专利名称：铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种化学合成技术领域的铜盐及其制备方法，具体是指一种铜离 子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐及其制备方法。
背景技术：
重金属离子是一类有毒的，持久的环境污染物。伴随着工业的发展，特别是近一 个世纪以来，随着矿冶，石油化工，机械制造，微电子等产业的快速发展，大量含有重金属离 子的工业废水，废气，废渣未经深化处理便随意排放，造成土壤，水体的严重污染，进而威胁 到自然生态平衡和生命的健康。重金属主要通过污染食品、饮用水及空气而最终进入人体。 进入人体后的重金属离子会与各种功能性蛋白质发生强烈的不可逆作用，对人类的健康构 成严重的威胁。因此，对环境中的重金属离子进行有效的检测是非常必要的。现在常用的 重金属离子检测方法是仪器分析法，如原子吸收光谱法(AAS)，电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS)，电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)等。仪 器分析法的特点是检测准确灵 敏，可靠性高，但是也存在着成本高，耗时，前处理复杂，处理量小等缺点。重金属离子的免疫检测方法集合了生物学，化学，免疫学等多个学科，是一种基于 具有亲和性和特异性的“抗原-抗体”反应的分析方法。重金属离子由于分子量小且免疫 原性弱而不能直接诱导动物产生抗体，因此需要将重金属离子以一定的方式与蛋白质连接 形成重金属离子全抗原，然后再利用制备出的全抗原诱导免疫动物产生针对重金属离子的 抗体。与传统的重金属离子检测方法相比，免疫学方法具有快速，准确，处理量大，前处理简 单，成本低等特点，在国内外的相关文献中已经有关于重金属离子免疫学检测方面的报道。 重金属离子的免疫学检测方法的核心在于制备出高度特异性的单克隆抗体，而制备出特异 的抗体的关键又在于重金属离子半抗原的制备。就目前而言，在重金属离子半抗原的制备 方面国内外相关的研究机构主要通过使用重金属离子螯合剂的方法。常用的重金属离子螯 合剂主要有以下几种乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，乙二醇二乙醚二 胺四乙酸(EGTA)，或类似的衍生物作为偶联剂。然后重金属离子与螯合剂之间以一定比例 螯合后形成的笼形结构的络合物作为半抗原。现有技术制备抗体的缺点主要有1.在重金属离子与螯合剂形成的笼形结构中， 重金属离子位于笼形结构的中央。因此，在随后的免疫应答中，针对重金属离子的免疫应答 作用便会被其周围的螯合剂所掩盖。在这种情况下，免疫反应后所产生的多克隆抗体大多 数是针对包含金属离子在内的由螯合剂形成的笼形结构，只有少部分的多克隆抗体是针对 金属离子的，这就对后续的单克隆抗体的筛选增加了难度。2.复合物不稳定，在体外环境 中，重金属离子复合物具有很强的稳定性，但是在免疫反应中，在体内生理生化作用下会造 成复合物的解离，这一方面降低了抗原的免疫原性，同时由于重金属离子的毒害作用，还会 造成动物的中毒甚至死亡。因此在重金属离子半抗原的设计方面，重金属离子与螯合剂结 合所形成的半抗原并不是一种理想的重金属离子半抗原。在国外还有研究者使用谷胱甘肽 作为偶联剂来连接重金属离子和蛋白质，这种方法克服了螯合剂做偶联剂的缺点，重金属离子与谷胱甘肽的硫醇基之间通过共价键连接，在动物体内具有很高的稳定性，不易解离。 但是这种方法也有缺点，因为谷胱甘肽作为偶联剂，免疫原性低，产生的抗体效价也低
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜 盐及其制备方法。本发明的优点在于反应体系简单，制备过程易操作，制备出的青霉烯酸硫 醇铜盐性质稳定，可作为一种稳定的铜离子半抗原。本发明是通过以下的技术方案实现的本发明涉及铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐，其结构式如下
CuCl
八 ^oI
——NH-^
COOH 其中R为 C6H5-CH2-。本发明还涉及如上铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，包括以下步骤步骤一，在咪唑的催化作用下，将青霉素G钠盐与氯化铜反应。步骤二，纯化反应产物，制备得到青霉烯酸硫醇铜盐。步骤一中，所述反应的pH为6. 8-7. O。步骤一中，所述反应在65 °C下进行。步骤一中，所述反应的时间为3小时。步骤二中，所述纯化条件为12000r/m离心5min纯化反应产物。与现有技术相比，本发明具有以下优点反应体系及操作方法简单，制备反应步骤 少。最终得到的产物青霉烯酸硫醇铜盐性质稳定，可作为铜离子的半抗原。铜离子通过共价 键连接到半抗原分子，在体内性质稳定不会解离，从而不会引起实验动物的中毒或者死亡； 半抗原分子中有相邻的铜离子、恶唑酮环和苯环三个抗原决定簇，免疫原性强；金属离子完 全暴露在半抗原分子表面，在免疫反应中可以与抗体进行直接的物理接触。
图1为青霉烯酸硫醇铜盐与青霉素G钠盐的紫外可见吸收光谱。图2为青霉烯酸硫醇铜盐的红外图谱。图3为青霉素G钠盐的红外图谱。
具体实施例方式以下结合附图并列举实例对本发明的相关内容进行详细阐述。下述的实验内容都 是在以本发明的相关内容为基础进行试验的，但是本发明的保护范围不限于下述的实例。 在下列的实验中未注明具体的实验方案和过程，一般条件下需按照常规条件，或者是按照 相关的仪器指标或厂商的建议进行操作。
实施例步骤一，青霉烯酸硫醇铜盐的制备取青霉素G钠盐50mg溶解在IOml的超纯水中，加入Ig咪唑，通过搅拌使其完全溶 解，逐滴加入IM HCl将pH调节至6. 8.然后加入与青霉素G钠盐等物质量的CuCl2,即5ml 的10mg/ml的CuCl2溶液，60°C水浴加热3个小时，取出，室温中冷却，反应完全后会产生深 蓝色的溶液。步骤二，青霉烯酸硫醇铜盐的纯化青霉烯酸硫醇铜盐在酸性溶液中是不溶的，可以形成大量絮状沉淀，利用这个性 质可以分离和纯化青霉烯酸硫醇铜盐。具体过程如下向反应后的溶液中滴加7ml IM HCl, 当滴加到5ml时可以观察到烧杯中有大量的白色絮状沉淀产生，当滴加到7ml时沉淀不再 增多。将溶液分装至4ml EP管中，12000r/m离心5min，弃去上清液，加水洗涤，再离心5min， 重复洗涤沉淀两次，离心后留在管底的沉淀即是半抗原青霉烯酸硫醇铜盐。步骤三，产物的检测根据前述的反应原理可以看到，青霉烯酸硫醇铜盐是青霉素和铜离子在咪 唑的催化作用下生成的青霉素类的降解产物。在其化学结构中，含有一个恶唑酮环， 所以在320nm-345nm处有特征的紫外吸收，利用紫外可见分光光度计的全波长扫描 (190nm-400nm)就可以判断出半抗原是否合成成功。对步骤二中反应得到的产物进行紫外 检测，如图1所示，在325nm处有特征吸收，证明了青霉烯酸硫醇铜盐合成成功。由于青霉 烯酸硫醇铜盐在水和有机溶剂中的溶解度很低，所以可以使用红外光谱法来检测产物的结 构和纯度。如图2所示，青霉烯酸硫醇铜盐不存在Π ^πΤΥβ-内酰胺环的特征吸收峰) 表明β-内酰胺环在合成过程中被完全降解了。1665CHT1和1677CHT1处的峰表明二者 都是α，β不饱和酮，这是青霉烯酸的特征吸收峰。2500CHT1处的峰证明青霉烯酸中存 在-SH (或-S-Cu2+)其他相应的峰还有750cm—1，700cm—1 (单取代苯环)，2927cm"1 (-CH2)， HOOcnT1，1368cm-1 [-C (CH3)2]。如图3所示，青霉烯酸硫醇铜盐(CMPA)含有一个羧基(-C00H)，可以和蛋白质的氨 基(-NH2)偶联，生成全抗原。在全抗原的的合成过程中，为了提高反应的选择性和效率，在 反应溶液中需要加入一定量的水溶性的EDC-HCl作为催化剂。具体的反应过程如下将纯 化后的50mg半抗原转移至烧杯中，滴加IOml 4% NaHCO3,加入200mg EDC-HCl，搅拌lOmin， 使得半抗原上的羧基充分活化。加入50mg BSA(或OVA)，搅拌12个小时；反应完毕后，离 心两次，过滤一次去除未反应的固体杂质。上清液转移至透析袋中透析2天，期间更换4 次透析液，每次的透析时间大于5小时，透析液为IOmMpH 7. 4PBS。透析完毕后，将全抗原 溶液定容，取出一定量的溶液进行紫外和ICP-AES检测，其余的全抗原溶液分装并冻成干 粉，-20°C保存。在青霉素类物质的衍生物中，青霉烯酸衍生物含有恶唑酮环，因此在320-345nm 处有特征吸收峰，而其它的青霉素类衍生物或降解产物都没有这种特征吸收。所以，紫 外可见分光光度法可以用来判断合成的全抗原青霉烯酸硫醇铜盐-蛋白质的连接效果。 BSA-CMPA和OVA-CMPA在325nm附近都有吸收峰，说明半抗原CMPA与蛋白质偶联成功。另 外因为在半抗原青霉烯酸硫醇铜盐(CMPA)中含有金属离子，因此我们可以通过ICP-AES来检测半抗原中重金属离子的含量。最终ICP-AES检测得CMPA-BSA的偶联比是28 1. CMPA-OVA的偶联比是4 1。该全抗原(CMPA-BSA)可以用于多克隆抗体的制备。在实验方案上，我们通过 ELISA对全抗原的免疫原性进行了系统化的分析，在实验中我们选取2只雄性的新西兰白 兔，每只重量约为3Kg。然后对实验动物进行皮下6-8点注射，第一次基础免疫的抗原剂量 为500 μ g/只，每次加强免疫的剂量为300 μ g/只，具体操作过程如下第一次免疫为基础 免疫，使用PBS(10mM，pH 7. 4)将缓冲液稀释成lmg/ml，与等量的福氏完全佐剂充分乳化， 皮下多点注射；14天后，进行第一次加强免疫，等量的全抗原溶液(lmg/ml)与福氏不完全 佐剂充分乳化，皮下多点注射；共加强免疫4次，每次间隔的时间为14天。从第二次加强 免疫起，每次免疫后7天从兔子的耳缘静脉取血，取出的全血37°C水浴2h，离心取上清，分 装，-20°C保存。免疫注射前，每只兔子取血作为阴性对照。实验结果表明1.新型的铜离子全抗原对动物是安全的，没有发现动物的中毒现象；2.新型的铜离子全抗原可以刺激动物的免疫系统产生高亲和性的抗 体。抗原具有 很高的免疫原性，经过4次加强免疫后，动物血清中的抗体的效价超过83000 ；3.为了验证血清中抗体针对Cu2+的特异性，我们用ELISA实验对抗体的亲和性做 了进一步的检测。为了检测特异性，我们合成了两种包被抗原，分别为OVA-GSH-Cu(II)和 OVA-GSH0 ICP-AES测得每个OVA分子连接9个Cu或者GSH。具体的检测方法是0VA-GSH_Cu 和OVA-GSH分别用50mM的碳酸盐缓冲液稀释为20 μ g/ml, 100 μ L/孔，37°C水浴中温育3小 时，而后用1 % OVA 300 μ L/孔封闭；每孔滴加100 μ L免疫血清(稀释300倍)，37°C水浴 中温育1小时，然后，用PBST(含0. 05% TWEEN-20的IOmMpH 7. 4PBS)洗涤3次；洗涤完毕 后，每孔滴加100 μ L羊抗兔IgG-HRP，37°C水浴1小时，PBST洗涤5次；最后加入100 μ L/ 孔TMB显色剂，显色后15min后加入50 μ L/孔2MH2S04终止反应。使用的酶标仪测量450nm 下的吸光度值。实验结果表明抗体与包被抗原OVA-GSH-CuCl反应所得的吸光度值(0D值)大于 0VA-GSH，这就表明血清中含有针对铜离子特异的抗体。半抗原及全抗原的合成步骤简单， 且易于表征。该全抗原可以应用于铜离子单克隆抗体的制备，具有很大的市场潜力。
权利要求
一种铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐，其特征在于，其结构式如下其中R为C6H5-CH2-。FDA0000021867370000011.tif
2.一种根据权利要求1所述的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤步骤一，在咪唑的催化作用下，将青霉素G钠盐与氯化铜反应； 步骤二，纯化反应产物，制备得到青霉烯酸硫醇铜盐。
3.根据权利要求2中所述的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，，其特征是， 步骤一中，所述的反应pH为6. 5-7. 0。
4.根据权利要求2中所述的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，，其特征是， 步骤一中，所述的反应温度为65°C。
5.根据权利要求2中所述的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，，其特征是， 步骤一中，所述的反应时间为3h。
6.根据权利要求2中所述的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐的制备方法，，其特征是， 步骤二中，所述的纯化条件为12000r/m离心5min。
全文摘要
一种化学合成技术领域的铜离子半抗原青霉烯酸硫醇铜盐及其制备方法。其结构式如下，其中R为C6H5-CH2-。制备方法步骤一，在咪唑的催化作用下，将青霉素G钠盐与氯化铜反应。步骤二，纯化反应产物，制备得到青霉烯酸硫醇铜盐。本发明反应体系及操作方法简单，制备反应步骤少。最终产物可作为铜离子的半抗原。半抗原分子中有相邻的铜离子、恶唑酮环和苯环三个抗原决定簇，免疫原性强；金属离子完全暴露在半抗原分子表面，在免疫反应中可以与抗体进行直接的物理接触。
文档编号C07D263/42GK101830860SQ201010186178
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者周培, 奚涛, 张薇, 徐武, 曹成喜, 樊柳荫, 谢鹏 申请人:上海交通大学