合成胸腺素的方法

专利名称：：合成胸腺素的方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学化学领域。具体地，本发明涉及借助于固相肽合成以高产率和纯度化学合成胸腺素的新方法。该方法基于在胸腺素序列的关键位置处引入假脯氨酸(pseudopro1ine)衍生物。假脯氨酸噍唑烷环在肽序列的延长期间防止锚接到树脂的生长的肽链的结构化(structuring)、防止肽基树脂的聚集和合成失败。
背景技术：
：胸腺素为具有重要生理功能的在生化和功能上不同的多肽家族。它们在1966年首次描述并最初在胸腺中分离，随后其在几种组织和细胞中鉴另U出[6^/d"e//2,丄厶，57"er,F./,粉〃e，丄，户reparaf2.0/a/zdpart/a/pi/r//7cat/o"o/"sf力/迈/c///z7/j力oc7fo;702'et/c/"actor，尸roc.vVaf/.5"c/.^S^_/夕<5"<5",G入J,-7赠。存在执行不同功能的不同胸腺素家族，例如，具有核定位并涉及DNA复制和/或转录的a-胸腺素，和位于细胞质并在涉及细胞运动的过程中显示对G-肌动蛋白的强烈亲和力的p-胸腺素。a-和P-胸腺素在调节免疫应答、血管生物学和癌发病机制中起重要作用，除了其作为分子标记而在诊断上的应用之外，还具有极大的治疗潜力[^/""/力properf/es//7Zea7f力fl/7dcf/sease，^J7erfOp/","/o人r力era;/,4(V人，-j7i]。a-胸腺素亚家族由胸腺旁腺素(parathymosin)a、前胸腺素a、胸腺素al和胸腺素all形成。最重要的胸腺素为最初从胸腺组织中分离的胸腺素al或胸腺法新(thymalfasin)，其为具有28个氨基酸的肽，4在N-末端位置酰化以及在其C-末端具有酸性基团，并且衍生自具有lll个氨基酸的前胸腺素ocl前体。由于其免疫调节性质，胸腺素al已经用于治疗免疫系统受影响的疾病，主要针对乙型、丙型肝炎和肝癌。慢性乙型肝炎为涉及免疫系统障碍的疾病，并且承担遭受硬化和肝细胞癌的高风险。胸腺素al充当免疫系统调节剂，其在几种动物和人类模型中激活NK细胞的产生，并且在患有慢性乙型肝炎和癌症的患者中增加CD3、CD4和CD8细胞的产生。其还激活Thl细胞因子的产生，所述Thl细胞因子涉及强的抗病毒免疫应答。许多体外细胞模型支持胸腺素al的治疗潜力。用胸腺素al治疗在原代细胞培养中降低HIV-l和副流感病毒复制A，ra/3A力e/afoc7,es/7ers/5^e/^///;3尸ecfei/y/f力c^/cir//7y/tro,力epat27/^7i^7,'"a『a/,'户a/s/zara,丄Awe,5^f/z/,尸.,o/*2./^rflce//u7<3rredox""e，,//^er/7<s"o/2s7i",;erf尸or"迈其进一步降低氧化胁迫，增加细胞内谷胱甘肽的水平，所述谷胱甘肽在HIV患者中的低浓度与低的存活率相关vVa;oh7s;30,C.,#<3"//o,丄,7%"0"'/fl7;7力a-Jregi/7"es柳Cc/ass//迈迈w20AM^,M，77》-7《。。胸腺素al增加MHCl类表达水平，保持免疫系统的能力以对传染原应答[^erze/26ei^,Z.丄/"eWosa,2'/z//a2're(/swry/ys///7^ZTcf/sease,户roc.yv2f/.Jcfld.Sci.，7,夕《房7-W力。在动物感染模型中，胸腺素al的治疗潜力已经在用几种病原体(单增李斯特菌(Listeriamonocitogenes)、白色念珠菌(Candida5albicans)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens))感染的小鼠中和在用5-氟尿嗜咬免疫抑制的小鼠中显示[i^力/"wira,〃/ttzzef/a,f.iVair緒wra，/.rag厶f.7《7"-JJ。]。因此，在用慢性乙型肝炎(土拨鼠肝炎病毒)的动物模型研究中，其中动物遵循用胸腺素al的治疗，血清病毒浓度降低了99%[Ger//2,/.L,^ar&,尸./.,re"/7a刀。及C.,j/7re/2'迈2'/2ar/reportofaco/7fr(//ecfsfi/tf/0/t力/yz7051//2a/p力a7///f力efroc^cAwci/z7ode/力e/a力an'rws//2/ecf/0/LA7ocAT.,/i3/7oraf/ozs//<3/7f/「/ra/deFe/o/7/z7e/7fa/^f力et/efecf/o/7"2，7"-W々Tei7/3a/^，及i^r&,及A,5a/f/^/"Coc^farcr,Z.丄,^oi76wci^e尸./.，7>e<2^T7e/fc力ro/2/'c^oc^c力i/c上力e;7a〃〃sK/rws//2,ec〃oz2t力jraos//2a/p力a—J(T^J人^"V/ra/紋M所述治疗降低了由肝细胞癌引起的死亡的风险。胸腺素al还增加了被单纯疱疹病毒、流感病毒或白色念珠菌(Candidaalbican)感染的成人或免疫抑制的动物的存活[i"/YVos,j.及，Css//7as，丄，^W/"orcT，兄厶，77ee/Tec/1ofy迈迈y/7o/o^ra/i///j尸e"/owscrease.Fb/7.Forir，F'.'船/y厶,"o/7迈assar,Carac/,f./"creaseo尸迈ouseres/sfa/2cefoa76/ca/751///ect/ofl6/^A/hos//7//2/ec仁/迈/z7w/7.M,M夕一"勺。在丙型肝炎的治疗中胸腺素al与其它细胞因子的协同效应已经在用胸腺素al、干扰素IFNa/p和抗病毒剂金刚烷胺的组合治疗被曱型流感病毒感染的小鼠的试验中显示。三种化合物的组合充分地提高了存'活百分比["，Jg0Sf//3/C.,户a/a/z^ra，J.71,Fap^///,C.f/77cac76/.//ZMw20/力ar/zaco/.7夕夕《J《夕5—J。2]。在具有乙型肝炎病毒突变体的难以治疗的患者中比较地研究用胸腺素al或干扰素IFNa-2b治疗的效果的研究显示，用胸腺素al消除病毒几乎是两倍的疗效。与IFNa-2b相反，在免疫抑制人群中胸腺素al更好地耐药并且此外不呈现显著的副反应U"ilreo/7e,户.，Ci/"sr。c/ro/7/'c力epa〃〃s》，^epsfo/og/，2《774—77，。虽然在治疗期间干扰素引起快速应答，抗性病毒菌林引起患者的复发，胸腺素al具有更多的涉及长期改善免疫系统的延时效应["raci，五.，^./a"ese，C.，S.，Jra/7c^/z7/zedco/7fro"ed"uc^f尸orf力e//2^2.y/dzya/sfr/f力coj;/^s6et^ee/22〃。a/7ffce7/s/ra迈:在动物癌模型中，a-胸腺素已经在预防以下方面证明了其疗效Co/c^fe//z,丄丄.,^A/迈os//7a/;/a7c力e迈o;re卩e/^/Fe尸or7u力g乳腺癌、在大鼠中作为刺激免疫系统的结果降低癌症发生的发病率尸e;〃(/ei,WG入7^2-7W<]和成胶质细胞瘤[昔W/s/fl/7cr肠/7""卿，"-M-"。习。干扰素IFNa-2b、胸腺素al和环磷酰胺的组合治疗已经给出了良好的结果，降低了小鼠中黑素瘤的大小[尸2'",尸rasc力e〃2',,#a"ei/cc/,C.,77/^/7/,C.,Was/，C,^'g力dosesoff力/迈os/za/p力aJe/2力a/cef力es/^/—fwnare/77cac/co/ff62'/7af/anc力e迈o—2'迈/z7i/i7c^力era///zwr//7e胸腺素al以及在白色念珠菌感染中与其一样有效的肽，des-(25-28)-胸腺素al和胸腺素all，已经从胸腺素片段5制备中分离，Ve/历er，f.户.，i^/r//7，&及，i^orecie了，及厶，^〃.5W.咖，M，"W-,。胸腺素的第二亚家族为|3-胸腺素，其形成在其肽序列中具有高度同源性的蛋白质家族(胸腺素(3-4，p-8，p-9，p-10，P-11，(3-15)(参见表l)。表l示出胸腺素序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>胸腺素P4包含43个氨基酸并且在对应心脏发育的胚胎发育阶段中表达。用动物在临床前研究中获得的这一发现，已经强调了胸腺素(34对治疗遭受心肌梗塞的患者的潜力。在用诱导心脏病发作的小鼠的临床前研究中，用胸腺素P4蛋白的治疗引起内皮细胞的分化并且刺激心肌细胞的迁移，改进上述细胞的能力[^cir-lai^ue〃e,/.,5^,ei3s,丄,W力/te,Z.，"/#a/o，/.，5r/Fasfs7a,,f力/迈os//7忠/^ra〃o/,swrF/ra/a刀(/card/screpa/r,Aaf"re,20^/,4J义胸腺素P4进一步调节一系列炎症趋化因子和细胞因子，其控制肌动蛋白的功能，与其结合，并且诱导产生层粘连蛋白-5，一种对于某些种类的哺乳动物细胞的正确粘连所必需的蛋白质并且在伤口愈合过程中为重要组分，从而促进上皮再生和诱导胶原沉积[^y^，T7y/Z7c^//26efa4//^erscf/o/7&K/ta瓜^anz/.2^^J,6(5"，2夕7—三/<5]。胸腺素P4的其它可能治疗应用包括通过激活毛嚢干细胞增加头发生长[，/y/^/^fJ77J爿义J/ef力oc^co/z^os/f/'o/51尸^rf力e还用于治疗几种类型的慢性皮肤病适应症，例如慢性静脉瘀血性溃疡(chronicvenousstasisulcers)、慢性压力性溃疡、大疱性表皮松解症、一组特征在于形成应答于机械性创伤的水疱的遗传性疾病和治疗角膜损伤。胸腺素P4的LKKTETQ片段(肌动蛋白结合结构域)促进治疗成体动物的皮肤创伤[尸力i/p".，So/^"o，尺/胸腺素P15为在前列腺癌中过量表达的具有44个氨基酸的肽，其中其有助于前列腺外部的肿瘤扩散。正将该肽开发以作为用于诊断上述癌症、用于鉴别良性和恶性前列腺肿瘤和用于适当地治疗它们的生物才示i己[iyi/fc力2'/7s0/2,厶.#,C力a/2g,f.Z.,5eci:er,C.,^A/j^/za,Se力o/n.cl，从，5T/力，脱C.,"elf^7/,KC.，Gasfo/，5*.M,Ze"e^10/7r0sfflfeca/7cer,^/oc力e瓜20^5",J《(^V,JJ《一J7J]。对于其在伤口再生和愈合上的用途，胸腺素(315也已经被授予专利，并且在不久的将来预示可将其用于此[爭WC^7i7夕J",r力/zz/c力o/7Z7o/eC力"，,]。胸腺素P10由43个氨基酸形成，并且在作为结肠腺癌的胚胎和肺瘤细胞中过量表达[Kas27e,f.,7b/z7〃a,f.，5rora,Z.尸.，/oc力er，ear///Jas^ages/7dse/esce/^7asciz/are;2tfc^Ae//wff/</Z7c^i/7ate^a"/7e"/""力e信"e薦/^W,/.,，W,阔。胸腺素P10与胸腺素(34有极大的同源性，这是因为它们二者都结合到肌动蛋白并且抑制其聚合[fi/,尸.J.,"/2,51.C.,Mrr"o/3-^^ora《，4are60acf2'"/zo/70/z7erse《ues^er2./7gprofe//2S，/.S2'0/.C力e瓜,"W，M《G人JM-J^J。最近的结果涉及胸腺素I310至肌动蛋白的结合，并且，在卵巢癌中的细胞凋亡过程的激活正在证明胸腺素pio及其衍生物的在用于治疗卵巢癌的新治疗方法中潜力W力o,&及，丄ee,C力w3,r.,Zee,S—A,户arir,f.，丄ee，,r力e/dei7f//7caf/.o/7o尸a/70/^05"/s—re/sfedres2.dwes//力"/hs/7f//迈os//7"2'0厶C力e迈.，2《。广W人JMOWM，。目前没有具有治疗潜力的P-胸腺素已经到达临床期，虽然用于治疗患者的胸腺素(34和胸腺素I315将很快提交FDA以将其用于临床1期的应用，所述患者在受损组织的再生中遭受心肌梗塞。在不同的P-胸腺素(参见表1)中，胸腺素P4、胸腺素j39和-胸腺素P10在哺乳动物中发现，与此相反，胸腺素P^n已经在两栖动物(爪蟾(Xenopus))中鉴别出["e"er，K,h"er，r.,"a/3力a/^e7,f.，Ac/wer，iS^/7f力es/so/*^thc^/;3//ejIa/j^/7sco/z7par/、on『j7力f力e/2<3fwra/fr/tefraco/7/7e;^/de,/.尸/vsir"C力e瓜,7夕夕夕,W-J/]，并且pil和pi2在鳟鱼(虹鳟鱼(Salmogairdneri))中鉴别出[/7s/oi/i/7^尸.尸.，Co/es，及，7^/^S2'70/3/,0.,5"c力/7/《及，#o^e〃,5*.，上7ire/,A,Koe"er,K,j7ar/^,丄A,r力eco迈p7"esegwe/7ceso/*froi/t(^<37/Z70^3/rctoer2V"Ua/d力o历o/ogi/ef力/yffc^//7y^义"/oc力e瓜/.,J夕夕^2《J,J《J"一J《巧。胸腺素(38包含39个氨基酸并且与胸腺素P4有高度的同源性(79%)。胸腺素J39具有41个氨基酸并且与胸腺素P9的不同在于在C末端区域的额外的二肽，与胸腺素|34有82%的同源性。具有42个氨基酸的胸腺素pil与胸腺素(34有78。/。的同源性。具有43个氨基酸的胸腺素(312与胸腺素|34有79%同源，与胸腺素|311有84%同源(参见表l)。第一个获得专利权的胸腺素合成方法是为了获得胸腺素ocl。该方法提出了在具有十五个(15)和十三个氨基酸(13)的两个片段的溶液中的片段缩合(convergentsynthesis),所述两个片段之前已经用Boc/Bzl策略以固相合成[爭^i^5^^《7《《，5^刀"es/51o尸M/zzzos//a/;力a7,^oZT脂/mLs/oc力e,7夕7巧。该方法随后以在其中使用七(7)个片段的溶液中执行的策略实施。[昔^/"WJ""《//^er迈e力'Wes在这些之前所述的方法中，用于以固相合成片段的策略为Boc/Bzl。还使用的另一选择为使用临时性N-末端位置保护基团，即所谓的Ddz[A^w/e",^e/"ze/,r.,S/rr，C.,ZWz,s力/g力/y同样已经公开的另一方法为在MBHA树脂上根据Boc/Bz1线性固相策略完成合成胸腺素al，同时使用HBr以及随后的三曱基溴硅烷12(bromotrimethylsUane)以从树脂裂解肽[/^/^,&，ra/^,及&A,//2"/.户ej^.W("X人〃ug力e^/.厶，WW人77"-777<5]。此外，对于在之前以固相获得的片段的溶液中的片段缩合，还存在另一专利方法，其使用临时性Moz保护代替Boc保护，提高了终产品的产率和纯度[爭^/断《J"化5W/cTp力,，c/^r然而，目前使用正交Fmoc/tBu策略的方法为最普遍接受的方法，这是因为使用TFA的工作步骤的消除，所述使用TFA的工作步骤用于消除临时性N末端保护基团和HF以从树脂裂解肽的。用该Fmoc/tBu策略，提出的用于合成胸腺素al的方法包括使用受保护的侧链和在具有DCC/H0BT的两种片段(1-10)和(11-28)的溶液中偶联，在最后4步的产率为30。/。[尸e//1,^e2./z/er，五.户.，^s/^,C.77.,"/p6ros，77./.,ferf—6i/0^sidec力a//3fee/"f./.尸ep夂尸rof.Aes.,7夕《i","入"卜7^]。之前所述的偶联步骤已经最优化，直至在TFE中获得44%的产率。虽然在CHCl3中的偶联产率为49。/。，在后者中获得的粗产品的纯度较差[尸e//^,ra/g,CT:,Za/^roAZ/.,s/z^Aes/V0/^//z70s//7尸ep".'57ri/cLFw2c",爿迈.尸e/L5^迈;.，W力，"《i]。使用Fmoc/tBu保护的逐步的线性固相策略还已经描述了使用对节氧羰基树脂[&力/er，尺，"e"er，K,已经描述了两种线性策略以用于以固相获得胸腺素(34:Boc/Bzl策略[ZorZ厶r.,^/7a&&,Co/f^fe//7,丄厶，5"o7/f/—/7力ases//7^es/so尸^/zz7c^//2々《'c力e迈/ca/a/7d6io7ogica/",7"-7州和Fmoc/tBu策略[Z/細，C.,",/叫A,Zeo油.acT2、Z.,fe^o/er/gc^,，i7力ai:/^/c^,".，f7a/2ge/"c^，61尸.,户e;7L5W,夕(7人4"-W巧。在后一策略中，使用不稳定的氯-三苯甲基型树脂，以30%的产率获得胸腺素|34,其优于用Boc/Bzl策略(5-12°/。)获得的胸腺素|34，但是从产业的观点来看，其可以改进(参见表2，显示在p-胸腺素的合成中获得的产率的比较)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2一种胸腺素P4变体，其中胸腺素p4的Ser15，Ala40和Ser41位置分别用Ala，Thr和Ser取代，为胸腺素^4^，其已经根据线性Fmoc/tBu策略合成并且从其已经获得48-53%纯度的粗产品[&e/^r,K,/.尸rai:"力e瓜，J辨'J仏入47-《57]。已经描述了胸腺素(310的固相合成，其用溴-4-氰基三苯曱基树脂遵循线性合成策略。该合成方法包括过夜延长偶联、再偶联和在几个4立置乙酖4匕[Zeand/ad/s,Z.,)^5^///ac^w，/.,27iro5^C.,//M7w/J0c力e/Z72'ca7co/fro/f力e5y/2f力ef/cpe/^/cfe,/.C/e/zz.Soc.，尸erh'力rraw.7,夕〃-夕7i]。借助于类似的策略，即基于Fmoc/tBu策略的线性合成，还获得所述的胸腺素[315的合成。此合成不仅产生胸腺素pi5产品还涉及包括乙酰化步骤的长且不完全的偶联，获得的粗产品的纯度下降[^i/"a尸o"r厶K，Zeo/2^'a(/2、丄.，C尸.，iY力ai:/ss/c^，/.S.5y77f力esisa/zd<s/^7oge/7e"'cacf/y/^ri刀户e/^2Ve^MM2《M7-Wi]。虽然对于大规模生产需要最优化合成方法，但其所获得的总产率不低(胸腺素|310为40%)和(胸腺素|315为45%)。在固相肽合成中，受保护的增长的肽链的疏水性相互作用导致低的偶联产率、不完全的去保护和获得副产品。最近引进长肽合成的假脯氨酸的使用在链延长期间，对于具有极大趋势要结构化的肽的现有技术而言，是实质性的改进。假脯氨酸为环状Ser、Thr或Cys的衍生物，其用作这些氨基酸的16保护基团(式I)并且促进合成困难的序列，中断仍锚接在树脂上的增长的肽链的结构化以及防止肽基树脂的聚集和合成的失败[粉力r,Va力7,尸.，^e/z2',丄，yoA『ec^er,及，r.,57/"，J.，#i/"er，prc^ecf/o"fec力刀/gwe/'/2/e/^2es/z^力e51/.51,/.爿历.C/e瓜5^c.，"夕6〃《，"M-"2。。假脯氨酸在肽链的主链中引入弯曲，其使用对疏水性序列或长肽的合成尤其有益。[Me力'/22'，丄，ya/e/W,/.户.，ag^regaf2.0/2—pro"epo/7pe;^/tfe，0r^3//c^e^L,夕〃〃i",7(V,,MJ-"(5;粉i7e，尸.，&7^,/.^,万ai/e力，Woo/z76erg,&，户e;"e5W.,厕《7。，,物e7i:ra"-6^〃a/2ira,兄，^ac力OKa,Z,f7rowz/za//7，f.，^ec左一57cir/;7^er,力.".,，一/2e歸/7e/7".cTef，C力e/z^/oC/e/z7,厕J,《"i]。R2=H(Ser);CH3(Thr)式I一旦合成终止，肽的序列和天然结构借助于最终的酸处理再生，所述酸处理包括侧链的裂解和去保护以及"恶唑烷环的打开(示意图1)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>示意图l表3示出胸腺素序列，将可用假脯氨酸取代的Ser和Thr加下划线。从以上看出，虽然在现有技术中已经公开了在学术领域的长肽的合成，但尚未将假脯氨酸在工业规模上或用于合成胸腺素上应用，其支持了本发明的发明新颖性和能力以及创造性。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>
发明内容本发明描述了在策略性(stretegic)位置处(参见4)使用受保护的假脯氨酸二肽，工业上制备和获得(oc和P)胸腺素的新合成方法。方法a)应用Fmoc/tBu方法在树脂上以固相线性合成肽，b)使用X-Thr或X-Ser，其中X是根据以下指导原则的在序列的策略性位置处以假脯氨酸二肽形式的任何氨基酸b.1)在C-末端或在N-末端位置处插入假脯氨酸二肽是不必要的，b.2)在序列中引入至少一个假脯氨酸二肽，b.3)假脯氨酸的结构不稳定效果在接下来的5-6个氨基酸中维持其影响，b.4)假脯氨酸二肽间的最优间隔为5-6个氨基酸，b.5)两个假脯氨酸二肽或假脯氨酸和脯氨酸之间的最小间隔优选为两个残基，b.6)如果假脯氨酸二肽位于疏水残基区域，合成结果最优。c)借助于用三氟乙酸处理肽基树脂来断裂肽-树脂键，去保护侧链，打开假脯氨酸环和获得胸腺素，d)如果在序列中存在Met氨基酸，通过RP-HPLC纯化之前用AcOH处理以使粗产品去叔丁基。相对于其它已存在的合成方法的基本差异为以受保护的假脯氨酸二肽的形式额外地引入序列X-Thr和/或X-Ser，其导致以非常良好的产率和高纯度获得终产品(参见表2)，粗产品的纯度高于80%,纯产品的纯度高于99%，并且总产率高于50%。表3显示具有引入假脯氨酸二肽的所有可能位置的胸腺素序列。只所以要实现本发明的目的，这是因为长肽的合成是一个挑战，其根本上由源自聚集效应的无效偶联和去保护引起，所述聚集效应还在不非常长但特别疏水或重复的序列中发现。20本发明旨在解决此技术缺陷，并且为此，其提出了用于工业上获得胸腺素的合成方法，该方法基于固相肽合成，在2-氯三苯甲基型树脂上应用Fmoc/tBu方法，在关键位置引入X-Ser和X-Thr作为假脯氨酸二肽。具有酸性C-末端官能的胸腺素的固相合成从2-氯三苯甲基氯化物树脂进4亍["ar/osr.,C力"Z2',(.,(7a"^".,57s汀o;o"/0^《7"7G7入J"-W^]。此树脂促进引入第一氨基酸和最小化二次外消旋反应。此树脂进一步减少在树脂上引入第二氨基酸之后，在用20%哌咬的DMF溶液进行的碱处理中哌嗪二酮形成的风险。如上所述，基于线性Fmoc/tBu合成策略，本发明的特征在于其根据肽序列，通过或借助于在肽序列的策略性位置加入假脯氨酸二肽，来引入氨基酸Thr或Ser。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>因此，本发明特征在于其根据肽序列，借助于根据以下指导原则在肽序列的策略性位置加入假脯氨酸二肽，来引入氨基酸Thr或Ser:a)在C-末端或在N-末端位置插入假脯氨酸二肽是不必要的，b)在序列中引入至少一个假脯氨酸二肽，c)假脯氨酸的结构不稳定效果在接下来的5-6个氨基酸中维持其影响，d)假脯氨酸二肽间的最优间隔为5-6个氨基酸，e)两个假脯氨酸二肽或假脯氨酸和脯氨酸之间的最小间隔优选为两个残基，f)如果假脯氨酸二肽位于疏水残基区域，合成结果最优。在工业水平上获得和最优化用于生产胸腺素的合成方法包括很大的努力。实验室尚未成功地解决用于获得胸腺素的其它合成策略。已经研究出三种不同的策略以获得用于生产胸腺素M的有利润的生产方法。借助于固相片段缩合(solid-phaseconvergentsynthesis)的第一策略在第一固相片段缩合策略中使用两种片段(l-27)和(28-43)-树脂已经解决胸腺素P4的合成。用于在受保护的28-43-树脂肽基树脂上的受保护的片段1-27的固相激活和偶联步骤引起阻碍反应的凝胶。用第一途径不能鉴别终产物。借助于线性固相合成的第二策略第二途径，胸腺素(34的逐步地线性固相合成引起低纯度的合成粗产品，对于生产胸腺素P4的工业方法而言是不可行的(考虑到纯化步骤的困难以及获得的低的总产率)。借助于以Fmoc/tBu策略并且使用假脯氨酸的线性固相合成的第三策略第三策略已经包括解决问题、获得符合有竟争力的工业规模方法的胸腺素。在本发明中，假脯氨酸的使用已经引入使用Fmoc/tBu策略23的固相合成，以获得更经济有效和有竟争力的合成方法。在胸腺素p4的线性合成策略和引入假脯氨酸的相同策略之间的比较合成中获得的结果，已经显示涉及引入假脯氨酸的极大优点，这是因为假脯氨酸为具有与脯氨酸类似结构的衍生自Cys、Ser和Thr的非天然氨基酸。环喁唑烷环防止仍然锚接在树脂上的增长的肽链的结构化，并且阻碍肽基树脂的聚集以及合成失败。肽基树脂的最终酸处理使自然序列(nativesequence)的Ser或Thr再生。在终产品的纯度方面第二和第三策略间的比较示于图l,其中观察根据线性SPPS策略(图1A)获得的胸腺素P4粗产品和根据相同的Fmoc/tBu策略但使用假脯氨酸获得的胸腺素P4粗产品的RP-HPLC色语图(图1B)。从图1A的两幅图的比较中可以看出，产率比本发明的合成目的低得多，其结果示于图1B。必须考虑对于传统的线性合成(图1A)而言，在Ile(34)、Thr(33)、Lys(31)、Ser(30)、Pro(29)、Leu(28)、Pro(27)、Asn(26)、Lys(16)Ser(15)、Lys(14)、Asp(13)、Phe(12)、Lys(11)、Glu(10)、lie(9)、Glu(8)、Ala(7)、Met(6)、Asp(5)、Pro(4)、Ser(l)位置的再激活是必须的，其必须在某些情况下再偶联lie(34)、Thr(33)、Leu(28)、Asn(26)、Lys(16)、Ser(15)、Asp(13)、Glu(10)、lie(9)、Glu(8)、Met(6)、Asp(5)。相反，在使用假脯氨酸的线性合成(图1B)中，仅仅需要在Ile(34)和Asn(26)处再激活并且在后者再偶联，其表明在合成方法中加入假脯氨酸实质上和令人惊奇地提高了该方法的产率，使其简单化、更有利和具有比用于合成胸腺素的已知方法高得多的产率。一旦本发明的合成目标已经完成，产品N-末端具有或不具有乙酰化，将肽基树脂用三氟乙酸和碳正离子清除剂进行最终处理以从树脂上裂解肽，并且消除侧链的保护基团和假脯氨酸保护。最终，所得的粗产品通过RP-HPLC纯化，将純片段收集并冻干，获得的终产品具有高于99%的纯度，以及具有高于50。/的总产率。图1显示根据策略2和策略3分离的胸腺素(34粗产品。表2(如上所示)显示用于合成p-胸腺素的这些策略和其它之前公布的策略在产率上的差异。根据不使用假脯氨酸的Fmoc/tBu策略的线性固相合成途径产生难以纯化的粗产品(图1A)，该产品以非常低的产率获得(表2)。然而，在线性Fmoc/tBu策略中使用假脯氨酸二肽显著地提高了终产品的产率和纯度。最后，作为以上陈述的结论，本发明中所要求保护的合成方法的关键点和发明点为基于根据前述的指导原则，在合成的关键位置使用假脯氨酸二肽，避免序列引起在树脂上增长链的聚集，从而消除不完全的去保护和偶联问题，所述问题导致低质量的肽粗产品并且因此导致低的合成产率，以及在随后的纯化步骤中的困难。对于作为大规模合成胸腺素的有竟争力的方法的本发明，该合成方法的被成功地开发出来，这是因为其作为廉价快速的方法，具有比现有技术所描述的那些方法更高的产率和纯度。用于本说明书的缩略语具有以下意义Ac20:乙酸酐。AcOH:乙酸。Boc:叔丁氧羰基。DCM:二氯甲烷。DIEA:N，N'-二异丙基乙胺。DIPCDI:二异丙基碳二亚胺。DMF:N，N-二甲基甲酰胺。Fmoc:9-药甲氧羰基。HF:氢氟酸。H0BT:N-羟基苯并三唑。HPLC:高效液相色镨。斗微升。pmol:微摩尔。tBu:叔丁基TFA:三氟乙酸Trt:三苯甲基。氨基酸Ala(A):L-丙氨酸Arg(R):L-精氨酸Asn(N):L-天冬酰胺Asp(D):L-天冬氨酸Gin(Q):L-谷氨酰胺Glu(E):L-谷氨酸Gly(G):L-甘氨酸lie(I):L-异亮氨酸Leu(L):L-亮氨酸T"o/^m、IWL-赖氨酸Met(M):L-蛋氨酸Phe(F):L-苯丙氨酸Pro(P):L-脯氨酸Ser(S):L-丝氨酸Thr(T):L-苏氨酸Tyr(Y):L-酪氨酸Val(V):L-缬氨酸根据笫一重要方面，本发明涉及借助于在聚合物载体(polymericsupports)上的固相合成，来获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤a.应用Fmoc/tBu方法，在树脂上以固相线性合成胸腺衍生肽，b.以假脯氨酸二肽形式在序列中引入至少一个X-Thr和/或X-Ser，c.以至少5个氨基酸的距离以嵌入的方式加入假脯氨酸二肽，d.借助于用三氟乙酸处理肽基树脂从而同时引起肽-树脂键的断裂、侧链的去保护以及假脯氨酸环的打开，来获得胸腺素，e.通过RP-HPLC纯化胸腺素本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中获得a-胸腺素和/或其药学上可接受的盐。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中获得P-胸腺素和/或其药学上可接受的盐。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中合成在聚合物载体上进行。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中在步骤a)中使用氯-三苯曱基型树脂。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中在步骤a)中使用pMBHA型树脂。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中在步骤b)中在肽基树脂中以假脯氨酸二肽和/或以假脯氨酸形式的改性Ser或Thr，额外地进行Ser或Thr的引入。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中两个假脯氨酸二肽或假脯氨酸和脯氨酸之间的最小间隔为两个氨基酸。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中优选将假脯氨酸二肽加入疏水氨基酸区域。本发明涉及获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其中如果在步骤d)后，序列中出现氨基酸Met，则额外地进行用AcOH的将粗产品去叔丁基处理。根据笫二重要方面，本发明涉及通过之前方法获得的分离和/或纯化的化合物，该化合物包括在其全长上与序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.11具有至少80%同一性的氨基酸序列。本发明涉及通过之前方法获得的分离和/或纯化的化合物，该化合物由选自以下的氨基酸序列组成序列SEQ.ID,N.l至SEQ.ID.N.11、其互补序列和/或其同源序列和/或其功能等价序列(functionalequivalentsequence)。本发明涉及通过之前方法获得的分离和/或纯化的化合物，该化合物包括选自以下至少一种氨基酸序列的片段序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.11、其互补序列、其同源序列和其功能等价序列。本发明涉及通过之前方法获得的分离和/或纯化的化合物，其中包含于序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.ll的任一氨基酸选自L-氨基酸、D-氨基酸、N-甲基氨基酸、非天然氨基酸、Met-tBu或氧化的Met。本发明涉及通过之前方法获得的分离和/或纯化的化合物，该化合物包括在N-末端氨基酸的选自酰化和/或聚乙二醇化(pegylations)的改性。根据第三重要方面，本发明涉及通过前述方法获得的化合物在制备医药产品上的用途。本发明涉及通过前述方法获得的化合物在制备调节免疫应答、血管生物学和癌发病机理的医药产品上的用途。具体实施例方式在该专利文档中提供的以下具体实施例用于举例说明本发明的性质。这些实施例仅仅包括说明性目的，并且不得解释为本说明书中所要求保护的发明的限制。实施例l:胸腺素al的合成在缺乏氨基酸的2-氯三苯甲基树脂上引入Fmoc-Asn-0HC-末端残基，以在引入第一氨基酸后获得0.85mmol/g官能化(functionalization)。在2.5g树脂(f=1.6mmol/g树脂，4mraol)上引入O.8g氨基酸(2.13mmol，0.5eq.)。在分开的容器中将树脂和氨基酸称重，并在真空下使其干燥至少4小时。将氨基酸溶于25mL的干燥DCM(在4A筛上)。加入DIEA(0.7mL，1.6mmol，1eq.)并将其搅拌5分钟。制备DIEA:DCM(l.4mL，3.2mmol，2eq.)为1:l的溶液(2.8ml)，并将其加入反应混合物。将其搅拌另外40分钟，然后加入4mL的干燥Me0H，并使其反应10分钟，其后在装备有滤板和钥匙(afilterplateandakey)的合成反应器中将树脂过滤，并进行以下洗涤步骤试剂重复时间1DCM31min2DMF51min35%哌啶的DMF溶液110min420。/。哌咬的DMF溶液115min5DMF51min相对于引入第一氨基酸后的树脂官能化(O.85mmol/g)，在所有情况下以过量的2.5eq氨基酸、HOBT和DIPCDI将下一个氨基酸引入。使其反应40-60min，并且随后用20%哌啶的DMF溶液将Fmoc基团去保护5min两次和去保护10min另外两次。使用2.5eq.的二肽、HOBT和DIPCDI将Fmoc-Ile-ThrOF^'Mepro)-OH二肽(对应于胸腺素ocl序列的氨基酸11-12)引入，使其反应lh。借助于茚三酮测试控制偶联效率。如果其是阳性的，使用l/3eq.HOBT和DIPCDI将其再激活，如果再激活后其仍然是阳性的，使用相对于第一偶联所用当量的^eq.的Fmoc-AA-0H、HOBT和DIPCDI将其再偶联。如果再激活、再偶联和再次再激活后茚三酮测试仍然是阳性的，使用2.5eq.的Ac20和DIEA进行乙酰化15min。需要再激活和/或再偶联的位置具体如下Ser(1)、Ser(2)、Thr(7)、假脯氨酸二肽(11-12)、Lys(14)、Leu(16)、Lys(17)、Glu(18)、Lys(19)。在获得Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(MeMepro)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Uu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-G1u(01Bu)-Va卜Va卜G1u(01Bu)-G1u(01Bu)-A1a-G1u(01Bu)-Asn-树脂中，在合成末将产率量化。将7g肽基树脂用80niLTFA:H2095:5混合物在搅拌下处理1小时30分。一旦反应终止，通过过滤将树脂从产物中分离并用TFA洗涤。向TFA溶液加入二乙醚(560mL)，在P3板(P3plate)中将白色沉淀物过29滤，并用MeOH和二乙醚洗涤。合成产率40%。产品表征ESI-MS:理论上M=3108g/mol，试验上M:(m/z):[M+2H]72-1555;[M+3H〗73=1037，[M+4H]74-778，[M+5H]75=623。RP-HPLC分析:梯度5-85%B20min，tr=11.7min;等强度19%B30min，tr=16.5min(B=0.07%TFA的乙腈溶液)。实施例2:胸腺素I34的合成使用Fmoc/tBu保护使用固相肽合成策略合成胸腺素(34。为了在2-氯三苯甲基树脂(lg，1.6mmol/g)上引入第一氨基酸，使用Na-Fmoc-保护的氨基酸(O.5eq)和DIEA(3eq.)的DCM溶液以在引入第一氨基酸后达到O.85mmol/g的官能化。将其机械搅拌40min，然后加入4mL的干燥MeOH并使其反应lOmin。在装备有滤板和钥匙(afilterplateandakey)的合成反应器中将树脂过滤，并用DCM和DMF进行以下洗涤。将树脂用5y。哌咬的DMF溶液处理lx10min和用20y。哌啶的DMF溶液处理lx15min,并将其用DMF冲洗。一旦已经引入第一氨基酸，剩余的氨基酸为在DMF中的Na-Fmoc-保护的氨基酸(3eq.)、HOBT(3eq.)和DIPCDI(3eq.)，该当量相对于树脂的官能化计算。选择以下基团作为用于侧链的保护基团用于Arg的2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰(Pbf)，用于Lys、Glu和Asp侧链的叔丁氧羰基(Boc)和用于Thr和Ser侧链的#又丁基。通过用20。/。哌啶的DMF溶液处理(5min两次和10rain另外两次)将临时性Fmoc保护基团裂解。在合成中将假脯氨酸二肽引入作为取代氨基酸l4-15的Fmoc-Lys(Boc)-Ser(Me，Mepro)-OH以及在氨基酸21-22和32-33的位置处引入Fmoc-Glu(OtBu)-ThrOFMe，Mepro)-OH。所述位置选自由于以下引起的可能位置其在肽序列中的排列、对C-末端位置的最优可及性、对Pro残基的最优可及性和假脯氨酸间的最优距离。借助于茚三酮测试控制偶联效率。如果其是阳性的，使用l/3eq.HOBT和DIPCDI将其再激活，如果再激活后其仍然是阳性的，使用相对于第一偶联的的Fmoc—AA—OH、HOBT和DIPCDI将其再偶联。如果30再激活、再偶联和再次再激活，后茚三酮测试仍然是阳性的，使用2.5eq的Ac20和DIEA进行乙酰化15min。需要再激活的位置为Ile(34)和Asn(26)，并且后一位置也被偶联。在合成Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-SerOFMeMepro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(^MeMepro)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr0FMeMepro)-Ile-Glu(OtBu)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-树脂末，将产率量化。将4.8g肽基树脂用24mLTFA:H2095:5混合物在搅拌下处理2h。将悬浮液过滤并将滤液用醚(168mL)沉淀。在P3板中将粗产品过滤，用MeOH和二乙醚洗涤并在真空下干燥。在37'C下用4。/。AcOH的水溶液将肽处理1小时30分钟，并且通过制备型RP-HPLC纯化。终产品通过在ESI-MS设备中的质谱表征，并根据说明书分析。纯度"％。产率50%。产品表征ESI-MS:理论上M=4962g/mo1，试验上M:(m/z):[M+4H]74=1242;[M+5H]75=994;[M+6H]76-828;[M+7H]77=710.RP-HPLC分析:梯度5-85。/。B20rain，tr=11.6min;等强度:20%B30min，tr=19min(B-0.07%TFA的乙腈溶液)。实施例3:胸腺素B15的合成合成方法与胸腺素|34所用方法类似。使用Fmoc-Lys(Boc)-SerOFMe'Mepro)-0H二肽取代氨基酸14-15，在氨基酸21-22的位置处为Fmoc-Asn(Trt)-Thr0FMe'Mepro)-0H，以及在位置32-33处为Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(YMe'Vo)-0H。仅仅在Lys(3)处需要偶联。以量化的产率获得肽基树脂Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(WMepro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(MeMepro)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Thr(tBu)-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(MeMepro)-Ile-Gln-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Asn-Gln-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-树脂。通过使其与TFA:H2095:5混合物反应1小时30分钟将肽从树脂裂解，用二乙醚将其沉淀和冻干。以半制备型RP-HPLC将粗产品纯化，并且将终产品通过在ESI-MS设备中的质诲表征。纯度98%。产率50%。产品表征ESI-MS:理论上M=5173g/mol，试验上M:(m/z):[M+6H]76=863，[M+7H]77=740，[M+8H]78=648，[M+9H]79=576。RP-HPLC分析:梯度5-85%B20min，tr=11.5min;等强度20%B30min，tr=11.5min(B=0.07%TFA的乙腈溶液)。虽然关于这些具体情况已经描述了本发明，但是在本领域中许多其它变型和改进以及其它用途与详述的那些内容相关。因此本发明不受此处的具体公开限制，而仅受权利要求限制。权利要求1.一种在聚合物载体上借助于固相合成获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于包括以下步骤a.应用Fmoc/tBu方法，在树脂上以固相线性合成胸腺衍生肽，b.以假脯氨酸二肽形式在序列中引入至少一个Thr或Ser，c.借助于用三氟乙酸处理肽基树脂从而同时引起肽-树脂键的断裂、侧链的去保护以及假脯氨酸环的打开，来获得胸腺素，d.通过RP-HPLC纯化胸腺素。2.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于获得oc-胸腺素和/或其药学上可接受的盐。3.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于获得P-胸腺素和/或其药学上可接受的盐。4.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于合成在聚合物载体上进行。5.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于在步骤a)中使用具有O.1-2讓ol/g官能化的氯-三苯曱基型树脂。6.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于在步骤a)中使用具有O.l-2mmol/g官能化的pMBHA型树脂。7.根据权利要求l所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于在步骤b)中在肽基树脂中以假脯氨酸二肽的形式和/或以假脯氨酸形式的改性Ser或Thr的形式进行Ser或Thr的引入。8.根据权利要求l-7任一项所迷的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于两个假脯氨酸二肽或假脯氨酸和脯氨酸之间的最小间隔为两个氨基酸。9.根据权利要求1-8任一项所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于优选将假脯氨酸二肽加入疏水氨基酸区域中。10.根据权利要求1-9任一项所述的获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于如果在步骤c)后在序列中出现氨基酸Met，则额外地用AcOH进行粗产品的去叔丁基处理。11.通过根据权利要求l所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，其特征在于其包含在其全长上与序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.11具有至少80%同一性的氨基酸序列。12.通过根据权利要求l所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，其特征在于其由选自以下的氨基酸序列组成序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.11、其互补序列和/或其同源序列和/或其功能等价序列。13.通过根据权利要求1所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，其特征在于其包括选自以下的至少一种氨基酸序列的片段序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.11、其互补序列、其同源序列和其功能等价序列。14.通过根据权利要求1所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，其特征在于包含于序列SEQ.ID.N.l至SEQ.ID.N.ll中的全部或任何氨基酸选自L-氨基酸、D-氨基酸、N-甲基氨基酸、非天然氨基酸、Met-tBu或IU匕的Met。15.通过根据权利要求l所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，其特征在于其包括选自酰化和/或聚乙二醇化的在N-末端氨基酸中的改性。16.根据权利要求11-15任一项所述的化合物在制备医药产品中的用途。17.根据权利要求16所述的化合物在制备用于调节免疫应答、血管生物学和癌发病机理的医药产品中的用途。全文摘要本发明涉及在聚合物载体上借助于固相合成获得胸腺素和/或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤以固相线性合成胸腺衍生肽，以假脯氨酸二肽的形式在序列中引入至少一个Thr或Ser，通过用三氟乙酸处理肽基树脂获得胸腺素，以及通过RP-HPLC纯化胸腺素。本发明还保护借助于所述方法获得的分离和/或纯化的化合物，以及其在制备医药产品上的用途。文档编号C07K14/575GK101484467SQ200780024724公开日2009年7月15日申请日期2007年4月25日优先权日2006年5月10日发明者B·蓬萨提奥维奥尔斯,J·克莱门特罗德里格斯,J·费尔南德斯卡尔亚多,R·鲁维雷斯费雷尔,S·帕冯费尔南德斯申请人:Bcn肽类股份有限公司