肝脏疾病血清特异蛋白及其应用的制作方法

专利名称：肝脏疾病血清特异蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的肝脏疾病血清标志物一高尔基蛋白gp73，属于生物监 测技术领域。本发明还公开了血清高尔基蛋白gp73在诊断肝脏疾病上的用途， 提供了血清gp73的检测试剂盒。
背景技术：
肝脏是人体最大的器官，肝脏疾病也是发病率和死亡率最高的疾病。由于 肝脏具有很强的代偿能力，部分损伤往往无临床表现，导致肝脏疾病潜伏性强， 待有临床表现时，已经是肝病晚期，难以有效治疗。目前，能够在临床上开展 的肝功能试验种类繁多，但是每一种试验只能探查肝脏的某一方面的某一种功 能，到现在为止仍然没有能反映肝脏的大部分功能的指标，因而，往往引起漏 检。肝脏疾病可分为病毒性的和非病毒性的。肝炎病毒(Hepatitis Virus)是引起 肝脏疾病的主要病原体。目前发现的肝炎病毒包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和 戊肝等。非病毒性肝病是由于药物、毒品、酒精等引起的肝损伤。肝脏疾病的 发展过程一般包括急性肝炎、慢性肝炎、肝脏纤维化、肝硬化(肝腹水)、肝 癌等阶段。尽管不同的诱因可引起不同类型和程度的肝损伤，各类早期肝损伤后都会 引起肝部的炎症反应(急性肝炎)。炎症反应是人体试图修复肝损伤的反应， 如果在此阶段能够及时诊断和治疗，将可以防止肝病向肝癌发展。目前肝癌治疗最有效的手段是手术切除，但由于缺乏早期诊断手段，其治 疗的效果并不理想，65%的肝癌患者发现并确诊时，病情已经晚期，失去了根 治手术的时机，约80%的患者在诊断后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低， 这主要是因为目前尚缺乏有效的早期诊断手段。目前对于肝损伤的诊断主要依靠肝功能检测。临床应用较为广泛的肝功能 指标有①反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、 前白蛋白(PA)。②反映肝细胞有无受损及严重程度的指标谷丙转氨酶(AIJT)、 谷草转氨酶(AST)、腺苷脱氨酶(ADA)、胆碱酯酶(ChE)、乳酸脱氢酶(LDH)等。 ③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标总胆红素(TBIL)、直接胆红素 (DBIL)、总胆酸(TBA)、血氨(NH)。④对诊断胆汁淤积指示酶(包括同工酶)有 帮助的酶碱性磷酸酶(ALP)、 r.谷氨酸转肽酶(GGT)、 5-核苷酸酶(5-NT)。⑤反映肝脏间质成分增生(肝纤维化和肝硬化)的指标m型前胶原氨基端肽(PIIIP)、 m型原胶原(PCIII)、 IV型胶原c端原肽(CIV/PC);层黏蛋白(LN);透 明质酸(HA)。⑥对肝肿瘤诊断有意义的血清标志物甲胎蛋白(AFP)。然而现行的种种肝功能试验，只能反映肝功能的一个侧面，并不能反映肝 功能改变的全貌，到目前为止，仍缺乏令人满意的有效诊断肝脏疾病的早期检 测手段。因此，本领域迫切需要开发一种新的有效检测肝脏异常的方法。gp73是主要定位在高尔基体上一种蛋白质，是一个II型跨膜蛋白，具有5 个糖基化位点，分子量约45KD，糖基化后约为73KD，该蛋白基因序列保守， 从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白，功能相当保守，在正常人肝脏组织表达量 很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却大量表达。国外的相关研究认为，gp73在 肝癌患者体内表达量会很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝损伤患者与健康人的 gp73含量比较低。他们利用免疫印迹的检测方法，该方法操作繁琐，灵敏度和 特异性都没有酶联免疫法高。而在我们的研究中显示，病毒性肝炎，肝硬化和肝 损伤患者的gp73含量也明显高于正常人，因此提出将gp73作为肝脏异常的标志 物。并且我们还建立了一种快速、灵敏的检测方法。发明内容木发明有两个目的， 一是提供一种新的肝脏疾病血清标志物，二是提供一种 有效的肝脏疾病诊断试剂盒。在本发明的第一方面，提供了一种肝脏疾病血清标志物，它具有以下特征(a) 该蛋白主要定位在高尔基体上。(b) 是一个II型跨膜蛋白，具有5个糖基化位点，分于量约45KD，糖基化 后约为73KD。(c) 该蛋白基因序列保守，从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白，功能相当 保守。(d) 在正常人肝脏组织表达量很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却大量表达。 在本发明的第二方面，提供了一种检测血清样品中是否存在本发明肝脏疾病标志物gp73的方法，包括以下步骤(a) 构建gp73重组质粒，原核表达并纯化。(b) 用该蛋白免疫小鼠和兔子，制备gp73的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。(c) 建立免疫学检测方法。(d) 收集健康人和有肝脏疾病患者的血清样品，检测血清中gp73的含量。(e) 利用原核表达的gp73作为标准品，建立检测的标准曲线，确定血清中 gp73含量。在本发明的第三方面，提供了一种检测肝脏疾病血清标志物gp73的酶联 免疫检测试剂盒。本发明提出将gp73作为肝脏疾病的早期诊断标志物。主要包括以下几部分 内容本发明提出的gp73蛋白包括gp73全蛋白、蛋白片段、蛋白衍生物、蛋白类 似物、多肽和单个的主要抗原决定簇。gp73蛋白的核苷酸全长序列或其片段通 常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得，尤其是开放阅读框序列 来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次 或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量地扩增获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主 细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其 是片段长度较短时，通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列 很长的片段。获得gp73重组蛋白的宿主细胞可以是原核生物的，也可以是真核 生物(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)。用重组DNA转5化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，表达该蛋白的基因所编码的多肽。根据 所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规的培养基。在适于宿主细 胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法 (如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞 外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不 限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超 离、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其他各种液相层析 技术及这些方法的结合。木发明还包括gp73的特异性多克隆抗体和单克隆抗体。尤其是单克隆抗体， 这里，"特异性"是指抗体能与gp73蛋白或片段特异性结合，而不识别或结合于 其他非相关抗原分子。木发明的抗体可以通过本领域内技术人员己知的各种技术 进行制备。木发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗 体片段，如Fab，或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv 分子；或嵌合抗体。利用ELISA、免疫荧光和western blot方法，来鉴定所制备的gp73抗体。 发现有HBV感染的肝癌细胞(HuT)培养上清中的gp73含量高于普通的肝癌细 胞(Huh7)，另外可以看到Hut的细胞膜上定位了大量的gp73。gp73特异性抗体可用于免疫组织化学技术中，检测血清标本中的gp73含量。 一种检测样品中是否存在gp73的方法是利用gp73的特异性抗体进行检测，它包 括酶联免疫吸附试验，荧光免疫试验，免疫印迹试验或胶体金试纸条等方法。 这些方法可以通过本领域内的技术人员已知的各种技术进行。本发明根据所制备的抗体特点，建立了酶联免疫检测gp73含量的方法，它 包括了以下步骤(1) 血清样品的前处理采得的新鲜血样品，在室温凝集后，放置4。Clh，离心分离血清，然后用样品稀释液稀释。(2) 检测方法a. 向包被有单克隆抗体的酶标板中加入处理好的血清样品，温育后洗涤拍下，加入酶标记的抗体，温育洗板后显色，终止，用酶标仪测定光吸收值。b. 向包被有单克隆抗体的酶标板中加入处理好的血清样品，温育后洗涤拍T， 加入兔多克隆抗体，温育洗板后加入酶标记的羊抗兔IgG，温育洗涤后显色， 终止，用酶标仪测定光吸收值。(3) 分析检测结果以已知的标准抗原浓度为横坐标，以不同标准抗原的光吸收值为纵坐标，制 作标准曲线，然后将血清样品的结果与标准曲线作比较，计算出血清样品中的抗原含量。木发明还提供了一种检测gp73含量的试剂盒，它包括以下组分-(1) 包被有gp73单克隆抗体的酶标板；(2) 酶标记的兔抗gp73抗体；(3) Gp73标准品溶液；(4) 底物显色液和终止液；(5) 浓縮洗涤液。该试剂盒在肝脏疾病早期血清学诊断上的用途，包括将双抗体夹心ELISA 显色反应的结果中标准可溶性gp73抗原的光吸收值与标准抗原的己知浓度作 图，得到一条标准曲线，将正常人血清反应的光吸收值加两倍标准方差与此标准 曲线比较，找到该值所对应的gp73抗原浓度，设定为阈值，将待测人血清反应 的光吸收值与标准曲线比较，计算出血清中的gp73浓度，大于该阈值的则诊断 为肝脏异常。


图l为gp73结构简图。图2为来源于不同种属动物的gp73的比较。其中2.A为"保守区一I"，2.B为"保守区一n"，加框区为高度保守区。图3为gp73的表达纯化与抗体鉴定。(A)用pTricHisA(Invitrogen)表达载体构建 表达质粒，在大肠杆菌(TOP10)中表达。SDS-PAGE、 brandford染色鉴定。 (B) western blot检测单克隆抗体对gp73的特异性。图4为对比研究有丙肝病毒复制的肝癌细胞(HuT)和肝癌细胞(Huh7)中gp73蛋白 的表达情况。利用含有HCV复制于的HuT细胞模型，研究gp73的表达与病 毒复制和相互作用的关系。实验发现在该细胞系中，高尔基体膜蛋白gp73会大量表达，证明该细胞系是一个可靠的研究平台。图5为ELISA检测gp73含量的标准曲线。.用原核表达的gp73作为标准品， 建立gp73检测的标准曲线。图6为临床血清样品的检测结果以及对该检测方法的评估。我们收集数百份临 床血清样本，包括正常人、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌。对其分析后发现， 在多种肝病患者的血清中，gp73的含量明显高于正常人。(A)检测临床病 人中gp73的抗体，观察到乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝病患者， 血清中gp73含量均高于正常人群(P0.0001)。 (B)血清gp73作为肝癌诊断 标志物的ROC曲线，该曲线下的面积为0.729。 (C)血清gp73作为肝病诊断 标志物的ROC曲线，曲线下的面积为0.95，表明该诊断方法具有非常好 (excellent)灵敏度和特异性。
具体实施例方式本发明经过广泛而深入的研究，首次将血清高尔基蛋白gp73作为肝脏疾病 的标志物，并利用分于生物学和免疫学技术，重组表达了 gp73，并制备了相应 的单克隆抗体和多克隆抗体，完成了本发明。由于血清具有取材方便、无创伤性 并可连续监测的优点，建立的免1S学检测方法特异性强、灵敏度高、快速方便， 将肝脏疾病的诊断提高到了一个新的水平，从而提高肝脏疾病的诊断准确率和治 愈率，降低肝病患者的死亡率。木发明制备的gp73蛋白，是根据公开的有关核苷酸序列，利用常规方法扩增出特异性的基因片断，并将其克隆入载体，再转入真核细胞或者原核细胞(细 菌，酵母、高等植物、昆虫、哺乳动物细胞)进行表达，然后纯化，作为免疫原， 该免疫原也可以是重组多肽，合成多肽。根据重组方案所用的宿主，本发明的多 肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的，本发明的蛋白还可包括gp73的片段、 衍生物和类似物。本发明关于制备gp73特异性多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体， 这里，"特异性"是指抗体能结合于gp73蛋白或者片段，本发明的抗体可以通过 本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，本发明不仅包括完整的多克隆或单 克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重 链，抗体轻链，遗传工程改造的单链Fv分子，或嵌合抗体。木发明还提供了一种检测gp73的试剂盒，它含有gp73蛋白，gp73的特异 性单克隆抗体和酶标记的gp73多克隆抗体。该试剂盒使用方便、快速，灵敏度 和特异性都比较高。下面结合具体实施例，进一步阐述木发明，应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中并未注明具体条件的实验方 法，通常都是按照常规的条件进行的。实施例l gp73重组蛋白的制备(1) 将gp73cDNA序列克隆至表达载体上引物设计正反义引物两端分别加上BamHI和Hind III酶切位点，引物序 列如下5 ，-CATAGGGATCCCTCCAGACACGGATCATGGAGCTGGAAGGC-3' 5 ，-GAGAGAAGCTTTC AGAGTGTATGATTCCGCTTTTC ACGCTG-3'.以mRNA为模板逆转录扩增得到gp73cDNA序列。 表达载体pTrichis A (该载体BamH I酶切位点上游有6Xhis标签) 分别用BamH I和Hind III将载体和目的片段进行双酶切，酶切产物经T4 连接酶连接，转化至TOP10感受态(购自TAKARA公司，转化步骤根据该感受 态说明书操作)，氨苄平板37t:过夜培养，挑取单克隆，经菌落PCR鉴定，得到 的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，确认gp73cDNA序列成功插入 了表达载体上。(2) 表达37。C摇菌过夜，测定00600=0.6， 37'C条件下，用lmmol/L的IPTG 诱导6小时后，收集细菌沉淀进行裂解，收集上清。(3) 纯化利用蛋白N端的6Xhis标签，用镍亲和柱纯化。 实施例2gp73抗体的制备 (1) gp73单克隆抗体制备的步骤为动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫剂量是50-100ug/mL, 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔2周后 取相同量的免疫原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，间隔10天后，直接用抗原免 疫，间隔一周后，脾脏或尾静脉加强免疫一次，3天后取脾细胞。细胞融合与克隆化取免疫小鼠的脾细胞，按照5-10: l比例与SP2/0骨髓 瘤细胞融合，采用间接ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，并利用westblot 对抗体进行鉴定，利用有限稀释法进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的 杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1~5X106 个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立 即放入37'C水浴锅中速溶，离心除去冻存液后，移入培养皿内培养。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)，腹 腔注射降脂烷0.5mL/只，10天后腹腔注射杂交瘤细胞1~5乂106个/只，待小鼠腹 腔胀满后采集腹水，用辛酸-硫酸铵法、分子筛和亲和层析法进行纯化，然后加 入等量的抗体保护液，分装后，-2(TC保存。 (2) gp73多克隆抗体的制备的步骤为采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原的剂量为lmg/只，首免时将免疫 原与等量的完全弗氏佐剂乳化，颈背部皮下多点注射，间隔3周后，取相同剂量 的免疫原与等量的弗氏不完全佐剂乳化后，颈背部皮下多点注射，然后每个10 天，直接用免疫原加强免疫两次，在最后一次免疫的7天后心脏采血，分离血清， 用辛酸硫酸铵法、分子筛和亲和层析法纯化，后加入抗体保护剂，分装-2(TC保存。实施例3gp73检测试剂盒的组建组建gp73酶联免疫检测试剂盒，使其包含以下组分(1) 包被有gp73单克隆抗体的酶标板；(2) 酶标记的兔抗gp73抗体；(3) 即73标准品溶液；(4) 底物显色液和终止液；(5) 浓縮洗涤液。木发明所述试剂盒中包被有gp73单克隆抗体的酶标板的制备步骤为(1 )用包被缓冲液将gp73单克隆抗体稀释成lug/mL;(2) 向96孔酶标板的每孔中加入100yl已经稀释好的单克隆抗体，密封后4 度放置18h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3遍，拍干；(3) 向96孔酶标板的每孔中加入封闭液200iil， 37'C温育2h，倾去孔内液体， 洗涤排干后密封保存。以上方法制备的酶标板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶标板的 相关技术参数均在正常范围，且包被的抗体具有很好的特异性。木发明所述试剂盒中酶标记抗体的制备方法步骤为将抗体用辛酸硫酸铵纯 化定量后，与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良过的过碘酸 钠法。本发明所述试剂盒中的酶标记多克隆抗体，标记酶可为辣根过氧化物酶或者 碱性磷酸酯酶；酶标记物所用的稀释液中含有50%甘油、惰性蛋白和防腐剂，这 样可防止其在-20。C环境中冻结，长期保持酶标记物的生物活性。木发明所述试剂盒中的底物显色液为TMB-H202混合显色剂，该显色剂是由 TMB， H202和一些稳定剂组成，该显色剂稳定，保存期长。实施例4 临床血清样品的检测方法本发明所述的血清gp73的检测方法，包括了以下步骤 (1)血清样品的前处理采得的新鲜血样品，在室温凝集后，放置4。C， lh，离心分离血清，然后用 样品稀释液稀释。(2) 检测方法a. 向包被有单克隆抗体的酶标板中加入处理好的血清样品，温育后洗涤拍-T-，加入酶标记的兔多克隆抗体，温育洗板后显色，终止，用酶标仪测定光吸收值。b. 向包被有单克隆抗体的酶标板中加入处理好的血清样品，温育后洗涤拍T， 加入兔多克隆抗体，温育洗板后加入酶标记的羊抗兔IgG，温育洗涤后显色， 终止，用酶标仪测定光吸收值。(3) 分析检测结果以已知的标准抗原浓度为横坐标，以不同标准抗原的光吸收值为纵坐标，制 作标准曲线，然后将血清样品的结果与标准曲线作比较，计算出血清样品中的抗原含量。本发明所述的检测试剂盒在肝脏疾病早期血清学诊断上的用途，包括将双抗体夹心ELISA显色反应的结果中标准可溶性gp73抗原的光吸收值与标准抗原的 已知浓度作图，得到一条标准曲线，将正常人血清反应的光吸收值加两倍标准方 差与此标准曲线比较，找到该值所对应的gp73抗原浓度，设定为阈值，将待测 人血清反应的光吸收值与标准曲线比较，计算出血清中的gp73浓度，大于该阈 值的则诊断为肝脏异常。序列表肝脏疾病血清特异蛋白及其应ni<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院 <120>肝脏疾病血清特异蛋A及其应用 <130><160> 2〈170> Patentln version 3. 4<210> <211〉 <212〉 <213>13047 DNANM 177937<400> 1cacccgaagg cgtccgggaa tcttcacttt ttccgttgct agcagtggaa gggtcacaga 60ccaaacacta aggcctgagc ggtgacaacc gaggcgagat gatggtcaac agggaatgcc 120tcgtgggaga aaaaagacaa ttttattctc agcgctgatt ttgagatgat gggcttggga 180aacgggcgtc gcagcatgaa gtcgccgccc ctcgtgctgg ccgccctggt ggcctgcatc 240atcgtcttgg gcttcaacta ctggattgcg agctcccgga gcgtggacct ccagacacgg 300atcatggagc tggaaggcag ggtccgc鄉gcggctgcag agagaggcgc cgtggagctg 360aagetagaacg agttccaggg卿gctggag aagcagcggg agcagcttga caaaatccag 420tccagccaca ac"ccagct ggagagcgtc aacaagctgt accaggacga aaaggcggtt 480ttggtgaata acatcaccac aggtgagagg ctcatccgag tgctgcaaga ccagttaaag 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Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu 15 10 15Val Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys lie lie Val Leu Gly Phe Asn Tyr 20 25 30Trp lie Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gin Thr Arg lie Met Glu 35 40 45Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu 50 55 60Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gin Gly Glu Leu Glu Lys Gin Arg Glu Gin 65 70 75 80Leu Asp Lys lie Gin Ser Ser His Asn Phe Gin Leu Glu Ser Val Asn85 90 95Lys Leu Tyr Gin Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn lie Thr Thr100 105 110Gly Glu Arg Leu lie Arg Val Leu Gin Asp Gin Leu Lys Thr Leu Gin 115 120 125Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gin Gin Asp Val Leu Gin Phe Gin Lys Asn 130 135 140Gin Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gin Cys lie 145 150 155 160Asn Gin Met Lys Glu Val Lys Glu Gin Cys Glu Glu Arg lie Glu Glu 165 170 175Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu 180 185 190Asn Asn Asp Gin Arg Gin Gin Leu Gin Ala Leu Ser Glu Pro Gin Pro 195 200 205Arg Leu Gin Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gin Gly Lys 210 215 220Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gin Thr Pro Ala Pro Ser Ser 225 230 235 240Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gin Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn 245 250 255Glu lie Gin Val Val Asn Glu Glu Pro Gin Arg Asp Arg Leu Pro Gin 260 265 270■Glu Pro Gly Arg Glu Gin Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg 275 280 285Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gin Thr Pro Gin Val Gin Ala 290 295 300Ala Leu Ser Val Ser Gin Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg 305 310 315 320Asp Gin Leu Val lie Pro Asp Gly Gin Glu Glu Glu Gin Glu Ala Ala 325 330 335Gly Glu Gly Arg Asn Gin Gin Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn 340 345 350Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gin Ala Ala Leu 355 360 365Ala Gly Asn Asp Arg Asn lie Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gin Lys 370 375 380Arg Asp Thr lie Asn Leu Leu Asp Gin Arg Glu Lys Arg Asn His Thr 385 390 395 400Leu
权利要求
1.一种肝脏疾病标志物血清蛋白gp73，其特征在于它具有如序列表sequence 1的核苷酸序列及sequence 2的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述肝脏疾病标志物血清蛋白gp73，其特征在于 它具有以下特征(a) 该蛋白主要定位在高尔基体上；(b) 是一个II型跨膜蛋白，具有5个糖基化位点，分子量约45KD， 糖基化后约为73KD;(c) 该蛋白基因序列保守，从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白， 功能相当保守；(d) 在正常人肝脏组织表达量很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却 大量表达。
3. —种肝脏疾病血清特异蛋白gp73的检测方法，其特征在于它包括 以下步骤(a) 构建gp73重组质粒，原核表达并纯化；(b) 用该蛋白免疫小鼠和兔子，制备抗gp73的特异性单克隆抗体或 多克隆抗体；(c) 建立免疫学检测方法；(d) 收集健康人和有肝脏疾病患者的血清样品，检测血清中gp73 的含量。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在歩骤(b)中的gp73特异性单克隆或多克隆抗体，不仅识别原核表达的gp73，而且还特异性识别真核细胞中的gP73或者是识别gp73多肽片段。
5. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，用原核表达纯化的 gp73作为标准对照，建立标准曲线，定量血清中的gp73含量，根 据标准曲线，将正常人的检测平均值加上两倍标准方差定为阈值， 将检测的病人血清gp73含量与正常人的血清gp73含量进行对比， 高于该阈值的将诊断为肝脏异常。
6. —种肝脏疾病血清特异蛋白gp73的检测试剂盒，其特征在于它包 括(a) 包被有gp73特异性单克隆抗体的酶标板；(b) 抗gp73的特异性多克隆抗体或者是酶标记的抗gp73的多克 隆抗体；(c) 酶标记羊抗兔IgG的抗体；(d) gp73的标准品溶液；(e) 底物显色液和终止液；(f) 浓縮洗涤液。
7. 肝脏疾病血清特异蛋白gp73在制备病毒性肝炎、肝硬化、肝损伤 诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的肝脏疾病血清标志物——高尔基蛋白gp73，属于生物监测技术领域。本发明还公开了血清高尔基蛋白gp73在诊断肝脏疾病上的用途，提供了血清gp73的检测试剂盒。
文档编号C07K14/765GK101328214SQ20071002869
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者古艳丽, 涛 彭 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院