专利名称：新的环阿尔廷型三萜皂苷及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及皂苷类化合物分离、制备和应用，具体涉及两个新 的环阿尔廷型三萜皂苷、制备方法及其在抗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
环阿尔廷类(9，19-cycl0artane)化合物为羊毛留烷型四环三萜类化合物。近 几十年来，发现了大量的环阿尔廷苷类。已分离得到的环阿尔廷类化合物主要来自植 物界，如豆科的紫云英属(Astragalus)、毛莨科的升麻属(Cimicifugeae)和唐松草属 (Thalictrum)、铁角蕨科的过山蕨属(Comptosorus)等。环阿尔廷类化合物是中药升麻和黄芪的主要成分。近年来的研究表明其有多方面 的药理活性。文献报道Astragalus oleifolius具有止汗、利尿的作用，并对肾炎、糖尿病、 白血病、子宫癌有疗效；Astragalus spinous在埃及的民间用来治疗高血压、白血病和子宫 癌；Mussaenda pubescens具有抗咽炎、急性肠胃炎、痢疾和引产的作用；有学者利用现代 药理手段证明了 Curculigo orchiodes禾口 Astragalus verrucosus的提取物分别具有免疫 增强作用和免疫调节作用；从Amberboa ramosa分离的环阿尔廷具有细胞毒活性；而有人 认为Astragalus的各种植物都具有细胞毒活性。总之，目前报道主要集中在富含环阿尔廷 单萜的植物总提取物活性研究上，而对单体化合物的研究较少，限制了这类成分在新药研 发中的应用。分离新的环阿尔廷型三萜皂苷，并充分的研究这类天然产物的药理活性，也是本 领域技术人员正在努力的方向。我们前期研究中发现铁角蕨科过山蕨属植物富含环阿尔 廷型三萜皂苷，综合利用多种分离和鉴定手段从过山蕨中分离制备、鉴定了新的环阿尔廷 三萜皂苷类化合物并检测其抗肿瘤活性和醛糖还原酶抑制活性，在现有技术中还未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供了两个新的环阿尔廷型三萜皂苷、制备方法及其应用。本发明提供了两个新的环阿尔廷型三萜皂苷，具有如下结构
4 本发明提供了新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，通过以下三种方法中任意一 种制备得到，方法一(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，减 压回收提取液至醇浓度低于5%，离心后取上清液；(2)上清液经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到 30% -90%醇洗脱部位；(3)步骤(2)所得醇洗物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙 醇一些有机溶剂或混合溶剂梯度洗脱；(4)上述步骤(3)中所得流分经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到新环阿尔廷型三萜皂苷1和2 ；方法二(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，减 压回收提取液至醇浓度低于5%，提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，收集得到 乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到 30% -90%醇洗脱流分；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一 些有机溶剂或混合溶剂梯度洗脱，得化合物2 ；(4)上述步骤(2)醇洗脱物，经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到化合物1 ；方法三(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50% -90%的乙醇或甲醇提取，减 压回收提取液至醇浓度低于5%，提取液用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，收集得到乙酸乙酯萃 取物和剩余水层；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水层经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度 洗脱，得到30% -90%醇洗脱流分；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有机溶剂或混合溶剂梯度洗脱，得化合物2 ；(4)上述步骤(2)醇洗脱物，经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/水，乙腈 /水或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到化合物1。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，所述方法一和方法二中的步 骤(2)的醇为乙醇，其梯度洗脱浓度为30% -90%。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，所述方法一中的步骤(3)为 醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为9 1 6 4的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙 醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯一些常规 有机溶剂，混合比例8 2 6 4的流分含有目标化合物。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，所述方法二和方法三中的步 骤(3)为乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为1 12 3 7的氯仿或二氯 甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙 酸乙酯一些常规有机溶剂，混合比例9 1 8 2的流分中得到化合物2。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，所述方法一中的步骤(4)为 步骤(3)洗脱流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水， 从甲醇/水混合溶剂比例为1 5 5 1、乙腈/水混合溶剂比例为1 10 5 1、甲 醇/乙腈/水混合溶剂比例为1 1 10 5 5 2的流分中得到化合物1和2。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，所述方法二和方法三中的步 骤(4)为步骤(2)中所得醇洗脱物经高效液相色谱分离，流动相为甲醇/水、乙腈/水或 甲醇/乙腈/7jC，从甲醇/水混合溶剂比例为1 5 5 1、乙腈/水混合溶剂比例为 1 10 5 1、甲醇/乙腈/水混合溶剂比例为1 1 10 5 5 2的流分中得到 化合物1。本发明提供的新的环阿尔廷型三萜皂苷化合物1和2有抗肿瘤和醛糖还原酶抑制 活性，可用于抗肿瘤和治疗糖尿病药物的开发和应用。
图1为实施例5的实验流程图。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例1(1)干燥过山蕨全草10kg经70%乙醇回流提取三次，每次2小时，减压回收提取 液至醇浓度低于3%，离心后取上清液；(2)上清液经HPD100大孔树脂柱色谱处理，依次用水和30 %乙醇、60 %乙醇和 90%乙醇梯度洗脱；(3)步骤(2)所得60%乙醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿甲醇10 1， 8 1,6 1,4 1,2 1 梯度洗脱；(4)上述步骤(3)中所得氯仿甲醇4 1流分经半制备HPLC色谱分离，以70% 甲醇/水为流动相洗脱，得到新化合物1 ；氯仿甲醇8 1流分经半制备HPLC色谱分离，以80%甲醇/水为流动相洗脱，得到新化合物2。实施例2 (1)干燥过山蕨地上部分以75%乙醇为溶剂，经闪式提取技术提取，减压回收提 取液至醇浓度低于5%，提取液分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂， 收集得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物经D101非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和70%乙醇、 90%乙醇梯度洗脱；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿丙酮8 1，6 1,4 1， 3 2梯度洗脱，氯仿丙酮6 1流分得化合物2;(4)上述步骤(2) 70%醇洗脱物，经制备型HPLC色谱分离，以40%乙腈/水为流动 相洗脱，得到化合物1。实施例3:(1)新鲜过山蕨全草经90%乙醇冷浸提取，低温减压回收提取液至醇浓度低于 5%，提取液分别用环己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，收集得到环己烷萃取物、氯仿萃 取物、乙酸乙酯萃取物；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水层经AB-8非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水、 20%乙醇、60%乙醇和90%乙醇梯度洗脱；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯甲醇20 1,15 1， 10 1,8 1,4 1梯度洗脱，10 1洗脱部分得化合物2;(4)上述步骤(2)60%醇洗脱物，经半制备型HPLC色谱分离，以65%甲醇/水洗 脱，得到化合物1。实施例4化合物1和2的体外抗肿瘤实验测试实验方法1.细胞的培养HL-60细胞株，Dul45细胞株，Colon205细胞株的培养条件均为RMPI 1640培养液， 10%胎牛血清，MCF-7细胞株的培养条件为低糖DMEM培养液10%胎牛血清，HepG2细胞株 的培养条件为高糖DMEM培养液10%胎牛血清，A549细胞株的培养条件为RMPI 1640培养 液，10%小牛血清。以上细胞株均培养于5% C02，37°C的培养箱中。2.药物的配制将所测定的环阿尔廷型三萜皂苷(1和2)配成浓度为50mmol/L的母液，储存 于-20 °C。细胞株使用无血清的RMPI 1640培养液将药物的母液稀释成lOOOumol/L， 500umol/L, 100umol/L, 10umol/L,每孔加入 10uL,使得药物的终浓度为 100umol/L, 50umol/L,10umol/L,lumol/L。3. MTT 实验调整细胞密度至1. 0 1. 5X 105/ml，加入96孔培养板中每孔100ul，培养24h后 加入上述各浓度药物，每孔10ul。每浓度为6个复孔。孵育72h后，每孔加入lOuLMTT，在 培养箱中孵育4h后，进行检测。将上清液吸出，加入lOOulDMSO，振荡均勻后，于酶标仪上 492nm处测得0D值。
细胞成活率％=给药组0D值的平均值/空白乳组0D值的平均值X 100%4.统计学处理方法采用SPSS(13. 0)统计软件进行分析。结果用i士S表示。5.每种药物针对三种细胞的筛选要重复三次。表1化合物1和2的体外抗肿瘤活性实验结果 实施例5化合物1和2醛糖还原酶抑制活性测试采用醛糖还原酶抑制剂(ARI)筛选模型，对化合物1和2进行了醛糖还原酶抑制 活性测试。(1)实验材料醛糖还原酶从大鼠眼睛晶状体中获得。180mM Na_K 磷酸盐缓冲液；DMS0 ；0. 5N HC1 ； 10mM DL-glyceraldehyde ；0. 3mM
NADPH ；1. OM Li2S04。(2)检量限制作A 180mM Na-K 磷酸盐缓冲液24501B 1. OM Li2S047001C lOmM DL-glyceraldehyde700LD稀释后的醛糖还原酶1400LE DMSO350LF 0. 5N HC12100LG 0. 3mM NADPH700LA-G液混合，分注于12支试管，600L/支，两支平行一组。每支分别加不同浓度的 NADP 501 ；再分别加入5001含有6N NaOH的10mM imidazole溶液；60°C加热20min，放至 室温，分别注入96孔平板，进行荧光测定。(3)实验流程如图1所示A 180mM Na-K 磷酸盐缓冲液2251B 1. 0M Li2S04501C lOmM DL-glyceraldehyde (样品组平行 2) 50LH20 (空白组)50LD 稀释后的醛糖还原酶100LE 样品(样品组和空白组各)251实验结果见表2表2化合物1和2的醛糖还原酶抑制活性实验结果
权利要求
新的环阿尔廷型三萜皂苷，其特征在于，其具有如下结构。FSA00000101682600011.tif
2.如权利要求1所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，减压回 收提取液至醇浓度低于5%，离心后取上清液；(2)上清液经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到30%-90%醇 洗脱部位；(3)步骤(2)所得醇洗物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一 些有机溶剂或混合溶剂梯度洗脱；(4)上述步骤⑶中所得流分经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/7K，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到新环阿尔廷型三萜皂苷1和2。
3.如权利要求1所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，减压回 收提取液至醇浓度低于5%，乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，收集得到乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物；(2)正丁醇萃取物经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到 30% -90%醇洗脱流分；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有 机溶剂或混合溶剂梯度洗脱，得化合物2 ；(4)上述步骤(2)醇洗脱物，经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/水，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到化合物1。
4.如权利要求1所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于(1)过山蕨经闪式提取技术或溶剂提取法，采用50%-90%的乙醇或甲醇提取，减压 回收提取液至醇浓度低于5%，提取液分别用石油醚或环己烷、氯仿或二氯甲烷、乙酸乙酯 萃取，回收溶剂，收集得到石油醚或环己烷萃取物、氯仿或二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取 物；(2)乙酸乙酯萃取后剩余水层经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到30%-90%醇洗脱流分；(3)乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇一些有 机溶剂或混合溶剂梯度洗脱，得化合物2 ；(4)上述步骤(2)醇洗脱物，经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/7K，乙腈/水 或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到化合物1。
5.按照权利要求2或3所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述 步骤(2)的醇为乙醇，其梯度洗脱浓度为30% -90%。
6.按照权利要求2所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(3)为醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为9 1 6 4的氯仿或二氯甲烷/甲醇 或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/乙酸乙酯，混合 比例82 64的流分含有目标化合物。
7.按照权利要求3或4所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述 步骤(3)为乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为1 12 3 7的氯仿或二 氯甲烷/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/丙酮，乙酸乙酯/甲醇或乙醇，氯仿或二氯甲烷/ 乙酸乙酯，混合比例9 1 8 2的流分中得到化合物2。
8.按照权利要求2所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(4)为步骤(3)洗脱流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/ 水，从甲醇/水混合溶剂比例为1 5 5 1、乙腈/水混合溶剂比例为1 10 5 1、 甲醇/乙腈/水混合溶剂比例为1 1 10 5 5 2的流分中得到化合物1和2。
9.按照权利要求3或4所述新的环阿尔廷型三萜皂苷的制备方法，其特征在于所述 步骤(4)为步骤(2)中所得醇洗脱物经高效液相色谱分离，流动相为甲醇/水、乙腈/水 或甲醇/乙腈/水，从甲醇/水混合溶剂比例为1 5 5 1、乙腈/水混合溶剂比例为 1 10 5 1、甲醇/乙腈/水混合溶剂比例为1 1 10 5 5 2的流分中得到 化合物1。
10.权利要求1所述新的环阿尔廷型三萜皂苷化合物1和2在制备抗肿瘤和醛糖还原 酶抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及两个新的环阿尔廷型三萜皂苷制备方法及其应用；两个新的环阿尔廷型三萜皂苷，具有如下结构该两个环阿尔廷型三萜皂苷化合物1和2有抗肿瘤和醛糖还原酶抑制活性，可用于抗肿瘤和治疗糖尿病药物的开发和应用。
文档编号C07J53/00GK101851266SQ20101016404
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者孟大利, 李宁, 李铣, 肖皖 申请人:沈阳药科大学