员将认识到投药途径将视欲治疗的细菌感染和疫苗的组成而改变。舒層風微游減本发明也提供用于筛检样品中PVL抗原的存在的方法。根据本发明的这个方面，任何上述PVL抗原都可与样品接触，且可评估样品中存在的抗体与任何PVL抗原之间的结合。所属
技术领域：
中众所周知以抗体为基础的检定，且本发明涵盖使用本发明的抗体来检测PVL抗原(包含天然PVL类毒素和任何上述PVL抗原)的定性与定量检定。可测试PVL抗原的样品未加限制且包含(例如)来自患者的生物样品(诸如血液或血清样品)、细胞培养物上层清液样品、细菌样品和怀疑含有PVL抗原的任何其它样品。参考以下实例对本发明进行进一步描述，这些实例仅为说明目的而提供。本发明并不限于这些实例，而是包含从本文中所提供的教示显而易见的所有改变。实例实例1.rLukF-PV和rLukS-PV野生型纯系的产生通过使用具有微小更改(将溶葡萄球菌素添加到再悬浮缓冲液中)的根据制造商(Promega)的方案，从ATCC以寄存编号49775寄存的金黄色葡萄球菌菌株(产生高含量PVL的PVL原型菌株)来分离基因组DNA。使用已公开PVL基因序列(GenBank寄存编号X72700和AB006796)来设计寡核苷酸引物以将LukF-PV和LukS-PV基因分别分类。正向引物经设计以消除假定信号肽且并入NcoI位点。Ncol位点的ATG经设计以充当翻译的起始密码子，从而避免添加由载体编码的N末端氨基酸。反向引物经设计在终止密码子下游不远处并入BamHI位点。使用标准PCR扩增条件由PCR从金黄色葡萄球菌ATCC49775来扩增Zwib-PV和基因。使用Ncol和BamHI位点将PCR产物克隆入pTrcHisB中。另外，含有Zwfo-PV和基因的NcoI-BamHI插入物随后经亚克隆入pET28(Novagen)中。实例2.rLukF-PV和rLukS-PV融合蛋白纯系的产生使用PCR克隆技术来建构PVL融合蛋白，其为由通过将/"/^-/^和&&-/^基因剪接在一起而得到的核苷酸序列编码的人类改造蛋白。通过具有构型rLukF-PV—aa连接子一rLukS-PV或rLukS-PV—aa连接子一rLukF-PV的短氨基酸连接子将PVL亚单位共价连接。这种融合蛋白不具有细胞毒性，因为两种亚单位不能以展现毒性所需的方式(例如，以正确插入白细胞膜中所需的方式)装配和/或相互作用。融合蛋白适用于将宿主中的抗体刺激为PVL的两种亚单位(例如，LukS-PV和LukF-PV)和作为整体的PVL毒素。实例3.rLukF-PV和rLukS-PV突变体纯系的产生使用由制造商(Stratagene)所述的方案且使用pTrcffisBLukF-PV禾Q/或pTrcffisBLukS-PV作为模板，使用QuickChange突变诱发试剂盒来建构以下突变体rLukF-PV突变体:AI124-S129;E191A;N173A;R197A;W176A和Y179A。rLukS-PV突变体:AD1-I17;AF117-S122;T28D;T28F;T28N禾QT244A。遗传学
技术领域：
中的一般技术人员了解这种命名为标准术语。也就是说，"AI124-S129"意谓在rLukF-PV突变体中缺失("A")在第124位由异亮氨酸终止且在第129位由丝氨酸终止的区域。类似地，"AD1-I17"表明在rLukS-PV突变体中缺失残基1(天冬氨酸)至17(异亮氨酸)。同样，熟练技术人员知道"E191A"意谓在第191位的谷氨酸由丙氨酸置换，"N173A"表明rLukF-PV突变体具有在第173位代替天然存在天冬酰胺(N)的丙氨酸(A)，且"R197A"意谓在第197位的精氨酸(R)被丙氨酸(A)楚楚wi、；寸寸。其它特定涵盖的突变体包含'rLukF-PV突变体产生内部二硫键的双突变体V12C/K136C;AW176;AG175-G177;△R197和AS196-Q198。rLukS-PV突变体消除磷酸化位点的T244A或AT244;产生稳定二硫键的双突变体I7C/N130C或双突变体D38/I113C，AT28;AV27-Q29;AG115-G124,和其它双突变体，诸如T28D/AD1-I7。使用制造商的方案(GeneChoice)将所有构筑体转化入大肠杆菌GC10细胞中。使用ABIPRISMDyeTerminatorCycleSequencing进行测序。将具有正确序列的所有纯系转化入大肠杆菌GC10或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。实例4.rLukS-PV和rLukF-PV野生型和突变型抗原的表达和纯化在振荡烧瓶中，将含有rLukS-PV或rLukF-PV质粒的大肠杆菌菌株GC10或BL21(DE3)pLysS在37'C下在选择性培养基中培养至对数中期阶段且使用最终浓度为1mM的异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导2-3小时。通过离心收集细胞。通过SDS-PAGE和Western印迹分析对振荡烧瓶培养物进行的分析展示在约33-34kDa下的谱带，其在诱导之前不明显。将丸粒状细胞再悬浮于细胞溶解缓冲液(20mMNa2HPO4、50mMNaCl、5%甘油，pH6.5)中，且在室温下用2mg/g溶菌酶处理，接着用Misonix超声波仪进行超声波降解。通过离心收集细胞溶菌液的上层清液。将可溶性蛋白质装载于经细胞溶解缓冲液预平衡的阳离子交换柱上。用于20mMNa2HPO4、5%甘油(pH6.5)缓冲液中的50mM至500mMNaCl的线性梯度来洗提经结合LukS-PV或LukF-PV蛋白。将含有rLukS-PV或rLukF-PV的洗提部分汇集且施加于陶瓷羟磷灰石柱上。自于20mMNa2HP04、5%甘油(pH6.8)缓冲液中的50mMNaCl至750mMNaCl的线性梯度来洗提纯rLukS-PV或rLukF-PV。已使用同一方法将rLukF-PV和rLukS-PV重组蛋白和突变体纯化且发现其纯度极高(对于rLukF-PV和rLukS-PV来说分别为约33或34kDa单一谱带；根据SDS-PAGE/考马斯蓝(CoomassieBlue)染色，纯度大于95%)。对于Western印迹分析来说，蛋白质经转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上且使用所属
技术领域：
中已知的标准程序使用rLukF-PV或rLukS-PV的一级单克隆抗体进行处理。印迹证实存在大致在约33-34kDa下具有谱带的rLukS-PV和rLukF-PV抗原。另外，rLukS-PV和rLukF-PV的N末端测序证实存在^feS-尸/和V基因产物。实例5.rLukF-PV或rLukS-PV多克隆抗体的制备和表征间隔两周三次将以1:1比率的rLukS-PV或rLukF-PV(各50pg)与佐剂(CFA，接着IFA)注射入新西兰白兔中。在针对抗原的免疫扩散检定中LukS-PV抗血清将rLukS-PV识别为相同抗原，而rLukF-PV抗血清识别LukF-PV。rLukS-PV或rLukF-PV不与异种抗血清反应。这表明rLukS-PV疫苗或rLukF-PV疫苗都不产生与异种蛋白质亚单位交叉反应的抗体。因此，本发明的疫苗适用于获得不与LukF-PV交叉反应的抗LukS抗体，和不与LukS-PV交叉反应的抗LukF抗体。将阳性血液组合且用蛋白质G柱纯化IgG。经纯化的抗PVLIgG用于如下所述的动物模型中。实例6.rLukF-PV或rLukS-PV抗原的免疫化学分析进行双免疫扩散以测定LukS-PV和LukF-PV抗血清的特异性，以及测定PVL亚单位抗原的抗原性。简单地说，将每孔10pl的200吗/ml各PVL抗原(外部孔)和每孔10^抗血清(中心孔)装载于1%琼脂糖凝胶中且使其在潮湿环境中扩散整夜。随后将琼脂糖凝胶在PBS中洗涤且连续压縮三次，随后干燥且用考马斯蓝染色。对凝胶分析沉淀带，其是在抗原与抗体反应且形成免疫复合物时形成。如图1中所示，rLukF-PV抗原与具有抗LukF-PV抗体的单一沉淀带反应，而rLukS-PV抗原不与此抗血清交叉反应。类似地，rLukS-PV抗原与具有抗LukS-PV抗体的单一沉淀带反应，而rLukF-PV抗原不与这些抗体交叉反应。因此这些抗体对同源PVL抗原具特异性。测试以下抗原<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如图1中所示，观察到所有突变型rLukF-PV和rLukS-PV抗原与同源野生型重组亚单位共有一致的抗体系，其展示突变型蛋白与同源野生型蛋白抗原性一致。举例来说，野生型rLukS-PV、rLukS-PVAD1-117、rLukS-PVAF117-S122、rLukS-PVT28F、rLukS-PVT28N、rLukS-PVT28D和rLukS-PVT244A各自与抗LukS-PV抗体反应且共有一致的抗体系。另外，野生型rLukF-PV、rLukF-PVAI124-S129、rLukF-PVE191A、rLukp-PVN173A、rLukF-PVR197A、rLukF-PVW176A和rLukF-PVY179A与抗LukF-PV抗体反应且共有一致的抗体系。对抗LukF-PV与抗LukS-PV抗体实施定量ELISA，证明任一PVL亚单位对异种抗血清无交叉反应性。此数据证实本文中所述的rLukF-PV和rLukS-PV抗原不与PVL抗原交叉反应。实例7.LukS-PV和LukF-PV杂交瘤制备(单克隆抗体)用rLukS-PV或rLukF-PV使BALB/c小鼠免疫。在单独程序中自个别研究的小鼠采集免疫脾细胞且在不同实验中使用50%聚乙二醇使其与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。将融合细胞再悬浮于选择培养基中，接种于96孔组织培养板中且在潮湿条件下在37'C培育箱中用8%C02培育。在用经纯化抗原(其代表各自的免疫原(rLukS-PV或rLukF-PV))涂覆的ELISA培养板上筛检生长培养物的上层清液中的单克隆抗体(MAb)分泌细胞。再筛检ELISA阳性对rLukS-PV和rLukF-PV抗原的交叉反应性以检验所分泌MAb的特异性，随后进行克隆实验以建立从单一细胞产生的MAb分泌集落。从由这些纯系建立的大量培养物产生种子储备，这些纯系也用于产生小鼠腹水，从小鼠腹水制备经纯化MAb且对其进一步表征。实例8.LukS-PV和LukF-PV单克隆抗体的表征展示各PVL蛋白亚单位的所有单克隆抗体(MAb)属于IgGlK子类。在ELISA检定中测试LukS-PV和LukF-PV的各10种MAb的上层清液对涂覆于ELISA培养板上的rLukS-PV和rLukF-PV抗原的交叉反应性。所有MAb对其同源抗原特异(LukSMAb仅与rLukS-PV抗原结合，而LukFMAb仅与rLukF-PV抗原结合)。在Western印迹检定中测试所有MAb与rLukS-PV和rLukF-PV蛋白的结合。此外，证实各MAb与其抗原特异性结合且证实其对其它抗原无交叉反应性。实例9.由转流入检定在活体外测定PVL活性将HL-60细胞(ATCCCLL-240;Gallagher等人，Blood54:713-33(1979))以每毫升2><105个细胞的密度接种且在6或7天后当细胞密度达到每毫升约lxl()6个细胞时传代。HL-60细胞如下分化使用TryanBlue进行细胞计数以测定细胞数目和活力，在细胞培养基中添加DMSO达1.25呢，且在含有DMSO的细胞培养基中将细胞稀释到每毫升2x105个。在37°C/8%C02下在C02培育箱中将细胞培养6至7天，随后进行细胞计数且测定细胞密度为每毫升约1><106个。在室温下对经分化HL-60细胞装载10Fluo-4和0.1%泊洛尼克酸(Pluronicacid)F-127历时30分钟。在培育之后将细胞在HBSS/HEPES/丙磺舒(Probenecid)中洗涤两次，且在HBSS/HEPES/丙磺舒中将细胞调节到每毫升6xl(^个细胞，且将其添加到96孔黑壁/透明底Costar微量滴定板的每一孔中。随后添加5的20mMCaCl2，接着随后添加25[xLrLukS-PV禾Q/或25pLrLukF-PV或缓冲对照物。通过使用基于Tecan'sSafire2单色仪的微量培养板检测系统测量如由荧光变化所测定的细胞内钙的变化来测定PVL对HL-60细胞的细胞毒性。仅在rLukS-PV与rLukF-PV都存在时检测到如由荧光变化所测定的流入HL-60细胞中的钙，其证实对于活体外细胞毒性来说需要两种PVL亚单位。单独一种PVL亚单位不展示荧光增加，因而证实单独rLukF-PV和rLukS-PV无细胞毒性且可在无需去毒的情况下个别地用作疫苗的抗原。在上述条件下使用钙流入检定，使用与异种野生型蛋白一致的突变体，评估上述rLukS-PV和rLukF-PV突变体的选择与野生型蛋白相比的活性。举例来说，将突变型rLukS-PV蛋白与野生型rLukF-PV组合，或将突变型rLukF-PV蛋白与野生型rLukS-PV组合，且将突变型/野生型组合的活性与野生型rLukF-PV和rLukS-PV的活性进行比较。发现并不是所有突变体都产生非活性复合物；然而，如由钙流入检定所测定，若干种突变体确实产生非活性形式(小于野生型活性的10%)。参看以下表1和表2。这些突变体包含经设计在磷脂酰胆碱结合槽中具有突变(例如，E191A、R197A、W176A和Y179A)的LukF-PV突变体和LukS-PV突变体T28F、T28N和T28D。如上所述，一种亚单位的任何非细胞毒性突变体(包含具有点突变、缺失、切断或经两个或两个以上这些突变双重去毒的那些突变体)都可与异种亚单位的野生型形式一起用于产生无毒刺激性抗原或疫苗。另外，可使用两种亚单位的突变体。在任一情况下，疫苗会诱导LukS-PV与LukF-PV的抗体。可使用上述钙流入检定来证实包括LukF-PV和LukS-PV的融合蛋白或化学连结物的无毒性。如上所述，此融合蛋白或化学连结物可用作刺激性抗原或疫苗以产生抗LukS-PV与LukF-PV的抗体。表1.rLukF-PV突变型蛋白的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2.rLukS-PV突变型蛋白的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实例10.使用钙流入检定进行PVL细胞毒性活性的多克隆抗体中和为测定PVL抗体的中和活性，如上所述进行钙流入检定，更改之处在于抗LukS-PV或抗LuKF-PV兔抗血清是用rLukS-PV或rLukF-PV培育，30分钟后添加到装载HL-60细胞中。为测定中和百分比，将此反应的荧光变化与单独野生型PVL蛋白的荧光变化进行比较。表3展示如上所述测定的PVL细胞毒性的中和。抗LukS-PV抗血清与抗LukF-PV抗血清均可有效中和活体外细胞毒性。当抗LukS-PV抗血清与抗LukF-PV抗血清在一起评估中和时，未检测到协同作用。也就是说，当一起使用次最佳浓度的两种抗体类型时(均为1:160稀释)，未观测到比加和中和更大的中和。这些结果证实PVL毒素的中和仅需要一种PVL亚单位的抗体(例如，抗LukF-PV抗体或抗LukS-PV抗体)。表3.由多克隆兔抗体进行PVL细胞毒性的中和<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实例11.由XTT检定在活体外测定PVL细胞毒性在补充有50吗/mL庆大霉素和1%热灭活胎牛血清(HI-FBS)(Gibco)的不含有酚红的高葡萄糖杜贝卡氏修饰依格培养基(high-glucoseDulbecco'smodifiedEagle'smedium;HG-DMEM)(Gibco)(维持培养基(MM))中制备含有rLukS-PV和rLukF-PV(各20nM)的溶液。在96孔细胞培养板上在MM中对毒素从20nM进行连续两倍稀释。在每一检定板上包含阴性培养基对照孔和细胞对照孔，各组都含有MM而非经稀释毒素。将约5xl()S个活HL-60细胞(经二甲亚砜(DMSO)诱导至分化为嗜中性粒细胞路径的更成熟且易受PVL影响的细胞)添加到具有稀释毒素和细胞对照物培养基的每一孔中。所有培养基对照孔接受MM而非细胞悬浮液。在潮湿条件下在37'C培育箱中用8%C02将具有样品的检定板培育24-48小时。随后将呈化合物2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鐵-5-羧基苯胺(Sigma,目录号TOX-2)的钠盐形式且根据制造商的说明在MM中制备的XTT以各孔中培养基体积的20%添加到所有孔中。将培养板移回到培育箱中进行额外培育以允许由于XTT作用而显色。(活细胞的线粒体脱氢酶使XTT的四唑鎿环裂解，产生显现橙色的溶液。)随后将培养板从培育箱移出，离心为丸粒细胞和碎片，随后将一定体积的来自各孔的上层清液转移到圆底ELISA培养板的相应孔中。借助于ELISA培养板读取器在450nm下测量上层清液的光学密度(OD)，将其减去作为背景的仅培养基OD，随后报导数据。随后计算由于PVL细胞毒性作用而杀死的细胞百分比。如由XTT检定所测定，活体外细胞毒性需要20.5nM的两种野生型PVL亚单位rLukF-PV和rLukS-PV。对于10nM的单独每一PVL亚单位未观测到细胞毒性。因此数据进一步证实单独一种PVL亚单位不具细胞毒性且可单独作为疫苗或刺激性抗原。实例12.使用XTT检定进行PVL细胞毒性的抗体中和对来自在哺乳动物细胞融合实验中为产生免疫脾细胞以进行杂交瘤制备而进行的LukS-PV和LukF-PV研究中所收集的小鼠免疫血清的经纯化抗体和来自由对毒素亚单位具特异性的巳形成杂交瘤分泌MAb所产生的腹水的经纯化抗体表征其在活体外中和PVL毒素的能力'。'在96孔细胞培养板上对抗体进行连续两倍稀释。在每一检定板上包含各自不含毒素的阴性培养基对照孔和细胞对照孔，和一组阳性毒素对照孔。将相等体积的于MM(上述)中的40nMPVL毒素亚单位添加到具有抗体的所有孔中和用于毒素阳性对照的那些孔中。将相等体积的MM添加到所有培养基对照孔和细胞对照孔中。向具有经稀释抗体、毒素和细胞对照培养基的各孔中添加体积等于各孔体积的约lxl()S个经DMSO诱导的活HL-60细胞。所有培养基对照孔都接受MM而非细胞悬浮液。因而将所有抗体和毒素浓度稀释为起始浓度的四倍。将各孔的内含物混合且将50%体积转移到另一96孔细胞培养板的相应孔中。在潮湿的37'C培育箱中用8呢C02培育两个培养板。随后将呈化合物2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎗-5-羧基苯胺(Sigma，目录号TOX-2)的钠盐形式且根据制造商的说明在MM中制备的XTT以各孔中培养基体积的20%添加到所有孔中。将培养板移回到培育箱中进行额外培育以允许由于XTT作用而显色。随后将培养板从培育箱移出，离心为丸粒细胞和碎片，随后将一定体积的来自各孔的上层清液转移到圆底ELISA培养板的相应孔中。在450nm下测量上层清液的光学密度(OD)。随后计算由于PVL细胞毒性作用而杀死的细胞百分比。如表4中所列，在这个检定中在中和PVL细胞毒性时抗LukS-PV的MAb比抗LukF-PV的MAb有效10倍。也就是说，如由XTT检定所测定，对于在活体外中和PVL细胞毒性来说需要约10倍高的LukFMAb。举例来说，使用0.4-10pg/mLLukSMAb达到PVL细胞毒性的50%中和，而为达到50%中和则需要5-95吗/mLLukFMab。表4中的结果也展示对rLukS-PV("LukS-M-IgG")或rLukF-PV("LukF-M-IgG")具特异性的多克隆抗体能够在活体外中和PVL细胞毒性。这些结果表明仅包括LukS-PV抗原(即，不具有LukF-PV)的组合物可有效作为疫苗，且仅包括抗LukS-PV抗体(包含MAb，或包括抗LukS-PV抗体的IVIG或超免疫特异性IVIG)(即，不具有抗LukF-PV抗体)的组合物可有效用于中和PVL细胞毒性。尽管相当的LukF-PV抗原/抗体组合物可能有效性较差，但如由在此检定中单独LukFMab中和PVL细胞毒性的能力所示，其也会有用。表4.PVL细胞毒性杀灭的MAb50%中和(XTT检定)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实例13.单克隆或多克隆抗LiikS抗体对PVL介导的细胞毒性的中和从健康志愿者提取周边血且通过Percoll梯度来纯化人类PMN。将不同稀释度的单克隆(1LukS235)或多克隆(兔)抗LukS-PV抗体添加到人类PMN(每孔5><105个细胞)中以抑制rPVL(10nM)或USA30024hr培养物上层清液(l:40稀释)(其含有1.2吗/ml的LukS-PV和0.5pg/ml的LukF-PV)的细胞毒性效应。这些经选择稀释液对人类PMN分别诱导85%(MAb)和70%(PAb)的细胞毒性。使用兔血清和抗a毒素MAb作为对照物。如由在450nm下的荧光变化所测量，在培养2小时后由XTT检定来评估抗LukS-PV抗体的抑制效应。结果表明经诱导HL-60细胞和周边血纯化人类PMN易受相同浓度的rPVL影响。rPVL和获自CA-MRSAUSA300的培养物上层清液的PVL可类似有效地诱导对人类PMN的细胞毒性。如表5中所示，多克隆抗体与单克隆抗体都可有效中和对人类PMN的PVL依赖性细胞毒性。作为对照，对于rPVL与含有USA300上层清液的PVL来说，自然兔血清(1:10稀释)仅诱导细胞毒性的10%中和。这些结果证实单克隆和多克隆抗LukS-PV抗体可有效中和rPVL与由CA-MRSA表达的天然PVL的细胞毒性效应。表5.PVL细胞毒性的MAb和PAb中禾口(XTT检定)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实例14.PVL毒素、rLukF-PV和rLukS-PV的毒性将4-5个月大的新西兰雌性兔(Harian)剃毛且经皮内注射增加剂量的大致等摩尔浓度的rLukF-PV和rLukS-PV或rPVL毒素(rLukF-PV和rLukS-PV)(12.5吗、25昭、50昭和100昭)。在1周内每日追踪皮肤坏死；测量病变尺寸。此研究展示兔对由rPVL毒素(rLukF-PV和rLukS-PV)的皮内注射造成的皮肤坏死的易感性。尽管在注射rPVL毒素(12.5-100pg)24小时后观测到皮肤坏死，但单一PVL亚单位(200吗rLukS-PV或200吗rLukF-PV)的注射不产生任何病变。观测到剂量依赖性效应，其中病变尺寸随着rPVL毒素的浓度增加而增加。这些结果进一步证实单独rLukS-PV或rLukF-PV为无毒抗原，其可不经进一步去毒而用作疫苗或刺激抗原。实例15.PVL抗体在活体内中和PVL毒素的功效评估包括rLukS-PV、rLukF-PV或rPVL(rLukS-PV+rLukF-PV)的疫苗在活体内中和rPVL毒素(12.5-200pg)的能力。使用1:1比率的Titermax(Sigma)作为佐剂，经由肌肉内途径用50叫rLukS-PV、50吗rLukF-PV或两种亚单位(各50吗)使5-6个月大的新西兰雌性兔间隔两周免疫三次。在第三次注射7天后对兔取血且由ELISA来评估LukS-PV和LukF-PV的IgG滴度。在所有相关血清中，对于OD450nm=2.0来说，LukS-PVIgG禾PLukF-PVIgG的滴度为1/106稀释。来自经rLukF-PV免疫的兔的抗血清仅与rLukF-PV反应，而经rLukS-PV免疫的兔仅与rLukS-PV反应，其证实在异种亚单位与抗体之间不存在交叉反应性。将兔剃毛且用rPVL毒素(各200|ig亚单位)、200吗rLukF-PV、200貼rLukS-PV或PBS在其背上注射(攻毒)。经rLukS-PV和rLukF-PV疫苗接种对各亚单位分别诱导高抗体滴度(对于0D-2来说，稀释1/106)。此外，这些抗体显示避免由rPVL毒素攻毒产生的皮肤坏死的保护。也就是说，在rPVL攻毒后，在经rPVL亚单位(rLukS-PV或rLukF-PV)免疫的兔中未观测到皮肤坏死。与此相反，在接受安慰剂(PBS加Titermax)的对照兔上观测到皮肤坏死。另外，在所有兔中，当仅一种PVL亚单位用作攻毒时，未观测到坏死。这些结果进一步证实经单独rLukS-PV或rLukF-PV(即，不具有其它亚单位)免疫可有效预防由PVL造成的坏死。因此，包括这些PVL抗原中的一种的组合物可适用于预防由产生PVL的CA-MRSA造成的坏死。实例16.PVL抗体在避免PVL+CA-MRSA感染的保护中的功效评估包括rLukS-PV、rLukF-PV或rPVL(rLukS-PV+rLukF-PV)的疫苗中和产生'PVL的金黄色葡萄球菌皮肤感染的能力。使用l:l'比率的Titermax(Sigma)作为佐剂，经由肌肉内途径用50pgrLukS-PV、50吗rLukF-PV或两种亚单位(各50(ag)使5-6个月大的新西兰雌性兔间隔两周免疫三次。在第三次注射7天后对兔取血且由ELISA来评估LukS-PV和LukF-PVIgG滴度。在所有相关血清中，对于OD45C)nm=2.0来说，LukS-PVIgG和LukF-PVIgG的滴度为1/106稀释。来自经rLukF-PV免疫的兔的抗血清仅与rLukF-PV反应，而经rLukS-PV免疫的兔仅与rLukS-PV反应，其证实在异种亚单位与抗体之间不存在交叉反应性。来自经两种亚单位免疫的兔的抗血清与LukF-PV和LukS-PV反应。将兔剃毛且在其背上注射每100pL金黄色葡萄球菌菌株USA300(产生PVL的CA-MRSA)1()8个CFU。经rLukS-PV和rLukF-PV疫苗接种对各亚单位分别诱导高抗体滴度(对于OD=2来说，稀释1/106)。这些抗体展示避免由产生PVL的金黄色葡萄球菌分离物(或CA-MRSAUSA300)造成的皮肤坏死的保护。也就是说，在经rPVL亚单位(rLukS-PV或rLukF-PV)或rPVL(rLukS-PV禾HrLukF-PV)免疫的兔上未观测到皮肤坏死。与此相反，在接受安慰剂(PBS加Titermax)的对照兔或自然兔上观测到皮肤坏死。另外，经rPVL(rLukS-PV和rLukF-PV)免疫的兔具有严重性降低的感染。经rPVL免疫的兔都未发生病变，而对照兔确实产生病变。经rLukS-PV或rPVL(rLukF-PV和rLukS-PV)免疫的兔在第7天是健康的。然而，经rLukF-PV免疫的兔在第5天显示临床发病征兆(体重降低、发热)，且接受PBS的对照兔在40小时后死亡。rLukS-PV疫苗和rPVL(rLukF-PV和rLukS-PV)疫苗可有效预防CA-MRSA感染。经rLukF-PV疫苗免疫的单一兔的发病征兆可表明rLukF-PV疫苗不如rLukS-PV疫苗有效，但样品尺寸过小不能得到科学上有效的结论。无论如何，rLukF-PV疫苗至少延迟疾病的发作和/或减轻其严重性，即使兔未经完全保护免于感染。实例17.PVL抗原的克隆、表达和纯化使用NcoI和BamHl限制位点分别在氨基和羧基末端处通过聚合酶链反应(PCR)自金黄色葡萄球菌ATCC第49774号基因组DNA将编码LukF-PV和LukS-PV的核苷酸序列克隆入pTrcHis-B载体(Stratagene)中。形成质粒pTrcLukSPV1和pTrcLukFPV1且其由DNA测序证实。质粒表达是在lac操纵子的控制下，且因此使用IPTG来诱导蛋白质表达。在经质粒转化的大肠杆菌细胞中实现表达。随后使用两步柱流程自大肠杆菌细胞来纯化LukF-PV和LukS-PV亚单位。将含有LukF-PV和LukS-PV的大肠杆菌细胞溶解且通过离心移除细胞碎片。首先将细胞溶解产物装载于在含有5%甘油的0.05MNaCl/0.02M磷酸钠(pH6.5)中的SP-Sepharose柱上，且用0.05M-0.5MNaCl线性梯度洗提。将如由SDS-PAGE所检测的含有抗原、LukF-PV或LukS-PV的洗提部分汇集。用陶瓷羟磷灰石(CHT)亲和柱将经汇集抗原进一步纯化。CHT柱首先经含有5%甘油的0.05MNaCl/0.02M磷酸钠(pH6.8)平衡且用0.05M-0.75MNaCl的线性梯度洗提。使用SDS-PAGE/银染色来分析最终产物的纯度。实例18.产生无毒PVL突变型蛋白通过突变诱发产生无毒PVL突变型蛋白。由PCR克隆/突变诱发技术产生突变型蛋白。使用标准定点突变诱发方法使用质粒DNA[pTrcLukFPV1(对于LukF-PV来说)和pTrcLukSPVl(对于LukS-PV来说)]作为模板DNA来产生突变体。突变型蛋白含有以下突变，其消除LukS-PV亚单位自身插入细胞膜中的能力，防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS或LukF而展开，改变白细胞溶解活性所需的磷酸化位点，阻断Ca+z通道活性，阻断PVL孔的活性，和/或破坏LukS-PV与LukF-PV亚单位之间的相互作用。实例19.中和检定由ELISA来检定来自动物研究的抗血清对于PVLLukF-PV和LukS-PV亚单位的滴度。在中和检定中使用具有高滴度的抗血清。基本上，通过添加中和抗体来进行细胞毒性检定。在与多形核细胞混合之前将抗体添加到PVL亚单位中，或在检定期间同时添加到多形核细胞中。通过观测由PVL造成的形态变化的降低和/或检测由通过活化钙通道或PVL孔流入的阳离子造成的荧光发射的降低来检测中和。实例20.PVL抗体制备醇微使用PVL蛋白对血浆供体进行疫苗接种。使用标准方法来收集血浆且纯化IgG。PVX淳^丝単克虔拔谬游产主对于MAb产生来说，以每种毒素两组小鼠用PVL毒素(LukF-PV亚单位或LukS-PV亚单位或两者)使四组BALB/c小鼠免疫。以两周时间间隔进行免疫，唯一例外在于在处死小鼠之前3天进行最后注射。以各自组每只小鼠5吗和10pg的量注射各毒素。对于前两次注射来说，依次投与毒素与完全和不完全弗氏佐剂(Freund'sadjuvant)的组合。用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的毒素进行随后注射。制备呈来自处死小鼠的各自组的池形式的脾细胞悬浮液且将其以适当等分试样存储在液氮中以在未来时期用于融合实验中。在约4个月的融合实验时期中产生对LukF-PV和LukS-PV特异的MAb的浓縮储备液供应的目录。在选定小鼠单克隆抗体后，通过将针对抗体的高特异性抗原识别部分的小鼠基因剪接入编码抗体分子的其余部分的人类基因中而将其人源化。人源化单克隆抗体通常含有少于10%的小鼠内含物，因而将任何免疫反应降至最低。置资贫谬劍备-,带鈸萝#展示#产主贫沐当使用噬菌体展示技术时应用两种策略。第一种是使用表达肽或人类抗体片段的被称作自然文库的现成文库。第二种涉及建构对所关注蛋白质具特异性的抗体文库。在决定使用哪种方法之前，研究且比较商业文库。或者，使用来自免疫动物的脾细胞以建构对所关注蛋白质具特异性的文库。在决定文库策略后，使用LukS-PV和LukF-PV作为用于筛检的目标。将LukS-PV和LukF-PV亚单位吸附于固体支撑物上以捕获展示特异性肽或抗体片段的噬菌体。对经捕获噬菌体粒子差示洗提以选择较高亲和性肽或抗体片段。通常使用三个回合的选择来分离高特异性肽或抗体片段。必要时，噬菌体文库的随机突变诱发也用于增强特异性。可在不悖离本发明的范围和精神的情况下对本文中所揭示的本发明作出各种代替和更改。前述描述和实例仅为说明性的，且并不限制本发明的范围，本发明的范围是由权利要求来限定。权利要求1.一种抗体，其与金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原特异性结合，所述抗体选自由以下组成的群组(i)与LukF-PV亚单位特异性结合但不与LukS-PV亚单位特异性结合的抗体和(ii)与LukS-PV亚单位特异性结合但不与LukF-PV亚单位特异性结合的抗体。2.根据权利要求l所述的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。3.根据权利要求l所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。4.根据权利要求l所述的抗体，其由以下方法制备，所述方法包括(i)向个体投与选自由以下组成的群组的组合物(a)包括作为PVL抗原的LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的组合物和(b)包括作为PVL抗原的LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的组合物，以及(ii)从所述个体获得所述抗体。5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述PVL抗原选自由经纯化野生型PVL抗原和重组PVL抗原组成的群组。6.根据权利要求4所述的抗体，其中所述PVL抗原相对于其野生型氨基酸序列在其氨基酸序列中包括突变，所述突变包括至少一个氨基酸取代、插入或缺失。7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述突变为至少一个选自由以下各突变组成的群组的突变(i)防止PVL与细胞膜结合的突变，(ii)防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS或LukF而展开的突变，(iii)阻断LukF-PV与LukS-PV装配的突变，(iv)阻断Ca"通道活性的突变，(v)阻断PVL孔活性的突变，(vi)改变LukS-PV磷酸化位点的突变，(vii)破坏LukF-PV膜结合槽的突变，(viii)产生PVL抗原"氨基闩"N末端缺失的突变，和(ix)产生防止主干前部展开及插入所述膜中的半胱氨酸双突变体的突变。8.根据权利要求6所述的抗体，其中所述PVL抗原包括LukF-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)E191A、(ii)R197A、(iii)W176A和(iv)Y179A组成的群组的突变。9.根据权利要求6所述的抗体，其中所述PVL抗原包括LukS-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)T28F、(ii)T28N和(iii)T28D组成的群组的突变。10.根据权利要求4所述的抗体，其中所述PVL抗原与另一细菌抗原连结。11.根据权利要求IO所述的抗体，其中所述PVL抗原与选自由以下组成的群组的抗原连结5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.印!'^/7m^fe)PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白。12.—种组合物，其包括权利要求1的抗体和医药学上可接受的载剂。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物为IVIG组合物。14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物为超免疫特异性IVIG组合物。15.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括针对一种或一种以上其它细菌抗原的一种或一种以上抗体。16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述一种或一种以上抗体选自由针对一种或一种以上金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(x-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白和其组合抗原的抗体组成的群组，所述金黄色葡萄球菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌组成的群组。17.—种用于中和个体中PVL相关细胞毒性的方法，其包括向个体投与包括权利要求1的抗体的组合物。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体与LukS-PV特异性结合。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体与LukF-PV特异性结合。20.—种检测样品中PVL抗原的方法，其包括将样品与权利要求1的抗体接触。21.—种组合物，其包括金黄色葡萄球菌的PVL抗原和医药学上可接受的载剂。22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述PVL抗原与另一细菌抗原连结。23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述另一细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GPl、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。24.根据权利要求22所述的组合物，其包括选自由以下组成的群组的PVL抗原连结物(a)与LukS-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；(b)与另一LukF-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；禾B'(c)与另一LukS-PV亚单位连结的LukS-PV亚单位。25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述PVL抗原相对于其野生型序列在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中包括突变，所述突变包括至少一个氨基酸取代、插入或缺失。26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述PVL抗原包括至少一个选自由以下各突变组成的群组的突变(i)防止PVL与细胞膜结合的突变，(ii)防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS或LukF而展开的突变，(iii)阻断LukF-PV与LukS-PV装配的突变，(iv)阻断Ca"通道活性的突变，(v)阻断PVL孔活性的突变，(vi)改变LukS-PV磷酸化位点的突变，(vii)破坏LukF-PV膜结合槽的突变，(viii)产生PVL抗原"氨基闩"N末端缺失的突变，和(ix)产生防止主干前部展开及插入所述膜中的半胱氨酸双突变体的突变。27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述PVL抗原包括LukF-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)E191A、(ii)R197A、(iii)W176A和(iv)Y179A组成的群组的突变。28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述PVL抗原包括LukS-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)T28F、(ii)T28N和(iii)T28D组成的群组的突变。29.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物包括选自由以下组成的群组的PVL抗原(a)包括突变型LukF-PV亚单位和野生型LukS-PV亚单位的PVL抗原；(b)包括野生型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原；禾Q(c)包括突变型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原。30.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位或包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位。31.根据权利要求21所述的组合物，其进一步包括一种或一种以上其它细菌抗原。32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述一种或一种以上其它细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、ot-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。33.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包括一种或一种以上其它PVL抗原。34.—种PVL抗原，其包括与另一细菌抗原连结的金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原。35.根据权利要求1所述的PVL抗原，其中所述PVL抗原选自由经纯化野生型PVL抗原和重组PVL抗原组成的群组。36.根据权利要求34所述的PVL抗原，其中所述另一细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌、336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、a-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。37.根据权利要求34所述的PVL抗原，其包括选自由以下组成的群组的连结物(i)与LukS-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；(ii)与另一LukF-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；禾B(iii)与另一LukS-PV亚单位连结的LukS-PV亚单位。38.根据权利要求37所述的PVL抗原，其包括LukF-PV亚单位和LukS-PV亚单位的融合蛋白或化学连结物。39.根据权利要求34所述的PVL抗原，其选自由(a)包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的PVL抗原和(b)包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的PVL抗原组成的群组。40.—种PVL抗原，其相对于其野生型序列在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中包括突变，所述突变包括至少一个氨基酸取代、插入或缺失。41.根据权利要求40所述的PVL抗原，其中所述突变选自由以下各突变组成的群组(i)防止PVL与细胞膜结合的突变，(ii)防止跨膜域的主干或细胞质末端为LukS或LukF而展开的突变，(iii)阻断LukF-PV与LukS-PV装配的突变，(iv)阻断Ca+2通道活性的突变，(v)阻断PVL孔活性的突变，(vi)改变LukS-PV磷酸化位点的突变，(vii)破坏LukF-PV膜结合槽的突变，(viii)产生PVL抗原"氨基闩"N末端缺失的突变，和(ix)产生防止主千前部展开及插入所述膜中的半胱氨酸双突变体的突变。42.根据权利要求40所述的PVL抗原，其中所述PVL抗原包括LukF-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)E191A、(ii)R197A、(iii)W176A和(iv)Y179A组成的群组的突变。43.根据权利要求40所述的PVL抗原，其中所述PVL抗原包括LukS-PV亚单位，其包括至少一个选自由(i)T28F、(ii)T28N和(iii)T28D组成的群组的突变。44.根据权利要求40所述的PVL抗原，其选自由以下组成的群组(a)包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的PVL抗原；(b)包括LukS-PV亚单位且不包括'LukF-PV亚单位的PVL抗原；(c)包括突变型'LukF-PV亚单位和野生型LukS-PV亚单位的PVL抗原；(d)包括野生型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原；和(e)包括突变型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原。45.—种抗体，其与权利要求34或权利要求40的PVL抗原特异性结合。46.—种用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的个体投与权利要求17、22、25或31中任一权利要求的组合物。47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括投与选自由抗感染剂、抗生素和抗菌剂组成的群组的药剂。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗生素药剂选自由万古霉素(vancomycin),克林霉素(clindamycin)和溶葡萄球菌素(lysostaphin)组成的群组。49.根据权利要求46所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染选自由以下组成的群组社区获得性甲氧西林(methicillin)抗性金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)感染、皮肤或软组织感染、坏死性肺炎、乳腺炎、坏死性筋膜炎、沃-弗综合征(WaterhouseFriderichsenSyndrome)、CA-MRSA败血症和由表达PVL抗原的金黄色葡萄球菌菌株引起的感染。50.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括投与针对一种或一种以上其它细菌抗原的一种或一种以上抗体。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述一种或一种以上抗体选自由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(x-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白抗原的抗体组成的群组，所述金黄色葡萄球菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌组成的群组。52.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括投与一种或一种以上其它细菌抗原。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述一种或一种以上其它细菌抗原选自由5型金黄色葡萄球菌、8型金黄色葡萄球菌和336型金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、(x-毒素、脂磷壁酸(LTA)和微生物表面成分识别粘附基质分子(MSCRAMM)蛋白组成的群组。54.—种用于制造超免疫特异性IVIG制剂的方法，其包括(i)向个体投与PVL抗原，(ii)自所述个体采集血浆，以及(iii)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。55.根据权禾」要求54所述的方法，其中所述PVL抗原选自由以下组成的群组(a)包括LukF-PV亚单位且不包括LukS-PV亚单位的PVL抗原；(b)包括LukS-PV亚单位且不包括LukF-PV亚单位的PVL抗原；(c)包括突变型LukF-PV亚单位和野生型LukS-PV亚单位的PVL抗原；(d)包括野生型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原；(e)包括突变型LukF-PV亚单位和突变型LukS-PV亚单位的PVL抗原；和(f)与另一细菌抗原连结的PVL抗原。56.根据权利要求54所述的方法，其中所述PVL抗原相对于野生型序列在LukF-PV或LukS-PV氨基酸序列的至少一个中包括突变，所述突变包括至少一个氨基酸取代、插入或缺失。57.根据权利要求54所述的方法，其中所述PVL抗原包括选自由以下组成的群组的连结物(i)与LukS-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；(ii)与另一LukF-PV亚单位连结的LukF-PV亚单位；禾n(iii)与另一LukS-PV亚单位连结的LukS-PV亚单位。58.根据权利要求54所述的方法，其中所述PVL抗原与另一细菌抗原连结。59.根据权利要求54所述的方法，其进一步包括向所述个体投与另一细菌抗原。60.—种用于制造超免疫特异性IVIG制剂的方法，其包括(i)对未经投与PVL抗原的个体进行筛检以获得高滴度的抗PVL抗体，(ii)自所述个体采集血浆，以及(iii)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。61.—种组合物，其包括(i)静脉内免疫球蛋白(IVIG)组合物，其包括与金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原特异性结合的抗体，和(ii)医药学上可接受的载剂，其中所述IVIG组合物具有比普通IVIG中所发现的滴度高至少两倍的抗PVL抗体滴度。全文摘要本发明涉及用于治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus；S.aureus)感染的组合物和方法。具体来说，本发明提供包括Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)抗原的疫苗、与PVL抗原结合的抗体和含有其的组合物，制造这些组合物的方法和用于治疗金黄色葡萄球菌感染(包含那些社区获得性甲氧西林(methicillin)抗性感染)的方法。本发明还提供PVL抗体，包含对单一PVL亚单位具特异性的PVL抗体；和PVL抗原，包含经连结及经突变的PVL抗原。文档编号C07K16/12GK101218252SQ200680024681公开日2008年7月9日申请日期2006年6月13日优先权日2005年6月13日发明者金伯利·路易斯·泰勒,阿里·易卜拉欣·法托姆申请人:Nabi生物制药公司