专利名称：：Wnt拮抗剂及其在wnt介导的病症的诊断和治疗中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明一般性涉及细胞生长的调节。更具体地，本发明涉及Wnt途径的抑制剂以及其在特征在于Wnt途径信号传导激活的病症的诊断和治疗中的用途，以及由Wnt途径信号传导介导的细胞事件的调控。
背景技术：
：由于在某些鼠乳房胂瘤中的早期观察和实验结果，Wnt信号传导途径与致癌作用开始联系起来。Wnt-l原癌基因(Int-l)最初从小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)诱导的乳房肿瘤(由于病毒DNA序列的插入)中鉴定。Nusse等，Cell1982;31:99-109。这种病毒整合的结果是导致肺瘤形成的不受调节的Int-l表达。Vanooyen,A.等，Cell1984;39:233-240;Nusse,R.等，Nature1984;307:131-136;Tsukamoto等，Cell1988;55:619-625。随后的序列分析表明Int-l是牵涉发育的果蝇无翅(Wingless,Wg)基因的哺乳动物同系物，然后这些术语被组合起来以产生"Wnt",用以鉴定该蛋白质家族。分泌型配体的人Wnt基因家族现在已经发展至至少19个成员(例如Wnt-1(RefSeq.:NM一005430)、Wnt-2(RefSeq.:鹿—003391)、Wnt-2B(Wnt-13)(RefSeq.:NM—004185)、Wnt-3(ReSeq.:NM—030753)、Wnt3a(RefSeq.:NM—033131)、Wnt-4(RefSeq.:NM一030761)、Wnt-5A(RefSeq.:NM_003392)、Wnt-5B(RefSeq.:NM—032642)、Wnt-6(RefSeq.:雨—006522)、Wnt-7A(RefSeq.:NM—004625)、Wnt-7B(RefSeq.:NM一058238)、Wnt-8A(RefSeq.:兩一058244)、Wnt-8B(RefSeq.:固—003393)、Wnt-9A(Wnt-14)(RefSeq.:NM—003395)、Wnt-9B(Wnt-15)(RefS叫.NM—003396)、Wnt-10A(RefSeq.:NM—025216)、Wnt-10B(RefSeq.:画—003394)、Wnt画ll(RefSeq.:NM—004626)、Wnt-16(RefSeq.:NM—016087))。各个成员具有不同程度的序列同一性，但全都含有显示高度保守间隔的23-24个保守半胱氨酸残基。McMahon,AP等，TrendsGenet,1992;8:236-242;Miller,JR.GenomeBiol.2002;3(1):3001.1-3001.15。Wnt蛋白是小的(即39-46kD)酰化分泌型糖蛋白，其在胚胎发生和成熟组织两者中发挥关键的作用。在胚胎学发育过程中，Wnt蛋白的表达在图式形成(patterning)中是重要的，其通过控制细胞增殖和决定干细胞命运来实现。Wnt分子还是棕榈酰化的，如此其疏水性高于仅通过氨基酸序列分析所预测的不进行棕榈酰化情况中会具有的疏水性。Willert,K.等，Nature2003;423:448-52。还认为棕榈酰化的一个或多个位点对于功能是至关重要的。Wnt蛋白起配体的作用，活化跨膜7次的受体巻曲蛋白(Frizzled,Frz)家族。Ingham,P.W.TrendsGenet.1996;12:382-384;YangSnyder,J.等，Curr.Biol.1996;6:1302-1306;Bhanot,R等，Nature1996;382:225-230。存在有10个已知的Frz家族成员(例如Frzl、Frz2、Frz3...Frzl0),每个的特征在于富含半胱氨酸的结构域(CRD)的存在。Huang等，GenomeBiol.2004;5:234.1-234.8。各种Wnt-巻曲蛋白相互作用之间的混杂程度巨大，但Wnt-Frz结合还必须掺入LDL受体相关蛋白(LRP5或LRP6)及细胞膜和细胞质蛋白质散乱蛋白(Dishevelled,Dsh)以形成活性信号传导复合物。Wnt对巻曲蛋白的结合可以激活信号传导，或是经由规范的Wnt信号传导途径，由此导致(3-联蛋白的稳定化和转录活性升高[Peifer,M.等,Development1994;120:369-380;Papkoff，J.等，Mol.CellBiol.1996;16:2128-2134]，或是经由非规范的信号传导，诸如通过Wnt/平面细胞极性(Wnt/PCP)或Wnt-4丐(Wnt/Ca2+)途径。Veeman,M.T.等，Dev.Cell2003;5:367-377。规范的Wnt信号传导途径是与癌症形成最相关的Wnt信号传导途径。Ilyas,M.,J.Pathol.2005;205:130-144。该途径的正常激活启动一系列的下游事件，其在蛋白质(3-联蛋白的稳定化和水平升高时达到顶点。该蛋白质正常情况下是一种没有活性的胞质蛋白质，并且见于与蛋白质(包括上皮钙粘着蛋白)结合的细胞膜。在没有Wnt配体时，磷酸化的胞质(3-联蛋白被正常地快速降解。在规范途径被激活后，未磷酸化的P-联蛋白被运输至细胞核，在那里其进一步导致各种靶基因的转录激活。随后这些耙基因转录的上调导致细胞变化，而且此类靶基因持续的、不受调节的表达导致肿瘤形成。因为异常Wnt信号传导在致癌作用中表现为必需的先驱，所以有效的Wnt信号传导抑制剂作为癌症治疗剂是令人有极大兴趣的。可溶性受体作为配体-受体相互作用拮抗剂的用途在本领域中是已知的。此类分子可以是有效的治疗性拮抗剂，如果它们结合游离配体且其结合方式使得阻止信号传导途径的初始受体活化步骤。根据晶体学数据，鉴定出巻曲蛋白受体的富含半胱氨酸的结构域(CRD)的可溶性最低限度胞外结构域(ECD)片段，其展现对Wnt的结合。Dann等，Nature412:86-90(2001)。然而，虽然此类巻曲蛋白片段确实展现对Wnt配体的结合，但此类片段不适合作为治疗剂，因为它们在体内快速降解。提出了将偶联有免疫球蛋白Fc的可溶性巻曲结构域用作潜在的Wnt拮抗剂。TherapeuticOpportunitiesoftheWntSignalingPathwayinCancer,NewYorkAcademyofSciences,2005年10月25日；Hsieh,J-C.等，PNAS,96:3546-3551(1999)。然而，本发明之前，创建可溶性巻曲蛋白受体-Fc融合物治疗剂的尝试一直未获成功。例如，一种基于Frz8CRD的残基1-173的此类嵌合体(Frz(173)-Fc，SEQIDNO:113)具有亚最适功效(图12),而且在体内是不稳定的(图ll)。此外，Frz(173)-Fc嵌合体仅降低了肿瘤体积增加的速率(与缩小起始肿瘤体积形成对比)。另外，虽然Fc融合物的创建作为改善所得构建体的体内稳定性的一种技术是普遍知道的，但由于许多问题(包括新蛋白构建体的不正确蛋白质折叠和融合构建体与靶物的空间位阻)，有效的治疗性Fc构建体的创建可以是困难的。如此，需要体内稳定性增强的Wnt拮抗剂治疗剂，其在抑制Wnt配体诱导的细胞信号传导中起作用。发明概述本发明提供了组合物及其在诊断和治疗Wnt介导的病症(诸如癌症)的方法和抑制细胞Wnt信号传导中的用途。具体地，本发明提供了Wnt拮抗剂及其在诊断和治疗Wnt介导的病症的方法和抑制细胞Wnt信号传导中的用途，所述Wnt拮抗剂是包含巻曲结构域构件(诸如自巻曲(Frz)蛋白、巻曲相关蛋白(sFRP)或另一种蛋白质(例如Ror-l,-2等)衍生的多肽)及免疫球蛋白Fc结构域的嵌合分子。本发明的一方面提供了包含巻曲结构域构件和Fc结构域的Wnt拮抗剂。该Wnt拮抗剂的巻曲结构域构件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一个实施方案中，该Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少l小时。在另一个实施方案中，该Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。在另一个实施方案中，该Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。在又一个实施方案中，该Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrz10(SEQIDNO:27)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原(pro-Frzpolypeptide)及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrz10(SEQIDNO:44);或选自下组的sFRP多肽原(pro-sFRPpolypeptide)及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂包含自选自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc构件。在另一个实施方案中，Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一个实施方案中，Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂进一步包含连接巻曲结构域构件与Fc结构域的接头。在一个这种实施方案，所述接头是肽接头，诸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂包含选自下组的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9画Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。本发明的另一方面提供了一种组合物，其包含至少一种药学可接受载体或赋形剂和如上所述的Wnt拮抗剂。本发明的又一方面提供了编码任何上文所述Wnt拮抗剂的核酸序列。在一个实施方案中，编码Wnt拮抗剂的核酸进一步包含含有与所述核酸可操作连接的控制序列的载体。在另一个实施方案中，所述载体包含在宿主细胞中，诸如哺乳动物、昆虫、大肠杆菌或酵母细胞。本发明的另一方面提供了一种制品，其包含含有至少一种药学可接受载体或赋形剂和如上所述的Wnt拮抗剂的组合物和容器；其中所述Wnt拮抗剂装在所述容器内，且所述容器进一步包含(a)附于所述容器的标签，或(b)所述容器里的包装插页，其提及所述Wnt拮抗剂的用途，指出所述组合物用于Wnt介导的病症的治疗性处理或诊断性;险测的用途。本发明的又一方面提供了一种抑制细胞中Wnt信号传导的方法，其包括使所述细胞与有效量的包含巻曲结构域构件和Fc结构域的Wnt拮抗剂接触。Wnt拮抗剂的巻曲结构域构件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少l小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。在又一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。在这方面的进一步实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或选自下组的sFRP多肽原及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。12在一个实施方案中，Wnt拮抗剂包含自选自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc构件。在另一个实施方案中，Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一个实施方案中，Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂进一步包含连接巻曲结构域构件与Fc结构域的接头。在一个实施方案，所述接头是肽接头，诸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂包含选自下组的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3扁Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在这种方法的一个实施方案中，所述细胞包含在哺乳动物内，且施用的量是治疗有效量。在另一个实施方案中，所述Wnt信号传导源自Wnt信号传导成分经由体细胞突变的激活。在另一个实施方案中，所述对Wnt信号传导的抑制导致对细胞生长的抑制。在又一个实施方案中，所述细胞是癌细胞。本发明的另一方面提供了一种在患有Wnt介导的病症的哺乳动物中治疗所述病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的包含巻曲结构域构件和Fc结构域的Wnt拮抗剂。所述Wnt拮抗剂的巻曲结构域构件包含自Frz蛋白、FRP蛋白、或Ror蛋白衍生的多肽。在一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少l小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少1天。在又一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。在这方面的进一步实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hJFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:4勺；或选自下组的sFRP多肽原及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂包含自选自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc构件。在另一个实施方案中，Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一个实施方案中，Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂进一步包含连接巻曲结构域构件与Fc结构域的接头。在一个实施方案，所述接头是肽接头，诸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂包含选自下组的多肽FrzS-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在这种方法的一个实施方案中，所述病症是与异常Wnt信号传导活性有关的细胞增殖性病症。在另一个实施方案中，所述异常Wnt信号传导活性源自Wnt蛋白表达升高。在又一个实施方案中，所述细胞增殖性病症是癌症，诸如结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、神经力交质瘤、及髓母细胞瘤(medulloblastoma)。本发明的又一方面提供了一种用于检测Wnt蛋白存在的方法，其包括使样品与如上所述的Wnt拮抗剂接触，其中复合物的存在，或所述Wnt拮抗剂和Wnt蛋白之间的结合水平指示Wnt蛋白和/或信号传导的存在。在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定Wnt信号传导水平是否异常，该方法进一步包括将所述样品中的结合水平与已知具有生理学正常Wnt信号传导的第二样品中的水平进行比较。所述样品中的结合水平高于或低于所述第二样品中的结合水平指示异常的Wnt信号传导。在又一个实施方案中，所述异常Wnt信号传导进一步指示Wnt介导的病症(诸如癌症)的存在。本发明的另一方面提供了一种在特征在于激活的或过量的Wnt信号传导的细胞中调控Wnt靶基因表达的方法，其包括使所述细胞与有效量的上文所述Wnt拮抗剂4妻触。本发明的又一方面提供了一种治疗性处理Wnt介导的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的包含巻曲结构域构件和Fc结构域的Wnt拮抗剂。Wnt拮抗剂的巻曲结构域构件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少l小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。在又一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。在这方面的进一步实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:1518)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sF鹏(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或选自下组的sFRP多肽原及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂包含自选自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc构件。在另一个实施方案中，Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一个实施方案中，Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂进一步包含连接巻曲结构域构件与Fc结构域的接头。在一个实施方案，所述接头是肽接头，诸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂包含选自下组的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9隱Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sF鹏-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5陽Fc(SEQIDNO:88)。所述拮抗剂的施用阻滞所述癌症任何随后的大小增加或严重程度进展。在一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的施用导致癌症大小或严重程度降低。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的施用降低所述癌症的肿瘤负荷。在又一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的施用杀死所述癌症。本发明的另一方面提供了Wnt拮抗剂在制备用于治疗细胞增殖性病症的药物中的用途。Wnt拮抗剂包含巻曲结构域构件和Fc结构域。Wnt拮抗剂的巻曲结构域构件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少l小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。在另一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。在又一个实施方案中，所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。在这方面的进一步实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低卩艮度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更进一步的实施方案中，巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或选自下组的sFRP多肽原及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂包含自选自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc构件。在另一个实施方案中，Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一个实施方案中，Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂进一步包含连接巻曲结构域构件与Fc结构域的接头。在一个实施方案，所述接头是肽接头，诸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂包含选自下组的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4陽Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在一个实施方案中，所述细胞增殖性病症是癌症，诸如结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、神经力交质瘤、及髓母细胞瘤。18附图简述图l是处于"关闭"或者无活性状态以及"开启"或活性状态的规范Wnt信号传导途径的简略概要。图2的示意图描绘了与人免疫球蛋白结构域的Fc区域连接的巻曲胞外结构域。图3是17种已知的巻曲蛋白胞外结构域的比对。图3A显示了10种巻曲蛋白原(SEQIDNO:35-44)和5种sFRP蛋白原(SEQIDNO:45-49)的胞外结构域的比对，而图3B显示了IO种成熟巻曲蛋白(SEQIDNO:50-59)和5种成熟sFRP蛋白(SEQIDNO:60-64)的胞外结构域以及2种成熟Ror蛋白(SEQIDNO:65-66)的胞外结构域的比对。相似残基以灰色框示，相同残基以星号指示。相似残基以酸性的、^喊性的、极性的和非极性的来分组。在图3B中，在两个划上方框的带箭头线条之间指示最小限度CRD(ECD)结构域(SEQIDNO:18-34)。图4显示了Frz(156)-Fc和Frz(173)-Fc嵌合构建体的序列。图4A显示了较长的Frz(173)-Fc序列(SEQIDNO:113)。以粗体显示的(即前24个N端氨基酸残基)是前导信号序列。残基25-27是丙氨酸残基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以划上方框的文本显示的(即残基157-173)是区分较长(Frzl73)嵌合构建体与较短(Frzl56)嵌合构建体的Frz8受体额外序列。接头序列(即残基174-182)是加下划线的，而Fc结构域序列以斜体显示(即残基l83-409)。图4B显示了较短的Frz(156)-Fc(SEQIDNO:74)。以粗体显示的(即前24个N端氨基酸残基)是前导信号序列。残基25-27是丙氨酸残基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。接头序列(即残基157-164)是加下划线的，而Fc结构域序列以斜体显示(即残基165-391)。图5A-5H显示了编码数种Wnt拮抗剂嵌合构建体的核酸序列(Frzl-Fc(SEQIDNO:115)、Frz2-Fc(SEQIDNO:116)、Frz3-Fc(SEQIDNO:117)、Frz4-Fc(SEQIDNO:118)、Frz5-Fc(SEQIDNO:119)、Frz6-Fc(SEQIDNO:120)、Frz7-Fc(SEQIDNO:121)、Frz8-Fc(SEQIDNO:122)、Frz9扁Fc(SEQIDNO:123)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:124)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:125)、sFRP2-Fc(SEQIDNO:126)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:127)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:128)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:129》。图6A-6E显示了人Frz、sFRP、及Ror蛋白的全长氨基断列。图7(A、B、及C)显示了数种Wnt拮抗剂嵌合构建体的氨基酸序列(Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz9画Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2隱Fc(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88))。Frzl-Fc(前28个N端氨基酸残基)、Frz2-Fc(前31个N端氨基酸残基)、Frz3-Fc(前31个N端氨基酸残基)、Frz4-Fc(前31个N端氨基酸残基)、Frz5-Fc(前31个N端氨基酸残基)及sFRP3-Fc(前31个N端氨基酸残基)的粗体文本指示非天然前导序列。接头是加下划线的，而接头之后的Fc结构域以斜体显示。图8显示了巻曲胞外结构域的比对，其中黑色显示了在所有受体间(acrossallreceptors)的保守残基，而灰色表示在同源组内(acrossthehomologousgroupsyf呆守的残基。图9显示了基于全长和胞外结构域序列同一性两者而分入各家族的巻曲蛋白。图10描绘了从CHO细胞表达和纯化的纯化的巻曲蛋白-Fc融合蛋白的样品。将样品在非还原性SDS-PAGE凝胶上分离，并通过考马斯染色成像。图ll显示了两种不同的Frz8-Fc嵌合体Frz8(173)-Fc和Frz(156)-Fc的血清稳定性比较。图llA是人Fc的免疫印迹，其用于在经嵌合物注射的无胸腺棵鼠的血清中检测渐增时间点上存在的嵌合蛋白。图11B显示了嵌合蛋白的Wnt抑制活性，其通过以相对萤光素酶活性测量Y轴上所示的TOPglow活性而获得。图12是肿瘤体积随时间的曲线图，其源自使用Frz8(173)-Fc嵌合物的处理。图13显示了施用单剂Frz8-Fc后测得的所述蛋白质的药动学(PK)数据。图13A是来自用Frz8-Fc处理的小鼠的纯净血清(neatsemm)的免疫印迹，其显示了自20或5mg/kg1.V.或20mg/kg1.P两者中在7天及之后的血清中的检测。图13B和13C是从药动学研究中测定的Frz8-Fc血清水平的图解汇总。图13D是Frz8-Fc药动学两阶段模型(biphasicmodel)的参数汇总表。图14表明Frz8-ECD在连接至二聚Fc结构域后阻断Wnt3a信号传导的能图。图14B的凝胶证实了分离的Frz8(156)CRD(ECD)的纯度。显示的是(a)未减小的(non-reduced)Frz8ECD(第l道);(b)分子量标志物(第2道);及减小的(reduced)Frz8ECD(第3道)。图15表明Wnt3a^JTrz8-Fc嵌合物的直接结合。图15A的BIAcore传感图表明纯化的可溶性Wnt3a对固定化Frz8-Fc的结合。图15B是固定化Frz8-Fc对纯化的可溶性Wnt3a的免疫沉淀。图16表明数种Frz-Fc嵌合物对Wnt配体的直接结合，如使用OCTE丁tm系统所测量的。图16A显示了来自Wnt3a^j"Frzl-Frz10-Fc嵌合物的结合的数据，图16B显示了来自Wnt3a对sFRP-Fc嵌合物的结合的数据。图16C显示了来自Wnt5a对Frz1-Frz10-Fc嵌合物和sFRP-Fc嵌合物的结合的数据。图17显示了Wnt拮抗剂对经TOPglow萤光素酶TCF报道质粒瞬时转染的Wnt刺激细胞的效应。图17A显示了用Wnt3a刺激的细胞，而图17B显示了用Wnt-5a刺激的细胞。在才艮道分子外还用Frz4和Lrp5转染有待用Wnt5a处理的细月包。用100ng/mlWnt3a或lug/mlWnt5a活化293(人肾)细胞。然后对细月包不进行处理，用对照Fc处理，或用PBS中的纯化的Frz-Fc蛋白处理，并测定萤光素酶应答。图18显示了在经萦光素酶TCF报道质粒稳定转染的U20S(人骨肉瘤)细胞中Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制。通过Wnt3a活化获得细胞中的初始Wnt信号传导。图19显示了Frz8-Fc对培养的畸胎瘤细胞和肿瘤异种移植物中Wnt-靶基因表达的效应。图19A显示了Wnt-靶基因在经Wnt3a和Frz8-Fc处理的PA-l细胞系中的表达。将从经Wnt3a、Frz8-Fc、或对照Fc蛋白处理的PA-1细胞中分离的RNA进行微列阵分析，并将所示基因表达水平响应外源添加的Wnt3a、Frz8-Fc、及对照Fc蛋白的变化绘图。柱，来自三个孔的表达水平均值；工形线，标准误差(S)。图19B显示了在来自给予PBS、CD4-Fc、或Frz8-Fc的小鼠的NTera-2胂瘤中的Wnt靶基因APCDDl、Gad-l、及Fzd5相对于PBS对照的相对表达。数据表示来自所示数目肿瘤的表达水平均值，并代表至少两个一式两份进行的独立qRT-PCR实验。还呈现了通过添加纯化的Wnt3a至相应的培养细胞对每种基因表达的调节。图20显示了图19(实施例9)所示基因表达的实时定量PCR分析所使用的引物和探针的编号和序列。图21的线性示意图描绘了用于转染以创建Wnt动物模型的载体构建体。图22显示了Frz8-Fc通过腹膜内(IP)剂量给药对无胸腺棵鼠中MMTV-Wnt肿瘤移植物的功效。图22A的曲线图显示了来自包含MMTV-Wnt-l肿瘤移植物的棵鼠的数据，所述棵鼠通过每周二次腹膜内注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)。将肿瘤体积均值对时间绘图，并通过X轴上的箭头指示了处理日。图22B是四个处理组中随时间的肿瘤体积均值和肿瘤体积均值％变化的列表汇总。图23显示了Frz8-Fc通过静脉内(IV)剂量给药对无胸腺棵鼠中MMTV-Wnt肺瘤移植物的功效。图23A的曲线图显示了来自包含MMTV-Wnt-l肿瘤移植物的棵鼠的数据，所述净果鼠通过每周三次静脉内注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)。将肿瘤体积均值对时间绘图，并通过X轴上的箭头指示了处理日。图23B是四个处理组中随时间的肺瘤体积均值和肿瘤体积均值％变化的列表汇总。图24的条形图显示了自MMTVWnt肿瘤研究分离的血清中各种Wnt拮抗剂的TOPglow测定法中的Wnt信号传导拮抗剂活性。依照处理、小鼠研究数目和稀释度，X轴样品出现在组A-E(图24A)或A-F(图24B)中。TOPGLOW基因报道测定法中的相对安光素酶活性显示在Y轴上。用约40ng/ml纯化的Wnt3a处理除NA(对照)外的所有样品。所有其它蛋白质对照以5吗/ml存在于培养基中。图24A显示了从经IP处理的小鼠中分离的血清的测试结果，而经IV处理的'J、鼠的测试结果显现在图24B中。图25显示了所示畸胎癌细胞系中各种Wnt拮抗剂的TOPglow测定法中的Wnt信号传导拮抗剂活性，其在没有(图25A)外源添加的Wnt3a时或存在(图25B)外源添加的Wnt3a时测定。对于每种细月包系，活性表述成相对于没有任何处理(NA)时观察到的活性；其代表至少两个独立的实验。从TOPglow测定法中测量各种癌细胞系的相对萤光素酶活性(Y轴)，其在存在Wnt抑制剂时或没有Wnt抑制剂时测量。图26显示了Frz8(156)-Fc处理对无胸腺棵鼠中NTera2肿瘤异种移植物生长的抗胂瘤功效。图26A是规程流程图，而图26B的曲线图描绘了随时间的肿瘤体积均值，其中处理日通过X轴上的箭头指示。图26C的条形图描绘了研究的第20天处死该组中所有动物时的肿瘤重量均值。图26D和26E分别是肺瘤体积均值和肿瘤体积均值。/。变化的列表汇总。图27的条形图显示了自NTera2肿瘤研究中的各个动物分离的血清的Wnt信号传导拮抗剂活性，正如TOPglow测定法所测定的。Y轴显示了来自对照和Frz8-FcWnt拮抗剂的TOPglow测定法的相对萤光素酶活性(Y轴)。没有向细胞添加额外的纯化的Wnt或Wnt条件化培养基。图28显示了Frz8(156)-Fc处理对无胸腺棵鼠中PA-l肿瘤异种移植物生长的抗肺瘤功效。图28A是规程流程图，而图28B的曲线图描绘了随时间的肿瘤体积均值。图28C是处死时胂瘤重量均值的曲线图。将肿瘤重量均值±SEM作为分组的函数绘图。图28D和28E分别是肿瘤体积均值和肿瘤体积均值。/。变化的列表汇总。图29显示了在用Frz8-Fc或Frz5-Fz处理的小鼠中的Wnt信号传导抑制，正如TOPglow测定法所测定的。Y轴显示了来自对照和Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗剂的TOPglow测定法的相对萤光素酶活性(Y轴)。图30显示了用Frz8-Fc和Frz5-Fz处理的肺瘤中降低的轴蛋白2表达，其中图30A显示了相对于GAPDH表达标准化的表达，而图30B显示了相对于rpl19表达标准化的表达。图31显示了(3-联蛋白的免疫组织化学(IHC)染色的IHC显微照片，并表明对再生组织(诸如肠和皮肤)的Frz8-Fc处理表现正常。图31A显示了经PBS(A-1)、对照蛋白质(A-2)、及Frz8-Fc(A-3)处理的小鼠的小肠中P-联蛋白的IHC。图31B显示了经PBS(B-l)、对照蛋白质(B-2)、及Frz8-Fc(B-3)处理的小鼠的皮肤中(3-联蛋白的IHC。图32显示了人乳腺癌中的活性Wnt信号传导。图32A显示了在正常的(A-l)、低等级的(A-"和高等级的(A-:3)人乳腺肿瘤中的Wnt-l表达(如通过体外杂交所示的),其最初报道于Wong等，J.Pathol.196:145(2002)。图32B显示了乳腺癌患者中(3-联蛋白的核(B-l)定位和胞质(B-2)定位(如通过IHC所示的)。还显示的是Kaplan-Meier存活曲线(B-3)，其显示了与所示(3-联蛋白表达样式相关的患者存活概率。该数据最初报道于Lin等，P.N.A.S.(USA)97(8):4262-66(2000)。图32C是Wnt-l表达的微列阵分析，其比较了来自没有癌症的患者的正常乳房与从患有her-2阴性浸润性(导)管癌的患者中分离的组织。发明详述I.定义"Wnt蛋白，，是结合巻曲受体以激活Wnt信号传导的Wnt信号传导途径成分配体。Wnt蛋白的具体例子包括至少19个成员，包括Wnt-l(RefSeq.:薩—005430)、Wnt画2(RefSeq.:画—003391)、Wnt隱2B(Wnt陽13)(RefS叫:画—004185)、Wnt-3(ReS叫.NM—030753)、Wnt3a(RefSeq.:薩—033131)、Wnt-4(RefSeq.:画—030761)、Wnt-5A(RefS叫.薩—003392)、Wnt画5B(RefSeq.:NM—032642)、Wnt-6(RefSeq.:NM_006522)、Wnt隱7A(RefS叫.:丽—004625)、Wnt-7B(RefSeq.:NM—058238)、Wnt-8A(RefS叫.:画—058244)、Wnt-8B(RefS叫濯—003393)、Wnt-9A(Wnt匿14)(RefSeq.:NM一003395)、Wnt-9B(Wnt-15)(RefSeq.:NM一003396)、Wnt-10A(RefSeq.:NM—025216)、Wnt-10B(RefSeq.:NM—003394)、Wnt-ll(RefSeq.:NM_004626)、Wnt-16(RefS叫.NM_016087))。虽然每个成员具有不同程度的序列同一性，但是每个都含有显示高度保守间隔的23-24个保守半胱氨酸残基。McMahon，AP等，TrendsGenet.8:236-242(1992);MillerJR.,GenomeBiol.3(1):3001.1-3001.15(2002)。为了本发明的目的，Wnt蛋白及其活性变体指结合巻曲ECD或此类FrzECD的CRD构件的蛋白质。"巻曲"(Frz)蛋白是一种Wnt信号传导途径成分且是7次跨膜受体，其能结合Wnt蛋白，并进一步与其它膜结合的Wnt信号传导成分复合以将Wnt信号传导传递至下游月包内成分。Frz蛋白包4舌Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、及FrzlO。人全长Frz蛋白的例子是hFrzl(NP—003496)(SEQIDNO:1)、hFrz2(NP一001457)(SEQIDNO:2)、hFrz3(NP—059108)(SEQIDNO:3)、hFrz4(NP036325)(SEQIDNO:4)、hFrz5(NP—003459)(SEQIDNO:5)、hFrz6(NP—003497)(SEQIDNO:6)、hFrz7(NP—003498)(SEQIDNO:7)、hFrz8(NP—114072)(SEQIDNO:8)、hFrz9(NP—003499)(SEQIDNO:9)、及hFrzlO(NP009128)(SEQIDNO:10)(图6A-6C)。"分泌型巻曲相关蛋白"(sFRP)是一种Wnt信号传导途径成分且是能结合Wnt蛋白的分泌型胞外多肽。sFRP蛋白包括sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、及sFRP5。人全长sFRP蛋白的例子是sFRPl(NP—003003)(SEQIDNO:11)、sFRP2(NP—003004)(SEQIDNO:12)、sFRP3(NP001454)(SEQIDNO:13)、sFRP4(NP—003005)(SEQIDNO:14)、及sFRP5(NP—003006)(SEQIDNO:15)(图6C-6D)。"Ror"蛋白包括哺乳动物同系物，即Rorl和Ror2,其特征在于胞外巻曲蛋白样富含半胱氨酸的结构域(CRD)以及近膜三环域。Ror蛋白在发育形态发生中发挥至关重要的作用，并与细胞骨架的不同成分有关。Rorl与F-肌动蛋白沿着应力纤维共定位(co-localize)，而Ror2与微管部分共定位。Rorl和Ror2共享约5S。/。的总体序列同一性。Roi^与黑素瘤相关抗原(MAGE)家族蛋白质Dlxin-l结合(associate),并调节其胞内分布。Rorl蛋白包括Rorl和Ror2。人全长Ror蛋白的例子是hRorl(NP—005003)(SEQIDNO:16)及hRor2(NP一004551)(SEQIDNO:17)(图6D陽6E)。"Frz结构域构件"指能够与Wnt蛋白结合的自Frz蛋白、sFRP蛋白、Ror蛋白、或其它蛋白质衍生的多肽。"衍生自"某蛋白质或"自"某蛋白质"衍生，，的多肽指具有可以在参照蛋白质序列内或在蛋白质活性变体的序列内找到的氨基酸序列的多肽。Frz结构域构件的例子包括Frz蛋白、sFRP蛋白、Ror蛋白的胞外结构域"CRD(ECD)"(诸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl、或Roi^的CRD(ECD))的最低限度富含半胱氨酸的结构域(CRD)及其活性变体。CRD(ECD)是100至250个氨基酸的保守结构基序，并通过10个高度保守的半胱氨酸定义。人CRD(ECD)的具体例子以划上方框的文本显示在图3B中，并表示为SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzl0(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、及hRor2(SEQIDNO:34)。Frz结构域构件的别的例子包括自Frz或sFRP蛋白原(诸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)衍生的Frz结构域原(pro-Frzdomain)及其活性变体。人Frz结构域原的具体例子显示于图3A中，并表示为SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrz10(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。Frz结构域构件的别的例子包括自成熟Frz、sFRP、或Ror蛋白(诸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl、或Ror2)书f生的成熟Frz结构域及其活性变体。人成熟Frz结构域的具体例子显示在图3B中，并表示为SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrz10(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、及hRor2(SEQIDNO:66)。"Wnt拮抗剂"是包含Frz结构域构件和免疫球蛋白Fc结构域的嵌合多肽，其能结合Wnt蛋白，且有减弱细胞Wnt信号传导或由此引起的生理学症状的活性。在某些实施方案中，Fc结构域是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域是人IgGlFc结构域。Fc结构域的具体例子显示在图4、5和图7及SEQIDNO:67和SEQIDNO:68中。在有些实施方案中，Frz结构域构件和Fc结构域是通过接头融合的。术语"接头"指将Frz结构域构件与Fc结构域拴在一起的构件。适于在本发明中使用的接头对Wnt拮抗剂分子的蛋白质结构域的表达、分泌和折叠展现最低限度干扰或没有干扰，并给Fc结构域的效应器功能或Frz结构域的Wnt蛋白相互作用功能(例如结合至Wnt蛋白)提供最低限度干扰或没有干扰，所述干扰是不通过立体的或其它的手段实现的。在具体的实施方案中，接头是短肽序列。接头序列还可以包括活性所需的最低限度残基外的来自Frz结构域构件或Fc结构域的别的氨基酸残基。优选的接头还会提供优秀的血清稳定性，并对蛋白酶切割有抗性。有用的接头的具体例子显示在图4、图5、及图7中，包括序列ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。如上文所述，这些接头可以包括活性所需的最低限度残基外的来自Frz结构域构件或Fc结构域的别的氨基酸残基。这些接头还可以包含除来自Frz结构域构件或Fc结构域构件的那些之外的别的氨基酸残基。"Wnt信号传导途径成分"指转导源自Wnt蛋白和Frz受体之间相互作用的信号的成分。因为Wnt信号传导途径是复杂的，并牵涉广泛的反馈调节，因此Wnt信号传导途径有很多的且可能尚未发现的成员。Wnt信号传导途径成分的例子包括膜结合蛋白LRP5和LRP6、轴蛋白、和散乱蛋白(Dishevelled)、胞外Wnt相互作用性蛋白sFRP、WIF-1、LRP灭活蛋白Dkk和Krn、胞质蛋白(3-联蛋白、(3-联蛋白"降解复合物"APC的成员、GSK3卩、CKIa和PP2A、核运输蛋白APC、pygopus和bcl9/无腿(legless)、及转录因子TCF/LEF、Groucho和各种组蛋白乙酰基转移酶诸如CBP/p300和Brg-1。"Wnt介导的病症"指特征在于异常Wnt信号传导的病症、疾患、或疾病状态。在具体的方面，异常Wnt信号传导指怀疑患病的细胞或组织中的Wnt信号传导水平超过类似的未患病的细胞或组织中的Wnt信号传导水平。在具体的方面，Wnt介导的病症包括癌症。术语"癌症"指哺乳动物中特征通常在于不受调节的细胞生长/增殖的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、和白血病。癌症的更具体例子包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、印巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肠的类癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞瘤、食管癌、肺的腺癌、间皮瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、头颈鳞状细胞癌、青少年鼻咽血管纤维瘤、脂肪肉瘤、曱状腺癌、黑素瘤、基细胞癌(BCC)、髓母细胞瘤及硬纤维瘤(desmoid)。术语"控制序列"指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于例如原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、及增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连4妄的"。例长口，若前序歹'J(presequence)或分;必前导(secretoryleader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein),则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的定位促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，"可操作连接的，，意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。"活性"多肽、变体多肽、或其片段保留活性多肽的天然或自然存在成分的生物学活性。生物学活性指由活性多肽的天然或自然存在对应物介导的功能。例如，结合或蛋白质-蛋白质相互作用构成生物学活性。在一种具体的意义中，活性Wnt信号传导途径成分可以是通过与其它Wnt信号传导途径成分相互作用而有效地转导信号的成分。在另一种具体的意义中，活性Wnt拮抗剂是相对于施用Wnt拮抗剂之前的水平，可检测地减弱Wnt信号传导或由此引起的生理学疾患的成分。杂交反应的"严格性，，可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubd等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyIntersciencePublishers，1995。"高严格性条件"，如本文中所定义的，可以如下鉴定(l)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠，于50。C;(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如曱酰胺，例如50。/。(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠緩沖液pH6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42。C;或(3)在如下溶液中于42。C过夜杂交，所述溶液采用50%曱酰胺，5xSSC(0,75MNaCl，0.075M柠4蒙酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦石粦酸钠，5xDenhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50吗/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，及于42。C在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中清洗10分钟，接着于55。C在含EDTA的0.1xSSC中高严格性清洗10分钟。"中等严格条件"可以如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborPress,1989中所述鉴定，包括使用比上文所述较不严格的清洗溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37。C在含20。/。曱酰胺，5xSSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50。C在lxSSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。术语"加表位标签的，，指与"标签多肽，，融合的多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。范例表位标签序列包括HA、GD、c-myc、多His及FLAG。"治疗"或"处理"或"緩和"指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减緩(减轻)所靶向的生理学疾病或病患或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及倾向于患上病症的受试者或要预防(prevent或prophylaxis)病症的受试者。在Wnt介导的病症是癌症时，若在依照本发明的方法接受治疗量的Wnt拮抗剂后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，则受试者或哺乳动物被成功"治疗"或显示降低的肿瘤负荷癌细胞数减少或癌细胞消失；肺瘤大小的降低；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肺瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低，及生命质量提高。就Wnt拮抗剂可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些征候或症状的减轻还可以由患者感受到。用于在病症中评估成功治疗和改善的上述参数是通过内科医师所熟悉的常规规程可容易测量的。对于癌症疗法，功效可以通过例如评估病情进展前时间(TDP)和/或测定应答率(RR)来测量。可以如下测定转移，即通过分期(staging)测试和通过骨扫描和针对锅水平及其它酶的测试以测定对骨的扩散。还可以进行CT扫描以在该区域中找寻对骨盆和淋巴结的扩散。使用胸部X射线和通过已知方法进行的肝脏酶水平测量来分别找寻对肺和肝的转移。用于监测疾病的其它路径包括经直肠超声检查法(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。"长期"施用指以与短期(acute)模式相反的连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长的一段时间。"间歇"施用指循环性的或受到周期性中断的处理，与连续的(continuous或consecutive)形成对比。"哺乳动物"指归入哺乳类的任何哺乳动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、家兔等。优选的是，哺乳动物指人。"联合，，一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的序贯施用。"载体，，在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH緩沖水溶液。生理学可接受载体的例子包括緩冲剂，诸如磷酸盐、杵檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。Wnt拮抗剂的"有效量"指足以实现明确规定的目的的量。"有效量"可凭经验且以常规方式，联系规定的目的来确定。术语"治疗有效量"指Wnt拮抗剂有效"治疗"受试者或哺乳动物中Wnt介导的病症的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数目；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减緩，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减緩，优选停止)肿瘤转移；一定程度地抑制肿瘤生长；和/或一定程度地减轻与癌症有关的一种或多种症状。参见本文中"治疗"的定义。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。Wnt拮抗剂的"生长抑制量"指能够在体外或在体内抑制细胞，尤其是肺瘤，例如癌细胞生长的量。Wnt拮抗剂为了抑制赘生性(neoplastic)细胞生长的"生长抑制量，，可凭经验且以常规方式来确定。Wnt拮抗剂的"细胞毒性量，，指能够在体外或在体内引起细胞，尤其是肺瘤，例如癌细胞破坏的量。Wnt拮抗剂为了抑制赘生性细胞生长的"细胞毒性量，，可凭经验且以常规方式来确定。术语"抗体"和"免疫球蛋白"可互换且以最广义使用，包括单克隆抗体(例如全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多^N元体、多特异性抗体(例如展现出想要的生物学活性的双特异性抗体)，而且还可以包括某些抗体片段，正如本文更详细描述的。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的或亲和力成熟的。根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡巾自(K)和拉姆达(人)。根据其重链恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。免疫球蛋白有五类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们分别具有称为a、S、e、Y和P的重链。Y和a类根据CH序列和功能中相对微小的差异而进一步分为亚类，例如人表达如下亚类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，并一般性地记载于例如Abbas等，CellularandMolecularBiology,第4版(2000)。抗体可以是通过抗体与一个或多个其它蛋白质或多肽的共价或非共价结合而形成的较大融合分子的一部分。"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(美国专利5,641,870);Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995);单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体生成两个相同的抗原结合片段(称为"Fab"片段)，及剩余的"Fc"片段(其名称反映易于结晶的能力)。Fab片段由一条完整轻链以及一条重链的重链可变区结构域(VH)及第一恒定域(CHl)组成。每个Fab片段关于抗原结合是单价的，即其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生了单个大的F(ab，)2片段，其大致对应于经二硫化物连接的、具有二价抗原结合活性的两个Fab片段，并仍能够交联抗原。Fab，片段与Fab片段的不同之处在于其在CHl结构域的羧基末端具有额外的几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)识别的部分。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。明确包括在单克隆抗体定义内的术语"嵌合"抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现期望生物学活性(美国专利4,816，567;Morrison等，P.N.A.S.USA81:6851-6855(1984))。非人(例如啮齿类)抗体的"人源化，，形式是包含自非人抗体衍生的最低限度序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基为具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区的残基所替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基为相应的非人残基所替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中都未找到的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。更多细节参见Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Trans.23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。"多核香酸"或"核酸"在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括但不限于DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核普酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核香酸可包含经修饰的核苷酸，诸如曱基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后引入。核芬酸序列可以由非核苦酸成分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如"帽"，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苦酸间修饰诸如例如不带电荷连接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)；带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，悬垂模块(pendantmoiety)，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、烷化剂、经修饰的连接(例如a端基异构核酸(anomericnucleicacid)等)。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可偶联至固相或半固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或l-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苦酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-0-曱基、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，a-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如曱基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯用p(o)-S-(硫代酸酯(thioate))、P(S)-S-(二硫代酸酯(d他ioate))、(0)NR2-(酰胺酉旨(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2-(曱缩醛(formacetal))替换，其中R或R'各自独立为H或者取代的或未取代的Cwo烃基，任选含有醚、芳基、烯基、环烯基或芳烃基连接。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多核苦酸，包括RNA和DNA。术语"肽"一般指通过肽键连接的氨基酸的连续且相对短的序列。典型地，但不是必须地，肽的长度为约2-50个氨基酸、4-40个氨基酸或10-30个氨基酸。虽然术语"蛋白质"一般指"多肽"的较长形式，但是两个术语在本文的有些背景中可以互换使用，指一般较长且可能较复杂的氨基酸序列(例如多重序列，二级和更高级结构)。多肽的"区域"指2个或更多个氨基酸残基的连续序列。在备选的实施方案中，区域是至少约3个、5个、IO个、15个或更多个连续的氨基酸残基。"C端区域"、"C端序列，，及其变化形式在用于本文时指位于C端(一般是3，)末端或与C端末端极接近的氨基酸序列。一般地，所述序列包括具有游离羧基的氨基酸。在一个实施方案中，C端区域或序列指包括约l-15个距离C末端最近的残基的多肽区域。"N端区域"、"N端序列"及其变化形式在用于本文时指位于N端(一般是5，)末端或与N端末端极接近的氨基酸序列。一般地，所述序列包括具有游离氨基的氨基酸。在一个实施方案中，N端区域或序列指包括约l-15个距离多肽N末端最近的残基的多肽区域。"内部区域"或"内部序列"及其变化形式指位于多肽内且在其N端和C端侧翼有一个或多个不是该序列一部分的氨基酸的氨基酸序列。一般地，该序列不包括具有游离羧基或氨基的氨基酸。"配体，，指能够与蛋白质或其它分子(诸如受体)上特定位点结合相互作用的天然存在的或合成的分子或模块。Wnt配体指与巻曲受体特异性相互作用的分子。"受体，，通常但非必须位于细胞表面或膜上。"融合蛋白"指具有两个共价连接在一起的部分的多肽，其中每个部分是从不同蛋白质衍生的。所述两个部分可通过单个肽键直接连接，或者经由包含一个或多个氨基酸残基的肽接头。通常，所述两个部分和接头会彼此处于读码框中，并使用重组技术来生成。"抑制肿瘤细胞生长"的Wnt拮抗剂或"生长抑制性"Wnt拮抗剂指导致具有异常Wnt信号传导活性的肿瘤细胞可测量的生长抑制的Wnt拮抗剂。与适当的对照相比，优选的生长抑制性Wnt拮抗剂将具有异常Wnt信号传导活性的肺瘤细胞的生长抑制大于20%,优选从约20%至约50%，甚至更优选大于50%(例如从约50%至约100%)，所述对照典型地是没有用正^f皮测试的Wnt拮抗剂分子处理的癌细胞。在一个实施方案中，可以在细胞培养物中在约0.1至30)ag/ml或约0.5nM至200nM的Wnt拮抗剂浓度测量到生长抑制，其中所述生长抑制是在肿瘤细胞暴露于Wnt拮抗剂后l-10天测定到的。体内肿瘤细胞的生长抑制可以以多种方式测定，诸如在下述实验实施例部分中所述的。若施用约l(ig/kg至约100mg/kg体重的Wnt拮抗剂导致肿瘤大小或细胞增殖在离第一次施用抗体约5天至3月内，优选在约5至30天内降低，则Wnt拮抗剂在体内是生长抑制性的。在一个具体的方面中，肿瘤大小相对于其在疗法开始时的大小是下降的。术语"细胞增殖性病症"和"增殖性病症"指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。"月中瘤，，在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。"诱导细胞死亡"的Wnt拮抗剂分子指使可存活细胞变为无法存活的Wnt拮抗剂。所述细胞是与相同组织类型的正常细胞相比具有异常的Wnt信号传导活性的细胞。优选地，如本文所定义，所述细胞是癌细胞。体外的细胞死亡可以在没有补体和免疫效应器细胞时测定以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，细胞死亡测定法可以使用热灭活血清(即在没有补体时)且在没有免疫效应器细胞时实施。为了测定Wnt拮抗剂是否能够诱导细胞死亡，可以相对于未处理细胞评估通过碘化丙锭(PI)、锥虫蓝(参见Moore等，Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD摄取所评估的膜完整性丧失。优选的细胞死亡诱导性抗体、寡肽或其它有机分子是那些在BT474细胞中在PI摄取测定法中诱导PI摄取的。单词"标记物"在用于本文时指与抗体、寡肽或其它有机分子直接或间接偶联从而产生"经标记的"或"带标记物的"抗体、寡肽或其它有机分子的可检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或焚光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)；化疗剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。下文描述了其它细胞毒剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。"化疗剂，，指在治疗癌症中有用的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);石黄酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和p泉泊舒凡(piposulfan);氮丙p定类(aziridines),i者啧口苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑蜂酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑石克代石岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酉旨类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));5-9-四氬屈大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);(3-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦月旨酸(betulinicacid);喜杉于石成(camptothecin)(包4舌合成类似物才乇泊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东复菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特另'J是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每绵#卩素(spongistatin);氛芥类(nitrogenmustards),"i者^口苯丁酉交氛齐(cWorambudl)、蔡氛齐(chlornaphazine)、月旦石寿醜胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、异环石粦酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酉臾氧氛芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仓(melphalan)、l斤氛芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、〉发尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracilmustard);亚；肖脲类(nitrosoureas),i者i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、-畐莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素yll和加利车霉素(oil(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin),放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomydn)、柔红霉素(daunorubicin)、i也4乇比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、及脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、4尹达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、揪榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二曱叶酸(denopterin)、曱氨虫莱呤、虫莱酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物，i者如氟达4立滨(fludarabine)、6-巯基嘌口令(mercaptopurine)、石克口米嘌口令(thiamiprine)、硫鸟。票呤(thioguanine);嘧咬类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苦、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞芬(cytarabine)、双脱氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine);主,;敫素类，i者如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酉交屈j也名,酮(dromostanolonepropionate)、表石克力,酉孚(epitiostanol)、美i,火克(m印itiostane)、睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉交(aminolevulinicacid);恩尿口密口足(eniluracil);安p丫口定(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(bisantrene);依达曲沙、(edatraxate);地石粦酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);dfornithine;依利醋按(elliptiniumacetate);epothilone;依托格鲁(etoglucid);硝酸《家；羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物石咸类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米4乇胍月宗(mitoguazone);米4乇葱、酉昆(mitoxantrone);莫哌达醇(m叩idamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);虫累i走错(spirogermanium);纟田交《连孑包菌酉同卧复(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);达卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);、派泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids),例3口TAXOL⑧帕利j也塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANETM无克列莫佛的(Cremophor-free)清蛋白改造的纟内米颗斗立剂型巾白利4也塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6nePoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR);6-石克鸟噤呤(thioguanine);巯基噤呤(mercaptopurine);曱氨蝶呤(methotrexate);賴类似物，"i者如顺粕(cisplatin)和卡4白(carboplatin);长春石咸(vinblastine)(VELBAN);钼；依托泊普(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新石成(vincristine)(ONCOVIN);奥沙利柏(oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基虫莱呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸(retinoids),诸如视黄酸(retinoicacid);卡培他滨(capecitabine)(XELODA);任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN)if关合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如LUPRON⑧和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞4木(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另夕卜，化疗剂的这种定义包4舌二膦酸盐类(bisphosphonates),i者如氯麟酉艾盐(clodronate)(侈'J^t口BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA⑧唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿伦膦酸盐(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID⑧替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸盐(risedronate);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓朴异构酶l抑制剂；ABARELIX⑧rmRH;lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。"生长抑制剂"在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是具有Wnt信号传导活性的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的此类细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓朴异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔纟工審素(daunorubicin)、依4乇泊苦(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴。秦(dacarbazine)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶令(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecularBasisofCancer,Mendelsohn和Israel编，第1章，题为"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等(WBSaunders,Philadelphia,1995),尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer)是帕利他塞(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。"多柔比星(Doxombicin)"是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-a-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6，8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-l-曱氧基-5,12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9，10-tetrahydro-6,8,ll-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-l-methoxy-5,12-naphthacenedione术语"包装插页"用于指通常包括在治疗用产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。II.具体实施方案的描述本文所述Wnt拮抗剂能够在体外结合Wnt配体，并能够抑制或阻抑Wnt刺激的细胞信号传导。另外，Wnt拮抗剂具有较长的体内半衰期，并展现体内抗肿瘤活性，其在小鼠MMTV乳房肿瘤模型中抑制Wnt-1驱动的肿瘤的生长。Wnt拮抗剂还能够在自人畸胎瘤细胞系衍生的肿瘤异种移植物的小鼠中抑制生长。从用Wnt拮抗剂处理的小鼠中采集的再生组织表现为在生理学规范(physiologicalnorm)之内。Wnt拮抗剂还能够在体外抑制人肿瘤细胞系中的自分泌Wnt信号传导。巻曲受体蛋白可以基于全长和细胞外结构域序列同一性两者分成家族。这种分组以图8和9中所示比对显示。在该图中加下划线的残基在所有Frz受体间(acrossalltheFrzreceptors)是保守的，而附阴影的残基在同源分组间(acrosshomologousgroupings)是寸呆守的。Frz蛋白可以分成^口下家》美1)Frzl、Frz2、及Frz7,它们具有全长序列上68-77%的共享同源性和ECD上90。/。的共享同源性；2)Frz5和Frz8,它们具有全长序列上57°/。的共享同源性和ECD上80%的共享同源性；3)Frz9和Frz10,它们具有全长序列上61°/。的共享同源性和ECD上74。/。的共享同源性；4)Frz3和Frz6,它们具有全长序列上49%的共享同源性和ECD上50。/。的共享同源性；及5)Frz4(其与FrzlO展现全长序列上46。/。的共享同源性和ECD上48。/o的共享同源性)。Frzl、Frz2、及Frz7的家力矣与果蝇Frzl具有显著的同源性，而Frz5和Frz8的家族与果蝇Frz2具有显著的同源性，显示它们分别负责平面细胞极性和Wnt信号传导。Wnt配体-巻曲蛋白结合行为似乎在巻曲蛋白家族内聚簇。相对于其它Frz蛋白，Wnt3a和Wnt5a两者最快地结合Frz5、Frz8和Frz4，而Wnt3a以较慢的速率结合Frzl、Frz2、和Frz7。Wnt5a结合行为的幅度和线性性质指示较低的结合亲和力(相对于Wnt3a结合)，正如通过OCTETTM结合测定法所测定的。高亲和力和低亲和力受体两者的存在可以赋予剧烈的和长期的信号传导能力。Wnt拮抗剂抑制Wnt配体诱导的信号传导的能力还表现为在巻曲蛋白家族内聚簇。Frz5和Frz8两者在基于细胞的测定法中显示对Wnt3a信号的完全抑制和对Wnt5a信号的显著抑制(实施例7)。Frz4、Frz2、和Frz7显示对Wnt3a信号的显著抑制。此发现映射了果蝇中的观察结果，即dFrz2(与Frz5和Frz8具有同源性)强烈地激活Wnt途径，而dFrzl(与Frzl、Frz2、及Frz7具有同源性)能微弱地激活Wnt途径。虽然不限于具体的作用理论，但是本文所示数据指出使用Wnt拮抗剂所产生的基于细胞的Wnt信号传导抑制数据与通过测量Wnt配体对Wnt拮抗剂的直接结合所获得的数据相关，指出Wnt拮抗剂直接结合Wnt配体，如此阻断它们结合细胞上的全长巻曲受体。本文所示数据进一步提供了如下验证，即可以使用体外活性来预测Wnt拮抗剂的体内Wnt信号传导阻断活性。如实施例中提出的使用Fz8-Fc的研究中所指出的，包含巻曲结构域和免疫球蛋白Fc结构域两者的Wnt拮抗剂惊人地展现出比单独的巻曲结构域增加的对Wnt配体的结合亲和力。例如，图14显示了在将FzECD结构域转变为Fz(156)-Fc构建体后结合亲和力增加了两个数量级以上。Fz(156)-Fc构建体作为稳定且高度有效的Wnt信号传导抑制剂的发现(其中与Fc的偶联导致结合亲和力两个数量级的增加)是非常意外的且不是显而易见的。A.本发明的组合物和方法1.多肽本发明针对用于治疗Wnt介导的病症(包括癌症)和用于抑制细胞Wnt信号传导的组合物和方法。本发明一方面提供了如下Wnt拮抗剂，其是包含巻曲(Frz)结构域构件和免疫球蛋白Fc结构域的嵌合分子。在此方面的具体实施方案中，Frz结构域构件和Fc结构域是经由接头融合的。另一方面提供了这些Wnt拮抗剂用于抑制细胞Wnt信号传导及用于治疗Wnt介导的病症(诸如癌症)的用途。一方面，本发明提供了如下Wnt拮抗剂，其是含Frz结构域构件的嵌合分子，所述Frz结构域构件包含细胞外结构域"CRD(ECD)"的最低限度富含半胱氨酸的结构域(CRD)。CRD(ECD)是100至250个氨基酸的保守结构基序，并通过10个高度保守的半胱氨酸限定。此蛋白质结构域出现在两类Wnt信号传导家族中一一称为巻曲蛋白的膜内在Wnt受体蛋白，和称为巻曲相关蛋白(sFRP)的分泌型胞外蛋白。一方面，本发明提供了如下Wnt拮抗剂，其是具有Frz结构域构件的嵌合分子，所述Frz结构域构件包含巻曲蛋白(诸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、或FrzlO)的CRD(ECD)。图3B中提供了此类CRD(ECD)的例子。在具体的实施方案中，Frz结构域构件选自hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)的CRD(ECD)及其活性变体。或者，Frz结构域构件包含例如来自分泌型巻曲相关蛋白(sFRP)(诸如sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)的CRD(ECD)。图3B中提供了此类CRD(ECD)的例子。在具体的实施方案中，Frz结构域构件选自sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)的CRD(ECD)或其活性变体。或者，Frz结构域构件包含例如受体酪氨酸激酶Ror1和Ror2的CRD(ECD)。图3B中提供了此类CRD(ECD)的例子。在具体的实施方案中，Frz结构域构件选自hRorl(SEQIDNO:33)和hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)及其活性变体。另一方面，Frz结构域构件是Frz原或sFRP原序列(pro-Frzorpro-sFrpsequence),其例子显示在图3A中。在具体的实施方案中，Frz结构域构件选自hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrzlO(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)及其活性变体。又一方面，Frz结构域构件书f生自成熟Frz、sFRP或hRor序列，其例子显示在图3B中。在具体的实施方案中，Frz结构域构件选自hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、和hRor2(SEQIDNO:66)及其活性变体。在具体的实施方案中，嵌合Wnt拮抗剂分子的Frz结构域构件和免疫球蛋白Fc结构域是通过接头融合的。在一个实施方案中，所述接头是肽接头。在另一个实施方案中，所述接头选自ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。任选地，接头可以包括来自Frz结构域构件或Fc结构域的、活性所需的最低限度残基以外的别的氨基酸残基。这些接头还可以包含除来自Frz结构域构件或Fc结构域构件的那些之外的别的氨基酸残基。在一个实施方案中，Wnt拮抗剂是包含Frz8CRD(ECD)和Fc结构域的Frz8-Fc嵌合体。在有些实施方案中，Frz8-Fc嵌合体进一步包含接头，诸如肽接头。在进一步的实施方案中，Frz8-Fc进一步包含前导序列。在具体的实施方案中，Frz结构域构件包含Frz8蛋白(SEQIDNO:8)的氨基酸1-156。在另一个实施方案中，所述Fc构件是人Fc。在进一步的实施方案中，所述Fc构件是人IgGFc。在又一个实施方案中，Frz8-Fc具有通过接头与人IgGFc融合的包含Frz8蛋白氨基酸l-156的Frz结构域构件。在进一步的实施方案中，Frz8-Fc是具有图4B中所示氨基酸序列(SEQIDNO:74)的嵌合体。在用于实施例和附图时，除非另有说明，"Frz8-Fc"指图4B中所示的嵌合体(SEQIDNO:74)。在进一步的实施方案中，Wnt拮抗剂是包含Frz5CRD(ECD)和Fc结构域的Frz5-Fc嵌合体。在有些实施方案中，Frz5-Fc嵌合体进一步包含接头，诸如肽接头。在进一步的实施方案中，Frz5-Fc进一步包含前导序列。在具体的实施方案中，Frz结构域构件包含Frz5蛋白(SEQIDNO:5)的氨基酸27-155。在另一个实施方案中，所述Fc构件是人Fc。在进一步的实施方案中，所述Fc构件是人IgGFc。在又一个实施方案中，Frz5-Fc具有通过接头与人IgGFc融合的前导序列和包含成熟Frz5蛋白氨基酸27-155的Frz结构域构件。在进一步的实施方案中，Frz5-Fc是具有图7A所示氨基酸序列(SEQIDNO:75)的嵌合体。在用于实施例和附图时，除非另有说明，"Frz5-Fc"指图7A中所示的嵌合体(SEQIDNO:75)。类似地，进一步的实施方案包括Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3陽Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frz-10陽Fc、sFRPl-Fc、sFRP2-Fc、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc和sFRP5-Fc嵌合体，其包含Frz结构域构件和Fc构件，所述Frz结构域构件包含来自每种相应Frz或sFRP蛋白的FrzCRD(ECD)。在有些实施方案中，Frz-Fc嵌合体进一步包含接头，诸如肽接头。在进一步的实施方案中，这些嵌合体包含前导序列。在有些实施方案中，所述Fc构件是人Fc。在进一步的实施方案中，所述Fc构件是人IgGFc。在进一步的实施方案中，这些嵌合体具有通过接头与人IgGFc融合的前导序列和FrzCRD(ECD)。在进一步的实施方案中，这些嵌合体具有图7A、7B和7C中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:76-88)。在用于实施例和附图时，除非另有说明，"Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frz-10-Fc、sFRPl-Fc、sFRP2-Fc、和sFRP4-Fc"指图7A、7B和7C中(SEQIDNO:76-85及87)所示的相应嵌合体。Wnt拮抗剂在体内是稳定的。先前利用附着于Fc构件的巻曲结构域的构建体在体内被快速降解，使它们不适于用作治疗性化合物(Hsieh,J-C.等,PNAS,96:3546-3551(1999))。本文所述Wnt拮抗剂比先前构建体实质性更长地保持体内稳定性。如实施例4(图13)所示，Frz8-FcWnt拮抗剂展现约4天的体内半衰期。因而，本发明提供了在给哺乳动物施用后具有至少l天、2天、3天、或4天的体内半衰期的Wnt拮抗剂。此外，如实施例3(图ll)所示，Wnt拮抗剂比先前构建体实质性更长地在体内保持活性。在一个实施方案中，在给哺乳动物施用Wnt拮抗剂后其活性持续至少30分钟、l小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、IO小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时、44小时、48小时、52小时、56小时、60小时、64小时、68小时、72小时、80小时、90小时、或100小时。如下测量活性，例如如实施例3和11中所提出的那样对施用Wnt拮抗剂的哺乳动物的血清测试抑制Wnt信号传导的能力，或使用本领域已知的其它方法。2.核酸本发明一方面提供了编码本文所述Wnt拮抗剂的核酸。在具体的实施方案中，核酸编码如下Wnt拮抗剂，其包含hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzlO(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、或hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)。在其它的实施方案中，核酸编码包含选自下组的Frz或sFRP蛋白原(pro-Frzorpro-sFrpprotein)的Wnt拮抗剂hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrzl0(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在其它实施方案中，核酸编码包含选自下组的成熟Frz、sFRP或hRor蛋白的Wnt拮抗剂hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、和hRor2(SEQIDNO:66)。在其它实施方案中，核酸编码如下Wnt拮抗剂，其包括Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、或sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在一个具体的实施方案中，核酸编码Frz8-Fc,并包含SEQIDNO:122(图5D)中所示核酸序列。在另一个实施方案中，核酸编码Frz5-Fc，并包含SEQIDNO:119(图5C)中所示核酸序列。在进一步的实施方案中，核酸编码Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frzl0-Fc、sFRPl-Fc、sFRP2、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc、或sFRP5-Fc,并包含图5(A-H)中所示核酸序列。例如，核酸包括Frzl-Fc(SEQIDNO:115)、Frz2-Fc(SEQIDNO:116)、Frz3陽Fc(SEQIDNO:117)、Frz4-Fc(SEQIDNO:118)、Frz5-Fc(SEQIDNO:119)、Frz6扁Fc(SEQIDNO:120)、Frz7-Fc(SEQIDNO:121)、Frz8-Fc(SEQIDNO:122)、Frz9-Fc(SEQIDNO:123)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:124)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:125)、sFRP2-Fc(SEQIDNO:126)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:127)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:128)、或sFRP5陽Fc(SEQIDNO:129)。本发明的另一方面提供了在高严格性条件下与上文所述核酸杂交的核酸。3.Wnt拮抗剂变体在本文所述Wnt拮抗剂多肽之外，可以制备Wnt拮抗剂变体。此类变体可以通过将合适的核普酸变化导入编码DNA中，和/或通过期望变体的合成来制备。本领域技术人员会领会，氨基酸变化可以改变Wnt拮抗剂的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特征。Wnt拮抗剂变体包括例如一个或多个结构域中氨基酸残基中的突变或氨基酸变体，然而其仍保持生物学活性。Wnt拮抗剂变体还包括具有至少一处氨基酸删除或添加但仍保持生物学活性的Wnt拮抗剂。氨基酸残基的添加或删除尤其可以在连接Frz结构域构件与Fc结构域的氨基酸序列周围的区域中发生，无论此区域是否含有接头。Wnt拮抗剂变体与参照Wnt拮抗剂多肽序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。一般而言，此类变体展现出与参照序列相比基本上相同的或实质性更大的对Wnt蛋白的结合亲和力，例如至少0.75X、0.8X、0.9X、l.OX、1.25X或1.5X,基于本领域接受的结合测定法定量单位/度量。在具体的实施方案中，Wnt拮抗剂变体是嵌合分子，其包含与hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzlO(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、或hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)具有至少70。/。、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz结构域构件。在其它实施方案中，Wnt拮抗剂变体是嵌合分子，其包含与选自hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrz10(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)的Frz或sFRP蛋白原具有至少70%、75°/。、80o/。、85%、86。/o、87o/o、88o/o、89。/o、90%、91o/o、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz结构域构件。在其它实施方案中，Wnt拮抗剂变体是嵌合分子，其包含与选自hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、及hRor2(SEQIDNO:66)的成熟Frz、sFRP或hRor蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98。/o或99。/。氨基酸序列同一性的Frz结构域构件。在其它实施方案中，Wnt拮抗剂变体是嵌合分子，其包含与Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5画Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2誦Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz结构域构件。"百分比(％)氨基酸序列同一性"定义为在比对两个序列时与参照(亲本)多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定百分比氨基酸同一性，对序列进行比对，并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性，不将保守替代视为序列同一性的一部分。测定百分比同一性的氨基酸序列比对规程对于本领域技术人员是公知的。通常使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件来比对肽序列。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。在比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的°/。氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)可如下计算%氨基酸序列同一性=X/Yx100其中X是通过序列比对程序或算法的A和B比对而评分为相同匹配的氨基酸残基数，且Y是B中的氨基酸残基总数。、若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的。/。氨基酸序列同一性。"分离的"或"纯化的"肽、多肽、蛋白质或生物学活性片段是与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。污染性成分包括通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的物质。将如下制备物视为基本上分离的，所述制备物根据非期望污染性物质(污染物).的干重具有优选小于30%,优选小于20%，10%,且优选小于5%的污染物。分离的重组生成的肽/多肽或其生物学活性部分优选基本上不含培养基，即培养基所占肽/多肽制备物的体积优选小于20%、优选小于约10%,且优选小于约5%。污染物的例子包括细胞碎片、培养基、及体外合成肽/多肽过程中所使用和生成的物质。本文所述Wnt拮抗剂中的变异可以例如使用关于保守和非保守突变的任何技术和指导方针来产生，例如美国专利No.5,364,934中所提出的。变异可以是一个或多个编码抗体或多肽的密码子的替代、删除或插入，其导致与天然序列抗体或多肽相比氨基酸序列中的变化。任选地，变异是通过在Wnt拮抗剂的一个或多个结构域中用任何其它氨基酸替代至少一个氨基酸实现的。确定哪个氨基酸残基可以被插入、替代或删除而不会不利地影响期望活性的指导可以通过比较Wnt拮抗剂的序列与同源的已知蛋白质分子的序列，并使高度同源性的区域中产生的氨基酸序列变化的数目最小化而发现。氨基酸替代可以是用另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸替代一个氨基酸的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。任选地，插入、删除或替代可以在大约1至5个氨基酸的范围中。可以如下确定容许的变异，即在序列中系统地产生氨基酸的插入、删除或替代，并对所得的变体测试全长或成熟天然序列所展现的活性。Wnt拮抗剂可以通过许多常规技术中的任一种来制备。可以化学合成期望的肽片段。备选的方法牵涉通过酶促消化生成抗体或多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或通过用合适的限制酶消化DNA并分离期望片段来实现。另一种合适的技术牵涉分离并扩增编码期望抗体或多肽片段的DNA片段，其通过聚合酶链式反应(PCR)实现。在PCR中的5，和3，引物上采用限定DNA片段的期望端的寡核苷酸。在具体的实施方案中，表A中优选替代的标题下显示了感兴趣的保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表A中称为"例示替代"的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>方面的效果差异显著的替代来实现(a)替代区域中多肽主链的结构，例如作为(折叠)片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;及(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点中，或更优选地，引入剩余(非保守的)位点中。变异可以使用本领域中已知的方法来产生，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可以对所克隆的DNA实施定点诱变[Carter等，Nucl.AcidsRes.，13:4331(1986);Zoller等,Nucl.AcidsRes"10:6487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene,34:315(1985)]、限制性选择诱变[Wells等,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA，317:415(1986)]或其它已知的才支术以生成本发明的Wnt拮抗剂。还可以采用扫描氨基酸分析以沿着连续的序列鉴定一个或多个氨基酸。相对较小的、中性氨基酸是优选的扫描氨基酸之一。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、及半胱氨酸。丙氨酸通常是此组中优选的扫描氨基酸，因为其消除了超出p-碳外的侧链，且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)]。通常还优选丙氨酸，因为其是最常见的氨基酸。进一步地，其在掩蔽位置和暴露位置两者中被频繁发现[Creighton，TheProteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.，150:1(1976)]。若丙氨酸替代不能产生足够量的变体，则可以使用电子等排(isoteric)氨基酸。不涉及维持Wnt拮抗剂的正确构象的任何半胱氨酸残基一般也可以用丝氨酸替代以改善分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键添加至Wnt拮抗剂以改善其稳定性(特别在抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。替代变体的特别优选的类型牵涉替代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步开发的所得变体相对于生成它们的亲本抗体会具有改善的生物学性质。用于生成此类替代变体的一种便利方式牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，使数个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点生成所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体颗粒中展现出来，作为每个颗粒内包装的与Mi3基因m产物融合的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选如本文所公开的其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以实施丙氨酸扫描诱变以筌定显著促成抗原结合的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定Wnt拮抗剂和Wnt蛋白之间的接触点可能是有益的。依照本文详述的技术，此类接触残基和邻近残基是替代候选。一旦生成此类变体，则对该组变体进行本文所述筛选，并可以选择在一种或多种相关测定法中具有优越性质的抗体以用于进一步开发。Wnt拮抗剂的共价修饰包括在本发明的范围之内。一种类型的共价修饰包括使Wnt拮抗剂的靶定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，所述有机衍生化试剂能够与Wnt拮抗剂的选定侧链或N末端或C末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如将Wnt拮抗剂交联至不溶于水的支持基质或表面以在用于纯化Wnt拮抗剂的方法中使用。常用的交联剂包括例如l,l-二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮水杨酸的酯)、同双功能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚氨基酯，诸如3，3'-二硫代二-(琥珀酰亚氨基丙酸酯))、双功能马来酰亚胺(诸如二-N-马来酰亚胺-l,8-辛烷)及诸如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸曱酯的试剂。其它修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱酰胺而分别成为相应的谷氨酰基和天冬酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸的侧链a-氨基基团的曱基"f匕[T.E.Creighton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)],N末端胺的乙酰化，及任何C末端羧基基团的酰胺化。Wnt拮抗剂的另一种类型的共价修饰包括在本发明的范围内，其包括改变Wnt拮抗剂的Frz、Wnt或sFRP多肽结构域的天然糖基化样式。"改变天然糖基化样式"定义为删除在构件结构域的天然序列中找到的一个或多个碳水化合物模块(或是通过除去潜在的糖基化位点或是通过以化学和/或酶的手段删除糖基化)，和/或添加天然序列构件结构域中不存在的一个或多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白的糖基化的定性变化，牵涉所存在的各种碳水化合物模块的性质和比例的变化。抗体和其它多肽的糖基化通常或是N连接的或是O连接的。N连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中任一种这些三肽序列的存在创建潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸，其最通常是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。如下方便地实现在Wnt拮抗剂中添加糖基化位点，即改变氨基酸序列，使得其包含一个或多个上文所述三肽序列(用于N连接糖基化位点)。还可以如下产生改变，即将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或替代至原始(即变异前)Wnt拮抗剂的序列中。任选地，该序列可以经由DNA水平上的变化而改变，具体是在预选的碱基上突变编码该序列的DNA,使得生成会翻译成期望氨基酸的密码子。在Wnt拮抗剂上增加碳水化合物模块的数目的另一种方法是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。此类方法在本领域中有记载，例如1987年9月11曰公布的WO87/05330及Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。Wnt拮抗剂上存在的碳水化合物模块的消除可以通过化学或酶学方法或通过突变替代编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子而实现。化学去糖基化技术在本领域中是已知的，并记载于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys"259:52(1987)及Edge等，Anal.Biochem,，118:131(1981)。多肽上碳水化合物模块的酶促切割可以通过多种内切和外切糖苷酶的使用来实现，如Thotakura等，Meth.Enzymol.,138:350(1987)所述。Wnt拮抗剂的另一种类型的共价修饰包括以美国专利No.4,640,835、4，496,689、4,301,144、4,670,417、4,791，192或4,179,337中提出的方式将序列连接至多种非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧化烯。抗体或多肽还可以包载于通过例如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶嚢(例如分别为羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)中，胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)中，或粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，Gennaro，A.,编,(2000)。本发明的Wnt拮抗剂还可以以这样一种方式修饰，使得其形成具有别的嵌合物性质的分子，所述分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的Wnt拮抗剂(即Frz-、sFRP-或Ror-Fc嵌合物)。在一个实施方案中，此嵌合分子包含Wnt拮抗剂与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供抗标签抗体能选择性结合的表位。表位标签一般置于Wnt拮抗剂的氨基端或羧基端。Wnt拮抗剂的此类加表位标签形式的存在可以使用针对标签多肽的抗体来检测。同样，表位标签的提供使Wnt拮抗剂能够使用抗标签抗体或结合表位标签的另一种类型的亲和基质通过亲和纯化而被容易地纯化。多种标签多肽和它们相应的抗体在本领域中是公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5[Field等,Mol.Cell.Biol"8:2159-2165(1988)];c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985)];及单纯疱渗病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990)]。其它标签多肽包括Flag肽[H叩p等，BioTechnology,6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martin等，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)];及T7基因10蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]。在备选的实施方案中，Wnt拮抗剂包含变体Fc构件。例如，Fc区可以包含人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)处包含氨基酸修饰(例如替代)。在一个实施方案中，此类变体与参照Fc多肽序列具有至少70。/。、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，Fc区变体可以展现出改变的新生儿Fc受体(FcRn)结合亲和力。此类变体Fc区可以在Fc区氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中EU索引的编号方式。对FcRn具有降低的结合的Fc区变体可以在Fc区氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447(EU索引/Kabat编号方式)中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰。或者，展现出对FcRn的结合增加的变体在Fc区氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(EU索引/Kabat编号方式)中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc区变体可以展现出对Fc丫R的结合降低，并在Fc区位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439(EU索引/Kabat编号方式)处包含氨基酸修饰。在又一个实施方案中，Fc区变体可以展现出对FcyRII的结合降低，并在Fc区氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439(EU索引/Kabat编号方式)中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰。在进一步的实施方案中，Fc区变体可以展现出对FcYRJI的结合增强，并在Fc区氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、338、373、376、414、416、419、435、438或439(EU索引/Kabat编号方式)中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰。在进一步的实施方案中，感兴趣的Fc区变体可以展现出对FcgRIII的结合降低，并在Fc区氨基酸位置238、239、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437(EU索引/Kabat编号方式)中的任何一个或多个处包含氨基酸修饰。在进一步的实施方案中，具有改变的(即改善的或削弱的)Clq结合和/或4卜体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc区变体记载于W099/51642。此类变体可以在Fc区氨基酸位置270、322、326、327、329、331、333或334中的任何一个或多个处包含氨基酸替代。还可参见涉及Fc区变体的Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利5,648,260;美国专利5,624,821及W094/29351。B.Wnt拮抗剂的制备以下描述主要涉及通过培养经包含Wnt拮抗剂多肽编码核酸的载体转化或转染的细胞来生成Wnt拮抗剂多肽。当然，可以采用备选方法(其在本领域是公知的)来制备此类Wnt拮抗剂。例如，合适的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来生成[参见例如Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)]。体外蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化来实施。可以实现自动化合成，例如4吏用AppliedBiosystems肽合成仪(FosterCity,CA)使用制造商的说明书来实现。Wnt拮抗剂多肽的各个部分可以使用化学或酶促方法来分开地化学合成并组合以生成期望的序列。1.编码Wnt拮抗剂多肽的DNA的分离可以自cDNA文库获得编码Wnt拮抗剂的拮抗剂或任何期望构件结构域(诸如Frz或sFRP)序列的DNA，该cDNA文库是从认为拥有此类序列并以可检测水平表达此类序列的组织中制备的。因而，人Frz或sFRP序列DNA可以方便地获自从人组织中制备的cDNA文库。期望的DNA序列基因还可以获自基因组文库或通过已知的合成规程(例如自动化核酸合成)获得。可以用设计的^t笨针(诸如至少约20-80个石威基的寡核苷酸)筛选文库以鉴定感兴趣基因或由其编码的蛋白质。用所选择的探针筛选cDNA或基因组文库可以使用标准规程(诸如记载于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中的)来进行。分离编码Wnt拮抗剂多肽及其构件的基因的备选方法是使用PCR方法[Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)]。筛选cDNA文库的技术在本领域是公知的。选作探针的寡核苷酸序列应当有足够的长度，并且是足够明确的以使得假阳性降至最低。寡核苷酸优选的方法在本领域是公知的，并包括使用放射性标记物(像"P-标记的ATP)、生物素化或酶标记。杂交条件(包括中等严格性和高度严格性)在Sambrook等，见上文中有提供。56此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与公共数据库(诸如GenBank)或其它私有序列数据库中存储且可获得的其它已知序列相比较和比对。分子的规定区域内或整个全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平或是在核苷酸水平)可以使用本领域已知的及本文所述的方法来测定。编码Fc免疫球蛋白结构域的DNA序列可以衍生自分泌期望Fc亚型的单抗的杂交瘤细胞。可以如下获得具有蛋白质编码序列的核酸，即使用本文首次公开的推理氨基酸序列，并在需要时如Sambrook等，见上文所述的那样使用常规引物延伸规程来筛选选择的cDNA或基因组文库以检测前体，并处理可能还没有逆转录成cDNA的mRNA中间体。2.宿主细胞的选择和转化将宿主细胞用本文所述用于Wnt拮抗剂多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中培养。技术人员无需过度实验就可以选择培养条件，诸如培养基、温度、pH等。一般而言，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案、及实践技术可参见MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler,编(IRLPress,1991)和Sambrook等，见上文。真核细胞转染和原核细胞转化的方法对于普通技术人员是已知的，例如，CaCl2、CaP04、脂质体介导的和电穿孔。根据使用的宿主细胞，使用对于此类细胞适当的标准技术来实施转化。采用氯化钙的钙处理(如记载于Sambrook等，见上文的)或电穿孔一般用于原核生物。根癌土壤杆菌(jgra6acten'wmz^me/ac/era)感染用于某些才直物细胞的转化，如Shaw等，Gene,23:315(1983)和1989年6月29日公布的WO89/05859所记载的。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸4丐沉淀方法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般性方面已经记载于美国专利No.4,399,216。典型地，依照VanSolingen等，J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法来实施向酵母中的转化。然而，还可以使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如通过核显微注射、电穿孔、与完整细胞进行的细菌原生质体融合、或聚阳离子，例如Polybrene、多鸟氨酸。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等，MethodsinEnzymology,185:527-537(1990)和Ma励ur等，Nature,57336:348-352(1988)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性的或革兰氏阳性的生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌林是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌抹MM294(ATCC31,446);大肠杆菌X1776(ATCC31,537);大肠杆菌菌林W3110(ATCC27，325)及K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科(五"&ra&"eWaceae)，诸如埃希氏菌属(&c/7en'c/^)(例如大肠杆菌或大肠埃希氏杆菌(Eco//))、肠杆菌属0&2feraZ^c^")、欧文氏菌属(5nWm'a)、克雷伯氏菌属(尺/6&&//")、变形菌属(iVoew)、沙门氏菌属(Sa/mo"e〃a)(例如鼠伤寒沙门氏菌(>S"a/mcwe〃a/yp/H'wwn'"m))、沙雷氏菌属(5^rah'a)(例如粘质沙雷氏菌(5^rra"a))、及志贺氏菌属(幼/<^//(3)、以及芽孢杆菌属(^ZC////)(诸如枯草芽孢杆菌CB.w^7/s)和地衣芽孢杆菌(及//c/zem/om^)(例如1989年4月12曰公开的DD266,710中所披露的地衣芽孢杆41P))、假单胞菌属CP"^fo/wwoy)(诸如铜绿假单胞菌CPaen^'mwa))、及链霉菌属(5^eptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是一种具体的优选宿主或亲本宿主，因为其是供重组DNA产物发酵用的常用宿主菌抹。优选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌抹W3110以在编码宿主内源性蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌林1A2(其具有完整基因型to;^4);大肠杆菌W3110菌抹9E4(其具有完整基因型to,x4/^3);大肠杆菌W3110菌抹2707(ATCC55,244)(其具有完整基因型to"J5f^gF-/ac」/69ow/r);大肠杆菌W3110菌抹37D6(其具有完整W3110菌抹40B4(其是含非卡那霉素抗性deg尸删除突变的菌抹37D6);及具有1990年8月7日公告的美国专利No.4,946，783所披露的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌抹。或者，体外克隆方法(例如PCR或其它核酸聚合酶反应)是合适的。全长抗体、抗体片段、及抗体融合蛋白可以在细菌中生成，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在治疗性抗体偶联至细胞毒剂(例如毒素)且免疫偶联物自身在肿瘤细胞破坏中显示功效时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算。对于在细菌中表达参见例如美国专利5，648,237(Carter等)、美国专利5，789，199(Joly等)、及美国专利5,840，523(Simmons等)(其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列)，本文收录这些专利作为参考。表达后，抗体以可溶性级分从大肠杆菌细胞浆中分离，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化例如CHO细胞中表达的抗体的方法。在原核生物之外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是适于Wnt拮抗剂多肽编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或卑酒糖酵母(Sacc/^rawyc^cerev&ae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(5t/2/zoacc/zara附yces;om6e)(Beach和Nurse,Nature,.290:140[1981];1985年5月2日公布的EP139,383);克鲁维氏酵母属(尺/wyveraw;;ce力宿主(美国专利No.4,943,529;Fleer等，Bio/Technology,9:968-975(1991))，诸如例如乳克鲁维氏酵母(K/acto)(MW98-8C，CBS683，CBS4574;Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2):737-742[1983])、脆壁克鲁维氏酵母(I/rag/fe)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维氏酵母(KZm/g(3n'c^)(ATCC16,045)、威克曼氏克鲁维氏酵母(vWcferam//)(ATCC24,178)、Kwa/"7(ATCC56,500)、果蝇克鲁维氏酵母(K<imop/z//orww)(ATCC36,906);VandenBerg等,Bio/Technology,8:135(1990))、耐热克鲁维氏酵母(KAermoto/era""、及马克斯克鲁维氏酵母(K,腦,"x/朋M5);亚罗酵母属Gwrow/a)(EP402,226);巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/n'a戸to"'5)(EP183,070;Sreekrishna等,J.BasicMicrobiol"28:265-278[1988]);假丝酵母属(C朋Ada);瑞氏木霉(7Hc/20&rma"ew'a)(EP244,234);粗糙月永孑包霉(他,，racra扁)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979]);许旺氏酵母属(Sc/w朋m'om少ce力，诸如西方许旺氏酵母真菌，诸如例如脉孢霉菌(7Veww/ora)、青霉属(尸ew'c/〃&m)、弯颈霉属宿主，诸如构巢曲霉(Am'(iw/(ms0(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.，112:284-289[1983];Tilburn等，Gene,26:205-221[1983];Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474[1984])及黑曲霉(Am.ge。(Kelly和Hynes,EMBOJ.,4:475-479[1985])。甲基营养型酵母在本文中是合适的，并包括但不限于选自下列属的、能够在曱醇上生长的酵母汉逊氏酵母属(1990年10月31日公布的EP394,538);及丝状,及曲霉属(v4^erg/〃—(Z/araemJa)、假丝酵母属、克勒克氏酵母属(K/oecfera)、毕赤氏酵母属(尸/c/w'a)、糖酵母属(Sacc/wram少ce"、球拟酵母属(7bnJo戸^)、及红酵母属(;/70^tora/a)。这类酵母例示性的特定种类的列表可参见C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs,269(1982)。适于表达糖基化Wnt拮抗剂多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊推动物细胞的例子包括昆虫细胞(诸如果蝇S2及夜蛾(Spodoptera)Sf9),以及植物细胞，诸如棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、及烟草的细胞培养物。已经鉴定出很多杆状病毒抹和变体及相应的来自下组宿主的许可性昆虫宿主细胞，诸如草地夜蛾(S/ocfo;^ra/n^peWa)(毛虫)、埃及伊蚊(」eJ^(蚊子)、白紋伊蚊(J^fesa/k^/"w)(蚊子)、黑腹果錄(Drow;/7z7awe/朋ogos^r)(果绳)，及家蚕Cgowxmon')。用于转染的多种病毒林是公众可获得的(例如苜蓿尺蠖04wtograp/zaca/^brm'ca)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5抹)，并且此类病毒可以用作依照本发明的本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。然而，兴趣最大的是脊推动物细胞，而且使培养(组织培养)中的脊推动物细胞增殖已经成为常规规程。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾系(293细胞或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));幼年仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房胂瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982》；MRC5细胞；FS4细胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。将宿主细胞用上文所述供Wnt拮抗剂多肽生成用的表达或克隆载体转化，并在为了诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中培养。3.可复制载体的选择和使用60本发明的一方面提供了插入供克隆(DNA的扩增)用的或供表达用的可复制载体中的编码Wnt拮抗剂多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)。多种载体是公众可获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒、或噬菌体形式。合适的核酸序列可以通过多种规程而插入载体中。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性内切核酸酶位点中。载体构件一^殳包括但不限于以下一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、及转录终止序列。含有一种或多种这些构件的合适载体的构建釆用对于技术人员已知的标准连接技术。Wnt拮抗剂不仅可以直接重组生成，而且还可以作为含异源多肽(其可以是在成熟蛋白或多肽的N端的信号序列或具有特定切割位点的其它多肽)的融合多肽而重组合成。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者其可以是插入载体中的Wnt拮抗剂多肽编码DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，其选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导、a-因子前导(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属a-因子前导序列，后者记载于美国专利No.5,010，182)、或酸性磷酸酶前导、白色假丝酵母(C.a/6/cam)葡糖淀粉酶前导(1990年4月4日公布的EP362,179)、或1990年11月15日公布的WO90/13646所记载的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌性多肽的信号序列，以及病毒分泌前导。表达载体和克隆载体都含有使得载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。用于多种细菌、酵母、和病毒的此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒起点适用于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。表达和克隆载体典型地会包含选择基因(也称为选择标志)。典型的选择基因编码下述蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨节青霉素、新霉素、曱氨蝶呤、或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。适用于哺乳动物细胞的选择标志的例子是那些使得有能力摄取Wnt拮抗剂编码核酸的细胞得以鉴定的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在釆用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和增殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所述的。适合酵母中使用的选择基因是酵母质粒YRp7中存在的/^7基因[Stinchcomb等，Nature,282:39(1979);Kingsman等，Gene,7:141(1979);Tschemper等,Gene,10:157(1980)]。trpl基因提供了供缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变型菌抹(例如ATCCNo.44076或PEP4-1[Jones,Genetics,85:12(1977)])用的选择标志。表达和克隆载体通常包含与Wnt拮抗剂编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。多种潜在宿主细胞所识别的启动子是7>知的。适于与原核宿主一起使用的启动子包括(3-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等,Nature,275:615(1978);Goeddel等，Nature,281:544(1979)]、石咸性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddd，NucleicAcidsRes.,8:4057(1980);EP36,776]、及杂合启动子，诸如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]。细菌系统中使用的启动子还会包含与编码Wnt拮抗剂多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。适于与酵母宿主一起使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]或其它糖酵解酶(诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氩酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、及葡糖激酶)的启动子[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]。其它酵母启动子(其是具有额外优势即转录受生长条件控制的诱导型启动子)是下组蛋白质的启动子区醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适于在酵母表达中使用的载体和启动子在EP73,657中有进一步的描述。在哺乳动物宿主细胞中来自载体的Wnt拮抗剂多肽转录受到如下启动子控制，例如自病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒U989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及自热^木克启动子获得的启动子，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。高等真核生物转录编码Wnt拮抗剂多肽的DNA可以通过将增强子序列插入载体中而得以增加。增强子是对启动子起作用而增加其转录的顺式作用DNA元件，通常为约10-300bp。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白、及胰岛素)的增强子序列。典型地，然而，会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、及腺病毒增强子。增强子可以在Wnt拮抗剂多肽编码序列的5，或3，位置剪接入载体中，但优选位于启动子的5，位点。真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还会包含转录终止及使mRNA稳定所必需的序列。此类序列通常可获自真核生物的或病毒的DNA或cDNA的5，非翻译区，偶尔地3，非翻译区。这些区域包含作为编码Wnt拮抗剂的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。适于改编后在重组脊推动物细胞培养物中合成Wnt拮抗剂多肽的其它方法、载体和宿主细胞记载于Gething等，Nature,293:620-625(1981);Mantei等,Nature,281:40-46(1979);EP117,060;及EP117,058。4.培养宿主细月包本发明的一方面才是供了包含编码Wnt拮抗剂的核酸的宿主细胞。用于生成本发明的Wnt拮抗剂多肽的宿主细胞可以在多种培养基中培养。商品化的培养基(诸如Ham氏FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基((DMEM)Sigma))适于培养宿主细月包。此外，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以在需要时补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐类(诸如氯化钠、4丐、镁、及磷酸盐)、緩沖剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸芬)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围中的终浓度存在的无机化合物)、及葡萄糖或等同能源。还可以包括本领域技术人员是已知的适当浓度的任何其它必需的补充物。培养条件63(诸如温度、pH等)就是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，而且对于普通技术人员是显而易见的。5.检测基因扩增/表达基于本文所提供的序列，基因扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如使用适当标记的探针通过常规Southem印迹、Northern印迹(用以定量m脂A的转录)[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52015205(1980)]、斑点印迹(DNA分析)、或原位杂交来实现。或者，可以采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可以标记抗体，并可以实施测定法，其中双链体结合至表面，使得在表面上形成双链体后，可以检出双链体所结合的抗体的存在。或者，基因表达可以通过免疫学方法(诸如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定法)来测量以直接定量基因产物的表达。对于免疫组织化学染色和/或体液测定法有用的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便地，抗体可以针对本文所鉴Wnt拮抗剂融合且编码特定抗体表位的外源序列而制备。6.Wnt拮抗剂的纯化可以从培养基或从宿主细胞溶胞产物中回收各种形式的Wnt拮抗剂多肽。若膜结合的，则可以使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促切割而将其从所述膜中释放。Wnt拮抗剂多肽的表达中所采用的细胞可以通过多种物理或化学手段(诸如冷冻-融化循环、超声处理、机械石皮石争、或细胞溶胞剂)来破坏。可能希望从重组细胞蛋白或多肽中纯化Wnt拮抗剂多肽。如下规程是合适的纯化M^程的例示通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC;硅土上或阳离子交换树脂(诸如DEAE)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；使用例如S印hadexG-75的凝胶过滤；蛋白ASepharose柱以除去污染物，诸如IgG;及金属螯合柱以结合加表位标签形式的Wnt拮抗剂。可以采用蛋白质纯化的多种方法，而且此类方法在本领域中是已知的，并记载于例^口Deutscher,MethodsinEnzymology，182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)。所选择的纯化步骤会取决于例如所使用的生成方法和所生成的特定Wnt拮抗剂多肽的性质。在使用重组技术时，Wnt拮抗剂多肽可以在细胞内、周质空间中生成，或直接分泌至培养基中。若Wnt拮抗剂多肽在细胞内生成，则作为第一步，通过例如离心或超滤来除去颗粒碎片(或是宿主细胞或是溶胞碎片)。Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间中的抗体的规程。简言之，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA、及苯曱基石黄酰氟(PMSF)存在下在约30分钟里融解(thaw)细胞浆。细胞碎片可以通过离心来除去。若Wnt拮抗剂多肽被分泌至培养基中，则一般首先使用商品化的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统的上清液。任何上述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以阻止外来污染物的生长。自细胞制备的Wnt拮抗剂多肽组合物可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、及亲和层析来纯化，且亲和层析是优选的纯化技术。作为亲和配体的蛋白A的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人yl、丫2或Y4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983》。蛋白G推荐用于所有的小鼠同种型和人^(Guss等，EMBOJ.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最经常是琼脂糖，但其它基质是可用的。机械稳定性基质(诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙晞)苯)容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若Wnt拮抗剂多肽包含CH3结构域，则BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)可用于纯化。其它用于蛋白质纯化的技术(诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如多天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、及碌L酸铵沉淀)也是可用的，这取决于待回收的抗体。任何初步的纯化步骤后，包含感兴趣抗体和污染物的混合物可以进行低pH疏水相互作用层析，其中使用pH约2.5-4.5的洗脱緩沖液，优选在j氐盐浓度(例如约0-0.25M盐)实施。C.药用配制剂本发明的一方面提供了包含Wnt拮抗剂和至少一种药学可接受的载体或赋形剂的组合物。通过将具有期望纯度的Wnt拮抗剂与任选的药学可接受的载体、贝武形齐寸或稳、定齐寸(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，A.Gennaro，编(2000))混合，以冻干配制剂或水溶液的形式，制^1照本发明使用的Wnt拮抗剂的治疗用配制剂供贮存。"药学可接受的载体"包括与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适载体或稀释剂的别的例子包括但不限于水、盐水、Finger氏溶液、右旋糖溶液、及5%人血清清蛋白。还可以使用脂质体和非水媒介，诸如不挥发性油。除非常规媒介或药剂与活性化合物不相容，涵盖这些组合物的使用。组合物中还可以掺入补充性的活性化合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括緩冲剂，诸如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基千基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;张力调节剂(tonicifier),诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨酯；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN⑧、PLURONICS⑧或聚乙二醇(PEG)。抗体优选包含浓度在5-200mg/ml间，优选在10-100mg/ml间的抗体。本文中的配制剂还可含有超过一种正被治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选那些具有互补活性且彼此没有不利影响的。例如，在特定的Wnt拮抗剂之外，可以期望在一种配制剂中包含别的抗体，例如结合Wnt蛋白上不同表位的抗体、针对完全不同的Wnt蛋白的抗体、或针对一些其它靶物(诸如影响Wnt介导的病症发展(growth)的生长因子)的抗体。或者/另外，组合物可以进一步包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素齐'J、和/或保心药。此类分子以组合方式以对于预期目的有效的量适当地存在。活性成分还可以包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶66嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯M鼓胶嚢)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版,A.Gennaro，编(2000)。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可以容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。本文中的治疗用组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶。施用的路径依照已知的方法，例如通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌肉内、目艮内、动脉内或损伤内路径，表面施用，或通过持续释放系统来注射或输注。本发明的药用组合物的剂量和期望药物浓度可以有所变化，取决于预想的具体用途。施用的合适剂量或路径的确定完全在普通技术人员的技术范围内。动物实验提供了用于确定人疗法的有效剂量的可靠指导。有效剂量的物种间定标可以遵《盾Mordenti,J.禾口Chappell，W,"Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics",于ToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobi等,纟扁,PergamonPress,NewYork1989,第42-96页规定的原则而实施。在采用本发明的物质或分子的体内施用时，正常剂量数量可以从每天约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多变化，优选约1|ig/kg/天至10mg/kg/天变化，这取决于施用的路径。文献中提供了有关投递的具体剂量和方法的指导；参见例如美国专利No.4,657,760;5,206,344;或5,225，212。不同配制剂将对不同治疗用化合物和不同病症有效，例如，靶向一种器官或组织的施用可能必须以与针对另一种器官或组织的方式不同的方式投递。若期望在具有适于治疗需要施用某种物质或分子的任何疾病或病症的释放特征的配制剂中持续释放施用该物质或分子，则涵盖所述物质或分子的微嚢化。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，所述基质处于定型产品形式，例如薄膜、或微胶嚢。用于持续释放的重组蛋白的微嚢化已经成功实施于人生长激素(rhGH)、干扰素-aj(rhIFN-a,1)、白介素-2、及薩rgpl20。Johnson等，Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther"27:1221-1223(1993);Hora等，Bio/Technology，8:755-758(1990);Cleland,"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"于VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,Powell和Newman,编，(PlenumPress:NewYork,1995)，pp.439-462;WO97/03692,WO96/40072，WO96/07399;及美国专利No.5,654,010。由于聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物的生物相容性和宽范围的生物可降解性质，可以使用其来开发这些蛋白质的持续释放配制剂。PLGA的降解产物(乳酸和乙醇酸)可以在人体内快速清除。此外，该聚合物的可降解性可以调整为数月至数年，取决于其分子量和组成。Lewis,"Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer",于M.Chasin和R.Langer(编),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990)，pp.1-41。持续释放基质的别的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。D.治疗Wnt介导的病症的方法法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的Wnt拮抗剂。在一个实施方案中，所述病症是与Wnt信号传导活性的表达异常(例如增加)有关的细胞增殖性病症。在另一个实施方案中，所述病症源自Wnt蛋白的表达增加。在又一个实施方案中，所述细月包增殖性病症是癌症，诸如例如结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、与涉及HSC的多种病症有关的癌症(诸如白血病和多种其它血液相关癌症)、及涉及神经元增殖性病症的癌症(包括脑瘤，诸如神经力交质瘤、星形细胞瘤、脑脊膜瘤、许旺氏细胞瘤、垂体瘤、原始性神经外胚层瘤(PNET)、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、及松果体区肿瘤(pinealregiontumor))。通过施用Wnt拮抗剂治疗细胞增殖性病症在如下一项或多项中导致可观察和/或可测量的降低或消失癌细胞数目减少或癌细胞消失；肿瘤大小的降低；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肺瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低，及生命质量提高。就Wnt拮抗剂可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些征候或症状的减轻还可以由患者感受到。用于评估成功治疗和改善疾病的以上参数是可通过内科医师所熟悉的常规规程容易测量的。对于癌症疗法，功效可以通过例如评估病情进展前时间(TDP)和/或测定应答率(RR)来测量。可以如下测定转移，即通过肿瘤分期(staging)测试和通过骨扫描和针对钙水平和其它酶的测试以测定对骨的扩散。还可以进行CT扫描以在该区域中找寻对骨盆和淋巴结的扩散。使用胸部X射线和通过已知方法进行的肝脏酶水平测量来分别找寻对肺和肝的转移。用于监测疾病的其它路径包括经直肠超声检查法(TRUS)和经直肠针吸活组织4全查(TRNB)。在一个具体的实施方案中，Wnt拮抗剂的施用降低了肺瘤负荷(例如降低了癌症的大小或严重性)。在又一个具体的实施方案中，Wnt拮抗剂的施用杀死癌症。E.抑制细胞中Wnt信号传导的方法
技术领域：
：本发明提供了抑制细胞中Wnt信号传导的方法，包括使细胞与有效量的Wnt拮抗剂接触。在一个实施方案中，所述细胞包含在哺乳动物(优选人)内，且施用量是治疗有效量。在又一个实施方案中，抑制Wnt信号传导进一步导致对细胞生长的抑制。在进一步的实施方案中，所述细胞是癌细胞。使用对于本领域技术人员已知的方法来测量对细胞增殖的抑制。例如，用于测量细胞增殖的便利测定法是CellTiter-GloTM发光细胞生存力测定法(LuminescentCellViabilityAssay),其可购自Promega(Madison,WI)。；亥测定法基于所存在的ATP(其是代谢活性细胞的指标)的定量而测定培养物中活细月包的数目。参见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88,美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，4吏其适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AnticancerDrugs6:398-404。测定规程牵涉将单一试剂(CellTiter-Glo⑧试剂)直接添加至培养的细胞。这导致细胞溶胞，并产生萤光素酶反应所生成的发光信号。发光信号与所存在的ATP量成比例，所述所存在的ATP量与培养物中存在的活细胞的数目成正比。可以通过光度69计或CCD相机成像装置来记录数据。发光输出以相对光单位(RLU)表示。F.调控Wnt靶基因表达的方法
技术领域：
：本发明提供了在特征在于激活的或过量的Wnt信号传导的细胞中调控Wnt靶基因表达的方法，包括使细胞与有效量的Wnt拮抗剂接触。在一个实施方案中，由于Wnt信号传导而使Wnt靶基因过表达，而与Wnt拮抗剂的接触的结果降低了Wnt靶基因的表达。在另一个实施方案中，Wnt靶基因选自轴蛋白2、APCDD1、Gadl、Saxl、c-myc、细月包周期蛋白D1、PPAR5、4足胃液素、簇蛋白(clusterin)、存活蛋白(survivin)、环氧合酶、fra-l、骨桥蛋白(osteopontin)、uPAR、密蛋白(claudin)-l、CD44、MMP-7/9/11/14/26、IGFBP-4、Met、BMP4、sox-9、组蛋白脱乙酰基酶2、VEGF。在又一个实施方案中，由于Wnt信号传导而使Wnt靶基因表达不足，而与Wnt拮抗剂的接触的结果恢复Wnt靶基因的表达。在进一步的实施方案中，Wnt靶基因选自Leftyl、Lefty2、sFRPl、Fzd5、fas抗原、胱天蛋白酶3、整联蛋白f37、ae整联蛋白、hathl、脂肪酸结合蛋白2、muc-2、kruppel样因子-4、碳酸酐酶-11、肝配蛋白(Ephrin)Bl、EphB2R、EphB3R、muc-3、组织相容性2、Q区基因座l、(32-微球蛋白。使用本领域技术人员已知的方法(包括那些本文所述的和以下实施例中所提出的)来测定靶基因的表达。G.4全测Wnt蛋白存在的方法
技术领域：
：本发明提供了在样品中检测Wnt蛋白存在的方法，包括使所述样品与Wnt拮抗剂接触，其中Wnt拮抗剂和Wnt蛋白之间复合物的存在或结合的水平指示Wnt蛋白和/或Wnt信号传导的存在。在一个实施方案中，该方法进一步包括测定Wnt信号传导的水平是否异常。在该实施方案中，将所述样品中的Wnt蛋白结合水平与已知具有生理学正常Wnt蛋白表达和/或Wnt信号传导的第二样品中的水平进行比较。与第二样品相比的可疑样品中的结合水平高于或低于生理学正常样品中的结合水平指示异常的Wnt信号传导。在另一个实施方案中，Wnt信号传导或异常Wnt信号传导的存在指示Wnt介导的病症(诸^口癌症)的存在。H.Wnt途径及与其有关的病症1.Wnt信号传导途径Wnt信号传导途径是一种异常复杂的信号传导过程，其牵涉在所述途径中施加不同水平控制的多种蛋白质。所述途径的这种多水平紧密调控指示其在细胞生物学中的重要性。尽管调控机制复杂，但是所述途径的启动信号是通过Wnt对巻曲(Frz)受体的结合而产生的。有效的信号进一步要求存在LRP(LDL受体相关蛋白)类的别的单次跨膜分子，具体地是LRP5和LRP6。Wnt可以进一步与LRP结合以与巻曲蛋白形成三聚体复合物。LRP的胞质尾继而与轴蛋白(另一种下游成分)相互作用。散乱蛋白(一种直接与巻曲蛋白相互作用的胞质成分)也可以直接与轴蛋白相互作用，如此形成巻曲蛋白、LRP、Dsh及轴蛋白的四重复合物。这种与轴蛋白的相互作用从"降解复合物"(下文所讨论的)中释放P-联蛋白，用于Wnt信号传导途径中随后的下游活性。在细胞外部，Wnt信号传导受到能结合Wnt由此使其与其受体隔绝的多种蛋白质的抑制。此组中包括分泌型巻曲相关蛋白(sFRP,Jones等，Bioessays2002;24:81l-820)和Wnt抑制因子-l(WIF-l,Hsieh,J.C.等，Nature1999;398:431-436)。在人中，sFRP家族包括5个成员(例如sFRP-l，sFRP-2...sFRP-5)，每个包含与Frz受体的富含半胱氨酸区域(CRD)共享30-50°/。序列同源性的CRD。(Melkonyan,H.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997;94:13636-13641)。认为sFRP与Frz受体形成功能抑制性复合物，因此是天然拮抗剂，但是生物学是复杂的，在有些情况中，其甚至可以起激动Wnt活性的作用。(Uren，A.等，J.Biol.Chem.2000;275:4374-4382)。另一类胞外Wnt抑制剂是Dickkopf(Dkk)。[Brott,B.K.等，Mol.CellBiol.2002;22:6100-6110;Fedi,P.等,J.Biol.Chem.1999;274:19465-19472]。Dkk家族的三个成员(例如Dkk-l、Dkk-2和Dkk-4)可以通过灭活细胞表面受体LRP-5和LRP-6(规范途径的必需成分)而拮抗Wnt信号传导。[Mao,J.H.等,Mol.Cell2001;7:801-809;Pinson,K.I.等，Nature2000;407:535-538]。Dkk与LRP5/6及单次跨膜受体Kremen1(Krm-l)或Kremen2(Krm-2)形成三重复合物[Mao等，Gene2003;302:179-183;Mao等，Nature2002;417:664-667;Mao等，Nature2001;411:321-325]。该复合物继而经受胞吞作用，由此从细胞表面除去LRP5/6受体。结果，Dkk可以选择性拮抗规范Wnt信号传导，而不影响非规范信号传导。规范Wnt信号传导激活的特点是蛋白质l3-联蛋白的水平升高。P-联蛋白是组成型生成的，且以单体蛋白集合存在于细胞质中。[Papkoff，J.等，Mol.CellBiol.1996;16:2128-2134]。用于控制P-联蛋白胞质水平的主要机制是经由募集成大的多蛋白复合物("降解复合物，，)后的直接物理降解。该复合物的中心支架是由轴蛋白以及供(3-联蛋白、腺瘤性结肠息肉(APC)、糖原合酶激酶3卩(GSK3卩)、酪蛋白激酶Ia(CKIa)及蛋白质磷酸酶2A(PP2A)结合的位点提供的[Hinoi,T.等，J.Biol.Chem,2000;275:34399-34406;Ikeda等，Oncogene2000;19:537-545;Yamamoto等，J.Biol.Chem.1999;274:10681-10684;Kishida等,J.Biol.Chem.1998;273:10823-10826;Ikeda等,EMBOJ.1998;17:1371-1384]。形成后，该复合物通过GSK3卩介导的轴蛋白和APC磷酸化、以及PP2A而稳定化。GSK3p然后磷酸化P-联蛋白，由此让它被含P-转导蛋白重复的蛋白((3-TrCP)所识别，由此将其靶向遍在蛋白化和蛋白体降解。[Aberle等，EMBOJ.1997;16:3797-804;Latres等，Oncogene1999;18:849-54;Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999;96:6273-8]。虽然与轴蛋白/APC/GSK3(3复合是p-联蛋白降解的主要机制，但是已有显示备选的降解途径牵涉通过与Siah-l和APC的C端复合而诱导的遍在蛋白化。[Matsuzawa等,Mol.Cell2001;7:915-926;Liu等,Mol.Cell2001;7:927-936]。在其作为转录因子的角色外，P-联蛋白进一步牵涉细胞粘附。[Nelson等，Science2004;303:1483-1487;Ilyas等，J.Pathol.1997;182:128-137]。P-联蛋白可以在细胞间接触(称为粘附连接)的细胞表面位点处找到，在那里其与E-钙粘着蛋白及cx-联蛋白复合。如此，E-钙粘着蛋白表达的任何增加会将P-联蛋白指导至细胞膜，由此消减胞质水平，并继而抑制Wnt信号传导。此外，E-钙粘着蛋白-联蛋白复合物的分解可以增加游离(3-联蛋白的胞质水平，由此剌激转录活性。[Nelson等，见上文]。如此，通过释力文(3-联蛋白进行的细胞表面受体cRON、表皮生长因子受体(EGFR)及c-ErbB2活化也可以刺激规范Wnt信号传导。其它信号传导途径可以激活或促进Wnt信号传导的效应。例如，整联蛋白信号传导可以导致P-联蛋白的核转运[Eger等,Oncogene2004;23:2672-2680],而经由胰岛素样生长因子(IGF)的信号传导可以通过"吸收"可用的GSK3P——由此阻止"降解复合物"的形成而激活Wnt信号传导。在规范的信号传导中，启动步骤牵涉在LRP5/6存在下Wnt^"Frz的结合。[Mao等，Mol.Cell2001;7:801-809;Pinson等，Nature2000;407:535-538]。此三聚体复合物的形成具有两种下游后果。第一种是散乱蛋白(Dsh)向细胞表面的募集及其通过酪蛋白激酶k(CIs)发生的磷酸化[Kishida等，J.Biol.Chem.2001;276:33147-33155]。磷酸化的Dsh可以与Fmt1和GSK3(3形成复合钩，其继而可以抑制GSK3P的活性。第二种，Wnt/Frz/LRP5M三重复合物促进LRP5/6介导的轴蛋白降解。其净效应是使负责磷酸化(3-联蛋白的降解复合物失稳定化。在没有磷酸化时，(3-联蛋白不被遍在蛋白化，由此逃脱降解，如此提高胞内水平和向细胞核易位的可用性。13-联蛋白转运至细胞核的方式尚未完全清楚，但是已经牵涉与核转运蛋白APC的相互作用[Rosin-Arbesfeld等，Nature2000;406:1009-1012;Neufeld等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000;97:12085-12090],以及;^go;w和Sc/9/7eg/e^。[Townsley等，NatureCellBiol.2004;6:626-633]。一旦在细胞核中，(3-联蛋白取代转录阻抑物Groucho而与T细胞特异性转录因子/淋巴样增强子结合因子-1(TCF/LEF)DNA结合蛋白结合。在没有卩-被联蛋白取代时，TCF/LEF与Groucho复合以阻抑Wnt"靶基因"的表达。通过与各种组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的相互作用进一步介导Groucho的抑制效应，认为所述组蛋白脱乙酰基酶使DNA对转录激活有折射能力(refractive)。[Cavallo等，Nature1998;395:604-8;Chen等，GenesDev.1999;13:2218-30]。TCF转录阻抑物复合物转变成转录激活复合物进一步牵涉组蛋白乙酰基转移酶(诸如Creb结合蛋白(CBP)/p300)以及其它激活因子(诸如Brg-l)的募集。[Takemam等,J.CellBiol.2000;149:249-54;Barker等,Cell2002;109:47-60;Brantjes等，Biol.Chem.2002;383:255-261;Roose等，Biochim.BiophysActa-Rev.Cancer1999;1424:M23-M37]。卩-联蛋白-TCF复合物和染色质之间的相互作用还可以由Leg/e^fBc/力和尸j《6^w来介导。Kramps等，Cell2002;109:47-60;Thompson等，Nat.CellBiol.2002;4:367-73;Parker等，Development2002;129:2565-76。图l描绘了处于"关闭"或无活性状态以及"开启"或活性状态的规范Wnt信号传导途径的简略概要。2.与Wnt信号传导活性有关的病症Wnt信号传导途径的失调可能是由编码各种Wnt信号传导途径成分的基因中的体细胞突变引起的。例如，异常Wnt信号传导活性已经与如下病症中的Wnt配体过表达联系起来非小细胞肺癌(NSCLC)[You等，Oncogene2004;23:6170-6174]、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)[Lu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:3118-3123]、胃癌[Kim等，Exp.Oncol.2003;25:211-215;Saitohetal.,Int.J.Mol.Med.2002;9:515-519]、头颈鳞状细胞癌(丽SCC)[Rhee等，Oncogene2002;21:6598-6605]、结肠直肠癌[Holcombe等，J,Clin.Pathol-Mol.Pathol.2002;55:220-226]、卵巢癌[Ricken等，Endocrinology2002;143:2741-2749]、基底细胞癌(BCC)[LoMuzio等，AnticancerRes.2002;22:565-576]及乳腺癌。此外，各种Wnt配体调节分子(诸如sFRP和WIF-l)的降低已经与如下病症联系起来乳腺癌[Klopocki等，Int.J.Oncol.2004;25:641-649;Ugolini等，Oncogene2001;20:5810-5817;Wissmann等，J.Pathol.2003;201:204-212]、膀胱癌[Stoehr等,LabInvest.2004;84:465-478;Wissmann等，见上文]、间皮瘤[Lee等，Oncogene2004;23:6672-6676]、结肠直肠癌[Suzuki等，NatureGenet2004;36:417-422;Kim等，Mol.CancerTher.2002;1:1355-1359;Caldwell等,CancerRes.2004;64:883-888]、前列腺癌[Wissman等，见上文]、NSCLC[Mazieres等，CancerRes.2004;64:4717-4720]、及肺癌[Wissman等，见上文]。用本发明的Wnt拮抗剂分子拮抗Wnt信号传导会治疗这些癌症。继续地，因Frz-LRP受体复合物的各种成分过表达而3)起的异常Wnt信号传导也已经与某些癌症联系起来。例如，LRP5过表达已经与骨肉瘤联系起来[Hoang等，Int.J.Cancer2004;109:106-111],而Frz过表达已经与癌症联系起来，诸如前列腺癌[Wissmann等，见上文]、HNSCC[Rhee等，Oncogene2002;21:6598-6605]、结肠直肠癌[Holcombe等，见上文]、卵巢癌[Wissman等，见上文]、食管癌[Tanaka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998;95:10164-10169]及胃癌[Kirikoshi等，Int.J.Oncol.2001;19:111-115]。此外，Wnt信号传导途径成分(诸如散乱蛋白)的过表达已经与癌症联系起来诸如前列腺癌[Wissmann等，见上文]、乳腺癌[Nagahata等，CancerSci.2003;94:515-518]、间皮瘤[Uematsu等，CancerRes.2003;63:4547-4551]及宫颈癌[Okino等，Oncol.Rep.2003;10:1219-1223]。Frat-l过表达已经与癌症(诸如胰腺癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌及胃癌)联系起来。[Saitoh等，Int.J.Oncol.2002;20:785-789;Saitoh等，Int.J.Oncol.2001;19:311-315]。轴蛋白功能丧失(LOF)突变已经与肝细胞癌[Satoh等，NatureGenet.2000;24:245-250;Taniguchi等,Oncogene2002;21:4863-4871]及髓母细胞瘤[Dahmen等，CancerRes.2001;61:7039-7043;Yokota等,Int.J.Cancer2002;101:198-201]联系起来。用本发明的Wnt拮抗剂阻断Wnt-Frz相互作用会减轻与Frz或LRP的过表达有关的癌症。最后，许多癌症已经与经由对"降解复合物"的破坏(诸如(3-联蛋白中的功能获得突变或APC中的功能丧失突变)而活化p-联蛋白联系起来。P-联蛋白降解的降低导致细胞中较大量的功能性|3-联蛋白，然后其引起靶基因转录升高，导致异常细胞增殖。例如,编码(3-联蛋白的基因(即CTNNBl)中的突变已经与癌症联系起来，诸如胃癌[Clements等，CancerRes.2002;62:3503-3506;Park等，CancerRes.1999;59:4257-4260]、结肠直肠癌[Morin等,Science1997;275:1787-1790;Ilyas等，Proc.NatlAcad.Sci.USA1997;94:10330-10334]、肠的类癌[Fujimori等，CancerRes.2001;61:6656-6659]、卵巢癌[Sunaga等，GenesChrom.Cancer2001;30:316-321]、肺的腺癌[Sunaga等,见上文]、子宫内膜癌[Fukuchi等，CancerRes.1998;58:3526-3528;Kobayashi等，Japan.J.CancerRes.1999;90:55-59;Mirabelli-Primdahl等，CancerRes.1999;59:3346-3351]、肝细胞癌[Satoh等，见上文；Wong等，Cancer2001;92:136-145]、肝母细胞瘤[Koch等，CancerRes.1999;59:269-273]、髓母细胞瘤[Koch等，Int.J.Cancer2001;93:445-449]、胰腺癌[Abraham等，Am.J.Pathol.2002;160:1361-1369]、曱状腺癌[Garcia-Rostan等，CancerRes.1999;59:1811-1815;Garcia-Rostan等，Am.J.Pathol.2001;158:987-996]、前列腺癌[Chesire等，Prostate2000;45:323-334;Voeller等，CancerRes.1998;58:2520-2523]、黑素瘤[Reifenberger等，Int.J.Cancer2002;100:549-556]、毛母质瘤[Chan等，NatureGenet.1999;21:410-413]、维尔姆斯氏(Wilms)瘤[Koesters等，J.Pathol.2003;199:68-76〗、胰母细胞瘤[Abraham等，Am.J.Pathol.2001;159:1619-1627]、月旨肪肉瘤[Sakamoto等，Arch.Pathol.LabMed.2002;126:1071-1078]、青少年鼻咽血管纤维瘤[Abraham等，Am.J.Pathol.2001;158:1073-1078]、硬纤维瘤[Tejpar等，Oncogene1999;18:6615-6620;Miyoshi等，Oncol.Res.1998;10:591-594]、滑膜肉瘤[Saito等，J.Pathol.2000;192:342-350]。而功能丧失性突变已经与癌症联系起来，诸如结肠直肠癌[Fearon等，Cell19卯；61:759-767;Rowan等，Proc.NatlAcad.Sci.USA2000;7597:3352-3357〗、黑素瘤[Reifenberger等，Int.J.Cancer2002;100:549-556;Rubinfeld等，Science1997;275:1790-1792]、髓母细胞瘤[Koch等，Int.J.Cancer2001;93:445-449;Huang等，Am.J.Pathol.2000;156:433-437]及硬纤维瘤[Tejpar等，Oncogene1999;18:6615-6620;Alman等，Am丄Pathol.1997;151:329-334]。因|3-联蛋白异常活性(由此激活Wnt途径)所引起的癌症适于用本发明的Wnt拮抗剂治疗。3.Wnt信号传导和致癌作用Wnt途径具有许多转录终点或靶基因。这些中的大多数对于某些类型是特异性的一一这在发育信号传导途径中是寻常的。这与胞外信号实现的基因控制的基础机制相一致，其中细胞而非信号决定应答的性质。然而，在细胞类型特异性的基因外，Wnt信号传导还控制较广泛诱导的基因，包括Wnt信号传导途径的成分及最可能被Wnt-(3-联蛋白-TCF级联所激活的基因。研究的对象以期更好地理解隐藏于癌症发生之下的事件。P-联蛋白进行的靶基因不适当激活如此可以导致生物体中的疾病状态，即使在靶基因自身中可能没有任何体细胞突变。Ilyas完成了大多数恶性肿瘤获得的Hanahan和Weinberg表型列表的修订，包括"不适当的干细胞表型/无限的复制潜力"、"逃脱凋亡"、"组织侵入和转移"、"生长信号的自给自足"、"对生长抑制剂的不敏感性"、"终末分化的失败"、"逃脱免疫应答"、及"持续的血管发生"。Ilyas,J.Pathol.2005;205:130-144;Hanahan和Weinberg,Cell2000;100:57-70。对受Wnt信号传导调控的基因的分析(包括如微列阵分析所显示的(3-联蛋白的靶基因或改变的表达)显示直接来自异常Wnt信号传导或经由对靶基因作用而来自异常Wnt信号传导的干扰可以给予几乎所有这些"赘生性表型"。Ilyas，M.，J.Pathol.2005;205:130-144。在表l中给出了Wnt信号传导的例示靶物列表。上调的基因靶物以黑体显示，而下调的那些是斜体的。可以在应用本发明的Wnt拮抗剂后矫正由于激活的和/或过量的Wnt信号传导的结果而引起的此类靶基因的异常表达。不适当的干细胞表型逃脱调亡组织4菱入和转移生长信号的自给自足对生长抑制剂的不敏感性终末分化的失败逃脱免疫应答持续的血管发生表lWnt靶基因和表型效应簇蛋白(7)存活蛋白(8)环氧合酶—2(9)Fra-l(lO)骨桥蛋白(7)uPAR(10)密蛋白-1(11)CD44(12)MMP-7/9/11/14/26(7)IGFBP-4(7)Met(13)整^蛋白"7「5JBMP4(14)淑A/(75」^脉凝趁合蛋力2^她c2州&'甲戸/存西子4(7。凌》沐齒/州Sox9(17)组蛋白脱乙酰基酶2(7)y2-微球蛋白(V)-VEGF(18)-细胞周期蛋白D1(2)PPARS(3)—促胃液素(4)_淑奢白錄柳一癌症日益被视为"干细胞，，疾病(Taipale等，Nature2001;411:349-54),即干细胞不适当的激活和/或维持。已有显示Wnt信号传导对于维持干细胞是必需的[He等，NatureGenet.2004;36:1117-1121;Reya等，Nature2003;423:409-414;Willert等,Nature2003;423:448-452]。在肠中，TCF4是卩-联蛋白的主要核结合因子，而且TCF4敲除小鼠未能在小肠中形成干细胞的实情进一步支持规范Wnt信号传导在干细胞维持中的作用[Korinek等，Nat.Genet.1998;19:379-83;Pinto等，GenesDev.2003;17:1709-13;Kuhnert等，Proc.Natl.Acad.Sc.USA2004;101:66-71]。基质金属蛋白酶基因(MMP)表明了Wnt信号传导对多种生物学过程的效应。已有显示MMP7、MMP14和MMP26指导(3-联蛋白的靶物[Marchenko等，Int.J.Biochem.CellBiol.2004;36:942-956;Takahashi等，Oncogene2002;21:5861-5867;Brabletz等，Am.J.Pathol.1999;155:1033-1038]，而发现其它MMP由肠的腺瘤直接表达[Paoni等，Physiol.Genomics2003;15:228-235]。MMP是分解间质胶原由此让肿瘤细胞获得表型"组织侵入和转移"的蛋白水解酶。酶活性还容许释放基质中的潜伏生长因子，其与肿瘤细胞自身分泌的其它生长因子一起会促成"生长信号的自给自足'，。[Coussens等，Science2002;295:2387-2392;Egeblad等，NatureRev.Cancer2002;2:161-174]。MMP还可以作用于骨桥蛋白(次级Wnt诱导的靶物)[Paoni等，见上文]以释放片段，其与血管内皮生长因子(VEGF)((3-联蛋白的直接靶物)一起促成"持续血管发生"的特征。[Zhang等，CancerRes.2001;61:6050-6054;Agnihotri等，J.Bio.Chem.2001;276:28261-28267]。虽然Wnt信号传导途径可以在配体受体相互作用下游的多个水平激活，但是有确凿的证据提示对胞外配体-受体相互作用成分的抑制在降低致肿瘤性中是有效的，即使启动Wnt信号传导的事件可能已经在下游发生。例如，Ilyas在最近的综述中报道了在数种结肠直肠癌细胞系中对Wnt信号的抑制导致致肿瘤性降低。[Ilyas,见上文]。此外，不起作用的巻曲受体(Frz7胞外域)向癌瘤细胞系(SK-CO-1)中的转染恢复了正常的P-联蛋白表型。由于纯合APC:突变，该细胞系具有活性Wnt信号传导。此外，此类细胞在体内转移时也未显示肺瘤形成。Vincan等，Differentiation2005;73:142-153。这表明胞外水平对Wnt信号传导的抑制可以下调因下游胞内Wnt信号传导途径成分的激活引起的Wnt信号传导。这进一步提示抑制Wnt-Frz相互作用的抑制剂诸如本发明的Wnt拮抗剂对任何Wnt介导的病症具有治疗性益处，不管Wnt信号传导是以何种具体方式#皮激活的。4.结肠癌中的异常Wnt信号传导最初发现Wnt信号传导成分APC的缺陷在遗传性癌症综合征家族性腺瘤性息肉病(FAP)中是关键的。遗传得到一个缺陷型APC等位基因的FAP患者在其寿命的早年中形成大量的结肠息肉、或腺瘤。此类息肉以其中第二APC等位基因被灭活的上皮细胞的克隆赘疣(clonaloutgrowth)形式形成。这些FAP腺瘤的累积效应不可避免地导致腺癌的出现，表现为别的癌基因或肿瘤抑制基因(诸如K-Ras、p53及Smad4)中的突变的或多或少的有序积累。此外，APC的缺失也在大多数散发性结肠直肠癌中发生。Kinzler等，Cell87:159-170(1996)。APC的突变灭活通过导致P-联蛋白的稳定化和最终核转运及Wnt信号传导而由此转化上皮细胞。有趣的是，包含串联TCF结合位点的报道质粒(诸如pTOPFLASH)(正常情况下仅在Wnt信号传导后转录)经由卩-联蛋白/TCF-4转录复合物的组成型激活而在APC突变型癌细胞中不适当地转录。在APC未突变的结肠直肠癌的其它例子中，支架蛋白轴蛋白-2是突变的[Liu等，NatureGenet.26:146-147(2000)]或者(3-联蛋白是突变的，从而除去N端Ser/Thr破坏基序。[Morin等，Science275:1787-1790(1997)]。如此，结肠直肠癌不仅与APC缺陷有联系，而且与(3-联蛋白/TCF-4转录激活的不适当持续有联系。还有报道，TCF-4突变导致结肠直肠癌中相同靶基因(如微列阵所显示的)的激活，如通过在隐窝千细胞和祖细胞中的缺陷型APC表达所观察到的。VandeWetering等，Cell111:241-250(2002)。一旦Wnt级联被激活，则APC一腺瘤细胞无限地维持其祖细胞状态。结果，可能的是，对Wnt信号传导的激活在结肠直肠癌的癌症发生中是必需的先兆，并且对Wnt信号传导的抑制可以是治疗和/或预防该病症发作的有效手段。5.造血干细胞中的Wnt信号传导在来自多能造血干细胞(HSC)的谱系定向祖细胞的过程中，造血干细胞产生循环系统的成熟血细胞。同样显而易见的是，Wnt信号传导促成HSC的自我更新和维持，且功能失常的Wnt信号传导是因HSC引起的各种病症(诸如白血病和多种其它血液相关癌症)的原因。Reya等，Nature434:843-850(2005);Baba等，Immunity23:599-609(2005);Jamieson等，N.Engl.J.Med.351(7):657-667(2004)。在干细胞转变成定向髓样祖细胞时，Wnt信号传导通常降低。Reya等，Nature423:409-414(2003)。不仅Wnt配体本身是HSC所生成的，而且Wnt信号传导也是有活性的，由此提示自分泌或旁分泌调节。Rattis等，Curr.Opin.Hematol.11:88-94(2004);Reya等，Nature423:409-414(2003)。另夕卜，(3-联蛋白和Wnt3a两者都促进鼠HSC和祖细胞的自我更新，而对人造血祖细胞的应用Wnt-5A在体外促进未分化祖细胞的扩充。Reya等，见上文；Willert等，Nature423:448-452(2003);VanDenBerg等，Blood92:3189-3202(1998)。在HSC外，显而易见的是，胚胎干细胞、表皮干细胞及上皮干细胞应答或依赖Wnt信号传导而维持在未分化的、增殖中的状态。Willert等，见上文；Korinek等,Nat.Genet.19:379-383(1998);Sato等，Nat.Med.10:55-63(2004);Gat等,Cell95:605-614(1998);Zhu等,Development126:2285-2298(1999)。因此，本发明的Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制可能是治疗由功能失常的血细胞生成引起的病症(诸如白血病和各种血液相关癌症，诸如急性、'隄性、淋巴样及髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome)及骨髓增殖性病症(myeloproliferativedisorder))中的一种疗法。这些包括骨髓瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)和非何杰金氏)、慢性和非进行性贫血(chronicandnonprogressiveanemia)、进ft性和症4犬性血纟田月包在夹乏症(progressiveandsymptomaticbloodcelldeficiencies)、真性红纟田月包增多症(polycythemiavera)、特发性或原发性血小板增多症(essentialorprimarythrombocythemia)、特发性骨髓纤维化(idiopathicmyelofibrosis)、慢性骨髓单才亥细月包'I"生白血病(chronicmyelomonocyticleukemia,CMML)、套纟田月包'淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、皮月夫T纟田月包'淋巴瘤(cutaneousT-celllymphoma)、瓦尔登斯特"f仑氏巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobinemia)。6.白血病中的Wnt信号传导不受调节的Wnt信号传导途径激活是白血病发生的先兆。Reya等，见上文。存在支持髓样和淋巴样谱系两者的致癌生长是依赖于Wnt信号传导的实验证据。已经将Wnt信号传导与调节慢性和急性两种形式的髓样白血病联系起来。来自慢性髓细胞性白血病患者的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)和来自对疗法耐受性的患者的原始细胞危象细胞(blastcrisiscell)展现激活的Wnt信号传导。Jamieson等，见上文。此外，通过轴蛋白异位表达实现的对P-联蛋白的抑制在体外降低了白血病细胞再次铺板(replating)能力，提示慢性髓细胞80性白血病前体细胞的生长及更新依赖于Wnt信号传导。同样，Wnt过表达使GMP获得长期自我更新的干细胞样性质。Jamieson等，见上文。该发现进一步支持如下假设，即Wnt信号传导对于血液谱系的正常发育是必需的，但是异常Wnt信号传导导致祖细胞的转化。本发明的Wnt拮抗剂对于治疗这些类型的白血病会是有用的。最近的研究还提示淋巴样瘤形成可能也受到Wnt信号传导的影响。Wnt-16在携带E2A-PbX易位的前B细胞白血病细胞系中过表达，提示自分泌Wnt活性可能促成瘤发生。McWhirter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:11464-11469(1999)。Wnt信号传导在正常B细胞祖细胞的生长和存活中的作用进一步支持这种看法。Reya等，Immunity13:15-24(2000);Ranheim等，Blood105:2487-2494(2005)。还提出了对Wnt的自分泌依赖性用于调节多发性骨髓瘤(终末分化B细胞的一种癌症)的生长。Derksen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:6122_6127(2004)。还发现原发性骨髓瘤和骨髓瘤细胞系表达稳定化的(即不依赖于降解复合物)。虽然在Wnt信号传导成分中不存在突变，但是数种成分(包括Wnt-5A和Wnt-10B)的过表达提示肿瘤依赖性和癌症自我更新不必依赖于Wnt信号传导途径成分中出现的突变，而仅依赖于该途径自身的组成型激活。Reya等，见上文。通过结合过表达的Wnt，本发明的Wnt拮抗剂会是治疗B细胞白血病中的有效治疗剂。自我更新中的、多能干细胞向髓样祖细胞的转变是通过下调Wnt信号传导来实现的。Reya等，Nature423:409-414(2003)。类似地，在淋巴样祖细胞中卩-联蛋白的稳定表达恢复了多项分化选择，虽然此类细胞缺乏典型地与任一细胞类型有关的标志物。Baba等，Immunity23:599-609(2005)。如此，强烈提示的是，本发明的Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制可以是治疗白血病(诸如髓样和淋巴样白血病，包括急性和慢性髓细胞性白血病以及急性和慢性淋巴样白血病)中的有效疗法。7.神经病症中的异常Wnt信号传导还观察到经由P-联蛋白进行的Wnt信号传导激活可以增加神经祖细胞的循环和扩充，而且此类信号传导的丧失可导致祖细胞区室的丧失。Chenn等,Science297:365-369(2002);Zechner等，Dev.Biol.258:406-418(2003)。正如Wnt信号传导的正常激活可以促进神经元千细胞的自我更新那样，异常Wnt途径激活在神经系统中可能是致瘤性的。支持该结论的实验证据是如下发现，即髓母细胞瘤(一种儿科小脑脑瘤)在(3-联蛋白和轴蛋白两者中含有突变，由此提示髓母细胞瘤源于原始祖细胞，其在应答不受控制的Wnt信号传导时被转化。Zurawel等，CancerRes.58:896-899(1998);Dahmen等，CancerRes.61:7039-7043(2001);Baeza等，Oncogene22:632-636(2003)。如此，强烈提示的是，本发明的Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制可以是治疗各种神经元增殖性病症中的有效疗法,所述神经元增殖性病症包括脑瘤，诸如神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑脊膜瘤、许旺氏细胞瘤、垂体瘤、原始性神经外胚层瘤(PNET)、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、松果体区肿瘤(pinealregiontumor)、及非癌性神经纤维瘤病。8.乳腺癌中的异常Wnt信号传导在干细胞有待明确分离的乳房组织中，Wnt转基因小鼠形成乳房肿瘤的研究提示了Wnt在祖细胞命运或维持中的控制作用。与来自过表达其它癌基因的小鼠的肺瘤形成鲜明对比，这些肿瘤中拥有干细月包和祖细胞性质的个体细胞的频率升高。[Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:4158-4163(2004);Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:15853-15858(2003)]。这提示Wnt途径在其将干细胞和祖细胞靶向转化的能力中可能是独特的，并提示在正常乳房上皮的更新中的关键作用。如此，本发明的Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制可能是治疗乳腺癌中的有效疗法。图32显示了人乳腺癌中的活性Wnt信号传导。图32A显示了在正常的(A-1)、低等级的(A-2)和高等级的(A-3)人乳腺肿瘤中的Wnt-l表达(如通过体外杂交所示的)，其最初报道于Wong等，J.Pathol.196:145(2002)。图32B显示了乳腺癌患者中(3-联蛋白的核(B-l)定位和胞质(B-2)定位(如通过IHC所示的)。还显示的是Kaplan-Meier存活曲线(B-3)，其显示了与所示(3-联蛋白表达样式相关的患者存活概率。该数据最初报道于Lin等，P.N.A.S.(USA)97(8):4262-66(2000)。图32C是Wnt-l表达的微列阵分析，其比较了来自没有癌症的患者的正常乳房与从患有her-2阴性的浸润性导管癌的患者中分离的组织。9.衰老中的Wnt信号传导Wnt信号传导途径还可能在衰老和年龄相关病症中发挥至关重要的作用。如BrackAS等，Science,317(5839):807-10(2007)中所报道，观察到来自老年小鼠的肌肉干细胞在它们开始增殖时从生肌性(myogenic)谱系转变至生纤维性(fibrogenic)谱系。此转变与老年生肌性祖细胞中规范Wnt信号传导途径活性的升高有关，并可以被Wnt抑制剂所抑制。另外，来自老年小鼠的血清成分结合巻曲蛋白，并可以解释老年细胞中升高的Wnt信号传导。将Wnt3A注射入年幼的再生中的月/L肉中降^氐了增殖，并增加了结締组织的沉积。已经将Wnt信号传导途径进一步与使用衰老加速的Klotho小鼠模式的研究中的衰老过程联系起来，在所述研究中确定Klotho蛋白在物理上与Wnt蛋白相互作用，并抑制Wnt蛋白。LiuH等，Science,317(5839):803-6(2007)。在细胞培养物才莫型中，Wnt-Klotho相互作用导致对Wnt生物学活性的抑制，而来自Klotho缺陷型动物的组织和器官显示了Wnt信号传导增加的证据。因而，Wnt拮抗剂可以作为治疗剂用于降低衰老的效应，并用于治疗年龄相关疾病。I.具体配制剂的施用模式1.一般考虑因素将药用组合物配制成与其预想的施用路径相容，所述施用路径包括静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即表面)、经粘膜、及直肠施用。用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯曱醇或对羟基苯曱酸曱酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氬钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及供调节张力用的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱来调节，诸如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。2.可注射配制剂适合用于注射的药用组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOREL(BASF,Parsippany,N丄)或磷酸盐緩沖盐水(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的，并应当是流体的，从而能使用注射器来施用。此类组合物在制备和贮存过程中应当是稳定的，并必须针对来自微生物(诸如细菌和真菌)的污染提供保护。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙83二醇、及液态聚乙二醇)、及合适的混合物。可以例如通过使用涂层(诸如卵磷脂)、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯曱酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、及硫柳汞)可以抗击微生物污染。等渗剂(例如糖类，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，及氯化钠)可以包括在组合物中。可延迟吸收的组合物包括诸如单硬脂酸铝和明胶等试剂。可以如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如本发明的任何调控性物质/分子)，接着灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介中而制备，所述无菌媒介含有基础分散介质及其它所需成分。供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其自无菌溶液产生含有活性成分和任何所需成分的粉末。3.系统施用系统施用也可以是经粘膜的或经皮的。对于经粘膜或经皮施用，选择能渗透靶物屏障的渗透剂。经粘膜渗透剂包括去污剂、胆汁盐、及梭链孢酸(fusidicacid)衍生物。鼻腔喷雾或栓剂可以用于经粘膜施用。对于经皮施用，活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂、或乳膏。化合物还可以以用于直肠投递的栓剂(例如含诸如可可脂及其它甘油酯等基质)或保留灌肠剂形式制备。4.载体在一个实施方案中，活性化合物与保护该化合物免于从身体内快速消除的载体一起制备，诸如受控释放配制剂，包括植入物和微嚢化投递系统。可以使用生物可降解的或生物相容的聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯、聚(酸)酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯、及聚乳酸。此类材料可以购自ALZACorporation(MountainView,CA)和NOVAPharmaceuticals,Inc.(LakeElsinore，CA),或由本领域技术人员制备。脂质体悬浮液也可以用作药学可接受载体。这些可以依照本领域^支术人员已知的方法(诸如Eppstein等，美国专利No.4,522,811,1985中的方法)来制备。5.单位剂量可以创建单位剂量形式的口服配制剂或胃肠外组合物以促进施用和剂量均一。单位剂量形式指适合作为供待治疗受试者用的单剂的物理离散单元，其包含与所需药用载体组合的治疗有效数量的活性化合物。单位剂量形式的规格由下列因素规定，并直接取决于下列因素活性化合物的独特性质和具体期望的治疗效果，及活性化合物复合的内在限制。6.基因疗法组合物可以将核酸分子插入载体中并用作基因疗法载体。基因疗法载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(Nabel和Nabel，美国专利No.5,328,470，1994)，或通过立体定向(stereotactic)注射(Chen等，ProcNatlAcadSciUSA.91:3054-7(1994))而投递给受试者。基因疗法载体的药用制剂可包括可接受稀释剂，或可包含其中埋置有基因投递媒介的緩慢释放基质。或者，若可以从重组细胞中完整地生成完全的基因投递载体(例如逆转录病毒载体)，则药用制剂可包括生成基因投递系统的一种或多种细胞。7.剂量药用组合物和方法可以进一步包含通常在Wnt拮抗剂的施用中应用的其它治疗活性化合物。在要求施用Wnt拮抗剂的疾患治疗或预防中，合适剂量水平一般会是约0.01至500mg/kg患者体重/天，其可以以单剂或多剂施用。优选地，剂量水平会是约0.1至约250mg/kg/天，更优选约0.5至约100mg/kg/天。合适的剂量水平可以是约0.01至250mg/kg/天，约0.05至100mg/kg/天，或约0.1至50mg/kg/天。在该范围内，剂量可以是0.05至0.5，0.5至5或者5至50mg/kg/天。对于口服施用，组合物优选以包含1.0至1000毫克活性成分，具体地，1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、及1000.0毫克活性成分的片剂形式提供，用于根据症状调整给待治疗患者的剂量。化合物可以以每天1至4次，优选每天一次或两次的方案施用。然而，对于任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以有所变化，而且会取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用的模式和次数(time)、排泄速率、药物组合、特定疾患的严重程度、及宿主正在接受的疗法。8.组合物的试剂盒组合物(例如药用组合物)可以与施用说明书一起包括在试剂盒、容器、85包装、或分配器中。在以试剂盒形式提供时，组合物的不同组分可以包装在分开的容器中，并在临使用前混合。组分的这种分开包装可以容许长期的贮存，而不丧失活性组分的功能。试剂盒还可以在分开的容器中包括促进特定测试(诸如诊断测试或组织定型)实施的试剂。(a)容器或器亚试剂盒中包括的试剂可以在任何种类的容器中提供，使得不同组分的寿命得到保存，并不受容器材料吸收或改变。例如，封口的玻璃安瓿可以装有冻干的调控物质/分子和/或緩冲剂，其已经在中性、非反应性气体(诸如氮气)下包装。安瓿可以由任何合适的材料构成，诸如玻璃、有机聚合物(诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等)、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其它材料。合适容器的其它例子包括可以由与安瓿类似的物质制成的简单瓶子，和包封，其可以由箔衬里的内部构成，诸如铝或合金。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可具有无菌存取口，诸如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子。其它容器可具有由可容易拆除的膜所分开的两个隔室，所述可容易拆除的膜在移动后容许各组分混合。可拆除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。(b)说明材料试剂盒还可以提供说明材料。说明书可以印刷在纸或其它基片上，和/或以电子可读的々某介4是供，诸如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、激光盘、录音磁带等。详细的说明书可以不是与试剂盒在物理上结合的，使用者可以登陆试剂盒制造商或销售商指定的因特网网址，或以电子邮件提供。9.联合疗法在某些实施方案中，包含Wnt拮抗剂的药用配制剂与至少一种别的治疗剂和/或佐剂联合施用。在某些实施方案中，别的治疗剂是化疗剂、生长抑制剂、或细胞毒剂(像毒素)诸如美登木素生物碱、加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。上文所述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一或分开的配制剂中)和分开施用，在分开施用的情况中，Wnt拮抗剂的施用可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生。Wnt拮抗剂还可以与放射疗法联合使用。10.药物本发明提供了Wnt拮抗剂在制备可用于治疗Wnt介导的病症的药物中的用途。在一个具体的方面中，所述Wnt介导的病症是癌症。包括以下实施例以表明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当领会，以下实施例中所公开的技术代表发明人所发现的、在本发明的实施中运行良好的技术，如此可以认为这些技术构成实施本发明的优选4莫式。然而，依照本公开，本领域技术人员应当领会，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以在所公开的具体实施方案中产生许多变化，且仍获得相像的或类似的结果。通过提及明确而完整地收录整篇说明书中所引用的所有参考文献。实施例l:通用方案哺乳动物细胞培养物将人肾上皮(HEK)293细月包(ATCC#CRL-1573)、人卵巢PA1细胞(ATCC#CRL-1572)在50/50Dulbecco改良的Eagle高葡萄糖培养基、Ham氏F12(其已经补充了10%胎牛血清)中培养。将人畸胎瘤衍生的NTer2(ATCC#CRL-1973)和Tera2(ATCC#HTB-106)细胞在补充有15。/。胎牛血清的McCoy氏培养基中维持，而将NCCIT细胞(ATCC#CRL-2073)在补充有10。/。胎牛血清的RPMI中维持。在37。C于5。/。C02中给所有细胞系进一步补充2mM谷氨酰胺及l。/。青霉素-链霉素。转染和萤光素酶测定法作为转染的准备，在转染前24小时将(1)500，000个HEK293细胞及(2)IOO,OOO个PAI细胞(ATCC#CRL-1572)、NCCIT、NTera2或Tera2细胞铺入12孔皿(Nuc)的各个孔中。用0.375jxgTOPglow(Upstate，Cat#21-204)、0.05mgLEF1、O.OlmgSV40RL以及Fugene(Roche)转染细胞，在转染后24小时，更换培养基，并在收获之前不对细胞进行处理，或对细胞仅用Wnt3a、仅用Wnt5a、或用血清样品再处理20-24小时。在完全培养基中为所示细胞系制备所有的稀释物。将细胞收获在50-100W1XSJC裂解緩沖液(20mMTrispH8.0、137mMNaCl、lmMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、1.5mMMgCl2、lmMDTT、50mMNaF、lmMNaV04及蛋白酶抑制剂)中，并使用Dual-Glo萤光素酶测定试剂盒(Promega,Part#TM058)来对双份的10pl进行测定，并以Envision发光计(PerkinElmer)检测。将萤光素酶活性相对于iew7/a活性标准化。实施例2:Frz-Fc嵌合分子的构建克隆和表达Frz8(173)-Fc和Frz8(156)-Fc图4A和B显示了Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc嵌合构建体的序列。图4A显示了较长的Frz8(173)序列。以灰色显示的(即前24个N端氨基酸残基)是前导信号序列。以下划线显示的(即残基25-27)是丙氨酸残基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以划上方框的文本显示的(即残基157-173)是区分较长Frz8(173)嵌合构建体与较短Frz8(Frzl56)嵌合构建体的Frz8受体额外序列。以粗体显示的(即残基174-182)是接头序列，而斜体形式的序列(即残基183-409)是Fc区。图4B显示了较短的Frz(156)最低限度CRD(ECD)结构域序列。以灰色显示的(即前24个N端氨基酸残基)是前导信号序列。以下划线显示的(即残基25-27)是丙氨酸残基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以粗体显示的(即残基157-164)是接头序列，而斜体形式的序列(即残基165-391)是Fc区。如下构建Frz8(156)-Fc构建体。将编码巻曲蛋白8残基1-156的cDNA亚克隆入pRK衍生的质粒的EcoRI和XhoI位点。虽然优选天然的人cDNA，但是也可以使用编码相同蛋白质序列的备选序列(例如鼠的)。在这种克隆规程中，将Frz8的羧基末端经由短接头区(例如残基LESGGGGVT)(SEQIDNO:70)而融合至人IgG效应器结构域(Fc)的氨基末端以创建Frz8-Fc融合物。最终的构建体编码Frz8的156个残基。使用标准分子生物学技术(Ausubd等(编),2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,4巻，JohnWiley&Sons)来实施克隆。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达蛋白质。或者，可以使用编码长度与之前所述不同的Frz8的一定长度(例如1-173)的cDNA。另夕卜，还可以使用备选的接头序列(例如ESGGGGVT)(SEQIDNO:69)。Frz-Fc和sFRP-Fc构建体以与为Frz8所述规程类似的方式，构建具有巻曲结构域构件(其包含Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)的Wnt拮抗剂的构建体。使用XhoI和AscI来将Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、及sFRP3亚克隆入pRK衍生的质粒。使用ClaI和XhoI来将Frzl、Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO、及sFRP4亚克隆入pRK衍生的质粒，而使用ClaI和AscI来将sFRPl、sFRP2、及sFRP5亚克隆入pRK衍生的质粒。与Frz8构建体一样，将Frz结构域的羧基末端经由短接头区而融合至人IgG效应器结构域(Fc)的氨基末端以创建嵌合Wnt拮抗剂。图7(A、B、及C)显示了这些构建体的例示性氨基酸序列。前导信号序列以粗体显示，斜体指示非天然前导序列。接头是加下划线的，而Fc构件以斜体显示。图5(A-H)(SEQIDNO:115-129)提供了这些Wnt拮抗剂构建体的例示性核酸序列。可以制备备选的构建体以优化体内活性或稳定性，或提供其它有益特征，诸如例如升高的溶解度、改良的结合特征。这些构建体可以包括与上文所述Wnt拮抗剂的接头不同的接头。例如，如下制备了Frz3-Fc嵌合蛋白(SEQIDNO:114)的备选构建体，即使用BstXI和XhoI来将Frz3结构域亚克隆入pRK衍生的质粒，并使用LESGGGGVT(SEQIDNO:70)肽接头来将Frz3结构域与Fc结构域融合。蛋白质分离使用PROSEP(Millipore)蛋白A偶联树脂通过亲和捕捉而将Wnt拮抗剂嵌合蛋白分离至大于90%的纯度。通过流经Superdex200(GE-Healthcare)凝胶过滤柱将较高等级的聚集体与二聚体分开。通过Edmund降解来证实蛋白质身份和除去信号序列的氨基端加工。估计最终蛋白质的纯度大于98%(图10)。材料在纯化后的内毒素水平是完全的(complete)并小于l.OEU/mg。实施例3:Frz8-Fc嵌合分子的血清稳定性Frz8(173)-Fc嵌合构建体的血清稳定性的最初研究表明该构建体具有有限的体内半衰期。体内不稳定性可能是因为巻曲受体构件的EC结构域(ECD)中存在蛋白酶切割位点。实施例2中所述Frz8(156)-Fc构建体展现出比Frz8(173)-Fc升高的血清稳定性。给无胸腺棵鼠静脉内注射10mg/kgFrz8(173)-Fc或Frz8(156)-Fc。在规定的时间点收集血清，并分析总蛋白质和活性蛋白质。图llA显示了人Fc的免疫印迹，其用于检测lpL血清中存在的蛋白质并与25吗效应的纯化的蛋白质(P)进行比较。Frz8(156)-Fc在施用后72小时在血清中是可检测的，而Frz8(173)-Fc过了30分钟便检测不到。通过测量HEK293细胞中对Wnt3a依赖性TOPglow报道活性的抑制来测定所收集的血清中Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc的活性。虽然对使用2.5pg/mL的纯化的Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc进行的处理观察到相当的体外效力，但从蛋白质施用后30分钟收集的用Frz8(173)-Fc处理的小鼠的血清中仅回收到部分的抑制活性。相比之下，可以从施用后长达24小时的用Frz8(156)-Fc处理的小鼠的血清中回收到更有力的抑制活性，其中可检测水平的抑制持续至少72小时(图11B)。这些研究表明在体内Frz8(156)分子比基于Frz8(173)的分子更稳定。另外，Frz8(173)-Fc具有亚最适功效，而且^f叉起降低肿瘤体积增加速率的作用(与缩小起始肿瘤体积形成对比)。这种亚最适功效显示于图12,其显示了肺瘤体积随时间的曲线图，这源自使用各种Wnt信号传导构件-Fc嵌合拮抗剂(包括Frz8(173)-Fc分子)的处理。在该测定法中，将MMTV-WNT-1肿瘤移植入无胸腺棵鼠的乳房脂肪垫中，并在X轴上箭头所示时间点静脉内施用药物。实施例4:Frz8(156)-Fc的体内药动学通过给棵鼠静脉内施用l、5、或20mg/kg单剂Frz8(156)-Fc或腹膜内施用20mg/kg单剂Frz8(156)-Fc来测试该蛋白质的体内药动学。如图13所报道及以下本实施例所进一步讨论的，所有剂量的Frz8-Fc药剂在棵鼠中展现两阶段消除。在IV或IP单剂后，Frz8-Fc展现:(1)与剂量成正比的暴露，(2)IP剂量给药后的快速吸收，。)约2S-30ml/天的清除，及(4)约4天的半衰期。生物利用度系数，AUC1P/AUCIV=92%。动物方案基于施用药物的数量和施用方式，将雌性无胸腺棵鼠分成4组，12只。组l:Frz8-Fc，lmg/kg，IV;组2:Frz8-Fc，5mg/kg,IV;组3:Frz8-Fc20mg/kg,IV;及组4:Frz8-Fc，20mg/kg,IP。依照分组指派，每只动物接受一剂Frz8-Fc的IV或IP推注。施用的剂量体积(5-10mL/kg)随剂量给药溶液的浓度和每种动物的重量而变化。IV剂量给药经由尾静脉来施行。依照如下规程，从每种动物收集约125pl血液。将血清!^存在-70。C,直至通过ELISA进行测定。取出样品，使得11=3只动物/时间点。额外的动物用于服药前(predose)样品收集和/或空白小鼠血清收集。使用交替的(alternative)眼睛，通过眶后放血收集每只动物前二个时间点的血液。对于最后一个时间点，经由心脏穿刺(cardiacstick)收集血液，并将约lml等分成2管。一个样品将用于测定Frz8-Fc浓度，而另一个将保留用于研究用途。在每个血液收集时间点后，每只动物接受10ml盐水IP推注作为补液。在异氟醚麻醉下实施眶后放血，并在氯胺酮(ketamine)/曱苯嚷。秦(xylazine)混合物下发生终末放血。最终采血后，在麻醉下经由颈脱位法对动物实施安乐死。结果图13A是来自用Frz8-Fc处理的小鼠的纯净血清的免疫印迹，其显示了自20或5mg/kg1.V.或20mg/kg1.P.两者在7天及之后的血清中的检测。在4、7、10或14天，自各只小鼠采集样品。对于对照，自未处理小鼠采集血清样品，将Frz8-Fc蛋白添加至20)ig/m1,并将样品在37。C温育2小时，然后将样品用SDS加样缓冲液处理(标记为2h);来自未处理小鼠的纯净血清还作为阴性对照电泳(标记为S)。'图13B和13C是从药动学研究中测定的Frz8-Fc血清水平的图解汇总。特定的时期包括在16天(图13B)和2天(图13C)里进行的评估。所有剂量的Frz8-Fc在棵鼠中展现两阶段消除施用。曲线表示预测的浓度，而各个数据点表示来自各个小鼠的Frz8-Fc蛋白的平均血清水平，正如通过ELISA所测定的。图13D是Frz8-Fc药动学两阶段模型的参数汇总。在通过i.p.或i.v.路径服用20mg/kg时，在注射一天内达到相当的蛋白质血清水平，且直到7天该蛋白质在血清中都是检测得到的。在i.p.剂量给药20mg/kg后，蛋白质被快速吸收，其中T隨为约8h且生物利用度(AUCIP/AUC1V)为92%。蛋白质清除为约25-30mL/d/kg,且半衰期为约4天。实施例5:Frz-Fc分子的结合亲和力Fc结构域添加至Frz8(156)结构域导致对Wnt3a的结合亲和力升高2个数量级以上。图14表明Frz8-ECD在连接至二聚Fc结构域后阻断Wnt3a信号传导ICso曲线图。图14B的凝胶证实了分离的Frz8(156)CRD(ECD)的纯度。显示的是(a)未减小的Frz8(156)ECD(第l道)；(b)分子量标志物(第2道);及减小的Frz8ECD(156)(第3道)。该凝胶表明用于结合测定法的Frz8ECD是完整的，并大致以预期的分子量电泳。实施例6:Frz-Fc嵌合物的结合活性ELISA对于Wnt拮抗剂的PK评估，将384孔ELISA微量滴定板(NuncMaxisorp,Rochester,NY)的各孔用PBS中1i!g/ml浓度的家兔抗人Fc(JacksonImmunoResearch,Westgrove,PA)(25昭/孑L)包被。在4。C温育过夜后，倒掉家兔抗人Fc溶液，并用4(Vl/孔封闭緩冲液(含0.5%BSA和10ppmProclin的PBS)封闭平板。在温和摇动下在室温温育60分钟后，将家兔抗人Fc包被的平板用清洗緩沖液(含0.05%Tween20⑧及10ppmProclin的PBS)清洗3次。将巻曲蛋白-Fc标准品(浓度范围为0.78-100ng/ml的稀释系列)，和在测定緩冲液(含0.5%BSA、0.05%Tween20⑧及10ppmProclin的PBS)中稀释成测定范围的样品添加至测定平板(25(il/孔)。在温和摇动下在室温温育120分钟后，将测定平板用清洗緩冲液清洗6次。使用在测定稀释液中稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG-Fc(JacksonImmunoResearch)(25|11/孔)来检测剩余的所结合的Frz-Fc。适当的显色(10-25分钟)后，用lM磷酸(25pl/孔)来停止酶促反应。在450nm波长及630nm参照波长处读取测定平板。通过针对使用4参数算法的标准曲线拟合比较样品OD来测定样品浓度。BIAcore图15表明Wnt3a对Frz8(l-156)-Fc嵌合物的直接结合。将该嵌合蛋白以约1700个响应单位胺偶联至BiocoreTM(BIAcore,Inc.Piscataway,NJ.)CM5传感器芯片，基本上如Chen,Y.等，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)所述。简言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N—羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。然后注射估计浓度为0.5叫/ml的Wnt3a,并通过作为时间函数的响应单位变化来评估结合。发现Wnt3a结合Frz8-Fc。如图15所示，Wnt3a和Frz-Fc的结合导致超过对照蛋白(大肠杆菌表达的非天然Wnt3a)1000个响应单位的高度显著增加。OCTET4吏用OCTETTM-QK系统(Fort6Bio，Inc.，MenloPark,CA)来测量Wnt拮抗剂与Wnt配体Wnt3a和Wnt5a相互作用的能力。该系统容许测量生物传感器表明的蛋白质结合。如下进行测定法，即首先将Wnt拮抗剂分子之一(20ug/mL)与抗人IgGFc特异性生物传感器一起在含0.5。/。CHAPS的磷酸盐緩沖盐水(PBS)中温育10分钟。通过在含0.5。/。CHAPS的PBS中清洗1.5分钟来除去未结合的Wnt拮抗剂。然后将Wnt3a或Wnt5a(5.0ug/mL)添加至该测定法，并与结合至生物传感器表面的Wnt拮抗剂分子一起在含0.5。/。CHAPS的PBS中温育5分钟。在相同的緩沖液中监测Wnt拮抗剂分子和Wnt配体之间的相互作用。所有的测定步骤均在室温在150uL体积中实施。图16显示了该结合测定法的结果，其中图16A显示了来自Wnt3a^j"Frzl-FrzlO-Fc嵌合体的结合的数据，图Wnt5a^"Frzl-FrzlO-Fc嵌合体和sFRP-Fc嵌合体的结合的数据。OCTETTM测定法表明Wnt3a和Wnt5a两者结合Fz8-Fc、Fz5-Fc、及Fz4-Fc最快(相对于其它Frz蛋白)，且Wnt3a以较慢的速率结合Fzl-Fc、Fz2-Fc、及Fz7-Fc。Wnt-5a结合曲线的幅度和线性性质表明相对于Wnt3a结合的较低结合亲和力，正如本结合测定法所测定的。OCTETTM结合数据的幅度表明sFRP-Fc蛋白所具有的对Wnt3a的亲和力类似于对Frzl、Frz2、及Frz7所观察到的，而且些微低于对Frz5和Frz8所观察到的。实施例7:Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制一一细胞测定法使用经TOPglow报道质粒转染的293(人肾)细胞来实施细胞测定法。作为转染的准备，在转染前24小时将大约500,000个HEK293铺入12孔皿(Nuc)的孑L中。用0.375(igTOPglow(Upstate,Cat#21-204)、0.05mgLEFl、0.0lmgSV40RL以及Fugene(Roche)转染细胞，在转染后24小时，更换培养基，并在收获之前不对细胞进行处理，或对细胞仅用Wnt3a、仅用Wnt5a、或用Wnt拮抗剂再处理20-24小时。在完全培养基中为所示细胞系制备所有的稀释物。将细胞收获在50-100ji11XSJC裂解缓冲液(20mMTrispH8.0、137mMNaCl、lmMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、1.5mMMgCl2、lmMDTT、50mMNaF、lmMNaV04及蛋白酶抑制剂)中，并使用Dual-GloTM萤光素酶测定试剂盒(Promega，Part#TM058)来对双份的lO(il进行测定，并以Envision发光计(PerkinElmer)检测。将萤光素酶活性相对于iem'〃a活性标准化。在报道分子外还用Frz4和Lrp5转染有待用Wnt5a处理的细胞。这些额外成分的存在容许Wnt5a引起的Wnt途径激活，以依照规范途径行进。MikelsAJ和NusseR.,PLOSBiol.4:el15(2006)。用100ng/mlWnt3a处理Wnt3a活化的细胞，而用lug/mlWnt5a处理Wnt5a活化的细胞。如图17A和B所示，Frz-Fc拮抗剂不同程度地抑制Wnt信号传导。Frz5-Fc和Frz8-Fc两者都显示了对Wnt3a信号的完全抑制，并显著抑制了Wnt5a信号。Frz4-Fc、Frz2-Fc、及Frz7-Fc显示了对Wnt3a信号的显著抑制。实施例8:Wnt拮抗剂的相对IC50如下测定Wnt拮抗剂的相对IC50,即如实施例7所述测量经TOPglow萤光素酶TCF报道质粒稳定转染的U20S(人骨肉瘤)细胞中Wnt拮抗剂对Wnt信号传导的抑制。通过Wnt3a活化获得细胞中的初始Wnt信号传导。将Frz-Fc的3倍稀释系列应用至细胞过^复(图18)。如本测定法所测定的，Wnt3a以亚纳摩尔IC50结合Frz8-Fc、Frz5-Fc、及Frz4-Fc(其中Frz8-Fc具有0.04nM的IC50,Frz5-Fc具有0.20nM的IC50,而Frz4-Fc具有0.48nM的IC50)，并以纳摩尔IC50结合Frz2-Fc和Frz7-Fc(其中Frz2-Fc具有1.2nM的IC50，而Frz2-Fc具有1.4nM的IC50)实施例9:作为药物响应的药效学标志物的Wnt乾基因作为(3-联蛋白免疫组织化学分析的备选，使用Wnt的转录靶物来监测对Wnt信号传导活性的抑制。具有自分泌Wnt信号传导的细胞系显示了升高的已知Wnt靶基因表达，而且这种表达受到Wnt3a体外处理以及Frz8-Fc的调节。NTera-2细胞的RNA分析表明Frz8-Fc处理影响所测试的Wnt靶基因的表达。如此，可以作为治疗功效的指标来追踪这些基因的表达。作为这些观察的延伸，这些Wnt輩巴基因的表达可以用作i貪断性工具以鉴定这冲羊的癌症，其由Wnt信号传导驱动且有可能是抗Wnt治疗剂的候选物。在体外对经纯化的Wnt3a、Fz8CRD-Fc、或对照蛋白质处理的PA-1细胞实施体外比较性基因表达分析以测定Wnt靶基因用以指示畸胎瘤细胞中对Wnt信号传导的体内抑制的适合性。对经Wnt3a、Frz8-Fc、或对照Fc蛋白处理的PA-1细胞中分离的RNA进行微列阵分析，并测定所示基因表达水平响应外源添加的Wnt3a、Frz8-Fc、及对照Fc蛋白时的变化。对于微列阵分析，将细胞用所示蛋白质一式三份处理，并使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)来分离总RNA。在Affymetrix人类基因组U133基因芯片集(RubinfeldB等，NatBiotechnol2006;24:205-9)上进行阵列分析。具体的探针和引物集显示于图20。Wnt信号传导的先前鉴定的靶物(诸如轴蛋白2、APCDD1、及Gadl)的表达水平通过Wnt3a处理而上调或通过Frz8-Fc处理而下调(图19A)。此外，一些基因(诸如Lefty2(A)、Leftyl(B)、sFRPl、及Fzd5)由Wnt3a下调，并通过用Frz8-Fc抑制Wnt信号传导而上调(图19A)。随后通过qRT-PCR进行的基因表达分析显示这些转录物在NTera-2、Tera-2、及NCCIT细胞中受到Wnt3a和Fz8CRD-Fc类似地调节。在体内APCDD1、Gadl、及Fzd5在上文所述体外分析中最一致调控的基因之中，因此选择它们作为供体内肺瘤异种移植物研究用的Wnt响应性的潜在标志物。从功效研究结束时收集的异种移植物样本中纯化肺瘤组织RNA,并如先前所述(RubinfeldB等，NatBiotechnol2006;24:205-9)实施Wnt响应性转录物的定量逆转录-PCR(qRT-PCR)分析。使用AACt法来测定每种基因的倍数诱导，且相对于甘油醛-3-磷酸脱氩酶来表示结果。具体的探针和引物集显示于图20。所有反应一式两份进行，并将至少两次测定的平均值土SEM绘图。与在体外看到的效果类似，治疗剂量的Frz8-Fc的处理降低了APCDD1和Gadl基因的表达，并提高了来自NTera-2异种移植物的肿瘤中Fzd5的表达(图19B)。虽然CD4hFc处理后所有基因均有一般性的非特异性下调，但这些变化与用Frz8-Fc处理的胂瘤中看到的那些相比是统计学不显著的。这些观察结果显示Frz8-Fc在体内的抗肿瘤发生效应是针对靶基因的，而且这些基因的表达水平可以用于监测潜在的抗Wnt治疗剂的功效。实施例10:Wnt拮抗剂对具有同种异基因移植物和人异种移植物的小鼠中肿瘤生长的抑制效应本实施例所列出的研究表明Wnt拮抗剂在治疗表达Wnt的肿瘤中是有用的。Wnt-1-MMTV模型的情况中基本上完全的肿瘤消退表明Wnt拮抗剂对强烈Wnt驱动的肺瘤的效应。然而，Wnt拮抗剂对PA-1和NTer2肿瘤的显著效应还反映了治疗可能不完全是Wnt驱动的肿瘤的强治疗潜力。动物使用雌性C57B16小鼠(TheJacksonLaboratory)来进行MMTV-Wntl肿瘤的传代(passaging)。-使用实'睑动物护理和4吏用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的方案来实施小鼠的维持和体内规程。MMTV-Wnt模型-同种异基因移植物图21的线性示意图描绘了用于转染以创建Wnt动物模型的载体构建体。该构建体^f莫仿通过MMTA病毒插入而观察到的组成型Wnt信号传导活化，如Tsujomoto等，Cell55:619-625(1988)及Li等，Oncogene19:1002-1009(2000)所述。MMTV-Wnt1转基因肿瘤在小鼠中的传代将来自MMTV-Wntl转基因小鼠的肿瘤通过在乳房脂肪垫中手术植入而在C57B16小鼠中连续传代达6至10代。在无菌条件下从转基因小鼠中收集肿瘤组织，将其在HBSS中漂洗，并切成小块。用氯胺酮(75-80mg/kg)和曱苯噻。秦(7.5-15mg/kg)的混合物来麻醉受体小鼠，在皮肤下插入肿瘤碎块，朝向第三乳房月旨肪垫(thetumorfragmentinsertedundertheskinrostraltothethirdmammaryfatpad)，并使用缝合夹(woundclips)来闭合皮肤。将肿瘤传代最多达10代，且在前2代后，对肿瘤组织进行组织学检查以证实其是乳房起源的且继续表达Wnt。6-12个月内在小鼠中形成乳腺癌。使用从这些小鼠中分离的肺瘤来创建下文所述移植物;漢型。体内研究对于测试Wnt拮抗剂在MMTV-Wnt模型中功效的体内研究，通过皮下注射从经浸渍的肿瘤组织中获得的细胞来导入肿瘤细胞。在无菌条件下从移植有来自Wnt转基因小鼠(上文所述的)的肿瘤的小鼠中收集肿瘤组织，将其在PBS或HBSS中漂洗，切成小块，并浸渍入HBSS，其使用细胞解离试剂盒(Sigma)进行。将细胞在无菌HBSS中清洗两次，并在HBSS中的50%Matrigel溶液中悬浮。将细胞悬浮液皮下接种入无胸腺棵鼠的乳房脂肪垫中，其中体积不超过150nl/小鼠。对于使用NTera2或PA-1动物模型的体内研究，如所述的那样培养细胞，并在生长处于对数期时收获细胞。将细胞悬浮在HBSS中的50%Matrigel溶液中，并以8乂106个细胞/小鼠(NTera2)或10xl(^个细胞/小鼠(PA-1)的浓度皮下接种入无胸腺棵鼠中。每天对肿瘤进行监测，并在接种后7-12天进行测量。将动物分组，各组具有在150-250mn^范围内的相同肿瘤体积均值。分组后l-2天开始Wnt拮抗剂处理，并每天一次给小鼠腹膜内(IP)或静脉内(IV)给药100-200plWnt拮抗剂、阴性对照蛋白CD4-Fc、或PBS阴性对照。随后的药物处理每周重复2-3次，并持续3-4周。每周两次测量肿瘤体积。在肿瘤体积达到2500mmS时处死动物。研究过程中通过眼窝静脉放血来收集血液，并通过SDS-PAGE接着通过使用HRP或荧光偶联的抗人Fc的免疫印迹和检测来对血清测定治疗剂的水平，并通过治疗剂抑制Wnt3a活化TOPglow活性的能力(如实施例7所述的)来对血清测定治疗剂活性。同种异基因移植物肺瘤Wnt拮抗剂对肿瘤同种异基因移植物生长的抑制效应通过i.p.或i.v.路径进行的Frz8-Fc处理在处理过程中导致快速的肿瘤消退及持续的抑制，而阴性对照蛋白CD4-Fc相对于PBS处理没有效果。处理终止后对经处理的小鼠监测3周，最终观察到肿瘤再生长。图22表明通过腹膜内(IP)剂量给药的Frz8-Fc对无胸腺棵鼠中MMTV-Wnt肿瘤移植物的功效。图22A的曲线图显示了通过每周二次腹膜内注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)的包含MMTV-Wnt-l肺瘤移植物的棵鼠。每组具有ll只小鼠，且在开始处理前各组的平均肿瘤体积是226mm3。将肿瘤体积均值对时间绘图，并在X轴上通过箭头指示了处理日。在第25天，处死对照组，并停止给处理组施用药物。图22B是四个处理组中随时间的肿瘤体积均值和胂瘤体积均值％变化的列表汇总。注意，在图22B中，Frz8-Fc拮抗剂处理后的胂瘤体积均值导致肿瘤体积从226mm^宿小至处理开始后第5天的约219mm3，及第18天的约67mm3。这分别表示肿瘤大小降低4%和70%。在该研究中，接受Frz-Fc拮抗剂施用的胂瘤与对照动物相比显示了肿瘤大小的消退。这表明本发明的Frz-Fc拮抗剂作为单一药剂是杀肿瘤的，并作为抗癌治疗剂是有用的。图23显示了通过静脉内(IV)剂量给药的Frz8-Fc对无胸腺棵鼠中MMTV-Wnt肿瘤移植物的功效。图23A的曲线图显示了通过每周三次静脉内注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)的包含MMTV-Wnt-l肺瘤移植物的棵鼠。每组具有ll只小鼠，且在开始处理前各组97的平均肿瘤体积是226mm3。本研究中第四组(高标尺)包括10只在研究开始时具有375mm^中瘤体积均值的小鼠，它们通过每周三次静脉内注射而用Frz8-Fc(10mg/kg/天)处理。将肿瘤体积均值对时间绘图，并在X轴上通过箭头指示了处理日。在第25天，处死对照组，并停止给处理组施用药物。图23B是四个处理组中随时间的肿瘤体积均值和肿瘤体积均值。/。变化的列表汇总。注意，在所有用Frz-Fc处理的小鼠中，肺瘤负荷从平均226mmS降低至处理开始后第4天的平均体积179mm3，及第18天后的73mm3。这分别表示肺瘤体积降〗氐21°/。和67%。对于高标尺组，肿瘤体积v(人平均376mmS降^f氐至处理第4天的225mm3，及第18天的53mm3。这分别表示肿瘤体积降低39°/。和86%。从经处理的小鼠中获得的血清对Wnt信号传导的抑制效应从经处理的小鼠中分离的血清对Wnt信号传导的抑制报道在图24中，其中图24A显示了从IP处理的小鼠中分离的血清的结果，而IV处理的结果显现在图24B中。数据表示为条形图，其显示了TOPglow测定法(如实施例7所述的)中的Wnt信号传导拮抗剂活性。样品依照处理、小鼠研究数目和稀释度而分组出现。TOPglow基因报道测定法中的相对萤光素酶活性显示在Y轴上。用约40ng/ml纯化的Wnt3a处理除NA(对照)外的所有样品。所有其它蛋白质对照以5吗/ml存在于培养基中。人异种移植物胂瘤Wnt拮抗剂对天然衍生的人肿瘤模型的抑制将充当它们在治疗人癌症中的有效性的进一步指标。对人肿瘤衍生的细胞系测试自分泌Wnt信号传导的证据，其与PA-1畸胎瘤细胞系中看到的类似，作为测试Wnt拮抗剂活性的有效性的指示。与展现出不受Frz8-Fc抑制的低基础信号传导的293细胞相比，畸胎瘤衍生的NTera-2、Tera-2、及NCCIT细胞系展现出可以受到Frz8-Fc抑制的基础WnH言号传导(图25A)。然而，所有四种畸胎瘤细胞系似乎都表达Wnt受体，因为信号传导可以通过Wnt3a处理而受到进一步刺激，这可以被Frz8-Fc阻断(图25B)。这些结果表明畸胎瘤细胞系表达可能促成其致瘤性的Wnt。因此对这些系评估在无胸腺棵鼠中的肿瘤形成，并基于肿瘤形成的一致性，选择NTera-2和PA-1用于体内功效研究。Wnt拮抗剂对NTera2胂瘤异种移植物生长的抑制效应相对于对照小鼠，用Wnt拮抗剂Frz8-Fc处理展现NTera2肿瘤异种移植物的小鼠导致肿瘤体积降低大约50%且肿瘤质降低大约70%。图26显示了Frz8-Fc处理对无胸腺棵鼠中NTera2肿瘤异种移植物生长的抗肿瘤功效。通过每周三次腹膜内注射来给携带NTera2肿瘤异种移植物的无胸腺棵鼠施药，首剂15mg/kg/天的PBS、CD4-Fc和Frz8-Fc,后续剂10mg/kg/天。每组具有20只小鼠，且在处理开始前各组的平均肿瘤体积是200mm3。本研究的第四组包括10只在研究开始时具有336mm^中瘤体积均值的小鼠，它们通过每周三次腹膜内注射而用Frz8-Fc(1Omg/kg/天)处理。图26A是例示性规程流程图，而图26B的曲线图描绘了随时间的肿瘤体积均值，其中处理日通过X轴上的箭头指示。图26C的条形图描绘了研究的第20天处死该组中所有动物时的肿瘤重量均值。图26D和26E分别是肿瘤体积均值和胂瘤体积均值％变化的列表汇总。.从具有NTera2肿瘤异种移植物的小鼠中获得的血清对Wnt信号传导的抑制效应图27的条形图显示了自NTera2肿瘤研究中各个动物分离的血清的Frz8-FcWnt拮抗剂在TOPglow测定法中的Wnt信号传导拮抗剂活性。相对萤光素酶活性(Y轴)通过从对照和Frz8-FcWnt拮抗剂的TOPglow测定法中测量。不向细胞中添加额外的纯化的Wnt或Wnt条件化培养基。这些结果表明Wnt信号传导减弱与这些用Frz8-FcWnt拮抗剂处理的小鼠中肺瘤大小降低有关。Wnt拮抗剂对PA-l胂瘤异种移植物生长的抑制效应用Wnt拮抗剂Frz8-Fc处理展现PA-l肺瘤异种移植物的小鼠导致处理的12天内肿瘤生长的显著降低。在这种模型中，肺瘤在处理期结束时小了大约50%，肺瘤块比对照小鼠中的肺瘤显著要'J、。图28表明Frz8-Fc处理对无胸腺棵鼠中PA-l肺瘤异种移植物生长的抗肿瘤功效。通过每周三次腹膜内注射来给携带PA-1肿瘤异种移植物的无胸腺棵鼠施用(首剂)15mg/kg/天的PBS、CD4-Fc或Frz-Fc，后续剂10mg/kg/天。每组具有13只小鼠，且在处理开始前各组的平均肿瘤体积是168mm3。图28A是例示性规程流程图，而图28B的曲线图描绘了随时间的肿瘤体积均值，其中处理日通过X轴上的箭头指示。图28C是处死时胂瘤重量均值的曲线图。在细胞接种后第58天(处理开始后第32天)处死小鼠，并对肿瘤进行切除和称重。将肿瘤重量均值土SEM作为分组的函数绘图。图28D和28E分别是肿瘤体积均值和肿瘤体积均值％变化的列表汇总。实施例ll:接受MMTV胂瘤移植并用Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗剂处理的小鼠中的Wnt信号传导Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗剂对WnH言号传导的效应Frz5-Fz如Frz8-Fc—样有效地抑制Wnt3a诱导的信号传导。用10mg/kg的Frz8-Fc、Frz5-Fz、或CD4-Fc(作为阴性对照)处理具有MMTV肿瘤(大小约400-800mm3)的无胸腺棵鼠。处理后5小时，通过心脏穿刺从小鼠中收集血清，并如实施例7所述的那样在用Wnt3a活化并用TOPglow转染的293细胞上分析Wnt抑制效应。用约40ng/ml纯化的Wnt3a处理除NA(对照)外的所有样品。所有其它蛋白质对照以5吗/ml存在于培养基中。图29显示了用Frz8-Fc或Frz5-Fz处理的小鼠中的抑制水平。Frz8-Fc或Frz5-Fz的处理导致类似水平的对Wnt3a诱导的信号传导的抑制。Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗剂对轴蛋白2表达的效应Frz8-Fc和Frz5-Fz化合物抑制体内Wnt信号传导，如通过对Wnt靶基因轴蛋白2的调控所测定的。用10mg/kg的Frz8-Fc、Frz5-Fz、或CD4-Fc(作为阴性对照)处理具有MMTV肿瘤(大小约400-800mm3)的无胸腺棵鼠。处理后5小时，通过心脏穿刺从小鼠中收集血清。使用QIAGENRNAEASY试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从肿瘤细胞中提取RNA，并如实施例9所述的那样分析轴蛋白2的表达。自用Frz8-Fc或Frz5-Fz处理的小鼠获得的样品中观察到轴蛋白2水平降低，表明这些化合物能够抑制体内Wnt信号传导。图30显示了Frz8-Fc和Frz5-Fz处理的肿瘤中降低的轴蛋白2表达，其中图30A显示了相对于GAPDH表达标准化的表达，而图30B显示了相对于rpll9表达标准化的表达。实施例12:用Wnt拮抗剂处理的再生组织Wnt信号传导在再生组织(诸如皮肤、肠、和造血细胞)的自我更新中发挥至关重要的作用，并且Dkkl对Wnt信号传导的抑制可以不利地影响这些组织在成年小鼠中的体系结构。以下实施例检查在与用于获得抗肿瘤功效相同的条件下暴露于Frz8-Fc是否对小鼠中的肠和皮肤有任何效应。14次处理(一周三次)后从在MMTV-Wntl肿瘤模型中处理的小鼠(实施例10所述的)中收集组织，并通过免疫组织化学对切片进行(3-联蛋白蛋白质染色。对皮肤和各种肠区室的分析揭示了在所有组的处理小鼠中这些组织的体系结构在形态学上表现为正常，在肠帕内特(Paneth)细胞(图31A)和皮肤毛嚢(图31B)中具有典型的胞质和核(3-联蛋白染色样式。此外，9次处理(一周三次)后从使用NTera-2模型的动物中收集的皮肤和肠的组织学和免疫组织化学分析也揭示了对照组和处理组之间没有差异。这表明可以抑制肿瘤生长的治疗方案的Frz8-Fc处理对皮肤和肠的组织更新没有不利影响。实施例13本实施例描述了Wnt拮抗剂的各种生产方法。Wnt拮抗剂在大肠杆菌中的表达本实施例说明了通过大肠杆菌中的重组表达来制备未糖基化形式的Wnt才吉4元剂。首先使用所选择的PCR引物扩增编码Wnt拮抗剂的DNA序列。引物应当含有与所选择的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点。可以采用多种表达载体。合适载体的例子是包含氨卡青霉素和四环素抗性基因的pBR322(衍生自大肠杆菌，参见Bolivar等，Gene,2:95(1977))。将该载体用限制酶消化，并去磷酸化。然后将PCR扩增的序列连接入载体中。载体优选包括编码抗生素抗性基因的序列、trp启动子、多His前导(其包括前6个STII密码子、多His序列、及肠激酶切割位点)、Wnt拮抗剂编码区、入转录终止子、及argU基因。然后使用Sambrook等，见上文所述方法，使用连接混合物来转化所选择的大肠杆菌菌抹。转化体通过它们在LB平板上生长的能力来鉴定，然后选择抗生素抗性菌落。分离质粒DNA,并通过限制性分析和DNA测序来证实。可以将所选择的克隆在液体培养基(诸如补充有抗生素的LB肉汤)中培养过夜。随后可以将过夜培养物用于接种更大规模的培养。然后将细胞培养至期望的光密度，在此期间开启表达启动子。将细胞再培养数小时后，可以通过离心来收获细胞。可以使用多种本领域已知的试剂来溶解通过离心而获得的细胞沉淀物，然后可以在容许蛋白质紧密结合的条件下使用金属螯合柱来纯化溶解的Wnt拮抗剂蛋白。使用如下规程，可以在大肠杆菌中表达加有多His标签形式的Wnt拮抗剂。首先使用所选择的PCR引物扩增编码Wnt拮抗剂的DNA序列。引物可含101有与所选择的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点，及其它有用的序列，其提供高效且可靠的翻译起始、金属螯合柱上的快速纯化、及用肠激酶进行的蛋白水解消除。然后将PCR扩增的、加有多His标签的序列连接入表达载体中，该载体载体用于转化基于菌抹52(W3110flihA(tonA)longalErpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大肠杆菌宿主。首先将转化体在30。C在摇动情况下在含有50mg/ml羧千青霉素的LB中培养，直至O.D.600达到3-5。然后将培养物在CRAP培养基(其如下制备，即混合500mL水中的3.57g(NH4)2S04、0.71g二水合柠檬酸钠、1.07gKCl、5.36gDifco酵母提取物、5.36gSheffieldhycaseSF，以及110mMMPOSpH7.3、0.55%(w/v)葡萄糖和7mMMgS04)中稀释50-100倍，并在30。C在摇动情况下培养大约20-30小时。取出样品以通过SDS-PAGE分析来检验表达，并将大量的培养物离心以使细胞沉淀。将细胞沉淀物冷冻直至纯化和重折叠。将来自0.5至1L发酵液的大肠杆菌浆(6-10g沉淀物)以10倍体积(w/v)重悬浮于7M胍，20mMTrispH8緩冲液中。添加固体亚石克酸钠和连四石克酸钠以分别获得0.1M和0.02M的终浓度，并在4。C搅动溶液过夜。该步骤导致蛋白质变性，其中所有的半胱氨酸残基通过亚硫酸化(sulfitolization)而被封闭。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。将上清液用3-5倍体积的金属螯合柱緩冲液(6M胍，20mMTrispH7.4)稀释，并过滤通过0.22微米滤器以澄清。将澄清后的提取物加载至在金属螯合柱緩冲液中平衡的5mlQiagenNi-NTA金属螯合柱上。用含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol等级)pH7.4的额外缓冲液(additionalbuffer)清洗该柱。用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。将含有期望蛋白质的级分合并，并贮存在4。C。通过280nm的吸光度来估算蛋白质浓度，使用基于其氨基酸序列的计算消光系数。通过将样品緩慢地稀释至新鲜制备的重折叠緩沖液中而使蛋白质重折叠，所述重折叠緩冲液含20mMTrispH8.6、0.3MNaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和lmMEDTA。选择重折叠体积，使得最终的蛋白质浓度在50至100ug/ml之间。将重折叠溶液在4。C温和搅动12-36小时。通过添力口TFA至0.4。/。的终浓度(pH约3)来淬灭重折叠反应。在进一步纯化蛋白质之前，将溶液过滤通过0.22微米滤器，并添加乙腈至2-10%终浓度。将重折叠的蛋白质在PorosRl/H反相柱上层析，其中使用0.1%TFA的流动緩沖液以及用从10至80%的乙腈梯度洗脱。在SDS-PAGE上分析具有A280吸光度的级分的等分试样，并合并含有同质重折叠蛋白质的级分。一般而言，大多数蛋白质的正确重折叠种类在最低的乙腈浓度洗脱，因为这些种类是最紧密的，从而保护它们的疏水内部免于与反相树脂相互作用。聚集种类通常在较高的乙腈浓度洗脱。除了将错误折叠形式的蛋白质与期望形式分开之外，反相步骤还从样品中清除内毒素。将含有期望的折叠的Wnt拮抗剂多肽的级分合并，并使用朝向溶液的温和氮气流来除去乙腈。将蛋白质通过透析或通过使用在配制緩冲液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)树脂的凝胶过滤而配制至含有0.14M氯化钠和4%甘露醇的20mMHepespH6.8中，并无菌过滤。Wnt拮抗剂在哺乳动物细胞中的表达本实施例说明了通过哺乳动物细胞中的重组表达来制备潜在糖基化形式的Wnt拮抗剂。采用载体pRK5(参见EP307,247，1989年3月15日公布)作为表达载体。任选地，使用诸如Sambrook等，见上文所述的连接方法，用容许插入Wnt拮抗剂DNA的所选择的限制酶将Wnt拮抗剂DNA连接入pRK5中。为了本实施例的目的，所得的载体称为pRK5-WA。在一个实施方案中，所选择的宿主细胞可以是293细胞。在组织培养平板中于培养基(诸如补充有胎牛血清，任选地，营养成分和/或抗生素的DMEM)中将人293细胞(ATCCCCL1573)培养至汇合。将约10吗pRK5-WADNA与约liig编码VARNA基因的DNA[Thimmappaya等，Cell,31:543(1982)]混合，并溶解于500fi1lmMTris-HCl、O.lmMEDTA、0.227MCaCl2t。将500ji150mMHEPES(pH7.35)、280mMNaCl、1.5mMNaP04逐滴添加至该混合物，并容许沉淀物在25。C形成10分钟。将沉淀物悬浮，并添加至293细胞，并容许在37。C沉降约4小时。吸去培养基，并添力口2mlPBS中的20。/。甘油达30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，添加新鲜培养基，并将细胞温育约5天。转染后约24小时，除去培养基，并用培养基(单独的)或含有200)iCi/ml"S-半胱氨酸和200iiCi/ml"S-曱硫氨酸的培养基更换。温育12小时后，收集条件化培养基，在旋转滤器上浓缩，并加载至15。/。SDS凝胶上。可以将处理后的凝胶干燥，并暴露于胶片达所选择的一段时间以揭示Wnt拮抗剂多肽的存在。含经转染细胞的培养物可以进行进一步的温育(在无血清培养基中)，并在所选4奪的生物测定法中测试该培养基。在备选的技术中，可以将Wnt拮抗剂瞬时导入293细胞中，其使用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)所述的硫酸右旋糖香法进行。将293细胞在旋转烧瓶中培养至最大限度密度，并添加700pgpRK5-WADNA。首先通过离心从旋转烧瓶中浓缩细胞，并用PBS清洗。将DNA-右旋糖苷沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。将细胞用20%甘油处理90秒，用组织培养基清洗，并再次导入装有组织培养基、5吗/ml牛胰岛素和0.1fig/ml牛运铁蛋白的旋转烧瓶中。约4天后，将条件化培养基离心，并过滤以除去细胞和碎片。然后可以将含有所表达的Wnt拮抗剂的样品浓缩，并通过任何所选择的方法(诸如透析和/或柱层析)来纯化。在另一个实施方案中，可以在CHO细胞中表达Wnt拮抗剂。可以使用已知的试剂(诸如CaP04或DEAE-右旋糖苷)来将pRK5-WA转染入CHO细胞中。如上所述，可以温育细胞培养物，并将培养基用培养基(单独的)或含有放射性标记物(诸如"S-曱硫氨酸)的培养基更换。在确定存在Wnt拮抗剂多肽后，可以用无血清培养基更换培养基。优选地，将培养物温育约6天，然后收获条件化培养基。然后可以将含有所表达的Wnt拮抗剂的培养基浓缩，并通过任何所选择的方法来纯化。还可以在宿主CHO细胞中表达加有表位标签的Wnt拮抗剂。可以将Wnt拮抗剂从pRK5载体中亚克隆出来。亚克隆插入物可以进行PCR,用以以符合读码框的方式与所选择的表位标签(诸如多His标签)融合入杆状病毒表达载体中。然后可以将加有多His标签的Wnt拮抗剂插入物亚克隆入SV40驱动的载体中，该载体含有供选择稳定克隆用的选择标志，诸如DHFR。最后，可以用SV40驱动的载体转染CHO细胞(如上文所述)。可以如上文所述的那样实施标记以检验表达。然后可以将含有所表达的加有多His标签的Wnt拮抗剂的培养基浓缩，并通过任何所选择的方法(诸如通过N产-螯合亲和层析)来纯化。还可以将Wnt拮抗剂通过瞬时表达规程而在CHO和/或COS细胞中表达，或通过另一种稳定表达规程而在CHO细胞中表达。使用如下规程来实施CHO细胞中的稳定表达。将蛋白质表达为IgG构建体(免疫粘附素)，其中将相应蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列融合至含有铰链、CH2和CH2结构域的IgGl恒定区序列和/或是加有多His标签的形式。PCR扩增后，在CHO表达载体中亚克隆相应DNA,其使用如Ausubel等,CurrentProtocolsofMolecularBiology,单元3.16,JohnWileyandSons(1997)所述的标准技术。构建在感兴趣DNA的5，和3，具有相容限制性位点的CHO表达载体，用以容许cDNA的便利改组。用于CHO细胞中表达的载体如Lucas等，Nucl.AcidsRes.24:9(1774-1779(19%)所述的，并使用SV40早期启动子/增强子以驱动感兴趣cDNA和二氬叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达容许转染后选择质粒的稳定维持。使用商品化转染试剂SUPERFECTt⑧(Quiagen)、DOSPER⑧或FUGENE⑧(BoehringerMannheim),将12ug期望质粒DNA导入大约10x106个010细胞中。如Lucas等，见上文所述的那样培养细胞。将大约3x107个细胞冷冻在安瓿中，用于如下文所述那样的进一步培养和生产。将装有质粒DNA的安吾瓦通过放置入水浴而融化，并通过涡旋而混合。将内含物吸入装有10ml培养基的离心管中，并在1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬浮于10ml选择性培养基(含有5%0.2jam渗滤胎牛血清的PS20，经0.2pm过滤)。然后将细胞等分至装有90mL选择性培养基的100mL旋转器中。l-2天后，将细胞转移入装有150mL选择性生长培养基的250mL旋转器中，并在37。C温育。再过2-3天后，以3x1()S个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL旋转器。通过离心和在生产培养基中重悬浮来用新鲜培养基更换细胞培养基。虽然可以采用任何合适的CHO培养基，但是实际上可以使用1992年6月16日公告的美国专利No.5,122,469所述生产培养基。以1.2x106个细胞/mL接种3L生产旋转器。第0天，测定细胞数目和pH。第1天，对旋转器取样，并开始喷入经过过滤的空气。第2天，对旋转器取样，将温度变动至33。C，并添加30mL500g/L葡萄糖和0.6mL10。/。消泡剂(例如35%聚二曱基硅氧烷乳齐'J,DowCorning365医学级乳剂)。贯穿整个生产过程，根据需要调节pH以将其保持在约7.2。IO天后，或直至生存力下降低于70%时，通过离心并过滤通过0.2iim滤器来收获细胞培养物。将滤液贮存在4。C，或立即加载至纯化柱上。对于加有多His标签的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)来纯化蛋白质。纯化之前，将咪唑添加至条件化培养基至5mM的浓度。将条件化培养基以4-5ml/min的流速泵至6mlNi-NTA柱上，该柱已经在含有0.3MNaCl和5mM咪唑的20mMHepespH7.4緩冲液中平衡。加载后，用另外的平衡緩沖液清洗105该柱，并用含有0.25M咪唑的平衡緩冲液洗脱蛋白质。随后将高度纯化的蛋白质用25mlG25Superfine(Pharmacia)柱来脱盐至含有10mMHepes、0.14MNaCl和4。/。甘露醇pH6.8的贮存緩冲液中，并贮存在-80。C。如下从条件化培养基中纯化免疫粘附素(含Fc的)构建体。将条件化培养基泵至5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，该蛋白A柱已经在20mM磷酸钠緩冲液pH6.8中平衡。加载后，用平衡緩冲液彻底清洗该柱，之后，用100mM柠檬酸pH3.5洗脱。通过将lml级分收集入装有275^L1MTris緩沖液pH9的试管中而使洗脱的蛋白质立即中和。随后如上文关于加有多His标签的蛋白质所述那样使高度纯化的蛋白质脱盐至贮存緩冲液中。通过SDS-PAGE并通过Edman降解进行的N末端氨基酸测序来评估同质性。Wnt拮抗剂在酵母中的表达以下方法描述了Wnt拮抗剂在酵母中的重组表达。首先，构建酵母表达载体，用于来自ADH2/GAPDH启动子的Wnt拮抗剂胞内生成或分泌。将编码Wnt拮抗剂的DNA和启动子插入选择质粒中的合适限制酶位点以指导Wnt拮抗剂的细胞内表达。为了分泌，可以将编码Wnt拮抗剂的DNA连同编码ADH2/GAPDH启动子、天然Wnt拮抗剂信号肽或其它哺乳动物信号肽、或例如酵母a-因子或转化酶分泌信号/前导序列、和接头序列(在需要时)的DNA—起克隆入所选择的质粒，用于表达Wnt拮抗剂。然后可以将酵母细胞(诸如酵母菌抹ABllO)用上文所述表达质粒转化，并在所选择的发酵培养基中培养。可以如下对经转化的酵母上清液进行分析，即用10%三氯乙酸沉淀，并通过SDS-PAGE分离，接着用考马斯蓝染料将凝胶染色。随后可以如下分离并纯化重组Wnt拮抗剂，即通过离心从发酵培养基中除去酵母细胞，然后使用所选择的筒式过滤器(cartridgefilter)来浓缩培养基。可以使用所选择的柱层析树脂来进一步纯化含有Wnt拮抗剂的浓缩液。Wnt拮抗剂在经杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达以下方法描述了Wnt拮抗剂在经杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。将编码Wnt拮抗剂的序列融合在杆状病毒表达载体内所包含的表位标签的上游。此类表位标签包括多His标签和免疫球蛋白标签(像IgG的Fc区)。可以采用多种质粒，包括自商品化质粒诸如pVL1393(Novagen)衍生的质粒。简言之，使用与5，和3，区互补的引物通过PCR来扩增编码Wnt拮抗剂的序列或Wnt拮抗剂编码序列的期望部分，诸如编码跨膜蛋白的胞外结构域的序列或编码成熟蛋白的序列(若该蛋白质是细胞外的)。5，引物可以掺入位于侧翼的(所选择的)限制酶位点。然后将产物用那些所选择的限制酶消化，并亚克隆入表达载体。使用Lipotectin(购自GIBCO-BRL)通过将上述质粒和BACULOGOLDTM病毒DNA(Pharmingen)共转染入草地夜蛾(5)wfifo/^rayh^^erafo,"Sf9")细胞(ATCCCRL1711)而产生重组杆状病毒。在28。C温育4-5天后，收获所释放的病毒，并用于进一步扩增。如O'Reilley等，Baculovirusexpressionvectors:ALaboratoryManual,Oxford:OxfordUniversityPress(1994)所述实施病毒感染和蛋白质表达。然后可以通过例如N产-螯合亲和层析如下纯化所表达的加有多His标签的Wnt拮抗剂。如Rupert等，Nature,362:175-179(1993)所述的那样从经重组病毒感染的Sf9细胞中制备提取物。简言之，将Sf9细胞清洗，在超声处理緩冲液(25mLHepespH7.9、12.5mMMgCl2、O.lmMEDTA、10%甘油、0.1%NP-40、0.4MKC1)中悬浮，并在水上超声处理2次达20秒。通过离心来澄清超声处理物，并将上清液在加样緩冲液(50mM磷酸盐、300mMNaCl、10%甘油，pH7.8)中稀释50倍，并通过0.45pm滤器过滤。制备具有5mL柱床体积的Ni2+-NTA琼脂糖柱(购自Qiagen)，用25mL水清洗，并用25mL加样緩冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以每分钟0.5mL加载至该柱上。用加样緩冲液将该柱清洗至基线A28。，在该点开始收集级分。接着，用第二清洗緩冲液(50mM磷酸盐、300mMNaCl、10%甘油，pH6.0)清洗该柱，其洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A28o基线后，用第二清洗緩冲液中0至500mM咪唑梯度对该柱进行展开。收集lmL级分，并通过SDS-PAGE和银染色或使用偶联有碱性磷酸酶的N产-NTA(Qiagen)进行的Western印迹来分析。收集含有所洗脱的加有His,o标签的Wnt拮抗剂的级分，并针对加样緩沖液透析。或者，可以使用已知的层析技术(包括例如蛋白A或蛋白G柱层析)来实施加有IgG标签的(或加有Fc标签的)Wnt拮抗剂的纯化。使用亲和层析来纯化Wnt拮抗剂多肽天然或重组Wnt拮抗剂多肽可以通过蛋白质纯化领域中的多种标准技术来纯化。例如使用对感兴趣Wnt拮抗剂多肽特异性的抗体通过免疫亲和层析来纯化Wnt拮抗剂多肽原、成熟Wnt拮抗剂多肽、或Wnt拮抗剂前(pre-)多肽。一般而言，通过将Wnt拮抗剂多肽共价偶联至活化的层析树脂而构建免疫亲和柱。或者，可以使用固定化的蛋白A树脂(诸如ProSepA(Millipore))从培养基中直接纯化含有Fc结构域的Wnt拮抗剂。或是通过硫酸铵沉淀或是通过固定化蛋白A(PharmaciaLKBBiotechnology,Piscataway,N丄)上的纯化来从免疫血清中制备多克隆免疫球蛋白。类似地，通过硫酸铵沉淀或固定化蛋白A上的层析来从小鼠腹水中制备单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着至层析树脂，诸如CnBr活化的SEPHAROSEtm(PharmaciaLKBBiotechnology)。依照制造商的说明书，将抗体偶联至树脂，封闭树脂，并清洗衍生树脂。可以通过从含有可溶形式的Wnt拮抗剂的细胞中制备级分而在Wnt拮抗剂多肽的纯化中利用这种免疫亲和柱。通过添加去污剂或通过本领域公知的其它方法来溶解全细胞或经由差速离心获得的亚细胞级分而衍生这种制备物。或者，可以将含有信号序列的可溶性Wnt拮抗剂多肽以有用数量分泌至培养细胞的培养基中。使含有可溶性Wnt拮抗剂多肽的制备物流过免疫亲和柱，并在容许Wnt拮抗剂多肽优先吸附的条件(例如存在去污剂时的高离子强度緩冲液)下清洗该柱。然后，在破坏抗体/Wnt拮抗剂结合的条件(例如低pH緩沖液，诸如大约pH2-3，或高浓度离液剂诸如尿素或硫氰酸根离子)下洗脱柱，并收集Wnt拮抗剂多肽。参考书目1.HeTC,SparksAB,RagoC,etal.Identificationofc-MYCasatargetoftheAPCpathway.Science1998;281:1509-1512.2.TetsuO,McCormickF.Beta-cateninregulatesexpressionofcyclinDlincoloncarcinomacells.Nature1999;398:422-426。3.HeTC,ChanTA,VogelsteinB，KinzlerKW.PPARdeltaisanAPC-regulatedtargetofnonsteroidalanti-inflammatorydrugs.Cell1999;99:335-345.4.KohTJ，BulittaCJ，FlemingJV，DockrayGJ,VarroA，WangTC.Gastrinisatargetofthebeta-catenin/TCF-4growth-signalingpathwayinamodelofintestinalpolyposis.JClinInvest2000;106:533-539.5.SansomOJ,ReedKR，HayesAJ,etal.LossofApeinvivoimmediatelyperturbsWntsignaling,differentiation,andmigration.GenesDev2004;18:1385-1390.6.ChenTA，YangI,I勿R，etal.Regulationofcaspaseexpressionandapoptosisbyadenomatouspolyposiscoli.CancerRes2003;63:4368-4374.7.PaoniNP,FeldmanMW,GutierrezLS,PloplisVA,CastellinoFJ.TranscriptionalprofilingofthetransitionfromnormalintestinalepitheliatoadenomasandcarcinomasintheAPC(Min/+)mouse.PhysiolGenomics2003;15:228-235.8.ZhangT，OtevrelT，GaoZQ,etal.EvidencethatAPCregulatessurvivinexpression:apossiblemechanismcontributingtothestemcelloriginofcoloncancer.CancerRes2001;61:8664-8667.9.HoweLR,SubbaramaiahK,ChungWJ,DannenbergAJ，BrownAMC.Transcriptionalactivationofcyclooxygenase-2inWnt-1-transformedmousemammaryepithelialcells.CancerRes1999;59:1572-1577.10.MannB，GelosM，SiedowA，etal.Targetgenesofbeta-catenin-Tcell-factorlymphoid-enhancer-factorsignalinginhumancolorectalcarcinomas.ProcNatlAcadSciUSA1999;96:1603-1608.11.MiwaN,FumseM,TsukitaS,NiikawaN,NakamuraY,FumkawaY.Involvementofclaudin-1inthebeta-catenin/Tcfsignalingpathwayanditsfrequentupregulationinhumancolorectalcancers.OncolRes2001;12:469-476.10912.WielengaVJM，SmitsR,KorinekV,etal.ExpressionofCD44inApeandTcfmutantmiceimpliesregulationbytheWNTpathway.AmJPathol1999;154:515-523.13.BoonEMJ，vanderNeutR,vandeWeteringM,CleversH,PalsST.WntsignalingregulatesexpressionofthereceptortyrosinekinaseMetincolorectalcancer.CancerRes2002;62:5126-5128.14.KimJS,CrooksH,DrachevaT,etal.Oncogenicbeta-cateninisrequiredforbonemorphogeneticprotein4expressioninhumancancercells.CancerRes2002;62:2744-2748.15.LeowCC,RomeroMS,RossS，PolakisP,GaoWQ.Hathl,down-regulatedincolonadenocarcinomas,inhibitsproliferationandtumorigenesisofcoloncancercells.CancerRes2004;64:6050-6057.16.BatlleE,HendersonJT,BeghtelH,etal.Beta-cateninandTCFmediatecellpositioningintheintestinalepitheliumbycontrollingtheexpressionofEphB/EphrinB.Cell2002;111:251-263.17.BlacheP,vandeWeteringM,DulucI，etal.SOX9isanintestinecrypttranscriptionfactor,isregulatedbytheWntpathway,andrepressestheCDX2andMUC2genes.JCellBiol2004;166:37-47.18.ZhangXB,GaspardJP,ChungDC.RegulationofvascularendothelialgrowthfactorbytheWntandK-raspathwaysincolonicneoplasia.CancerRes2001;61:6050-6054.19.DeAlmeida,VL.,MiaoL,ErnstJA,KoeppenH.，PolakisP.,Rubinfeld,B,ThesolubleWntreceptorFrizzled8CRD-hFcinhibitsthegrowthofteratocarcinomasinvivo,CancerRes2007;67:5371-5379.权利要求1.一种Wnt拮抗剂，其包含(a)卷曲结构域构件，和(b)Fc结构域，其中所述卷曲结构域构件包含自选自下组的蛋白质衍生的多肽(i)卷曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型卷曲相关蛋白(sFRP)蛋白，和(iii)Ror蛋白，而且进一步地其中所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少1小时。2.权利要求1的Wnt拮抗剂，其中所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。3.—种Wnt拮抗剂，其包含(a)巻曲结构域构件，和(b)Fc结构域，其中所述巻曲结构域构件包含自选自下组的蛋白质衍生的多肽(i)巻曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型巻曲相关蛋白(sFRP)蛋白，和(iii)Ror蛋白，而且进一步地其中所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。4.权利要求3的Wnt拮抗剂，其中所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。5.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含来自选自下组的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzl0(SEQIDNO:27)。6.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含来自选自下组的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。7.权利要求1-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含来自选自下组的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)结构域及其活性变体hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。8.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Frz多肽及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59)。9.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含选自下组的成熟sFRP多肽及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64)。10.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含选自下组的成熟Ror多肽及其活性变体hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。11.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含选自下组的Frz多肽原及其活性变体hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44)。12.权利要求l-4中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述巻曲结构域构件包含选自下组的sFRP多肽原及其活性变体sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。13.权利要求l-12中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述Fc构件衍生自选自下组的免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3及IgG4。14.权利要求13的Wnt拮抗剂，其中所述Fc衍生自IgGl免疫球蛋白。15.权利要求14的Wnt拮抗剂，其中所述Fc包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。16.权利要求-15中任一项的Wnt拮抗剂，其进一步包含连接所述巻曲结构域构件与所述Fc结构域的接头。17.权利要求16的Wnt拮抗剂，其中所述4妄头包含选自下组的肽ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。18.—种Wnt拮抗剂，其包含选自下组的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3画Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl画Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。19.一种组合物，其包含至少一种药学可接受载体或赋形剂和权利要求1-18的任何Wnt拮抗剂。20.—种编码权利要求l-18的任何Wnt拮抗剂的核酸序列。21.权利要求20的核酸，其进一步包含含有与所述核酸可操作连接的控制序列的载体。22.权利要求21的载体，其进一步包含宿主细胞。23.权利要求22的宿主细胞，其选自哺乳动物、昆虫、大肠杆菌和酵母细胞。24.—种制品，其包含权利要求19的组合物和容器；其中所述Wnt拮抗剂装在所述容器内，且所述容器进一步包含(a)附于所述容器的标签，或(b)所述容器里的包装插页，其提及所述Wnt拮抗剂的用途，指出所述组合物用于Wnt介导的病症的治疗性处理或诊断性检测的用途。25.—种抑制细胞中Wnt信号传导的方法，其包括使所述细胞与有效量的权利要求1-18的任何Wnt拮抗剂接触。26.权利要求25的方法，其中所述细胞包含在哺乳动物内，且施用的量是治疗有效量。27.权利要求25的方法，其中所述Wnt信号传导源自Wnt信号传导成分经由体细胞突变的激活。28.权利要求25的方法，其中所述对Wnt信号传导的抑制导致对所述细胞生长的抑制。29.权利要求28的方法，其中所述细胞是癌细胞。30.—种在患有Wnt介导的病症的哺乳动物中治疗所述病症的方法，其包4舌给所述哺乳动物施用治疗有效量的依照权利要求l-18中任一项的Wnt拮抗剂。31.权利要求30的方法，其中所述病症是与异常Wnt信号传导活性有关的细胞增殖性病症。32.权利要求31的方法，其中所述异常Wnt信号传导活性源自Wnt蛋白表达的升高。33.权利要求31的方法，其中所述细胞增殖性病症是癌症。34.权利要求33的方法，其中所述癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、神经胶质瘤、及髓母细胞瘤。35.—种用于检测Wnt蛋白存在的方法，其包括使样品与依照权利要求1-18中任一项的Wnt拮抗剂接触，其中(a)复合物的存在或(b)Fz/Fc拮抗剂和Wnt蛋白之间的结合水平指示Wnt蛋白和/或信号传导的存在。36.权利要求35的方法，其中该方法进一步包括确定Wnt信号传导水平是否异常，该方法进一步包括将所述样品中的结合水平与已知具有生理学正常Wnt信号传导的第二样品中的水平进行比较，其中所述样品中的结合水平高于或低于所述第二样品中的结合水平指示异常的Wnt信号传导。37.权利要求36的方法，其中所述异常Wnt信号传导进一步指示Wnt介导的病症的存在。38.权利要求37的方法，其中所述Wnt介导的病症是癌症。39.—种在特征在于激活的或过量的Wnt信号传导的细胞中调控Wnt靶基因表达的方法，其包括使所述细胞与有效量的权利要求1-18中任一项的Wnt拮抗剂接触。40.—种治疗性处理Wnt介导的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求l-18中任一项的Wnt拮抗剂，其中所述拮抗剂的施用阻滞所述癌症任何随后的大小增加或严重程度进展。41.权利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗剂的施用导致所述癌症大小或严重程度降低。42.权利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗剂的施用降低所述癌症的肿瘤负荷。43.权利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗剂的施用杀死所述癌症。44.Wnt拮抗剂在制备用于治疗细胞增殖性病症的药物中的用途，所述Wnt拮抗剂包含(a)巻曲结构域构件，和(b)Fc结构域，其中所述巻曲结构域构件包含自选自下组的蛋白质衍生的多肽(i)巻曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型巻曲相关蛋白(sFRP)蛋白，及(iii)Ror蛋白，而且进一步地其中所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少1小时。45.权利要求44的用途，其中所述Wnt拮抗剂的活性在体内持续至少5小时。46.Wnt拮抗剂在制备用于治疗细胞增殖性病症的药物中的用途，所述Wnt拮抗剂包含(a)巻曲结构域构件，和(b)Fc结构域，其中所述巻曲结构域构件包含自选自下组的蛋白质衍生的多肽(i)巻曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型巻曲相关蛋白(sFRP)蛋白，及(iii)Ror蛋白，而且进一步地其中所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少l天。47.权利要求46的用途，其中所述Wnt拮抗剂的体内半衰期为至少2天。48.权利要求44-47中任一项的用途，进一步包含连接所述巻曲结构域构件与所述Fc结构域的接头。49.权利要求48的用途，其中所述接头是选^^下组的肽ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。50.权利要求44-49中任一项的用途，其中所述细胞增殖性病症是癌症。51.权利要求50的用途，其中所述癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、神经胶质瘤、及髓母细胞瘤。全文摘要本发明提供了包含自卷曲蛋白、分泌型卷曲相关蛋白或Ror蛋白衍生的Frz结构域构件和Fc免疫球蛋白构件的嵌合Wnt拮抗剂，及其在细胞Wnt信号传导和Wnt介导的病症(包括癌症)的治疗和诊断性检测中的用途。文档编号C07K14/435GK101600449SQ200780040506公开日2009年12月9日申请日期2007年9月7日优先权日2006年9月8日发明者保罗·波拉基斯,维尼塔·I·德阿尔梅达,詹姆斯·A·厄恩斯特,邦尼·鲁宾费尔德申请人:健泰科生物技术公司