专利名称：：Foxp3肽疫苗的制作方法
技术领域：
：相关申请的交叉引用本申请要求享受分别于2007年1月3日和2007年3月22日递交的美国临时专利申请No.60/878,615和美国临时专利申请No.60/896,472的权益，并通过才是述并入它们的全部内容。本发明涉及生物学领域，更具体地，涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及Foxp3肽，它们可以极其有效地用作癌症疫苗，并涉及用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术：
：已经证明，CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTLs)可以识别来源于MHCI类分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAAs)的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。自从MAGE家族作为第一个TAA实例被发现以来，利用免疫学方法已经发现了许多其他的TAAs(BoonT,IntJCancer54:177-80,1993;BoonTetal.,JExpMed183:725-9,1996;vanderBruggenPetal"Science254:1643-7，1991;BrichardVetal.，JExpMed178:489-95，1993;KawakamiYetal"JExpMed180:347-52,1994)，并且其中一些作为免疫治疗的靶标现已处于临床开发阶IS:。可以诱导强烈并且特异的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定，为进一步开发各类癌症中的肽疫苗接种的临床应用策略提供了保证(HarrisCC,JNatlCancerInst88:1442-5,1996;ButterfieldLHetal,,CancerRes59:3134-42，1999;VissersJLMetal"CancerRes59:5554-9,1999;VanderBurgSHetal"JImmunol156:3308-14,1996;TanakaFetal.，CancerRes57:4465-8,1997;FujieTetal"IntJCancer80:169-72，1999;KikuchiMetal"IntJCancer81:459-66,1999;OisoMetal.，IntJCancer81:387-94,1999)。已经进行了各种类型的抗原特异性免疫治疗，然而，迄今为止，就肿瘤的显著退缩这一点而言，所获得的临床功效甚低(RosenbergSAetal.,NatMed10:909-15，2004)。一个主要的原因是，来自晚期癌症患者的胂瘤浸润4JImmunol136:1899-907,1986)。这种由肿瘤诱导的免疫抑制是对肿瘤抗原应答不良(YoungRCetal.,AmJMed52:63-8,1972),T细胞增殖不足(AlexanderJPetal.，CancerRes53:1380-7，1993)，细胞因子产生减少(HoriguchiSetal.，CancerRes59:2950-6,1999)，和T细月包和天然杀伤细月包的信号传导缺陷(KonoKetal.，ClinCancerRes11:1825-8,1996，KiesslingRetal.,CancerImmunolI腿腳ther48:353-62,1999)的原因。为了提高免疫治疗的临床功效，重要的是克服肿瘤所诱导的免疫抑制因子的影响。免疫耐受以及针对自身免疫的保护作用是由多种中.枢和外周性的机制造成的，包括胸腺中自反应T细胞的克隆删除，和在外周遇到自身抗原时无反应性的诱导。最近人们已经阐明，以共表达CD4和CD25标志为特征的调节T细胞(T-regs)是一类功能上独特的T细胞群体，它们发挥维持免疫内平4軒(immunehomeostasis)的作用(SakaguchiSetal.，JImmunol.155:1151-64,1995，DieckmannDetal.,JExpMed193:1303-10,2001)。T-reg细胞是抑制各类免疫应答的主要参与者之一(MiescherSetal.，JImmunol136:1899-907,1986;YoungRCetal.,AmJMed52:63-72,1972;AlexanderJPetal"CancerRes53:1380-7,1997;HoriguchiSetal"CancerRes59:2950-6,1999;KonoKetal.,ClinCancerRes11:1825-8，1996;KiesslingRetal.，CancerImmunolImmunother48:353-62，1999)。尽管对于T-reg的产生和功能至关重要的分子相互作用和信号途径尚不完全清楚，但是T-reg需要由Foxp3基因(GenBank登录号No.NM—014009;SEQIDNOl)编码的叉头状转录因子(forkheadtranscriptionfactor)scurfin(Foxp3;SEQIDN02)，该因子控制它们的发育和调节性质(FontenotJDetal.，NatImmunol4:330-6,2003,HoriSetal"Science299:1057-61,2003,KhattriRetal.，NatImmunol4:304-6，2003)。进一步，用经Foxp3mRNA转染的树突细胞对小鼠进行疫苗接种可引发Foxp3特异的CTL应答(SmitaNetal.，CancerRes.Janl;67(l):371-80，2007)。因此，Foxp3可作为癌症免疫治疗的靶标，而且，Foxp3编码的蛋白的部分肽可以作为被CTL识别的抗原。发明概要为了提高免疫治疗的临床功效，重要的是克服被肿瘤诱导的免疫抑制因子。已经发现T-reg细胞是抑制各种类型免疫应答的主要参与者之一。因此，开发出靶向Foxp3表达性T-reg的疫苗，以克服T-reg诱导的免疫抑制，是非常重要的。本发明是基于，至少部分地基于，从Foxp3的基因产物中鉴定了可引发特异针对相应Foxp3肽或表位的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)表位肽。用来自Foxp3的结合HLA-A*24和HLA-A*02的候选肽刺激健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。已经证明，这些肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽，可以诱导强烈而特异的针对表达Foxp3的T-reg的免疫应答。因此，本发明提供了用于调节免疫抑制的方法，这些方法包括施用本发明Foxp3多肽的步骤。施用Foxp3多肽可诱导例如细胞毒T淋巴细胞的抗免疫抑制作用(也就是逆转或对抗免疫抑制)。因此，本发明提供了用于诱导抗免疫抑制的方法，这些方法包括施用Foxp3多肽的步骤，并提供了包含Foxp3多肽的用于调节免疫抑制的药剂。在一个方面中，本发明提供了肽，所述肽包含选自下组的氨基酸序列或由其组成SEQIDNO:3-5，7-9,12,15-19，22,24,27-30,37,67或74。在另一个方面中，本发明提供了具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列或由其组成(a)SEQIDNO:3-5,7-9,12,17，67或74;和(b)SEQIDNO:3-5,7-9，12,17,67或74，其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。在进一步的方面中，本发明提供了具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQIDNO:15-19，22,24,27-30，或37,，(b)SEQIDNO:15-19，22，24，27-30,或37,其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。关于实施方案，在一些实施方案中，自N端起的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。在一些实施方案中，自N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或曱硫氨酸。在一些实施方案中，C端氨基酸是95，97或98的氨基酸序列。本发明进一步提供了组合物，其包含本发明的Foxp3肽或编码本发明Foxp3肽的多核苷酸，和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，该组合物纟皮配制成作为疫苗施用。组合物可以包括一种本发明的肽，或多种不同的本发明的Foxp3肽。这些组合物可用于抑制T-reg细胞，例如抑制T-reg细力包的增殖或阻遏其功6匕在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种这样的Foxp3肽，它们可在HLA抗原是HLA-A24的受试者中引发抑制T-reg细胞的免疫应答。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种这样的Foxp3肽，它们可在HLA抗原是HLA-A02的受试者中引发抑制T-reg细胞的免疫应答。在另一个方面中，本发明提供了这样的组合物，它们包含编码本发明的Foxp3肽的多核苷酸。在一些实施方案中，该组合物包括编码多个本发明Foxp3肽的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。在一些实施方案中，该组合物包含编码多个本发明Foxp3肽的多核苷酸。在一些实施方案中，该组合物包含其它具有诱导针对癌性细胞的细胞毒T细胞的能力的肽，或者编码所述其它肽的其它多核苦酸。在进一步的方面中，本发明提供一种外来体(exosome),其表面上呈递包含HLA抗原和本发明Foxp3肽的复合物。在一些实施方案中，所述HLA抗原选自下组HLA-A24,HLA-A2402，HLA-A02和HLA-A0201。在一个相关的方面中，本发明提供用于治疗癌症(例如减少肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞死亡)的方法，所述方法是通过向个体施用Foxp3肽或编码Foxp3肽的多核苷酸。在另一个方面中，本发明提供诱导具有高的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，所述方法是通过施用本发明的Foxp3肽或编码Foxp3肽的多核苦酸。在另一个方面中，本发明提供诱导细胞毒T细胞的方法，所述方法是通过施用本发明的Foxp3肽或编码Foxp3肽的多核苷酸。在一个相关方面中，本发明提供了一种分离的细胞毒T细胞，其是被本发明Foxp3肽-漆导的。在另一个方面中，本发明提供了一种抗原呈递细胞，其包含HLA抗原与本发明的Foxp3肽之间形成的复合物。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是分离的。在进一步的方面中，本发明提供了调节受试者中T-reg细胞的方法，包括向受试者施用疫苗，该疫苗包含本发明的Foxp3肽或该肽的免疫活性片段，或者编码该肽的多核芬酸。在本发明方法的实施中，受试者或患者可以是人。应当理解，无论是前述的发明概要还是下文的详细说明都是例示性的实施方案，对本发明或本发明的其他变化实施方案不构成限制。附图简述图1显示的照片显示了对用来源于Foxp3的肽诱导后的CTL进行的IFN-gammaELISPOT测定的结果。在图1A中，如下编号的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-363(SEQIDNO3)刺激的2号和7号孑L，用Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7)刺激的1号孔和6号孔，用Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9)刺激的5号孔，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDN074)刺激的7号孔，与对照相比，显示出强烈的IFN-gamma产生。在图1B中，如下编号的孔中的CTL:用Foxp3-A24-9-207(SEQIDNO4)刺激的4号孔，用Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5)刺激的6号孔，用Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8)刺激的6号孔，和用Foxp3画A24國l0-114(SEQIDNO12)刺激的1号孔，与对照相比，显示出强烈的IFN-gamma产生。图2显示的照片显示了对用来源于Foxp3的肽诱导后的CTL进行的IFN-gammaELISPOT测定的结果。在图2A中，如下编号的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)刺激的2号孔，用Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16)刺激的2号孔，用Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)刺激的6号孔，用Foxp3-A2-10-359(SEQIDNO22)刺激的4号孔，用Foxp3-A2-263(SEQIDNO24)剌激的7号孑L，和用Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)刺激的2号孔和5号孔，与对照相比，显示出强烈的IFN-gamma产生。在图2B中，如下编号的孔中的CTL:用Foxp3-A2-l0-233(SEQIDNO28)刺激的全部孔，用Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)刺激的6号孔和7号孔，用Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)刺激的5号孔，和用Foxp3隱A2-10-246(SEQIDNO37)和用Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)刺激的1号孑L，与对照相比，显示出强烈的IFN-gamma产生。在图2C中，如下编号的孔中的CTL:用Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)刺激的1号，2号，4号，5号，7号，9号，11号孔和12号孔，用Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19)刺激的5号孔和11号孔，用Foxp3-A2-9-68(SEQIDNO7)刺激的7号孔，和用Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)刺激的12号孔，与对照相比，显示出强烈的IFN-gamma产生。图3显示，对阳性孔中的细胞进行扩增并执行IFN-gammaELISA测定。在图3A,B和C中，与对照(实方形)相比，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)刺激的CTL系(实菱形)显示强烈的IFN-gamma产生。在图3D中，与对照(实方形)相比，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)处理的CTL系(实菱形)显示强烈的IFN-gamma产生。在图3E中，与对照(实方形)相比，用Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO:74)处理的CTL系(实菱形)显示强烈的IFN-gamma产生。在图3F中，与对照(实方形)相比，用Foxp3-A02-10-94(SEQIDNO:27)处理的CTL系(实菱形)显示强烈的IFN-gamma产生。在图3G中，与对照(实方形)相比，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO:67)处理的CTL系(实菱形)显示强烈的IFN-gamma产生。特异CTL活性。在图4A和B中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系针对用Foxp3和HLA-A02二者转染的293T显示出高度的特异CTL活性。而另一方面，它针对对照没有显示出显著的特异CTL活性。在图4C中，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系针对用Foxp3和HLA-A24二者转染的293T显示高度的特异CTL活性。另一方面，它针对对照没有显示出显著的特异CTL活性。[图5]图5显示了Foxp3-252一h和Foxp3-252_m肽的体内免疫原性测定。将IFA偶联肽或仅IFA在第0天和第7天皮下注射到BALB/c小鼠体内。在第14天，收集经接种小鼠的脾细胞，并用作应答(responder)细胞。经相应肽(空心方形)冲击或没有用肽(实心方形)冲击过的lx104RLmalel细胞用作刺激(stimulator)细胞，用于IFN-gammaELISPOT测定。用Foxp3-252一h(A)和Foxp3-252—m(B)对5只小鼠(M1-M5)进行接种，对3只小鼠(N1-N3)进行没有任何肽的IFA注射，作为每个测定的对照。图6显示了用Foxp3表位肽进行疫苗接种的体内抗肿瘤效果。在第0天，将lxl()S个4Tl乳腺癌细胞系注射到BALB/c小鼠体内。在第3和10天，注射与Foxp3-252—h(-空心圆-),Foxp3-252—m(-实心方块-)偶联的IFA或者没有偶联肽(-实心三角形-)的IFA。作为正常肿瘤生长对照，在本测定中还制备了没有接种疫苗的小鼠(-x-)。用Foxp3表位肽进行接种观察到了显著的肿瘤生长抑制差异。*，P<0.01;**，P<0.005。图7显示了Foxp3-9-252取代物对HLA分子的亲和性的测定。在图7A中，用Foxp3-9-252-WT诱导的CTL识别在HLA-A2分子上呈递Foxp3-9-252-9V肽的细胞。进行IFN-gammaELISPOT测定，分别使用经Foxp3-9-252-WT肽诱导的CTL系作为应答细胞，经Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽冲击的T2细胞作为刺激细胞。制备未经肽冲击的T2细胞作为对照。在图7B中，Foxp3-9-252-9V和Foxp3-9-252-WT显示相似的对HLA-A2分子的亲和性。进行IFN-gammaELISPOT测定，分别使用经Foxp3-9-252-WT肽诱导的CTL系作为应答细胞(lx105个细胞/孔)和经Foxp3-9-252-WT(-实心圆-),Foxp3-9-252-9V(-空心圆-)或HIV-A02(-实心三角形-)肽冲击的T2细胞作为剌激细胞(lxl(^个细胞/孔)。制备未经肽冲击的T2细胞作为对照。在每种肽和肽浓度下，刺激细胞的肽沖击在37摄氏度下进行2小时。在图7C中，CTL可以被靶向HLA-A2分子的Foxp3-9-252取代物的刺激所诱导。针对所有靶向HLA-A2分子的取代肽的CTL是根据"材料和方法，，中描述的方法产生的。用Foxp3-9-252-3M刺激的3号和7号孔，用Foxp3-9-252-3L刺激的7号孔，和用Foxp3-9-252-9V刺激的8号孔中的细胞与对照相比显示了IFN-gamma产生。在图7D中，用Foxp3-9-252-9V产生的CTL可识别涂布有Foxp3-9-252-WT肽的刺激细胞。用Foxp3-9-252-9V肽i秀导的CTL系:故用作应答细胞。与Foxp3-9-252-9V(-实心圓-)或与Foxp3-9-252-WT(-空心圆-)肽温育过的T2细胞，或没有用肽(-空心方形-)温育过的T2细胞在本测定中用作刺激细胞(^104个细胞/孔)。发明详细说明I.定义除非特别指出，否则本文使用的词语"一个(或一种)"、"某个(或某种)"和"该"是指"至少一个(或至少一种)"。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或者是非天然存在的残基，例如相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的术语"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在氨基酸相似地发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些翻译后在细胞内被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。短语"氨基酸类似物"是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(a碳与一个氢原子、一个羧基、一个氨基和一个R基结合)，但具有经修饰的R基或者经修饰的骨架的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、曱硫氨酸亚砜、曱硫氨酸曱基锍)。短语"氨基酸模拟物"是指具有与一般氨基酸不同的结构但相似的功能的化学化合物。在本文中，氨基酸用其众所周知的三字母符号或者IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。在本文中，除非特别指出，术语"基因"、"多核苷酸"、"核苷酸"和"核酸，，可互换使用，并且与氨基酸类似，可以用它们普遍接受的单字母编码表示。除非另外定义，否则本文使用的全部技术和科学术语的意思与本发明所属领域的普通技术人员所公知的意思相同。当存在矛盾时，以本专利说明书包括定义为准。II.肽为了证明来自Foxp3的肽可以发挥被细胞毒T细胞(CTLs)所识别的抗原的功能，在本发明中，对由Foxp3亚序列构成的肽进行了分析，看它们是否是被世界上常见的HLA等位基因——HLA-A24或HLA-A02——限制的4元原表4立(DateYetal.,TissueAntigens47:93-101,1996;KondoAetal.,JImmunol155:4307-12,1995;KuboRTetal.，JImmunol152:3913-24,1994)。，利用关于它们对HLA-A24和HLA-A02的结合亲和性的信息鉴定出由Foxp3亚序列组成的HLA-A24和HLA-A02结合肽的候选物。在用载有这些肽的树突细胞(DCs)体外刺激T细胞之后，用如下的肽成功地建立了CTL:.Foxp3陽A24-9-363(SEQIDNO3),Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9),Foxp3-A24-9画207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5),Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-10-114(SEQIDNO12),Foxp3-A2國9匿390(SEQIDNO15)，Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17),Foxp3陽A2-10画359(SEQIDNO22),Foxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，Foxp3-A2-10-233(SEQIDNO28)，Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，Foxp3-A2-10-246(SEQIDNO37),Foxp3画A2-9画68(SEQIDNO18)，Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19)，Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)。建立的这些CTL针对经肽沖击的把细胞显示出强烈而特异的CTL活性。这些结果与如下的结论一致，即Foxp3是被CTL识别的抗原，并且Foxp3-A24-9-363(SEQIDNO3)，Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9),Foxp3-A24-9-207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5)，Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-10-114(SEQIDNO12),Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15),Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16),Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17)，Foxp3-A2-10-359(SEQIDNO22)，Foxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，Foxp3-A2善233(SEQIDNO28)，Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29),Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30),Foxp3-A2-10-246(SEQIDNO37),Foxp3-A2-9-68(SEQIDNO18),Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19),Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)是被HLA-A24和HLA-A2限制的表位肽。因为Foxp3在大多数癌症患者中表达，并且与由胂瘤所致免疫抑制因子(immunosuppressivefactorsduetotumors)所i秀导的免疫才中制有关,所以Foxp3是用于免疫治疗的良好靶标，用于提高针对癌症的抗原特异性免疫治疗的临床功效。因此，本发明提供了九肽(由9个氨基酸残基构成的肽)和十肽(由10个氨基酸残基构成的肽)。本发明的Foxp3肽结合HLA分子，并诱导细胞毒T淋巴细胞(CTLs)中的细胞毒活性。更具体地，本发明提供了由选自SEQIDNO:3-5，7-9,12,15-19,22,24，27-30，37,67或74的氨基酸序列所组成的肽。一般地，现在可以在互联网上获得软件程序，例如ParkerKC.etal,JImmunol.1994Janl;152(l):163-75中描述的程序，用于通过计算机(insilico)计算各种肽与HLA抗原之间的结合亲和性。与HLA抗原的结合亲和性可以在体外测量，例如在下列文献中描述的ParkerKC.etal,JImmunol.1994Jan1;152(1):163陽75.;NukayaI.etal,IntJCancer.1999Jan5;80(l):92-7.;K画shimaK，etal.((2001)Blood.;98(6):1872-81.;JournalofImmunologicalMethods,1995,185:181-190.;ProteinScience,2000,9:1838-1846)。而且，本发明的Foxp3肽在保留其CTL诱导能力的前提下可以在两侧具有额外的氨基酸残基。这些具有CTL诱导能力的肽可以少于大约40个氨基酸，例如少于大约20个氨基酸，例如少于大约15个氨基酸。位于由选自SEQIDNO:3-5,7-9,12，15-19，22,24，27-30，37,67和74的氨基酸序列组成的肽之两侧的氨基酸序列不受限制，可以由任何类型的氨基酸组成，只要其不抑制所述肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明还提供了具有CTL诱导能力的肽，其包括选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19，22,24，27-30,37，67和74。一般知道，对蛋白质中的一个或多个氨基酸进行修饰不会影响蛋白质的功能，或者在某些情况下，甚至会提高原始蛋白质的期望功能。实际上，经过修饰的肽(也就是，由通过向原始参考序列替换或添加1个、2个或数个氨基酸残基进行修饰而得到的氨基酸序列组成的肽)已知可以保持原始肽的生物活性(Marketal.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-6，1984;ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-500,1982;Dalbadie腸McFarlandetal"ProcNatlAcadSciUSA79:6409-13,1982)。因此，根据本发明的一个实施方案，本发明具有CTL诱导能力的肽可以由如下的氨基酸构成，其包含氨基酸序列SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19，22，24,27-30,37,67或74，其中添加和/或替换了一个或数个氨基酸。本领域的技术人员会认识到，向一个氨基酸序列进行个别的添加或替换以改变单个氨基酸或少部分的氨基酸，其结果仍然会保留原始氨基酸侧链的性质；因此被称作"保守替换"或"保守修饰"，其中蛋白质的改变可产生具有相似功能的蛋白质。可提供功能上相似氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。氨基酸侧链性质的实例由疏水性氨基酸(A，I，L，M,F,P,W，Y,V),亲水性氨基酸(R,D，N，C,E,Q，QH,K，S，T),和具有如下共同功能基团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P);含羟基的侧链(S,T,Y);含硫原子的侧链(C，M);含羧酸和酰胺的侧链(D，N,E,Q);含碱基的侧链(R，K,H);和含芳香基的侧链(H，F,Y,W)。此外，如下8组中，每组包含的各个氨基酸彼此是构成保守替换的1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L)，曱硫氨酸(M)，缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)丝氨酸(S),苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，曱硫氨酸(M)(见例如Creighton,Proteins(1984)).这些经过保守修饰的肽也被看作是本发明的肽。然而，本发明的肽不仅限于此，可以包括非保守修饰，只要肽保留CTL诱导能力即可。而且，经过修饰的肽不排除CTL诱导性肽的多态性变异体、种间同源物和Foxp3的等位基因(alleles)。可以仅对少数(例如1个，2个或数个)或少部分的氨基酸残基进行修饰(添加或替换)，同时仍然保留必要的CTL诱导能力(即CTL激活)。这里，术语"数个"是指5个或者更少，或者例如3个或者更少。被修饰的氨基酸残基的百分比可以是SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19,22,24,27-30,37,67和74的整个氨基酸序列的20%或者更少，例如15%或10%或者更少，例如1-5%。与已鉴定序列的整体具有至少95%，96%,97%,98%,99%的氨基酸序列同一性的Foxp3肽也是本发明意图的。序列同一性可以用本领域已知的任何算法来测算，例如可以可在美国国立生物信息中心访问的BLAST(万维网i也i止为ncbi,nlm.nih.gov/blast/Blastcgi)。对本发明肽的同源性(即序列同一性)分析Foxp3陽A24-9画363(SEQIDNO3),Foxp3-A24-9-366(SEQIDNO7),Foxp3-A24-9-190(SEQIDNO9)，Foxp3陽A24画9-207(SEQIDNO4),Foxp3-A24-9-332(SEQIDNO5),Foxp3-A24-9-337(SEQIDNO8),Foxp3-A24-l0-114(SEQIDNO12)，Foxp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，Foxp3-A2-9-69(SEQIDNO16),Foxp3-A2-9-252(SEQIDNO17),Foxp3-A2-10-359(SEQIDNO22),Foxp3-A2-10-263(SEQIDNO24),Foxp3-A2-10-94(SEQIDNO27),Foxp3-A2-10-233(SEQIDNO28),Foxp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，Foxp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，Foxp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，Foxp3-A2-9-68(SEQIDNO18),Foxp3-A2-9-304(SEQIDNO19),Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)表明它们与来源于任何其他已知的人基因产物的肽都不具有显著的同源性。这降低了在用于免疫治疗时发生未知或不良的免疫应答的可能性。当用于免疫治疗时，本发明的肽将作为与HLA抗原的复合物被呈递在细胞或外来体的表面上。因此，选择除了它们的CTL诱导能力之外，还具有高的HLA结合亲和性的肽。而且，肽可以通过替换、添加氨基酸残基等进行修饰，以实现更高的结合亲和性。除了自然展示的肽之外，因为通过与HLA抗原结合展示的肽序列的规则性(即一致性)是已知的(JImmunol152:3913,1994;I画unogenetics41:178,1995;JImmunol155:4307,1994),所以HLA-A24结合亲和性的肽，可以将其自N端起第二个氨基酸替换为苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，也可以使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸替换的肽。另一方面，自N端起第二个氨基酸被替换为亮氨酸或曱硫氨酸并且其中C端氨基酸被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽，可以用作具有高HLA-A02结合亲和性的肽。替换不仅可以在末端氨基酸进行，还可以在肽的潜在TCR识别位置进行。Zaremba等证明，CAP1肽中的氨基酸替换可等同于或者好于原始肽(CancerRes.57,4570-4577，1997)。例如，经过替换的肽包含SEQIDNO:95，97或98的氨基酸序列。而且，也可以向肽的N和/或C端添加l-2个氨基酸。这种经过然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能会诱发副作用，例如自身免疫紊乱或针对特定物质的过敏症状。因此，可以用可获得的数据库进行同源性检索，以避免、减少或最小化肽序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当通过同源性检索明确了不存在与目标肽相差1个或2个氨基酸的其他肽时，即可对目标肽进行修饰，以增加与HLA抗原的结合亲和性，和/或增加CTL诱导能力，而没有任何副作用的危险。上文描述的与HLA抗原具有高结合亲和性的肽将是非常有效的。还可以对以是否存在高结合亲和性作为指标而选出的候选肽检查其CTL诱导能力的实际存在。这里，短语"CTL诱导能力"表示肽在被呈递到抗原呈递细胞上时诱导CTL的能力。进一步，"CTL诱导能力"包括肽诱导CTL激活、CTL增殖和增加IFN-gamma产生的能力。CTL诱导能力的确认可以通过诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，或者更具体地，来源于人外周血单核白细胞的树突细胞，并且在用肽刺激后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由针对靶细胞的CTL所产生和释放的IFN-gamma。作为反应系统，可以使用已产生的可以表达人HLA抗原的转基因动物(例如在下列文献中介绍的BenMohamedL,KrishnanR，LongmateJ，AugeC，LowL，PrimusJ,DiamondDJ,HumImmunol61(8):764-79，2000Aug,RelatedArticles,Books,LinkoutInductionofCTLresponsebyaminimalepitopevaccineinHLAA*0201/DR1transgenicmice:dependenceonHLAclassIIrestrictedT(H)response),例如，靶细胞可用51Cr等进行》文射性标记，细胞毒活性可以由从耙细胞释放的放射性计算出来。或者，可以通过测量在携带有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生和释放的IFN-gamma,并4吏用抗IFN-gamma单克隆抗体对培养基上的抑制区进行可视化，来进行检验。作为检验如上所述的肽CTL诱导能力的结果，具有高HLA抗原结合亲和性的肽不一定具有高诱导能力。而且，从包含如SEQIDNO:3-5，7-9，12,15-19，22,24,27-30,37,67或74所示的氨基酸序列的肽中选出的九肽或十肽除了具有高的HLA抗原结合亲和性，还显示出特别高的CTL诱导能力。除了对本发明肽的上述修饰之外，本发明的肽可以进一步与其他物质连接，只要它们保留CTL诱导能力即可。可以使用的物质包括肽、月旨、糖和糖链、乙酰基、天然和合成聚合物等。肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化、或磷酸化；只要该修饰不破坏本文所述的肽的生物活性即可。可以进行这些类型的修饰来提供额外的功能(例如靶向功能和递送功能)或者使多肽稳定。例如，本领域已知，为了增加多肽的体内稳定性，可引入特别有用的各种D氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；本发明的多肽也可采用该构思。多肽的稳定性可以用多种方式来测试。例如，肽酶和各种生物介质，例如人血浆和血清，已被用于检测稳定性(见例如Verhoefetal.,EurJDrugMetabPha廳cokin11:291-302,1986)。III.肽的制备本发明的肽可以用众所周知的技术加以制备。例如，可以通过合成方式，利用重组DNA技术或化学合成方法来制备肽。本发明的肽可以个别地合成，或者可以合成为包含两个或更多个肽(例如两个或更多个Foxp3肽或一个Foxp3肽与一个非Foxp3肽)的较长多肽。可以对肽加以分离，即纯化，而使其基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，例如至少大约70%、80%或90%纯化。本发明的肽可以根据所选的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可用于合成的传统肽合成方法包括(i)PeptideSynthesis,Interscience,NewYork,1966;(ii)TheProteins,Vol.2,AcademicPress,NewYork,1976;(iii)PeptideSynthesis(曰文)，MaruzenCo.,1975;(iv)BasicsandExperimentofPeptideSynthesis(曰本),MaruzenCo"1985;(v)DevelopmentofPharmaceuticals(secondvolume)(曰本)，Vol.14(peptidesynthesis),Hirokawa，1991;(vi)W099/67288;和(vii)BaranyG.&MerrifieldR.B.，PeptidesVol.2，"SolidPhasePeptideSynthesis",AcademicPress,NewYork,1980，100-118。或者，本发明的肽可以用任何已知的用于产生肽的遗传工程方法获得(例如，MorrisonJ.(1977)J.Bacteriology132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss(1983)MethodsinEnzymology(eds.Wuetal.)101:347-62)。例如，首先，制备合适的载体，其具有以可表达形式编码目标肽的多核苷酸(例如，处于相应启动子序列调节序列的下游)，并将其转移到合适的宿主细胞。然后培养宿主细胞，产生目的肽。肽还可以采用体外翻译系统在体外产生。IV.多核苷酸本发明提供了多核苷酸，其编码任何一种前述的本发明肽。这包括来自天然存在的Foxp3基因的多核苷酸，和具有其经过保守修饰的核苷酸序列的那些多核苷酸。在这里，短语"保守修饰的核苷酸序列，，是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质被大量功能相同的核酸所编码。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个被密码子规定为丙氨酸的位置，可以该密码子改变成任何所述的相应密码子，而不会改变所编码的多肽。这样的核酸变异是"沉默变异，，，是保守修饰的变异中的一种。本文中，每一个编码肽的核酸序列也说明了该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(除了下面二者以外AUG,其一般仅是曱硫氨酸的密码子；TGG,其一般仅是色氨酸的密码子)均可被修饰，以产生功能相同的分子。因此，在每个公开的序列中默示地说明了编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA及其衍生物构成。DNA合适地由碱基，例如A、T、C和G构成。在RNA中，T被U替换。本发明的Foxp3多核苷酸可以编码多个本发明的Foxp3肽，它们之间存在或者不存在间插的(intervening)氨基酸序列。例如，间插氨基酸序列可以提供该多核苷酸或所翻译的肽的剪切位点(例如酶识別序列)。而且，多核苷酸可以是重组多核苷酸，其包括表达肽所需的调节序列。一般地，这些重组多核苦酸可以通过传统的重组技术，使用例如聚合酶和核酸内切酶，对多核苷酸进行操作，来加以制备。重组和化学合成技术均可用于产生本发明的多核苦酸。例如，可以通过插入到在转染到感受态细胞中时可以表达的合适载体中来产生多核苷酸。或者，多核苷酸可以用PCR技术或者在合适的宿主中表达进行扩增(见例如Sambrooketal.,《分子克隆实-睑室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989)。或者，多核苦酸可以用固相技术加以合成，例如在下列文献中介绍的BeaucageS丄.&IyerR.P"Tetrahedron48:2223-311,1992;Matthesetal.,EMBOJ3:801-5,1984。V.药剂因为Foxp3已经被鉴定是调节性T(T-reg)细胞(此类细胞执行维持免疫动态平衡的功能)的分子，所以本发明的Foxp3肽或编码Foxp3肽的多核苷酸可以用于调节T-reg细胞。因此，本发明提供了一种用于调节T-reg细胞的药剂，其包括一种或多种本发明的肽，或者编码这些肽的多核苷酸，作为活性成分。本文中，"调节"(regulating)T-reg细胞表示体内修饰T-reg细胞的状态，例如通过抑制T-reg细胞的增殖或阻遏其功能。T-reg细胞被认为是各类免疫应答的抑制的主要参与者，本文中"阻遏T-reg细胞的功能"是指降低T-reg细胞的阻遏免疫应答的能力。特别地，T-reg细胞在外周发挥作用，被称作外周耐受(MiescherSetal"JImmunol136:1899-907，1986;YoungRCetal"AmJMed52:63-72,1972;AlexanderJPetal.,CancerRes53:1380-7，1997;HoriguchiSetal"CancerRes59:2950-6,1999;KonoKetal"ClinCancerRes11:1825-8，1996;KiesslingRetal"CancerImmunolI腿腸ther48:353-62,1999;FontenotJDetal.，NatImmunol4:330-6,2003,HoriSetal.，Science299:1057-61,2003;KhattriRetal"NatImmunol4:304-6，2003)。T-reg细月包在例如癌症患者体内提供免疫抑制效果。因此，本发明Foxp3肽(其在T-reg细胞中过表达)或编码该Foxp3肽的多核苷酸可以用作治疗癌症的药剂(例如疫苗)。在本发明中，短语"疫苗"(也称作免疫原性组合物)是指这样的物质，其在被接种到动物体内时，具有诱导抗肿瘤免疫或调节T-reg的免疫的功能。本发明的药剂可用于治疗和/或预防受试者体内的癌症，所述受试者例如人和任何其他哺乳动物，包括但不限于，小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或家畜。根据本发明，包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19,22，24,27-30,37，67或74的氨基酸序列的多肽是HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽，能够诱导针对Foxp3表达性T-reg细胞的强烈而特异的免疫应答。因此，本药剂意图施用于HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02的受试者。有待于用本发明的药剂治疗的癌症没有限制，包括所有在受试者体内Foxp3表达的种类的癌症。癌症的实例包括乳腺癌、AML、膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。如果需要，由Foxp3肽或编码Foxp3肽的多核苷酸构成的本发明的药剂可选地包含其他治疗性物质作为活性成分，只要该物质不抑制目的肽的T-reg细胞调节作用即可。例如，制剂可以包含抗炎剂、止痛剂、化疗剂等。药剂本身除了包含其他的治疗性物质之外，本发明的药剂还可以和一种或多种其他的药理学作用剂顺次地或同时地施用。药物和药理学作用剂的量取决于，例如，所用的药理学作用剂类型，所治疗的疾病，和给药的日程方案和途径。-应当理解，除了本文中特别提到的成分之外，本发明的药剂可以包括与所讨论的制剂类型有关的在本领域中常规使用的其他作用剂。在本发明的一个实施方案中，本药剂可以包含在产品和试剂盒中，所述产品和试剂盒含有对于要治疗的疾病状况(例如癌症)的治疗有用的材料。该产品可以包括具有标签的任何本发明药剂的容器。该容器可以用多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器上的标签应当指明该制剂是用于治疗或预防疾病的一种或多种状况。该标签还应标明用药说明等。除了上述的容器之外，包含本发明药剂的试剂盒还可以任选地包含第二容器，其容纳药物可接受的稀释剂。还可以进一步包括其他从商业和用户角度看可取的材料，包括其他的緩冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。如果期望的话，药物组合物可以置于包(pack)或配药器(dispenserdevice)中提供，所述包或配药器可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。所述包可以包括，例如，金属或塑料箔(foil)，例如发泡包。该包装或配药器可以通过给药说明书实现。(1)含有肽作为活性成分的药剂如果需要的话，本发明的肽可以作为经传统制剂方法配制过的药剂直接施用。在这些情况下，除了本发明的肽之外，还可以视情况包括载体、赋形剂和其他通常用于药物的物质，没有特殊的限制。这些载体的实例有灭菌水、生理盐水、磷酸盐緩冲液、培养液等。而且，药剂可以根据需要包含稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。本发明的药剂可用于治疗和/或预防癌症，特别是调节T-reg细胞。本发明的肽可以制备为包含两种或多种本发明的Foxp3肽的组合，用于在体内诱导CTL。这些Foxp3肽可以是鸡尾酒混合物(cocktail)或者可以用标准技术将它们彼此偶联。例如，可将这些Foxp3肽表达成单个多肽序列。组合中的肽可以是相同的也可以是不同的。通过施用该发明的Foxp3肽，这些肽以高密度呈递在抗原呈递细胞的HLA抗原上，然后诱导出特异性地对被展示肽与HLA抗原之间形成的复合物起反应的CTL。或者，从用本发明肽刺激的受试者体内取出树突细胞，从而获得在细胞表面上固定有本发明Foxp3肽的抗原呈递细胞；通过将载有Foxp3肽的树突细胞重新施用到受试者体内来诱导CTL，结果，可以增加针对靶细胞的攻击性。包含本发明的Foxp3肽作为活性成分的用于调节T-reg细胞的药剂任选地可以包含佐剂，以便有效地建立细^(免疫；或者可以将它们与其他活性成分一起施用，并且它们可以配制成颗粒来施用。佐剂是指这样的化合物，其在和具有免疫原性的蛋白质一起(或顺次)施用时，可以提高针对该蛋白质的免疫应答。可以使用的佐剂包括在文献中介绍的佐剂(ClinMicrobiolRev7:277-89,1994)。佐剂实例包括磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等，但不仅限于此。而且，可以方便地使用脂质体剂型，Foxp3肽与几mcm直径的球珠结合的颗粒剂型，和脂质与肽结合的剂型。在一些实施方案中，本发明的药剂包括可初始化(prime)细胞毒T淋巴细胞的成分。脂质已被确认为是能够在体内针对病毒抗原初始化CTL的作用剂。例如，可以将棕榈酸残基附接到赖氨酸残基的s-和a-氨基，然后连接到本发明的肽上。脂质化的肽随后或是直接在胶束或颗粒中施用，或者掺入到脂质体中施用，或者在佐剂中乳化后施用。作为CTL应答的脂质初始化的另一个实例，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，在共价附接到合适的肽后，可以用来初始化CTL(见例如Deresetal.，Nature342:561，1989)。给药方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等，并可以使用系统给药或者在目标部位的附近局部给药。给药的执行可以是单次给药或者通过多次给药进行增强(boost)。本发明肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、给药方法等进行合适的调节，一般为0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg，并可以/人每几天纟合药1次到每几个月给药l次。本领域的技术人员可以恰当地选择合适的剂量。(2)含有多核苷酸作为活性成分的药剂本发明的药剂还可以包含处于可表达形式的编码本文公开的Foxp3肽的核酸。本文中，短语"处于可表达的形式，，是指多核芬酸在引入到细胞内后，将被体内表达成可诱导抗肿瘤免疫的多肽。在一个实施方案中，目标多核苷酸的核酸序列包括在靶细胞中表达该多核苷酸所必需的调节元件。多核苷酸可以被配备成可以稳定地插入到靶细胞的基因组内(关于同源重组盒式载体的介绍见例如ThomasKR&CapecchiMR,Cell51:503-12,1987)。见例如Wolffetal.，Science247:1465-8,1990;美国专利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO98/04720。基于DNA的递送技术的实例包括"棵DNA"、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的("基因枪")或压力介导的递送(见例如美国专利No.5,922,687)。本发明的肽还可以用病毒或细菌载体表达。表达载体的实例包括减毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。这种方法涉及^f吏用例如牛痘病毒作为载体，表达编码该肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主内，重组的痘苗病毒表达免疫原性肽，借此引发免疫应答。免疫方案中有用的痘苗载体和方法在下列文献中有介绍，例如美国专利4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stoveretal.，Nature351:456-60，1991中有介绍。很多其他的可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等，是容易想到的。见例如Shataetal.，MolMedToday6:66-71,2000;Shedlocketal.JLeukocBiol68:793-806,2000;Hippetal"InVivo14:571-85,2000。将多核苷酸输送到患者体内可以是直接的，在此情况下患者被直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，在此情况下首先在体外用目的多核苷酸对细胞进行转化，然后将细胞移植到患者体内。这两种方法被分别称作体内或回体基因治疗。关于基因治疗方法的一般综述，见Goldspieletal.，ClinicalPharmacy12:23488-505,1993;WuandWu，Biotherapy3:87-95，1991;Tolstoshev，AnnRevPharmacolToxicol33:573-96，1993;Mulligan,Science260:926-32，1993;Morgan&Anderson,AnnRevBiochem62:191-217,1993;TrendsinBiotechnology11(5):155-215，1993。可以使用的在重组DNA技术中普遍知道的方法在下面文献中有介绍Ausubel等编辑的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons,NY,1993;和Krieger《GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual》，StocktonPress,NY,1990。给药方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等，还可以使用系统给药或对目标部位附近局部给药。给药可以通过单次给药来进行，或者通过多次给药来加强。至于在合适载体内或者用编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞内的多核苷酸的剂量，可以根据持治疗的疾病、患者的年龄、体重、给药方法等进行合适的调节，一般为0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg,并可以从每几天给药1次到每几个月给药1次。本领域的技术人员可以恰当地选择合适的剂量。(3)外来体或者，本发明提供称作外来体的细胞内嚢泡，其在表面上呈递在本发明肽与HLA抗原之间形成的复合物。外来体的制备可以通过，例如，使用在已公开的国际公告日文翻译特表平11-510507和特表2000-512161中详细描述的方法，并可以用从作为治疗和/或预防的对象的受试者获得的抗原呈递细胞加以制备。与本发明的肽相似，本发明的外来体可以作为疫苗进行预防注射。所用的HLA抗原类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型相匹配。例如，对于日本人，HLA-A24，特别是HLA-A2402,通常是合适的。关于HLA抗原，使用在日本人和白人中高表达的A-24或A-02型有利于获得有效的结果。且使用包括A-2402和A-0201在内的亚型是有用的。通常，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样可以合适地选择对该抗原具有高水平结合亲和性，或具有通过抗原呈递诱导细胞毒T细胞(CTL)的能力的肽。而且，为了获得显示高结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在的Foxp3部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或数个氨基酸的替换或添加。(4)抗原呈递细胞本发明还提供抗原呈递细胞(APC)，该细胞在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。通过与本发明的肽或编码本发明的肽的核苷酸接触获得的APC可以从治疗和/或预防的目标受试者制备，而且可以单独或与其他药物(包括本发明的肽、外来体或细胞毒T细胞)组合而作为疫苗施用。APC不仅限于任何类型的细胞，包括树突细胞(DC)、朗格汉斯(Langerhas)细胞、巨噬细胞、B细胞、和激活的T细胞，所有这些都已知可以在细胞表面上呈递蛋白质抗原，从而被淋巴细胞识别。因为DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，所以DC作为本发明的APC特别有用。例如，APC可以通过从外周血单核细胞诱导树突细胞，然后使它们与本发明的肽在体外、回体或在体内进行接触(刺激)来获得。当将本发明的肽施用于受试者时，在受试者体内诱导出具有固定在其上面的本发明的肽的APC。"诱导APC"包括使细胞与本发明的肽或者编码本发明肽的核苦酸接触(刺激)，从而在该细胞表面上呈递在HLA抗原和本发明的肽之间形成的复合物。或者，在将本发明肽固定在APC之后，APC可以作为疫苗施用给受试者。例如，回体施用可以包括如下步骤a:从受试者收集APC;和b:使步骤a的APC与肽接触。通过步骤b获得的APC可以作为疫苗施用给受试者。根据本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。这些具有高水平细胞毒T细胞诱导能力的APC可以通过包括在体外将包含编码本发明的肽的多核苷酸的基因转移到APC的步骤的方法来制备。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。关于导入方法，没有特殊限制，本领域常用的各种方法，包括脂质转染、电穿孔和磷酸4丐方法，都可使用。更具体地，可以按照下列文献中的描述来进行CancerRes56:5672-7,1996;JImmunol161:5607-13,1998;JExpMed184:465-72,1996;已公开的国际7^布日文翻译特表2000-509281。通过将基因转移到APC内，基因在细胞内经过转录、翻译等，然后所得的蛋白质^皮MHCI类分子或II类分子加工，并通过呈递途径呈递部分肽。(5)细胞毒T细胞就针对任一种本发明的Foxp3肽被诱导的细胞毒T细胞而言，认为它们可以在体内强化耙向T-reg细胞的免疫系统，因此可以与肽类似地用作疫苗。因此，本发明提供被任何本发明的肽诱导的、分离的细胞毒T细胞。这些细胞毒T细胞可以通过(l)向受试者施用本发明的肽，或者(2)在体外使源自受试者的APC和CD8阳性细胞，或者外周血单核白细胞与本发明的肽接触(刺激)，来获得。对于被呈递本发明肽的APC的刺激所诱导的细胞毒T细胞，其可以来自治疗和/或预防的目标受试者，并可以独自或者与其他包括本发明肽的药物或用于调节效果的外来体组合施用。所获得的细胞毒T细胞特异地作用于呈递本发明肽(例如与用于诱导肽的相同的肽)的靶细胞。靶细胞可以是内源表达Foxp3的细胞，或者是被Foxp3基因转染的细胞，此外，由于这些肽的剌激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞，也可以成为攻击的靶标。(6)TCR本发明还提供了一种包括编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚基的多肽的核酸的组合物，并提供了其使用方法。TCR亚基具有形成TCR的能力，TCR为T细胞提供针对呈递本发明肽的细胞的特异性。通过使用本领域已知的技术，可以鉴定作为用本发明的一种或多种肽诱导的CTL的TCR亚基的a-和卩-链的核酸(W02007/032255和Morganetal.,JImmunol,171,3288(2003))。衍生的TCR优先以高亲和性结合展示Foxp3肽的耙细胞，并任选地在体内和体外介导针对呈递Foxp3肽的靶细胞的高效杀伤。可以将编码TCR亚基的核酸掺入到合适的载体例如逆转录病毒载体内。这些载体是本领域众所周知的。核酸或包含它们的载体可以被有用地转移到T细胞内，该T细胞优选地来自患者。有利地，本发明提供了即时可用的(off-the-shelf)组合物，其允许快速地修饰患者自身的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)，从而快速而容易地产生具有优异T-reg细胞杀伤性质的修饰T细胞。另外，本发明提供通过用编码与本发明Foxp3肽结合的TCR亚基多肽的核酸进行转化而制备的CTL。经转化的CTL能够在体内归巢于(fomingto)T-reg细胞，并用众所周知的体外培养方法进行扩增(例如Kawakamietal.,JImmunol.,142，3452-3461(1989))。可以使用本发明的T细月包形成免疫组合物，用于治疗或预防需要治疗或保护的患者的癌症(W02006/031221)。VI.使用Foxp3肽的方法
技术领域：
：本发明的Foxp3肽和编码Foxp3肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。Foxp3肽和多核苷酸可以和任何其他化合物组合使用，只要该化合物不抑制其CTL诱导能力即可。因此，任何前述的本发明的药剂均可用于下文提到的本发明的方法。(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法因此本发明提供了使用本发明的肽或编码这些肽的多核苷酸诱导APC的方法。APC的诱导可以如上文条目"V-(4)抗原呈递细胞"中所述进行。本发明还提供了用于诱导具有高水平的细胞毒T细胞诱导能力的APC的方法，该诱导在上文条目"V-(4)抗原呈递细胞"中有讨论。或者，根据本发明，选自包含SEQIDNO:3-5,7-9，12，15-19,22，24,27-30，37，67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含抗原呈递细胞的药物组合物的用途。进一步，本发明还提供了选自包含SEQIDNO:3-5,7-9,12,15-19,22,24,27-30,37，67或74的氨基酸序列的肽中的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸，用于诱导抗原呈递细胞。(0096)(2)诱导细胞毒T细胞的方法而且，本发明还4是供了使用本发明的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸诱导CTL的方法。当将本发明的Foxp3肽施用于受试者时，在受试者身体内诱导CTL,靶向T-reg细胞的免疫系统的强度被提高。或者，它们可以用于回体治疗方法，其中将来自受试者的APC和CD8阳性细胞或者外周血单核白细胞在体外与本发明的肽接触(刺激)，诱导CTL之后，将细胞返回给受试者。例如，该方法可以包括如下步骤a:从受试者收集APC，b:使步骤a的APC与肽接触，c:将步骤b的APC与CD8+T细胞混合，并共培养以诱导细胞毒T细胞，和d:从步骤c的共培养物中收集CD8+T细胞。通过步骤d获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用于受试者。在上面步骤c中与CD8+T细胞混合的APC还可以根据在上文条目"V-(4)抗原呈递细胞"中详细说明的方法加以制备，即通过将编码本发明肽的基因转移到APC中；但并不仅限于此，任何能够有效地将本发明的肽呈递给T细胞的APC或外来体均可用于本方法。或者，根据本发明，从包含SEQIDNO:3-5,7-9,12,15-19,22,24，27-30，37，67或74的氨基酸序列的肽中选择的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸用于制造包含CTL的药物组合物的用途。进一步，本发明还提供了从包含SEQIDNO:3-5,7-9,12，15-19，22,24,27-30，37,67或74的氨基酸序列的肽中选择的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸，用于诱导CTL。(3)调节免疫抑制如上面讨论的，本发明的肽、多核苷酸、外来体、APC和CTL可以用作疫苗来调节(即抑制)T-reg细胞。因为T-reg被认为是抑制各种类型的免疫应答，特别是CTL细胞毒活性的主要参与者之一，所以本发明肽、多核苷酸、外来体、APC和CTLs的能力提示它们还可以用于对抗免疫抑制，特别是对抗CTL细胞毒活性的免疫抑制。因此，本发明提供了调节T-reg细胞的方法，以及调节(即对抗)免疫抑制的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本发明的肽、多核苷酸、外来体、APC和CTL的步骤。而且，本发明还提供了从包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19，22，24，27-30,37,67或74的氨基酸序列的肽中选择的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸在制造用于调节免疫抑制的免疫原性组合物方面的用途。或者，本发明还涉及从包含SEQIDNO:3-5，7-9,12，15-19,22,24，27-30,37，67或74的氨基酸序列的肽中选择的Foxp3肽或编码这些Foxp3肽的多核苷酸，用于调节免疫抑制。这里，"调节免疫抑制"意味着本发明的肽、多核苷酸、外来体、APC和CTL的施用在体内造成任何类型的变化。在一些实施方案中，由本发明的肽、多核苷酸、外来体、APC和CTL造成的变化是免疫抑制状态水平的降低(免疫抑制的抑制或对抗)，也就是说，抗免疫抑制(anti-immunosuppression)的诱导。因此，本发明还提供了诱导抗免疫抑制的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本发明的肽、多核苷酸、外来体、APC或CTL的步骤。一般地，抗免疫抑制包括的免疫应答如下-诱导针对表达Foxp3的T-regs的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识别表达Foxp3的T-regs的抗体，和-诱导抗T-regs细胞因子的产生。因此，如果某种蛋白质在接种到动物体内时可诱导这些应答的任何一种，则判定该蛋白质具有诱导抗免疫抑制的效应。受蛋白质诱导的抗免疫抑制可以通过观察宿主免疫系统针对该蛋白质的体内或体外应答来进行检测。例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导(即活化)的方法是众所周知的。具体地，已知进入活体内的外来物质在抗原呈递细胞(APC)的作用下被呈递给T细胞和B细胞。以抗原特异方式应答被APC所呈递的抗原的T细胞在抗原的刺激下分化成细胞毒T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称作T细胞的活化)。因此，特定肽的CTL诱导可以这样来加以评估通过APC将该肽呈递给T细胞，并检测CTL的诱导(即，增殖、IFN-gamma产生和细胞毒活性)。而且，APC具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨p蓝细胞、嗜酸性细胞和NK细胞的作用。因为CD4+T细胞对于抗肿瘤免疫也是重要的，可以用这些细胞的活化效应作为指标来评估肽的抗肿瘤免疫诱导作用。使用树突细胞(DC)作为APC来评估诱导CTL的作用的方法是本领域众所周知的。根据本方法，最初使测试肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触后，若检测到具有针对表达(即在HLA分子上呈递)目标肽的细胞的细胞毒作用的T细胞，则显示该测试肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。CTL针对T-regs的活性可以用例如510"-标记的肿瘤细胞的裂解作为指标进行检测。或者，使用3&胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评估T-regs破坏程度的方法也是众所周知的，并可以在本发明中使用。除了DC之外，还可以使用外周血单个核细胞(PBMC)作为APC。有报道称通过在GM-CSF和IL-4的存在下培养PBMC可提高CTL的诱导。类似地，已证明通过在钥孔虫威血蓝蛋白(KLH)和IL-7的存在下培养PBMC可以诱导CTL。通过这些方法被确认具有CTL诱导活性的测试肽，是具有DC活化作用和随后的CTL诱导活性的肽。因此，可诱导针对肿瘤细胞的CTL的Foxp3肽可以用作针对T-regs的疫苗。而且，通过与Foxp3肽接触而获得了诱导针对T-regs的CTL的能力的APC也可用作针对T-regs的疫苗。而且，藉由APC呈递肽抗原而获得了细胞毒性的CTL也可用作针对T-regs的疫苗。这些利用由APC和CTL介导的免疫来调节T-regs的方法#:称作细胞免疫治疗，并且包含在本发明之内。一般地，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，已知可以通过组合多种具有不同结构的肽并使它们与DC接触，可提高CTL诱导的功效。因此，在用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。或者，肽诱导的抗免疫抑制可以通过观察针对T-regs的抗体产生的诱-导来确认。例如，当在用某种肽免疫过的个体(例如人患者、实验动物)体内诱导出针对该肽的抗体时，并且当T-reg细胞被那些抗体抑制时，就可以确定该肽具有诱导抗免疫抑制的能力。抗免疫抑制可以通过施用本发明的疫苗加以诱导，并且该诱导使得免疫抑制的消除成为可能。这些效果可以是统计上显著的。例如，在观察中，在5%或者更低的显著度水平，其中将针对T-regs的疫苗的调节作用与没有施用疫苗的对照相比较。例如，可以使用Student'st-test，Mann-WhitneyU-test或ANOVA进4于统计分析。当使用APC或CTL作为本发明疫苗时，例如可以通过回体方法调节(即抑制)T-regs。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，使细胞以回体方式与多肽接触，在APC或CTL诱导之后，可将细胞施用于受试者。APC的诱导还可以通过以回体方式将编码多肽的载体引入到PBMC中来实现。在体外诱导的APC或CTL在施用前可以进行克隆。通过克隆和培养具有高的靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地执行细胞免疫治疗。而且，免疫治疗，还可以用于其他个体中相似类型疾病的的细胞免疫治疗。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学用语均具有本发明所属领域内普通技术人员所普遍知晓的意思。尽管可以使用与在本文中介绍的相似或等价的方法和材料本发明的实施或测试，但在下文中介绍了合适的方法和材料。本文通过引用并入在本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容。在出现矛盾的情况下，以本专利申请包括定义为准。此外，材料、方法和实施例只是例证性的，不含限制意义。下面的实施例是提供用于示例说明本发明，以及帮助技术人员制作和使用本发明。这些实施例没有任何限制本发明范围的意思。实施例材泮+和方法细胞系A24LCL细胞(HLA-A24/24)、T2细胞(HLA-A02/02)、人B类淋巴母细胞、293T和COS7购自于ATCC。Foxp3衍生肽的候选物筛选用结合预测冲欠件"BIMAS"(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken—parker—comboform)预测从Foxp3衍生的可以和HLA-A*2402和HLA-A*0201分子结合的九聚体和十聚体肽，算法如ParkerKC,etal.((1994)JImmunol.;152(l):163画75,)和KuzushimaK,etal.((2001)Blood.;98(6):l872-8l.)所述。这些肽由Sigma(Sapporo，Japan)根据标准固相合成方法合成，并通过反相HPLC纯化。肽的纯度(>90%)和身份分别用分析HPLC和质谱分析确定。肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，并保存于-80摄氏度。体外CTL诱导在HLA上的肽的CTL应答。DC在体外产生，方法如别处所述(HoriguchiS.etal.CancerRes.59:2950-6)。具体地，用Ficoll-Plaque(Pharmacia);容液/人正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-八*0201)分离外周血单个核细胞(PBMC)，通过粘附到塑料组织培养盘(BectonDickinson)对其进行分离，从而富集其中的单核细胞组分。将富集了单核细胞的群体在1000U/mlGM-CSF(R&D31System)和1000U/mlIL-4(R&DSystem)的存在下在含有2%热灭活的自体同源血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中培养。培养7天后，在3mcg/mlbeta2-微球蛋白的存在下，在20摄氏度的AIM-V培养基中用20mcg/ml的合成肽沖击4小时。然后用丝裂霉素C(MMC)(30mcg/ml30mins)使这些经肽冲击的DC失活，并以1:20的比例与自体同源CD8+T细胞混合，这些CD8+T细胞是通过用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)进行阳性筛选而获得的。将这些培养物置于48孔培养板(Corning)中，每孔含有1.5x104个经过肽冲击的DC,3xl()5个CD8+T细胞和10ng/mlIL-7(R&DSystem),处于0.5mlAIM-V/2%AS中。3天后，向这些培养物添加IL-2(CHIRON)至终浓度为20IU/ml。在第7和14天，用经过肽冲击的自体同源DC进一步对T细胞进行再刺激。每一次DC的制备均采用与上述相同的程序。在第21天，经过3轮肽刺激后，对针对经过肽沖击的A24LCL细胞或T2细胞的CTL活性进行测试。CTL扩增程序使用与下列文献中报道的相似的方法Riddell,etal.(Walteretal.，NEnglJMed333(16):1038-44,1995;Riddelletal,,NatMed2(2):216-23,1996Feb)在培养基中扩增CTL。将总共5x10"个CTL与两种用MMC灭活的人B-类淋巴母细胞系一起在40ng/ml的抗-CD3单克隆抗体(Pharmingen)的存在下重新悬浮在25mlAIM-V/5%AS中。开始培养l天之后，向培养物中添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天，向培养物添加含有30IU/mlIL-2的新鲜AIM-V/5%AS。特异CTL活性为了检验特异的CTL活性，进行了IFN-gammaELISPOT测定和IFN-gammaELISA。简而言之，制备经肽冲击的A24-LCL、T2细胞(lx104/孑L)或内源表达Foxp3和HLA分子的细胞，作为刺激细胞。使用在48孔板中培养的CTL系作为应答细胞。IFN-gammaELISPOT测定和IFN-gammaELISA根据制造商的程序进行。表位肽在BALB/c小鼠体内的免疫原性为了初始化肽特异的CTL,使用100mcl疫苗混合物进行免疫，该疫苗混合物含有每只小鼠50mclHLA-A24限制性肽和50mclIFA。疫苗在第0天皮下注射到小鼠的右胁进行第一次免疫，在第7天注射到左胁进行第二次免疫。在第14天，使用来自接种的小鼠的脾细胞作为应答细胞，使用经过或者未经肽沖击的RLmalel细胞作为刺激细胞，进行IFN-gammaEUSPOT观'J定。体内抗肿瘤岁文应在第0天，将4T1细胞(lxl05/小鼠)皮下注射到BALB/c小鼠的右胁。在第3和10天，用hFoxp3-252(KLSAMQAHL:SEQIDNO:17)或mFoxp3-252(KLGAMQAHL:SEQIDNO:88)IFA-偶联的肽进行疫苗接种。Foxp3-9-252替换物对HLA分子的亲和性的测定实施IFN-gammaELISA测定来检查经替换的肽与HLA-A2分子的亲和性。用Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL:SEQIDNO:17)肽诱导的CTL作为应答细胞，通过在37摄氏度与Foxp3-9-252-WT、Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV:SEQIDNO:95)和HIV-A02(SLYNTYATL)肽温育2小时来制备T2细胞，作为刺激细胞。用宽浓度范围(10-l()4mcg/ml)的每种肽对T2细胞进行肽冲击。结果来源于Foxp3的HLA-A24和HLA-A2结合肽的预测表1、2和3按照预测高结合亲和性的得分次序显示了Foxp3蛋白的HLA-A*2402结合肽或HLA-A*0201结合肽。总共选择了60种具有潜在HLA-A24结合活性的肽和26种具有潜在HLA-A2结合活性的肽。33<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>开始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸数目。结合得分源于在"材料和方法"中介绍的"BIMAS"。Foxp3衍生的HLA-A2402结合性10聚体肽<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>开始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸数目。结合得分源于在"材料和方法"中介绍的"BIMAS"。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>开始位置表示自Foxp3N端起的氨基酸数目。结合得分源于在"材料和方法"中介绍的"BIMAS"。使用预测的HLA-A2402限制性肽对T细胞进行刺激根据上文"材料和方法"中描述的方法生成针对来源于Foxp3蛋白的肽的CTL。在IFN-gammaELISPOT测定中显示可检测的特异CTL活性的所得CTL显示在图1A和图1B中。在图1A中，如下孔编号中的细胞用Foxp3-A24-9-363刺激的孔编号2号和7号孔，用Foxp3-A24-9-366刺激的1号孔和6号孔，用Foxp3-A24-9-190刺激的5号孔，用Foxp3-A24-10-87刺激的7号孔，和用Foxp3-A24-10-60刺激的7号孔，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图IB中，如下孔编号中的细胞用Foxp3-A24-9-207刺激的4号孔，用Foxp3-A24-9-332刺激的6号孔，用Foxp3-A24-9-337刺激的6号孔，和用Foxp3-A24-10-114刺激的1号孔，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。使用预测的HLA-A0201限制性肽对T细胞进行刺激在进行IFN-gammaELISPOT测定时显示可检测的特异CTL活性的所得CTL显示于图2A、图2B和图2C中。在图2A中，如下孔编号中的细胞用Foxp3-A2-9-3卯刺激的2号孔，用Foxp3-A2-9-69刺激的2号孔，用Foxp3-A2-9-252刺激的6号孔，用Foxp3-A2-10-359刺激的4号孔，用Foxp3-A2-263刺激的7号孑L，和用Foxp3-A2-10-94刺激的2号孔和5号孑L,与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图2B中，如下孔编号中的细胞用Foxp3-A2-10-233刺激的所有孔，用Foxp3-A2-10-152刺激的6号和7号孔，用Foxp3-A2-10-77刺激的5号孔，用Foxp3-A2-10-246和用Foxp3-A2-10-94刺激的1号孑L，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图2C中，如下孔编号中的细胞用Foxp3-A2-9-390刺激的1、2、4、5、7、9、11和12号孔，用Foxp3-A2-9-304刺激的5号和11号孔，用Foxp3-A2-9-68刺激的7号孔，和用Foxp3-A2-9-252刺激的12号孔，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。从Foxp3特异性肽建立CTL系对阳性孔中的这些细胞进行扩增，并进行IFN-gammaELISA测定。在图3A、B、C中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)刺激的CTL系，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图3D中，用Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)刺激的CTL系与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图3E中，用Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO:75)刺激的CTL系，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图3F中，用Foxp3-A02-10-94(SEQIDNO:27)刺激的CTL系，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。在图3G中，用Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO:68)刺激的CTL系，与对照相比显示了强烈的IFN-gamma产生。针对内源表达Foxp3和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶细胞的特异CTL活性对于所建立的从这些肽产生的CTL克隆，检查其识别内源表达Foxp3和HLA-A*24或02的把细胞的能力。使用对Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系作为效应细胞，对针对同时转染了全长Foxp3基因和HLA-A*24或02分子的293T(它是内源表达Foxp3和HLA-A*24或02的靶细胞的特异性模型)的特异性CTL活性进行了4企测。在图4A和图4B中，用Foxp3-A02-9-390(SEQIDNO:15)和Foxp3-A02-9-252(SEQIDNO:17)生成的CTL系针对同时被Foxp3和HLA-A02转染的293T显示出高度特异的CTL活性。另一方面，其对于对照则没有显示出显著的特异性CTL活性。这清楚地表明，Foxp3-A02-9-390和Foxp3-A02-9-252与HLA-A02和/或24分子一起被自然地表达到耙细胞的表面，并识别CTL。而且，这些肽是表位肽，可用作靶定表达Foxp3的T-regs的疫苗。Foxp3-A24-9-252肽在BALB/c小鼠中的免疫原性为了评估Foxp3-9-252肽对BALB/c小鼠的免疫原性，分别用人Foxp3-9画252肽(Foxp3画252一h;KLSAMQAHL)和小鼠Foxp3-9画252肽(Foxp3-252—m;KLGAMQAHL)(SEQIDNO:89)进行免疫。在第二次注射肽之后，通过IFN-gammaELISPOT测定来确定肽特异的CTL活性(图5)。从收集自用肽接种的小鼠的脾细胞，在与用相应肽冲击过的剌激细胞共培养的孔中4全测到了强烈的IFN-gamma产生，而在对照孔中则没有显示IFN-gamma产生。在图6A中，在5只小鼠中的3只(M3，M4和M5)中检测到Foxp3-252—h肽特异性的CTL应答，而在仅用IFA接种的对照小鼠(N1N3)中则没有。在图6B中，在5只小鼠中的1只(M1)中检测到Foxp3-252—m肽特异的CTL应答，而在仅用IFA接种的对照小鼠(N1N3)中则没有。这些数据表明，用Foxp3-252—h或Foxp3-252—m肽的每一种进行肽接种均可在体内诱导出针对经肽冲击靶细胞的CTL。38Foxp3表位肽疫苗接种的抗肿瘤效应为了检验靶向Foxp3的肽接种的抗肿瘤效应，尝试了使用4T1肿瘤细胞和BALB/c小鼠的体内治疗设定。在第0天，将4T1乳腺癌细胞皮下注射到BALB/c小鼠中，在肿瘤攻击后的第3和第10天，对这些小鼠进行接种。结果，与对照小鼠相比，用Foxp3-252—h或Foxp3-252—m肽接种的BALB/c小鼠体内的肿瘤生长显著降低(图6)。考虑到统计分析，其显示了用Foxp3表位肽进行接种的小鼠体内的肺瘤生长抑制的显著性差异。Foxp3表位肽的氨基酸替换在前述结果中，Foxp3-9-252肽(SEQIDNO17)被鉴定为同时被HLA-A*2402和HLA-A*0201限制的表位肽。为了提高Foxp3-9-252肽的免疫原性，选择单个或数个氨基酸替换，以获得比天然Foxp3-9-252肽Foxp3-9-252-WT(KLSAMQAHL)(SEQIDNO17)更高的对HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的结合亲和性；Foxp3-9-252(SEQIDNO17)中氨基酸替换的结合得分用BIMAS软件产生。表4显示了Foxp3-9-252来源的替换肽的氨基酸序列及其对HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的结合得分。肽的结合得分用BIMAS软件产生。合成了6或9种替换物，总共15种肽，其预测具有比野生型更高的对HLA-A24或HLA-A2分子的结合亲和性(表4)。Foxp3-9-252(SEQIDNO17)中^J^酸替换对HLA-A*2402或0201分子的结合得分<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>然后，本发明人检查了用这些替换物进行过肽沖击的刺激细胞是否被用Foxp3-9-252-WT肽产生的CTL所识别。结果，被Foxp3-9-252-WT肽诱导的CTL产生了针对Foxp3-9-252-9V(KLSAMQAHV)(SEQIDNO95)冲击过T2细胞的IFN-gamma,同样也产生了针对经Foxp3-9-252-WT肽沖击的T2细胞的IFN-gamma(图7A)。因为从针对没有用任何肽冲击过的刺激细胞的CTL中没有检测到IFN-gamma的产生，所以表明，用Foxp3-9-252-WT肽产生的CTL不但可识别HLA-A2分子上呈递的Foxp3-9-252-WT，还可识别HLA-A2分子上呈递的Foxp3-9-252-9V肽。而且，为了评估Foxp3-9-252-9V肽是否具有比Foxp3-9-252-WT肽更高的对HLA-A2分子的亲和性，用以宽泛浓度范围(10-l(rVncg/ml)的这些肽沖击过的刺激细胞确定CTL活性。结果，与分别用Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V肽冲击过的刺激细胞共培养的CTL产生了相似的IFN-gamma(图7B)。从这些数据显示，呈递在HLA-A*0201分子上的Foxp3-9-252-9V肽可以被用Foxp3-9-252-WT肽建立的CTL识别。另一方面，本发明人尝试使用包括Foxp3-9-252-9V肽的所有HLA-A*0201限制性替换物来诱导CTL。结果，用Foxp3-9-252-3M(KLMAMQAHL)(SEQIDNO97)，Foxp3-9-252画3L(KLLAMQAHL)(SEQIDNO98)或Foxp3-9_252-9V肽刺激产生了CTL(图7C)。如下孔编号中的细胞用Foxp3-9-252-3M刺激的3号和7号孑L,用Foxp3-9-252-3L剌激的7号孑L,和用Foxp3-9-252-9V刺激的8号孑L，与对照相比显示了肽依赖的IFN-gamma产生。通过体外扩增建立了受Foxp3-9-252-9V剌激诱导的CTL系之后，使用经Foxp3-9-252-WT或Foxp3-9-252-9V冲击过的刺激细胞确定了CTL活性。结果，通过Foxp3-9-252-9V刺激而诱导的CTL识别了用Foxp3-9-252-WT冲击过的刺激细胞，与Foxp3-9-252-9V冲击的相同的效果相同(图7D)。这些结果强烈显示，Foxp3-9-252-9V肽可以和Foxp3-9-252-WT肽同样地诱导Foxp3特异性CTL。抗原肽的同源性分析用下列肽的刺激CTL:FOXp3-A24-9-363(SEQIDNO3),FOXp3-A24國9-366(SEQIDNO7),FOXp3-A24-9-190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4),FOXp3-A24画9画332(SEQIDNO5),FOXp3_A24-9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10-114(SEQIDNO12)FOXp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，FOXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，FOXp3-A2-9-252(SEQIDNO17),FOXp3-A2-10-359(SEQIDNO22),FOXp3-A2-10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2-10-94(SEQIDNO27)，FOXp3-A2-10-233(SEQIDNO28),FOXp3-A2-10-152(SEQIDNO29)，FOXp3-A2-10-77(SEQIDNO30)，FOXp3-A2-10-246(SEQIDNO37),FOXp3-A2-9-68(SEQIDNO18)，FOXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDN074)显示了显著而特异的CTL活性。这可能意味着，如下的序列FOXp3-A24-9-363(SEQIDNO3)，FOXp3-A24-9-366(SEQIDNO7),FOXp3-A24-9-190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4),FOXp3-A24-9-332(SEQIDNO5)，FOXp3-A24画9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10画114(SEQIDNO12)，FOXp3-A2-9-390(SEQIDNO15),FOXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，FOXp3-A2画9-252(SEQIDNO17),FOXp3-A2-10-359(SEQIDNO22),FOXp3-A2画10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2-10-94(SEQIDNO27),FOXp3-A2-l0-233(SEQIDNO28)，FOXp3-A2-10-152(SEQIDNO29),FOXp3-A2-10-77(SEQIDNO30),FOXp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，FOXp3-A2-9-68(SEQIDNO18)，FOXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)与其他已知可以敏化人免疫系统的分子的衍生肽同源。为了排除这一可能性，以这些肽序列作为检索子(queries)42使用BLAST算法(http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行同源性分析，结果显示没有具有显著同源性的序列。这些结果表明，如下序列FOXp3画A24-9-363(SEQIDNO3),FOXp3-A24-9-366(SEQIDNO7),FOXp3画A24-9画190(SEQIDNO9),FOXp3-A24-9-207(SEQIDNO4)，FOXp3-A24-9-332(SEQIDNO5),FOXp3-A24-9-337(SEQIDNO8),FOXp3-A24-10-114(SEQIDNO12),FOXp3-A2-9-390(SEQIDNO15)，FOXp3-A2-9-69(SEQIDNO16)，FOXp3-A2隱9画252(SEQIDNO17),FOXp3画A2-10画359(SEQIDNO22),FOXp3-A2-10-263(SEQIDNO24),FOXp3-A2画10-94(SEQIDNO27),FOXp3画A2-10-233(SEQIDNO28),FOXp3-A2-10-152(SEQIDNO29),FOXp3-A2画10陽77(SEQIDNO30),FOXp3-A2-10-246(SEQIDNO37)，FOXp3-A2-9-68(SEQIDNO18),FOXp3-A2-9-304(SEQIDNO19)Foxp3-A24-10-87(SEQIDNO67)和Foxp3-A24-10-60(SEQIDNO74)是独特的，据我们所知，它们引起针对任何非相关分子的不希望的免疫应答的可能性微乎其微。综上所述，Foxp3是一种对于靶向T-reg细胞有用的抗原，使用这些表位肽的疫苗对于免疫治疗可能是有用的。讨论从图6的数据，用每种hFoxp3-252和mFoxp3-252肽进行接种可以在体内诱导表位特异性的CTL。这表明这两种Foxp3表位肽均可诱导针对表达Foxp3和相应主要组织相容性复合物分子的靶细胞的CTL。换言之，我们认为这些CTL可能能够识别调节性T淋巴细胞(T-regs)。为了评价这一假说，利用BALB/c小鼠检查了用这些Foxp3表位肽进行接种的体内抗肿瘤效应。在分别用hFoxp3-252和mFoxp3-252肽接种的小鼠体内显示出明显的抗肿瘤效应。这些结果强烈暗示，通过阻遏T-regs进入局部肿瘤^:环境可以抑制肿瘤生长，甚至不需要用任何TAA表位肽进行疫苗接种。本发明人认为，当体内存在肿瘤时会诱导出针对肺瘤细胞的CTL，然而，来自肿瘤细胞的一些免疫抑制因子也会"i秀导T-reg,T-reg抑制抗肿瘤效应细^^的功能。用Foxp3表位肽进行接种可以通过杀死或抑制T-reg而消除免疫抑制状肽，所以在没有用TAA表位肽进行接种或者用强佐剂对整个免疫系统进行刺激的情况下，显示出了抗肿瘤效应。另夕卜，在图5和图6中，与mFoxp3-252肽(KLGAMQAHL)(SEQIDNO88)相比，hFoxp3-252肽(KLSAMQAHL)(SEQIDNO17)的接种可以诱导更高的CTL和抗肿瘤效应。根据这些结果可以认为，与mFoxp3-252肽的接种相比，hFoxp3-252肽的接种可能有效避免了免疫耐受。换言之，因为hFoxp3-252的氨基酸序列与mFoxp3-252在第3位不同，所以hFoxp3-252肽在体内被看作"非自身抗原"，从而能有效地诱导针对T-reg的CTL。综上所述，表明Foxp3可以作为癌症免疫治疗的新靶标。而且，这些结果强烈支持这样的结论，即使用Foxp3表位肽进行接种可以抑制T-reg的功能，而且应当可用于多种类型癌细胞的癌症免疫治疗。权利要求1.一种肽，其由SEQIDNO3-5、7-9、12、15-19、22、24、27-30、37、67或74的氨基酸序列组成。2.—种具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQIDNO:3-5、7隱9、12、17、67或74，和(b)SEQIDNO:3-5、7-9、12、17、67或74，其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。3.权利要求2的肽，其中自N端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸。4.权利要求2或3的肽，其中C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。5.—种具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQIDNO:15-19、22、24、27-30或37，和(b)SEQIDNO:15-19、22、24、27-30或37,其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。6.权利要求5的肽，其中自N端起第二个氨基酸是亮氨酸或曱硫氨酸。7.权利要求5或6的肽，其中C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。8.权利要求2或5的肽，其中被替换的肽包含SEQIDNO:95、97或98的氨基酸序列。9.用于调节T-reg细胞的药剂，其包含权利要求1-7中任一项的一种或多种肽，或编码所述肽的多核苷酸。10.权利要求9的药剂，其意图用于抑制T-reg细胞的增殖。11.权利要求9的药剂，其意图施用于HLA抗原为HLA-A24的受试者。12.权利要求9的药剂，其意图施用于HLA抗原为HLA-A02的受试者。13.权利要求9的药剂，其意图用于抑制T-reg细胞的功能。14.权利要求9的药剂，其意图用于治疗癌症。15.权利要求14的药剂，其是疫苗。16.权利要求15的药剂，其除了包含权利要求2、5的肽或编码该肽的多核苷酸之外，还包含具有诱导针对癌性细胞的细胞毒T细胞的能力的其它肽，或者编码所述其它肽的其它多核苦酸。17.—种外来体，所述外来体在其表面上呈递包含HLA抗原和权利要求2或5的肽的复合物。18.权利要求14的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A24。19.权利要求14的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。20.权利要求14的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A02。21.权利要求14的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。22.通过施用权利要求2、5的肽或编码该肽的多核苷酸来诱导具有高的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法。23.通过施用权利要求2、5的肽或编码该肽的多核苷酸来诱导细胞毒T细^^的方法。24.—种诱导权利要求19的具有高细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其中该方法包括向抗原呈递细胞转移包含编码权利要求2或5的肽的多核苷酸的基因。25.—种分离的细胞毒T细胞，其是被权利要求2的肽诱导的。26.—种抗原呈递细胞，其包含HLA抗原与权利要求2或5的肽之间形成的复合物。27.权利要求25的抗原呈递细胞，其是通过权利要求21的方法诱导的。28.—种调节受试者体内T-reg细胞的方法，包括向所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含权利要求2的肽或该肽的免疫活性片段，或编码该肽的多核苷酸。全文摘要本发明提供了Foxp3肽，其包含SEQIDNO3-5，7-9，12，15-19，22，24，27-30，37，67或74的氨基酸序列，并提供了如下的Foxp3肽，其包含上述的氨基酸序列并且其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸，并具有细胞毒T细胞诱导能力(inducibility)，本发明还提供了包含这些Foxp3肽的用于调控调节T细胞的药物。本发明的Foxp3肽可以用作疫苗。文档编号C07K7/06GK101641369SQ20078005197公开日2010年2月3日申请日期2007年12月26日优先权日2007年1月3日发明者大泽龙司,角田卓也申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司