专利名称：提取光合膜蛋白(光系统Ⅰ)的方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从类囊体中分离提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，产品纯度达84%以上。
背景技术：
光合膜蛋白(光系统I)是两个具有光化学活性的生物复合体之一，主要参与光合作用中的电子转移，从而实现光合作用将光能转化为化学能。研究发现，光合膜蛋白(光系统I)的光电转化效率高达95%，是人类研发新型生物太阳能电池的重要材料。然而基于光合蛋白复合体的新型光电器件距实际应用还有很长的一段路要走。其中，如何大量制备高活性光合膜蛋白(光系统I)并长时间保持其稳定性，对光系统I基光电器件的光电效率和寿命具有重要影响，是光系统I基太阳能电池开发的重要前提和保障。目前，从类囊体中分离光合膜蛋白(光系统I)的主要方法有蔗糖梯度离心法、层析法和等电聚焦法等。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，蔗糖梯度离心法需要进行长时间的超速离心，容易引起蛋白质的失活和变性；层析法和等电聚焦法，成本昂贵，且难于工业放大。膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力， 对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。超滤膜是指膜孔径在I-IOOnm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂， 且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的光合膜蛋白(光系统I)超滤提取方法。本发明采取的技术路线是1.将含有叶绿素的藻类或高等植物叶子等，在IOO-SOOmM山梨醇Trich-HCl缓冲液(pH5-9)下勻浆；2.利用纱布对步骤1得到的勻浆液过滤，将滤液进行离心，离心条件为4°C，离心力大于1000g，离心时间大于10分钟；
3.利用蒸馏水将步骤2得到的沉淀进行悬浮，并使叶绿素浓度在0. 2-1. Omg/mL ；4.向步骤3得到的叶绿素溶液中滴加表面活性剂，使表面活性剂浓度在0-5% (w/ ν)，将溶液在4°C下搅拌30分钟以上，再离心，离心条件为4°C，离心力大于6000g，离心时间大于20分钟；5.利用截留分子量为100-300kDa的超滤膜对步骤4得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为表面活性剂浓度为0-5% (w/v)，溶液pH值6-10，离子强度0-1M。上述步骤均在4°C黑暗中进行。本发明直接应用超滤分离技术从类囊体中提取获得高纯度的光合膜蛋白(光系统I)，由于超滤膜是指膜孔径在Ι-lOOnm，具有不对称结构的复合膜。其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。本发明工艺仅涉及勻浆、增溶、离心和超滤四个简单步骤，相对目前的实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓缩同步进行、活性损失小、回收率高、能耗低、分离效率高、产品纯度可调控、控制因素单一， 便于工业放大等特点。
具体实施例方式下面结合实施例进一步描述本发明。实施例1，从菠菜中提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，步骤取新鲜无斑的菠菜叶1kg，用蒸馏水洗净，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)缓冲溶液200mL，用组织捣碎机捣碎，勻浆，勻浆液用4层纱布过滤，滤液在4°C离心15min(离心力1400g)，取沉淀。用蒸馏水将沉淀悬浮，使叶绿素浓度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非离子型表面活性剂Triton X-100，至Triton X_100终浓度为 0.2% (w/v)，在4°C下搅拌30min，离心(4°C，6000g，20min)，取上清液(1.8L)，利用截留分子量为300kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)进行分离，分离条件=TritonX-IOO浓度为0.2% (w/v)，溶液pH值8.0，NaCl浓度300mM，截留液即为光合膜蛋白(光系统I)溶液，纯度为83%。实施例2，从钝顶螺旋藻中提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，步骤取基因改造的钝顶螺旋藻^g，用蒸馏水洗净，加入200mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 0)缓冲溶液500mL，用组织捣碎机捣碎，勻浆，勻浆液用4层纱布过滤， 滤液在4°C离心15分钟(离心力2500g)，取沉淀。用蒸馏水将沉淀悬浮，使叶绿素浓度至 0. 6mg/mL，向溶液中滴加非离子型表面活性剂Triton X-100，至Triton X_100终浓度为 0.3% (w/v)，在4°C下搅拌30min，离心(4°C，6000g，20min)，取上清液(3. 5L)，利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)进行分离，分离条件TritonX-100浓度为0.3% (w/v)，溶液pH值7.0，NaCl浓度200mM，截留液即为光合膜蛋白(光系统I)溶液，纯度为86%。实施例3，从菠菜中提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，步骤取新鲜无斑的菠菜叶1. 5kg,用蒸馏水洗净，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)缓冲溶液300mL，用组织捣碎机捣碎，勻浆，勻浆液用6层纱布过滤，滤液在4°C离心10min(离心力4000g)，取沉淀。用蒸馏水将沉淀悬浮，使叶绿素浓度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非离子型表面活性剂Triton X-100，至Triton X_100终浓度为0.2% (w/v)，在4°C下搅拌30min，离心(4°C，8000g，15min)，取上清液(2. 5L)，利用截留分子量为300kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)进行分离，分离条件=TritonX-IOO浓度为0.2% (w/v)，溶液pH值7.8，妝(1浓度3001111，截留液即为光合膜蛋白(光系统I)溶液，纯度为84. 1%。
权利要求
1.一种提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，是以截留分子量为100-300kDa的超滤膜超滤处理光系统I的粗酶液，最终获得高纯度的光合膜蛋白(光系统I)；所述光系统I的粗酶液是将类囊体膜增溶、离心后得到的上清液。
2.根据权利要求1所述的提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，其特征在于所述用截留分子量为100-300kDa的超滤膜处理时，表面活性剂浓度为0_5% (w/v)，溶液pH值6_10， 离子强度0-1M。
3.根据权利要求1或2所述的提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，其特征在于所述表面活性剂为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或两亲性肽分子表面活性剂。
4.根据权利要求1或2或3所述的提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，其特征在于 所述用截留分子量为100-300kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。
全文摘要
本发明提供了一种提取光合膜蛋白(光系统I)的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过破碎、离心、增溶和超滤四个简单步骤，即可从叶绿体中提取高纯度的光合膜蛋白(光系统I)，在提取过程中，未使用层析及蔗糖梯度离心技术，大幅度缩短了提取周期，实现了光合膜蛋白(光系统I)的快速大规模制备。
文档编号C07K1/34GK102344484SQ201010240728
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者刘建国, 吕建仁, 崔占峰, 张曙光 申请人:中国石油大学(华东)