专利名称：一种整体柱及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种整体分离介质的制备方法，特别是一种整体柱及其制备方法与 应用。
背景技术：
随着蛋白组学的发展，对分离科学快速、高效、高通量的要求越来越高。仅就 高效液相色谱在分离科学研究中的应用而言，人们已在硬件(高压输液泵、色谱柱、 检测器)和软件(数据采集系统和处理软件)方面进行了相应的改进。其中色谱分 离的核心部分是色谱柱，传统的填充柱在柱效与通量之间无法取得平衡，也就是提 高柱效的同时柱背压也随之增加，无法满足快速、高效、高通量分离的要求。在这 种背景下，整体住应运而生(又被称为连续床)，整体柱柱体本身具有相互贯通的 微米级通孔，因此具有良好的通透性；并且，因整体柱体表面残留的基团容易进行 化学修饰等特点，故自上世纪九十年代初诞生以来，目前整体柱已能适用于各种分
离模式。如反相色谱、正相色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱等模式。
目前制备整体柱的方法多采用普通自由基原位聚合的方法，此方法取材广泛， 制备过程简单。但由于普通自由基聚合本身的反应机理，如反应速度快、分子量不 可控、易发生链转移等，而使制备的柱体结构多为颗粒堆积的结构，这种结构的柱 体存在许多缺点如结构不均一、孔径不易精确控制、机械性能差等。为了克服这
些缺点，人们采用逐步縮聚(Macromolecules， 2005， 38， 9901-9卯3)和氮氧自由 基调节聚合(AdvancedMaterials, 2006， 18， 2407-2411)的方法制备出了具有三维 连续骨架结构的整体柱。但是，这两种方法仍存在着一些局限性，如逐步縮聚方法 选材范围较窄；氮氧自由基调节聚合所需温度较高(〉100°C)，操作不方便等。
发明内容
本发明的目的是提供一种整体柱及其制备方法与应用。 本发明提供的制备整体柱的方法，包括如下步骤
1) 将聚合单体、致孔剂、引发剂和催化剂混合，除氧后加入催化剂配体，于色 谱柱管中密封，发生活性自由基聚合反应，反应完毕后将所述色谱柱管与高压输液 泵连接去除致孔剂等可溶物，得到具有三维连续骨架结构的整体柱；
2) 将功能单体的有机溶液、催化剂、催化剂配体和抗氧化剂的混合物注入到所 述步骤l)得到的整体柱中，发生活性自由基聚合反应，反应完毕得到所述整体柱。
4该方法的步骤l)中，聚合单体为具有双乙烯基的丙烯酸酯类及苯乙烯类单体;
优选的，所述丙烯酸酯类单体为甲基丙烯酸乙二醇酯；所述苯乙烯类单体为二乙烯 基苯。致孔剂为有机溶剂混合物，优选的所述致孔剂为甲醇与正己垸的混合物或甲 苯与十二醇的混合物。引发剂为卣代酯类，优选的所述引发剂为溴代丙酸乙酯(BPE) 和氯代丙酸乙酯(CPE)。催化剂为卤化物，优选的所述卤化物为溴化亚铜和氯化 亚铜。催化剂配体为多胺类和联吡啶类，优选的，所述多胺类催化剂配体为五甲基 二亚乙基三胺(PDMETA);所述联吡啶类催化剂配体为2， 2-联吡啶(BPY)。
引发剂的摩尔用量为所述聚合单体的1.0%-20.0%，优选16.0%;所述催化剂与 催化剂配体的摩尔用量为1-3:1-3，优选1:1;致孔剂中，甲醇与正己垸的体积比为 1-3:1-3;甲苯与十二醇的体积比为1-3:1-3。
步骤2)中，所述功能单体为丙烯酸酯类，优选的所述丙烯酸酯类为甲基丙烯 酸正丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸十二酯；所述功能单体 的有机溶液中，有机溶剂为甲醇、正己垸或四氢呋喃；催化剂为CuBr2或CuCl2，催 化剂配体为五甲基二亚乙基三胺(PDMETA)或2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为 抗坏血酸或辛酸亚锡(简称Sn (II))。功能单体的有机溶液、催化剂、催化剂配 体和抗氧化剂的摩尔用量比为50-100:1-2:1-2:1-5，优选70:1:1:4。
上述步骤1)中，反应温度为室温，可为5-25°C;反应时间为10-100 h，优选 24 h。步骤2)中，反应温度为室温，可为5-25"C;反应时间为4-20h，优选14h。
另外，步骤l)中，在将所述色谱柱管与高压输液泵连接后，还进行如下处理 用有机溶剂冲洗色谱柱管与高压输液泵；步骤2)中，在反应完毕后，还进行如下处 理用有机溶剂冲洗所述整体柱。所用有机溶剂均为甲醇、正己烷或四氢呋喃。
另外，利用上述方法制备得到的整体柱及该整体柱在制备用于分离类固醇类激 素药物(包括氢化可的松、睾酮、黄体酮)或蛋白质整体柱中的应用，也属于本发 明的保护范围。
活性原子转移自由基聚合法(简称ATRP)，是上世纪九十年代出现的一种活 性/可控自由基聚合技术，具有取材广泛、反应条件温和、可控能力强等特点，广泛 地应用于功能高分子合成、材料制备、表面修饰等方面。本发明正是采用ATRP的 可控性来实现制备具有三维连续骨架结构的整体柱。
本发明提供的制备具有三维连续骨架结构的整体柱的方法，可在室温下聚合， 大大改善了柱体由于聚合温度高造成的柱体结构不均一以及体积收縮等问题，制备 过程简单、易操作、制备方法重现性好。制备所得整体柱具有三维连续骨架结构， 与传统的普通自由基制备的颗粒堆积的整体柱的结构有明显的不同，可适用于分离类固醇类激素药物(包括氢化可的松、睾酮、黄体酮)或蛋白质等生物大分子。
图1为ATRP制备柱体材料内部形貌扫描电镜显微图 图2为普通自由基制备柱体材料内部形貌扫描电镜显微图 图3反相模式下分离类固醇类药物混合物的色谱图 图4反相模式下分离蛋白质混合物的色谱图
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明提供的制备整体柱的方法，所用聚合物整体分离介质是由双乙烯基聚合 单体甲基丙烯酸乙二醇酯和二乙烯基苯聚合而成，该聚合体系还包括由甲醇与正己
垸两种有机物组成的复合致孔剂和由甲苯与十二醇组成的复合致孔剂、引发剂、催 化剂及催化剂配体。
该方法的具体步骤如下
1) 整体柱的合成
将上述各物质混匀后的反应液注入模具中，如50X4.6 mm i.d.， 100X4.6 mm i.d.
不锈钢色谱柱管，在室温下反应足够的时间，然后连接在高压输液泵上用有机溶剂 冲洗柱体中的致孔剂及其他可溶物；
2) 整体柱的修饰
将功能单体丙烯酸酯类单体溶于甲醇与正己烷的混合溶剂或四氢呋喃溶剂中， 除氧后，再依次加入催化剂、催化剂配体、抗氧化剂，超声混匀；用注射泵将上述 混匀后的反应液注入待修饰的色谱柱中，在室温下连续反应；
将修饰完后的柱体仍用注射泵注入有机溶剂进行冲洗，去除柱体中未反应的可 溶物，待冲洗完毕后测试其色谱性能。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1 试剂及溶剂
聚合单体为甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA);致孔剂为甲醇和正己烷；引发剂为溴 代丙酸乙酯(BPE);催化剂为CuBr和CuBr2;多胺为五甲基二亚乙基三胺 (PDMETA)，联吡啶为2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为抗坏血酸(维生素C， Vc)，修饰的功能单体为甲基丙烯酸正丁酯。
柱体制备过程
第一步、柱体合成EDMA0.50mL (2.64 mM) ， 0.50 mL甲醇，0.50 mL正己烷，0.050 mL (0.39 mM)BPE， 0.056 g (0.39 mM)CuBr， 0.080 mL (0.39 mM) PDMETA混合在一起，超 声混匀后注入不锈钢色谱柱管中，室温反应24h后，柱管两端安装上色谱柱柱头， 然后连接于高压输液泵上，先以100mL四氢呋喃(THF)冲洗色谱柱，然后再以50 mL 甲醇与正己烷(1:1, v/v)混合溶剂冲洗，完毕后进行ATRP表面引发接枝聚合乙烯 基单体。
第二步、柱体修饰
接枝反应液配比为68 mg (0.39 mM) CuBr2， 87 mg (0.39 mM) PMDETA，甲醇与 正己烷(1:1, v/v) 50.0 mL，甲基丙烯酸正丁酯3.88 g (27.3 mM) ， Vc 0.27 g (1.56 mM)，超声混匀后，用注射泵以3.0mL/h流速注入色谱柱中在室温下反应14h。接 枝聚合完毕后，以50mL甲醇与正己垸(1:1， Wv)混合溶剂做冲洗液冲洗柱体后备 用。
用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，所得结果如图 l所示，从SEM照片上可以看出，材料具有微米级的通孔和1-3微米的三维连续骨架。
在其它条件相同的情况下，以普通自由基聚合引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)代 替ATRP引发剂BPE，在6(TC水浴中反应24h，除去致孔剂后得到的柱体的内部结 构图如图2所示，可以看出柱体的骨架由大量堆积的球形颗粒形成。经对比图l和 图2，可以看出利用本发明提供的制备方法得到的整体柱与用普通自由基聚合法制备 出的整体柱，具有明显不同的内部结构。
利用接枝后的柱体分离了三种具有不同疏水性的类固醇类药物混合物，其色谱 分离谱图如图3所示，按照出峰顺序依次为1、氢化可的松；2、睾酮；3、黄体酮。 其色谱条件为流动相为50%甲醇水溶液，流速为lmL/min，检测波长为254nm。
另外，利用接枝修饰后的柱体分离了两种蛋白混合物，其色谱分离谱图如图4
所示，按照出峰顺序依次为1、核糖核酸酶A; 2、卵清蛋白。其色谱条件为流
动相为60%乙腈+0.1%三氟乙酸水溶液，流速为lmL/min,检测波长为280nm。
实施例2 试剂及溶剂
聚合单体为甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA);致孔剂为甲醇和正己烷；引发剂为溴 代丙酸乙酯(BPE);催化剂为CuBr和CuBr2;多胺为五甲基二亚乙基三胺 (PDMETA)，联吡啶为2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为抗坏血酸(维生素C，Vc)，修饰功能单体为甲基丙烯酸乙酯。 柱体制备过程-第一步、柱体合成
该步骤与实施例1的第一步完全相同。 第二步、柱体修饰
接枝反应液配比为68mg(0.39mM)CuBr2， 87 mg (0.39 mM)PMDETA，甲醇与 正己垸O:l， v/v)50.0mL，甲基丙烯酸乙酯3.12 g (27.3 mM) ， Vc 0.27 g (1.56 mM)， 超声混匀后，用注射泵以3.0mL/h流速注入色谱柱中在室温下反应14h。接枝聚合 完毕后，以50mL甲醇与正己垸(1:1， Wv)混合溶剂做冲洗液冲洗柱体后备用。
用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知材料 具有微米级的通孔和1-3微米的三维连续骨架。
利用接枝后的柱体同样可以分离上述实施例1种所述的三种具有不同疏水性的 类固醇类药物混合物和两种蛋白的混合物，其分离条件亦同。
实施例3 试剂及溶剂
聚合单体为二乙烯基苯(DVB);致孔剂为甲苯和十二醇；引发剂为溴代丙酸乙 酯(BPE);催化剂为CuBr和CuBr2;多胺为五甲基二亚乙基三胺(PDMETA)， 联吡啶为2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为抗坏血酸(维生素C， Vc)，修饰的功 能单体为甲基丙烯酸正丁酯。
柱体制备过程 第一步、柱体合成
0.50 mL (8.56 mM)DVB， 0.50 mL甲苯，0.50 mL十二醇，0.068 mL(0.53 mM) BPE， 0.077 g (0.53 mM) CuBr， 0.111 mL (0.53 mM) PDMETA混合在一起，超声混 匀后注入不锈钢色谱柱管中，室温反应24h后，柱管两端安装上色谱柱柱头，然后 连接于高压输液泵上，先以100mL四氢呋喃(THF)冲洗色谱柱，然后再以50mL甲 醇与正己垸(1:1， v/v)混合溶剂冲洗，完毕后进行ATRP表面引发接枝聚合乙烯基 单体。
第二步、柱体修饰
接枝反应液配比为68 mg (0.39 mM) CuBr2， 87 mg (0.39 mM) PMDETA，甲醇与 正己烷(1:1， v/v) 50.0 mL，甲基丙烯酸正丁酯3.88 g (27.3 mM) ， Vc 0.27 g (1.56 mM)，超声混匀后，用注射泵以3.0mL/h流速注入色谱柱中在室温下反应14h。接枝聚合完毕后，以50mL甲醇与正己烷(1:1， v/v)混合溶剂做冲洗液冲洗柱体后备 用。
用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知材料 具有微米级的通孔和1-2.5微米的三维连续骨架。
利用接枝后的柱体同样可以分离上述实施例1种所述的三种具有不同疏水性的 类固醇类药物混合物和两种蛋白的混合物，其分离条件亦同。
实施例4 试剂及溶剂
聚合单体为二乙烯基苯(DVB);致孔剂为甲苯和十二醇；引发剂为氯代丙酸乙
酯(CPE);催化剂为CuCl和CuCl2;多胺为五甲基二亚乙基三胺(PDMETA)， 联吡啶为2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为抗坏血酸(维生素C， Vc)，修饰的功 能单体为甲基丙烯酸正丁酯。
柱体制备过程
第一步、柱体合成
DVB 0.50 mL (8.56 mM)， 0.50 mL甲苯，0.50 mL十二醇，0.067 mL (0.53 mM) CPE， 0.053 g (0.53 mM) CuCl， 0.111 mL (0.53 mM) PDMETA混合在一起，超声混 匀后注入不锈钢色谱柱管中，室温反应24h后，柱管两端安装上色谱柱柱头，然后 连接于高压输液泵上，先以100 mL四氢呋喃(THF)冲洗色谱柱，然后再以50 mL甲 醇与正己烷(1:1， v/v)混合溶剂冲洗，完毕后进行ATRP表面引发接枝聚合乙烯基 单体。
第二步、柱体修饰
接枝反应液配比为52 mg (0.39 mM) CuCl2， 87 mg (0.39 mM) PMDETA，甲醇与 正己烷(1:1， v/v) 50.0 mL，甲基丙烯酸正丁酯3.88 g (27.3 mM) ， Vc 0.27 g (1.56 mM)，超声混匀后，用注射泵以3.0mL/h流速注入色谱柱中在室温下反应14h。接 枝聚合完毕后，以50mL甲醇与正己烷(1:1, v/v)混合溶剂做冲洗液冲洗柱体后备 用。
用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知材料 具有微米级的通孔和1-3微米的三维连续骨架。
利用接枝后的柱体同样可以分离上述实施例1种所述的三种具有不同疏水性的 类固醇类药物混合物和两种蛋白的混合物，其分离条件亦同。实施例5 试剂及溶剂-
聚合单体为二乙烯基苯(DVB);致孔剂为甲苯和十二醇；引发剂为氯代丙酸乙
酯(CPE);催化剂为CuCl和CuCl2;多胺为五甲基二亚乙基三胺(PDMETA)， 联吡啶为2， 2-联吡啶(BPY)，抗氧化剂为辛酸亚锡(Sn(II))，修饰的功能单体 为甲基丙烯酸正丁酯。
柱体制备过程
第一步、柱体合成
该步骤与实施例4的第一步完全相同。 第二步、柱体修饰
接枝反应液配比为52 mg (0.39 mM) CuCl2， 87 mg (0.39 mM) PMDETA，甲醇与 正己烷(1:1 ， v/v) 50.0 mL，甲基丙烯酸正丁酯3.88 g (27.3 mM) ， Sn(II) 0.63 g (1.56 mM)，超声混勻后，用注射泵以3.0mL/h流速注入色谱柱中在室温下反应14h。接 枝聚合完毕后，以50mL甲醇与正己烷(1:1， v/v)混合溶剂做冲洗液冲洗柱体后备 用。
用扫描电子显微镜观察上述制备得到的整体柱的柱体微观形貌，可以得知材料 具有微米级的通孔和1-3微米的三维连续骨架。
利用接枝后的柱体分离了同样可以分离上述实施例1中所述的类固醇类药物混 合物以及蛋白混合物，其分离条件亦同。
由上述实验结构可知，利用本发明提供的方法制备得到的整体柱，具有三维连 续骨架结构，并可在室温下聚合，大大改善了柱体由于聚合温度高造成的柱体结构 不均一以及体积收縮等问题。
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权利要求
1、一种制备整体柱的方法，包括如下步骤1)将聚合单体、致孔剂、引发剂和催化剂混合，除氧后加入催化剂配体，于色谱柱管中密封，发生活性原子转移自由基聚合反应，反应完毕后将所述色谱柱管与高压输液泵连接去除可溶物，得到具有三维连续骨架结构的整体柱；2)将功能单体的有机溶液、催化剂、催化剂配体和抗氧化剂的混合物注入到所述步骤1)得到的整体柱中，发生活性原子转移自由基聚合反应，反应完毕得到所述整体柱。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中，聚合单体为甲基 丙烯酸乙二醇酯或二乙烯基苯，致孔剂为甲醇与正己垸的混合物或甲苯与十二醇的混 合物，引发剂为溴代丙酸乙酯或氯代丙酸乙酯，催化剂为溴化亚铜或氯化亚铜，催化 剂配体为五甲基二亚乙基三胺或2， 2-联吡啶；所述步骤2)中，所述功能单体为甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙 烯酸乙酯或甲基丙烯酸十二酯，功能单体的有机溶液中，有机溶剂为甲醇、正己烷或 四氢呋喃中的任意一种或任意几种以任意比例混合的混合物；催化剂为CuB&或 CuCl2，催化剂配体为五甲基二亚乙基三胺或2， 2-联吡啶，抗氧化剂为抗坏血酸或辛 酸亚锡。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤l)中，引发剂的摩尔用量为所述聚合单体的1.0%-20.0%，优选10%-20%，更优选16.0%; 所述催化剂与催化剂配体的摩尔用量为1-3:1-3，优选l:l;所述甲醇与正己烷的混合物或甲苯与十二醇的混合物中，甲醇与正己垸或甲苯与十二醇的体积比为1-3: 1-3;所述致孔剂与所述聚合单体的体积比为1-3: 1-3;所述步骤2)中，功能单体的有机溶液、催化剂、催化剂配体和抗氧化剂的摩尔 用量比为50-100:1-2:1-2:1-5，优选70:1:1:4。
4、 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步骤l)和步骤2)中， 反应温度均为室温，反应时间分别为10-100小时和4-20小时，分别优选为24小时和 14小时。
5、 根据权利要求l-4任一所述的方法，其特征在于所述步骤l)中，在将所述 色谱柱管与高压输液泵连接后，还进行如下处理用有机溶剂冲洗色谱柱管与高压输液泵； 所述步骤2)中，在反应完毕后，还进行如下处理用有机溶剂冲洗所述整体柱。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇、正己垸或 四氢呋喃中的任意一种或任意几种以任意比例混合的混合物。
7、 权利要求l-6任一所述方法制备得到的整体柱。
8、 根据权利要求7所述的整体柱，其特征在于所述整体柱为三维连续骨架结构。
9、 权利要求7所述整体柱在制备用于分离类固醇类激素药物或蛋白质整体柱中的应用。
10、 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述类固醇类激素药物为氢化可的松、睾酮或黄体酮。
全文摘要
本发明公开一种整体柱及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤1)将聚合单体、致孔剂、引发剂和溴化亚铜混合，除氧后加入催化剂配体，于色谱柱管中密封反应，反应完毕后将所述色谱柱管与高压输液泵连接，用有机溶剂冲洗去除致孔剂等可溶物，得到具有三维连续骨架结构的整体柱；2)将功能单体的有机溶液、催化剂、催化剂配体和抗氧化剂的混合物注入到上述整体柱中，柱体表面残留的基团溴引发乙烯基单体进行表面接枝聚合反应。该方法可在室温下聚合，大大改善了柱体由于聚合温度高造成的柱体结构不均一以及体积收缩等问题，所得整体柱与传统整体柱的结构明显不同，适用于分离类固醇类激素药物或蛋白质等生物大分子。
文档编号C07K1/00GK101537344SQ200910082659
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者娟 乔, 姚春荷, 张荣月, 辛培勇, 魏晓奕, 莉 齐 申请人:中国科学院化学研究所