专利名称：一种人mgf多肽及其抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种特异的人MGF多肽及其抗体制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
1999年，Goldspink等将兔子的胫前肌置于伸展固定状态后对其进行电剌激，7天后发现肌肉块增大了 35%。釆用差异显示技术，在那些处于拉伸状态并被电刺激的的肌纤维中，发现了大量能促使肌肉修复的IGF-1剪接异构体，命名为Mechano GrowthFactor (MGF)。国内学者一般将其翻译为机械生长因子、力生长因子、生长因子素等。MGF在快速促进受损伤肌肉修复再生、增加肌肉干细胞数量、保护神经等方面具有重要的生理作用。
人MGF基因序列与来自肝脏的IGF-1相比，是在其mRNA的5号外显子上插入了49个碱基，由于插入的碱基不能被3整除，所以产生了不同于IGF-1的表达产物。与全身性表达和发挥广泛生理功能的IGF-1不同，MGF多在机体受到机械刺激或局部肌肉/神经遭到损伤时，才会在损伤发生部位表达并发挥高效的修复和保护功能。在体内，通过模式动物证实，MGF在维持局部肌肉质量和组织修复过程中的作用效果也明显高于IGF-1。把含有MGF cDNA的表达载体注入老鼠胫骨前肌，仅在15天内肌肉质量就可增加20%，而携带IGF-1Ea cDNA的病毒载体注入后，则需120天肌肉质量才达到同等水平。表明MGF是肌肉修复过程中一种重要的功能分子，与肌肉再生所必需物质的表达之间存在着密切的内在联系。通过制备肌肉切片并测定肌纤维尺寸，发现肌纤维整体平均增加25%,但这种增加只局限于受注射部位，表明MGF的生理功能既具有作用效果的显著性，也具有很强的靶位点特异性。另外，Olesen等ff究发现MGF还可诱导肌腱胶原蛋白的合成，在机械刺激后表达迅速上调的MGF与胶原蛋白III的mRNA合成速率正相关。另外，MGF还具有很强的神经保护作用。在蒙古沙鼠的短暂脑缺血模型中，Dluzniewska等通过注射MGF合成肽能够赋予沙鼠显著的神经保护作用；在抵抗脑部缺血的海马体内检测到了表达明显上调的MGF蛋白，而且这种作用是不依赖于IGF-1的受体而独立发挥。Goldspink等研究了 MGF对面神经切断术后的修复损伤作用，发现相距3毫米的神经创面仅在两周内就得到完全愈合，明显优于IGF-1 Ea和其他分子。数据显示，MGF对运动神经元的保护效果达到了80。/。以上。目前为止，未见介绍通过合成多肽进行抗人MGF多克隆抗体制备的文献报道。
发明内容
本发明是为解决通过免疫实验特异性检测人MGF的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针对人MGF的合成多肽抗体及其制备方法。
本发明所述的抗人MGF合成多肽抗体，按照以下步骤制备
抗原表位分析与拮抗位置确定利用经典的表位预测软件DNAstar进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原指数、表面可及性等，最终确定第76到第88位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为QRHTDMPKTQKYQ。
多肽的合成靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。
多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的免疫原性，从而制备出人工免疫原。
免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制
备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性词养后进行多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。
抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫
酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。
本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人MGF分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为人MGF分子的研究及其相关疾病的研究提供了一个重要工具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。
图1是DNASTAR软件分析图，表明本发明所选择的肽段位于该蛋白的抗原性和亲水性较强区段。
图2是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图，其中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为106-107L/mol。
具体实施方式
1、 人MGF抗原肽的合成
用DNAstar分析软件对人MGF氨基酸序列进行亲水性结构(Hydrophilicity)、抗原指数(Antigenicity)、表面可及性(Surface Probability)等分析以及同源性分析(Homology)，最终确定第76到第88位为靶标，其氨基酸序列为QRHTDMPKTQKYQ。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获得粗品。经30%乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定，由图1所示。.
2、 合成多肽与载体的偶联
载体蛋白选择KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用双功能试剂顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联取KLH 5mg (0.11|jmol，含赖氨酸2.2iJmo1),溶于0.75mL偶联缓冲液1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mgMBS (11|jmol)溶于75ijL二甲酷肢(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8 mL)加入预先用偶联缓冲液2 (0.1 mol/L磷酸盐，0.15 mol/L NaCL， 0.01 mol/LNa2EDTA，pH-7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5 mg合成多肽于0.15 mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56mL，室温下旋转混合，作用2小时后置4X过夜，将反应混合物(约0.7mL)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。
3、 抗多肽抗体的制备
取偶联的KLH-多肽500pg，溶于500 pL磷酸缓冲液，加等体积的完全福氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经过适应性词养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(250 pg)，加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫，方法同前。再2周后耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1 pg/mL)包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到1: 10万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。
4、 亲和层析纯化抗多肽抗体
①人MGF合成多肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化S印harose 4B，
用1 mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗2次，迅速与溶于5 mL偶联缓冲液的合成多肽500ijg混合，室温下旋转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50 mL磷酸盐缓冲液洗凝胶，按终止浓度0.02 %加叠氮钠(NaN3)，置4。C保存。
②亲和层析纯化抗多肽抗体将20 mL兔抗多肽血清与1.6 mL多肽偶联的S印harose4B共同加入50mL离心管，4。C旋转混合6小时。将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用15 mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8 mL pH=2.9， 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8支预先加入80 mL 2mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.5) ， 20mL磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4°C下完成。毎管取洗脱液2ijL，稀释50倍后测280nm的od值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。
5、抗体的鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数用合成肽交联BSA，分别以5 u g/mL和10 u g/mL的浓度，在4度下包被ELISA检测板过夜，10%的山羊血清室温封闭2小时后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗兔lgG二抗0.1mL， TMB显色测定A450。以抗
体浓度的对数为横坐标，以曲线达到水平时的A450值为100%，以其他相对于该浓度
的百分数为纵坐标作图，求出A5o即50。/。A值对应的抗体浓度。按照Kaff=(n-1)/2(n[Ab't-2[Ab]t)算出抗体相对亲和常数，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A50时即包被抗原分别为5 p g/mL和10u g/mL时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度，[Ag]t、 [Ag， ]t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10pg和5wg， n=[Ag]t/[Ag，t，本实验中n-2，如图2所示。试验效果
1. 多肽与载体的偶联效率SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回收率大致相符，大于90%。
2. 抗体效价多只家兔得到的抗血清效价均在1: 10万以上。
3. 抗体亲和力相对亲和常数为106-107L/mol。
4. 抗体的应用以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于蛋白印迹和各种酶免实验，以及建立相应体外免疫分析试剂。序列表
<110>北京科技大学
<120> —种人MGF多肽及其抗体制备方法 <160>2
<210> 1 <211> 110 <212> PRT <213>人
<400> 1
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSC DLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQQRHTDMPKTQKYQKGSTF EEHK
<210>2 <211> 13 <212> PRT <213>人
<400> 2
QRHTDMPKTQKYQ
权利要求
1、一种人MGF多肽及其抗体制备方法，其特征在于，利用经典的表位预测软件DNAstar进行综合分析，最终确定第76到第88位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为QRHTDMPKTQKYQ，再经多肽合成，多肽与载体蛋白交联，免疫动物，抗体纯化，得到目标抗体。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，多肽合成是将靶标多肽在全自 动多通道多肽合成仪中合成，采用柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1%的标 准乙晴梯度来检测纯度。
3、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，多肽与载体蛋白交联选择钥孔 嘁血蓝素进行交联。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，免疫动物是以抗原肽-交联载体 蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。
5、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，抗体纯化是将达到要求的免疫 动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方 法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度。
全文摘要
本发明公开了一种人MGF多肽及其抗体制备方法，涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品。本发明利用经典的表位预测软件DNAstar进行综合分析，确定抗原表位分析与拮抗位置，确定第76到第88位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为QRHTDMPKTQKYQ，经过多肽合成，多肽与载体蛋白交联，免疫家兔制备抗体和抗体纯化，得到目标抗体。本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人MGF分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。
文档编号C07K16/18GK101602794SQ200910083899
公开日2009年12月16日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者李传宝, 杜宏武, 爽 王, 金海明 申请人:北京科技大学