制备纽莫康定B₀的方法

专利名称：制备纽莫康定B₀的方法
技术领域：
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种制备卡帕芬净的前体纽莫康
定Bo的方法。
背景技术：
自20世纪70年代以来，在临床治疗过程中，真菌感染疾病和由于无法 控制真菌感染而造成的死亡率逐渐提高，这与广泛使用对人体免疫系统有 损害的药物和大量使用广谱抗菌药物有直接的关系。另外，与临床使用体 内植入物和像艾滋病这样的慢性免疫抑制病毒的感染有关。因此，研究开 发安全、新型和有效的抗真菌药物显得非常重要。众所周知，真菌细胞是 具有细胞壁的，哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，应将真菌的细胞壁作为 新型抗真菌药物的作用耙点。纽莫康定类即是作用于真菌细胞壁的药物。
纽莫康定(Pneumocandins) 是由Zalerion arboricola产生的一类天然 抗真菌药物，由于它对多种念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊虫均有 效,因而越来越受到人们的关注。其主要作用机理是能够非竞争性的抑制真 菌细胞壁中(3-l， 3葡聚糖合成酶的活性，进而引起真菌细胞壁的裂解以及 细胞内外渗透压的改变从而将真菌细胞彻底杀死。按照其结构中脯氨酸上 取代基的不同主要分为三大类Ao(32羟基242甲基脯氨酸)、B"32羟基脯 氨酸)和Co(42羟基脯氨酸)，此外，根据环状多肽上取代基的不同纽莫康定 Ao又可以分为Ao、 A,、 A2、 A3、 A4五小类，Bo又可以分为B。、 Bs两小类。 其中纽莫康定B。的衍生物已经在临床上得到应用，商品名为卡帕芬净。
国内对于纽莫康定Bo制备工艺的研究几乎没有报道，国外主要是默克 公司的科研人员对其进行过系统的研究，但在分离工艺方面尚未有成熟的 能够直接应用于大规模制备的方法。
发表于1992年6月15号的Ae7'0w"a/ 杂志上的一篇题 为敛^"^^^定/mm Za/eWo" aAon'co/a详细介绍了纽莫康定B。的分离提取
4工艺，此工艺运用多种分离手段对其进行纯化，并最终用结晶的方法制备 纽莫康定Bo。
此工艺的大致流程如下
a用1.5倍甲醇浸泡发酵液，高速离心后取菌丝体，再用两倍体积的 甲醇泡，继续离心后用80。/o的甲醇浸泡纽莫康定B();
b选用HP-207树脂，用40%-50%的甲醇上柱，先用65: 35的甲醇水
洗柱子，再用100Q/。的甲醇将纽莫康定B。洗下来；
c在25度时，纽莫康定Bo溶液中缓慢加入醋酸异丙酯沉淀，在通过
过滤和离心蒸干后纯度为67°/。，收率为84%;
d硅胶层析，用85: 10: 5的EtOAC-MEOH-5。/。AcOH洗柱子，收集
后在用50%的甲醇水溶解上HP-20，先用50%洗，再用100%的甲醇水冲
洗，50%的回收再用；
e加已腈沉淀纽莫康定Bo，再过滤，最终纯度为85%，含有部分色素； f在正丙醇中，50mg/ml浓度，60度加热，加水后冷却到室温结晶。 此工艺的主要缺点是分离步骤烦琐，且上游发酵液中的色素很难彻底
除去，最大的缺点是很多步骤难以实现大规模的工业化生产，如硅胶层析。

发明内容
为解决现有技术中制备纽莫康定Bo的工艺难以除去发酵液中的色素， 且整个流程较为繁琐的技术问题，本发明提供一种制备纽莫康定Bo的简 单方法，该方法不仅能够很好的去除纽莫康定Bo中的色素，且能将其纯 度提高到96%以上。
因此，本发明提供一种制备纽莫康定Bo的方法，该方法包括下列步骤
a) 离心纽莫康定B。的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中 纽莫康定B。，过滤除去菌丝体；
b) 将纽莫康定Bo第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡， 过滤除去不溶物；
c) 将纽莫康定B。第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性 氧化铝柱，收集流出液；
d) 将纽莫康定B。收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；
e) 将纽莫康定Bo收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一
种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；
f) 将纽莫康定B。收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过 饱和后结晶析出，制得纽莫康定Bo。
本发明方法中的第一种溶剂可以选自甲醇或乙醇，优选为甲醇；第二 种溶剂为正丁醇。
本发明方法中用草酸将a)步骤中纽莫康定Bo发酵液的pH值调至2 4， 优选pH值调至3。
本发明方法a)步骤中第一种溶剂和b)步骤中第二种溶剂所用的体积优
选为菌丝体的1.5 2.5倍，优选1.5倍。
本发明方法a)步骤和b)步骤中的第一种溶剂的浓度优选大于900/。。 本发明方法b)步骤中的第二种溶剂的浓度优选为100。/。。 本发明方法0步骤中的第一种溶剂的浓度为70%~80%，优选浓度为
75%。
本发明方法(1)步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60%~70%，优选浓 度为65%，洗脱时第一种溶剂浓度为85%~95%，优选浓度为90%。
本发明方法e)步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60。/。 70。/。，优选浓 度为65%，洗脱时第一种溶剂浓度为85%~95%，优选浓度为90%。
本发明方法d)步骤中的洗脱液为纯度大于50Q/。的部分；e)步骤中的洗脱 液为纯度大于90%的部分。
本发明方法d)步骤中的吸附树脂优选为HP20树脂。
优选地，本发明方法e)步骤中的反相树脂优选为YPR-II树脂。
本申请人通过对比例证明，本发明方法的c)步骤能明显去除溶液中的 色素，使得纽莫康定B。溶液的颜色由红棕色变为无色，如果没有这一步， 最终的成品会有部分色素。
而在d)步骤中，由于所述的吸附树脂对极性较大的物质没有吸附作 用，因此可以将溶液中的极性杂质去掉，使得纽莫康定B。的液相纯度得 以提咼°
本发明的e)步骤能够将氧化铝没有完全去除的杂质深深地吸附在树脂上不下来，且能够去除HPLC上保留时间在纽莫康定Bo附近的杂质，因 此其纯度有很大的提高。另外，由于此树脂对纽莫康定B。有很好的富集 作用，洗脱时大量的纽莫康定B。被集中洗脱下来。
相对于现有技术，本发明的优点在于整个工艺流程简单，成本较低，
易于实现工业化生产。而且此工艺能够将发酵液中的色素和杂质基本去 除，使得目标产物的纯度达到理想的水平。
具体实施例方式
本发明纽莫康定B。HPLC检测条件如下 色谱柱ODS-C18(5p); 检测波长210nm ;
流动相水甲醇已腈(20: 70: 10);
流速0.800ml/min
柱温40°C。
本发明纽莫康定B。发酵条件如下
菌种ATCC 20957 斜面培养 培养基PDA 条件25°C， 10天
种子培养
培养基葡萄糖1.0%、甘露醇0.5%、甘油1.0%、棉籽粉2.5%、 KH2P04 0.5%，消前pH为6.8-7.0
条件25°C， 5天，摇床转速250rpm
发酵培养
培养基甘露醇8.0%、棉籽粉3.0%、酵母粉1.0%、 KH2PO40.5%， 消前pH7.0
12rC灭菌20min，接种量10%，摇瓶装量100ml/750ml，置于25。C恒 温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵9天后，得到纽莫康定B。发酵液。实施例1 3考察了发酵液pH对分离工艺的影响。
实施例1
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为8%，单位为683ug/ml，将发 酵液pH调为2.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用 1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸 干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B。，同样过滤除去其中的不溶物， 检测其纯度为14.7%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo 纯度为34.9%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B。完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为48.9%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中 纯度较高的部分，检测发现纯度为90.4%。最后再将纽莫康定B。蒸干用 甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为93.4%，以上 几步的总收率约为36%。
实施例2
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为13%，单位为596ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为16.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定Bo正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0
纯度为42.7%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定Bo完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为58.2%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中 纯度较高的部分，检测发现纯度为94%。最后再将纽莫康定B。蒸干用甲 醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为96.1%，以上几 步的总收率约为34%。
实施例3
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为13%，单位为596ug/ml，将 发酵液pH调为4.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B。，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B。，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为14.8%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定Bo正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo 纯度为39.4%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定Bo完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为54.7%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-n树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为89%。最后再将纽莫康定Bo蒸干用甲 醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.4%，以上几 步的总收率约为35%。
实施例4~6考察不同浓度配比的溶剂对树脂吸附洗脱的影响 实施例4:
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为595ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B。，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0 纯度为43.5%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于含30%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用含5%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱 液中纯度较高的部分，检测发现纯度为57.2%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含30%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定B。完全被吸附在柱上，再用含5%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集 洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为91.2%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为94.3 %，以上几步的总收率约为34%。
实施例5:最佳配比例
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为595ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶
物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定Bo正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0 纯度为43.5%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 B。完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱 液中纯度较高的部分，检测发现纯度为62.4%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定Bo完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.4%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.2 %，以上几步的总收率约为41%。
实施例6:
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为595ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B()，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo 纯度为43.5%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于含40%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 B。完全被吸附在柱上，再用含15。/。水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为57.3%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含40%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定Bo完全被吸附在柱上，再用含15%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为85.0%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为91.5 %，以上几步的总收率约为37%。
实施例7， 8， 9考察不同浓度配比的溶剂对氧化铝洗脱的影响 实施例7
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为11.9%，单位为623ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bc，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.2%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成70%的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍 柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo纯度 为47.2%，色素基本除去，此步收率约为70%。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱 液中纯度较高的部分，检测发现纯度为63.2%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定Bo完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.6。％。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.3 %，以上几步的总收率约为35%。
12实施例8
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为11.9%，单位为623ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.2%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成75%的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍 柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo纯度 为45.2%，色素基本除去，此步收率约为85%。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱 液中纯度较高的部分，检测发现纯度为61.3%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定Bq完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.2%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.1 %，以上几步的总收率约为40%。
实施例9
取纽莫康定Bo发酵液500ml，其纯度为11.9%，单位为623ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.2%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成80%的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍 柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B。纯度为42%，大部分色素被除去，此步收率约为90%。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱 液中纯度较高的部分，检测发现纯度为59.2%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含35%水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定B。完全被吸附在柱上，再用含10%水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为92.6%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为95.2 %，以上几步的总收率约为40%。
实施例10， 11， 12考察不同体积的溶剂浸泡菌丝体对分离工艺的影
响
实施例10
取纽莫康定Bo发酵液500ml，其纯度为12.8%，单位为664ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸 干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定Bo，同样过滤除去其中的不溶物， 检测其纯度为15.6%，收率为65%。
实施例11
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.8%，单位为664ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B。，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为14.9%，收率为85%。
实施例12
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.8%，单位为664ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸 干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定Bo，同样过滤除去其中的不溶物， 检测其纯度为16.0%，收率为90%。
结论用不同体积的甲醇和正丁醇浸泡发酵液对发酵液纯度的影响不 大，但对其收率影响很大，两倍体积的溶剂和一倍体积相比提高不是很多， 本着节约的原则，选用1.5倍。
实施例13考察乙醇作为第一种溶剂对分离工艺的影响
取纽莫康定Bo发酵液500ml，其纯度为12.7%，单位为596ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的乙醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将乙醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B。，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.2°/。。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定Bo正丁醇浸 取液蒸干后配成75%的乙醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍 柱体积同样配比的乙醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo纯度 为46.2%，色素基本除去，此步收率约为80%
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo蒸 干后溶解于含35%水的乙醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo没有完全被吸附在柱上，有10%左右的漏液，再用含10%水的乙醇溶液 洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为60.4%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于含35%水的乙醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫 康定Bq完全被吸附在柱上，再用含10%水的乙醇溶液洗脱柱子，分布收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为91.4%。最后再将纽莫康定 Bo蒸干用乙醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.1 %,以上几步的总收率约为40%。对比例1:考察步骤b)中不用正丁醇浸取对分离工艺的影响
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为9.3%，单位为667ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B。，过滤除去菌丝体，检测其纯 度为11.2%，且发酵液中含有很多水溶性的杂质。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定Bo甲醇溶液 蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍 柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo纯度 为30.1%，大部分色素除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定Bo完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为42.6%。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中 纯度较高的部分，检测发现纯度为87%。最后再将纽莫康定Bo蒸干用甲 醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.4%，以上几 步的总收率约为42%。
结论工艺中如果没有正丁醇浸泡这一步，发酵液中很多水溶性的杂 质难以除去，使得最终成品的纯度有所降低。
对比例2:考察缺少步骤c)对分离工艺的影响
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为586ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定Bo正 丁醇溶液蒸干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B。完全被吸附在柱上，再用9: l的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱
液中纯度较高的部分，检测发现纯度为42.2%，收集液中有少量色素，溶
液呈淡黄色。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定 Bo蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定 Bo完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中 纯度较高的部分，检测发现纯度为91%。收集液中含有少量色素。最后再 将纽莫康定Bo蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此 时纯度为94.6%，晶体含有少量色素。以上几步的总收率约为42%。
对比例3:考察缺少步骤d)对分离工艺的影响
取纽莫康定Bo发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为586ug/ml，将 发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0 纯度为42.7%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0 蒸干后溶解于3: 1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0 完全被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯 度较高的部分，检测发现纯度为61.8%。
最后再将纽莫康定B。蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后放入 结晶设备中，发现无法结晶，最终只能得到纯度为61.8%的白色无定形物。
对比例4:考察缺少步骤e)对分离工艺的影响
取纽莫康定B。发酵液500ml，其纯度为12.5%，单位为586ug/ml，将
发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体
17用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定Bo，过滤除去菌丝体，再将甲醇
蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定BQ，同样过滤除去其中的不溶 物，检测其纯度为15.9%。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B。正丁醇浸 取液蒸干后配成4: 1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用 两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定Bo 纯度为42.7%，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B。蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定Bo完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为58.2%。
最后再将纽莫康定B。蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后放入 结晶设备中，发现无法结晶，最终只能得到纯度为58.2%的白色无定形物。
附本发明所用树脂型号
1 DIAIONHP20
生产厂家日本三菱公司
比表面积(m2/g): 600 孔半径(A): >200 表观密度(g/L-R): 680 水含量(％): 55-65
2 YPRII
生产厂家安徽三星树脂科技有限公司 交换当量相对红霉素u/ml之8万 水份％: 45-55 粒度(0.315-1.25mm): ^95 机械强度％: 290
权利要求
1.制备纽莫康定B0的方法，该方法包括下列步骤a)离心纽莫康定B0的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中纽莫康定B0，过滤除去菌丝体；b)将纽莫康定B0第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；c)将纽莫康定B0第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性氧化铝柱，收集流出液；d)将纽莫康定B0收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；e)将纽莫康定B0收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；f)将纽莫康定B0收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得纽莫康定B0。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)步骤中所述第一种溶剂 选自甲醇或乙醇。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，a)步骤中所述第一种溶剂 为甲醇。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b)步骤中所述第二种溶 剂为正丁醇。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将a)步骤中纽莫康定Bo 发酵液的pH值调为2 4。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将a)步骤中纽莫康定Bo 发酵液的pH值调为3。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)步骤中第一种溶剂和b) 步骤中第二种溶剂所用的体积为菌丝体的1.5 2.5倍。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，a)步骤中第一种溶剂和b) 步骤中第二种溶剂所用的体积为菌丝体的1.5倍。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)步骤和b)步骤中的第一种溶剂的浓度为大于90%。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 的浓度为100%。
11. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于，的浓度为70% 80%。
12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于， 的浓度为75%。
13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 为溶剂的第 一 种溶剂的浓度为60% 70% 。
14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于， 为溶剂的第一种溶剂的浓度为65%。
15. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 为洗脱剂的第一种溶剂浓度为85%~95%。
16. 根据权利要求15所述的方法，其特征在于， 为洗脱剂的第一种溶剂浓度为90%。
17. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 度大于50%的部分。
18. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 度大于90%的部分。
19. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， HP20树脂。
20. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， YPR- II树脂。b) 步骤中的第二种溶剂c) 步骤中的第一种溶剂c) 步骤中的第一种溶剂d) 步骤和e)步骤中的作 d)步骤和e)步骤中的作 d)步骤和e)步骤中的作 d)步骤和e)步骤中的作d) 步骤中的洗脱液为纯e) 步骤中的洗脱液为纯d) 步骤中的吸附树脂为e) 步骤中的反相树脂为
全文摘要
本发明公开一种制备纽莫康定B₀的方法，该方法包括下列步骤a)离心纽莫康定B₀的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中纽莫康定B₀，过滤除去菌丝体；b)将纽莫康定B₀第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；c)将纽莫康定B₀第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性氧化铝柱，收集流出液；d)将纽莫康定B₀收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；e)将纽莫康定B₀收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；f)将纽莫康定B₀收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得纽莫康定B₀。本发明的制备纽莫康定B₀的方法不仅能够很好的去除色素，且能将其纯度提高到96％以上。
文档编号C07K7/56GK101659693SQ200910133118
公开日2010年3月3日 申请日期2009年4月1日 优先权日2008年8月27日
发明者刘笑芬, 亮 卢, 李继安, 林惠敏 申请人:上海医药工业研究院