α-芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：α-芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种α -芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的前肽、其核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。
背景技术：
芋螺毒素(conopeptide, conotoxin, CTX)大多是由7-50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素(肽)按其作用的受体靶可分为α、ω、μ、δ等多种亚型。a-CTX能够特异性地作用于神经末端的乙酰胆碱(acetylcholine, nAChR)受体(Livett BG, Sandall Dff, Keays D, Down J, Gayler KR, Satkunanathan N, KhalilZ.Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic·acetylcholine receptor. Toxicon. 2006,48(7) :810-829.)。烟瘾是由烟草中的烟碱(尼古丁)引起的，其体内受体就是烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)(Azam L, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes ofnicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 2009 ；30 (6) :771-783.)。众所周知，吸烟几乎损害人体全部重要器官(例如呼吸系统、循环系统、神经系统、泌尿系统及其它重要脏器)，并且对孕妇和胎儿的特殊危害。据调查，抽烟是美国人健康的第一大杀手，每年因抽烟死亡的人数高达43万多人，居所有死亡原因之首，其次是酒精中毒引起的死亡人数为每年约10万人。抽烟在中国更是普遍，且危害更严重，每天有2000个中国人是因抽烟而死亡，到2050年，这个死亡人数将上升到每天8000人。抽烟引起的死因主要来自癌症和肺病。烟碱乙酰胆碱受体具有重要生理作用和临床研究意义，其介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、Y-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。然而，要开发这样的药物的前提是，要获得可以特异结合nAChRs各种亚型的选择性化合物，作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能，或直接作为相关疾病的治疗药物。另外，在小细胞肺癌中，肿瘤细胞膜上烟碱乙酰胆碱受体的激活促进肿瘤细胞增殖，用药物阻断这些受体的激活，可有效地进行早期诊断，或治疗这种灾难性癌症。药物成瘾既是医疗难题亦是严重的社会问题。截至2008年12月，全国登记在册的吸毒人员为112. 7万，比90年代初期相比增加了近16倍，全国所有刑事案件60%以上与吸毒有关，戒毒难难于上青天，主要原因就在于没有有效的治疗成瘾的药物面世，加上药物成瘾的机制尚不明确。国际上至今还没有有效的戒烟、戒毒对症药物，能治疗成瘾的α-芋螺毒素的预期经济和社会效益无可限量。新近研究表明，阻断含有α3β2或α6β 2的nAChRs可有效防止烟瘾和吗啡毒瘾的发作，显著抑制吸烟和吸毒的欲望(Brunzell DH, Boschen KE, Hendrick ES, Beardsley PM, McIntosh JM. Alpha-conotoxinMII—sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbensshe 11 regulate progressive ratio responding maintained by nicotine.Neuropsychopharmacology. 2010 ；35 (3) :665-673.)。据调查，疼痛影响1/6的人群，包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8%的人群。现有治疗神经痛的方法，主要是局部麻醉用药，来阻断由于外周神经、神经丛、背根神经、交感神经系统等产生的疼痛信号。但这些治疗只能短时间有镇痛效果，但并不能根治神经痛。而据调查，疼痛影响1/6的人群，包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8%的人群，很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污 染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、叶啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。目前有研究表明，阻断脊髓神经上的α3β2 nAChRs，通过抑制C-纤维释放谷氨酸进行疼痛信号的传递，可产生镇痛效应(Young T, Wittenauer S, McIntosh JM, Vincler M. Spinal alpha3beta2*nicotinic acetylcholine receptors tonicalIy inhibit the transmission ofnociceptive mechanical stimuli. Brain Res. 2008 ；1229 :118-124.)。因此，急需发现新的高特异性的nAChRs各种亚型的阻断剂。而且，估计在芋螺属的毒液中至少有1000中不同的a -CTXU-芋螺毒素)，而至今已发现和研究过的、或有临床应用价值的a-CTX仅十来种，绝大多数a-CTX尚未被发现和研究。因此研究与开发新的a-CTX具有重要意义。

发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性地劳动，发现了一类新型α -芋螺毒素肽，并且惊奇地发现，其能够特异性地阻断乙酰胆碱受体，并且具有很强的镇痛作用，具有在制备镇痛药物、戒烟或戒毒药物等方面的良好应用前景。由此提供了下述发明本发明的一个方面涉及一种多肽，其包含选自如下(I)至(4)中任一项所述的氨基酸序列(I)SEQ ID NO :3(下文中也称为LvIA)或者SEQ ID NO :6 (下文中也称为TxIC)或者SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID NO 2或者SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列；(3)与上述(I)或⑵所述氨基酸序列至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、最优选至少97%相同的氨基酸序列(在本文中称作“同源肽”)；或
(4)被1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选I个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述(I)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。为了本发明的目的，两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2. O蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等，1997，核酸研究25 :3389-3402)并采用下列参数确定的blastall-p blastp-a4-el0-E0-v500-b250_I [查询文档]_d prot_all,其中-p 指程序名称，_a指将要用到的服务器数，-e指期望值，-E指延伸缺口的代价，-V指单线描述(one-line description)数，_b指将要显示的比对数，-I指查询文档，_d指用于查询的数据库。同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :1-6中任一氨基酸序列不同之处可能在于取代、插入、添加和/或缺失了 I或多个、优选1-5个、更优选1-3个、尤其优选1-2个、最优选I个氨基酸残基。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是I到大约5个、优选1-3个、更优选I个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达 大约20-25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill, 1979,在《蛋白质》一书，Academic Press, NewYork 中描述过。最常见的替换是 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。本发明还包括在本发明α -芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列，使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。根据本发明任一项所述的多肽，其具有SEQ ID NO 3 (LvIA)、SEQ ID NO 6 (TxIC)、SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :2 (该多肽实际上是LvIA的前肽)、或者SEQ ID N0:5(该多肽实际上是TxIC的前肽)所示的氨基酸序列。优选地，SEQ ID NO 3 (LvIA)或者SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的羧基末端是酰胺化的。本发明的上述多肽即为芋螺毒素肽；具体地，是α -芋螺毒素肽。上述芋螺毒素肽可以分别从我国海南产的疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)、织锦芋螺(C. textile Linnaeus)提取。也可以如果化学合成氨基酸序列(例如参考实施例2中的方法)；或者通过基因重组的手段表达其核苷酸(核苷酸序列的制备参考实施例1)，得到多肽。也可以参考下面的方法本发明的另一方面涉及本发明任一项所述的多肽的制备方法，包括下述步骤I)在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了芋螺毒素线性肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为Pmc (Arg)、Trt (Cys)、But (Thr、Ser> Tyr), OBut (Asp), Boc (Lys)；
2)采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，所有半胱氨酸(Cys)都用Trt保护基团；3)将步骤2)得到的线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化；4)将步骤3)得到的产物进行氧化折叠。本发明的再一方面涉及一种多核苷酸，其编码本发明任一项所述多肽的氨基酸序列。根据本发明任一项所述的多核苷酸，其包含选自如下的(I)至(4)中任一项所述的核苷酸序列(I)SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示的多核苷酸序列； (2) SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4所示的多核苷酸序列；(3) SEQ ID NO : 11或SEQ ID NO 12所示的多核苷酸序列；(4)在严谨条件下可与上述⑴、(2)、或(3)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。关于多核苷酸之间的杂交，在现有技术中有众多的文献可供参考，包括例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，1989。杂交中可以应用各种程度的严谨条件，例如中度、中度-高度，或者高度严谨条件。越严谨的条件，形成双螺旋要求的互补程度越高。可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等等控制严谨程度。对于双链DNA基因探针，杂交于低于DNA杂合体熔解温度[melting temperature,Tm] )20-25°C下在 6X SSPE、5X Denhardt 氏溶液、(λ 1%SDS,0. lmg/ml 变性DNA 中进行过夜。清洗通常如下进行于Tm-20°C在O. 2X SSPE、0. 1% SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)。本发明的再一方面涉及一种引物对，其包含SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列。所述引物对能够用于PCR扩增，得到SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :4所示的多核苷酸序列。本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其包含本发明任一项所述的多核苷酸。本发明的再一方面涉及一种表达载体，其包含本发明任一项所述的核酸构建体。本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其包含本发明任一项所述的表达载体。本发明的再一方面涉及一种融合蛋白，其包含本发明任一项所述的多肽以及与之融合的其它氨基酸序列。本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的多肽，或者包含本发明的融合蛋白；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。本发明的再一方面涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体是α 3β 2乙酰胆碱受体。本发明的再一方面涉及一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂或者确定乙酰胆碱受体亚型的方法，该方法包括通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体与本发明任一项所述的多肽进行接触的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体为α 3β 2乙酰胆碱受体。当α -芋螺毒素LvIA和/或TxIC能够特异阻断α 3 β 2乙酰胆碱受体时，则推断该乙酰胆碱受体是α 3 β 2亚型的乙酰胆碱受体。本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽用于阻断乙酰胆碱受体的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α 3β 2乙酰胆碱受体。本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α 3β 2乙酰胆碱受体。本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽在制备治疗或预防神经系统疾病例如成瘾、帕金森症、痴呆、或神经痛的药物，或者用于制备杀灭害虫、镇痛、戒烟、或戒毒的药物的用途；具体地，所述神经痛由如下原因导致癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、叶啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防神经系统疾病例如成瘾、帕金森症、痴呆、或神经痛的方法，或者一种杀灭害虫、镇痛、戒烟、或戒毒的方法，包括给予有效量的·本发明的多肽(芋螺毒素肽或其前肽)或者本发明的药物组合物的步骤；具体地，所述神经痛由如下原因导致癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、叶啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。本发明的芋螺毒素肽可通过结合α 3β 2乙酰胆碱受体(nAChR)发挥作用，具有很强的镇痛活性。可应用于研究、诊断和治疗帕金森症、痴呆、成瘾、以及神经痛等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，确定nAChR的不同亚型等方面。不同的a-CTX对脊椎动物受体的亲和性不同，有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得a -CTX可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChR的种系发生，可作为分子探针来确定nAchR的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。下面给出了本发明涉及的术语的解释。神经痛本发明所述多肽涉及到治疗各种神经痛的用途。神经痛是周围或中枢神经系统原发或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉超敏、痛觉过敏等。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、叶啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。核酸构建体本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的I或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列，使其表达所述肽。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。 本文中术语“调控序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。表达载体 本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括I或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。优选本发明所述载体含有I或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich，1978，美国国家科学院学报75 :1433)。可以向宿主细胞插入I个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少I个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如SambiOOk等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。宿主细胞本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。制备方法本发明还涉及重组制备本发明肽的方法，该方法包括(a)在适于产生所述肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列；和(b)回收该肽。在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行 培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J. C. Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers, New York, 1989)。转基因动物和植物本发明还涉及转化了本发明的核酸序列的动物或植物细胞，优选小麦、玉米等植物细胞，赋予被转化宿主新的性状(如抗虫性)。这可以通过本领域技术人员熟知的技术，用此处公开的构建体转化动物或植物细胞而实现。用于控制害虫的方法和制剂可以通过本领域技术人员知道的多种方法，使用本发明的芋螺毒素肽或多核苷酸来实现控制害虫。这些方法包括例如将重组微生物应用于害虫(或它们的所在地)、和用编码本发明的芋螺毒素肽的基因转化植物。转化可以由本领域技术人员使用常规技术进行。此处公开了用于这些转化的必要物质，或者熟练的技术人员可以通过其它方法容易的获得。可以将配制的含有芋螺毒素肽、或包含本发明所述多核苷酸的重组微生物的制剂应用于土壤。还可以将配制的产品作为种子覆料或根部处理或作物生长周期晚期的完整植株处理应用。制剂可以包括扩散-增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式使用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。本领域技术人员可以理解，杀虫剂浓度将由于特殊制剂的本性广泛变化，特别是可作为浓缩物或直接使用。杀虫剂将以至少1% (重量计)存在，而且可能是100% (重量计)。干燥制剂通常有大约1-95% (重量计)的杀虫剂，而液体制剂将通常是液相中固体重量大约1-60%。含有细胞的制剂将通常含有大约IO2-大约IO4个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大约50mg(液体的或干的)-lkg或更多的量使用。通过喷、撒、洒、等等，可以将制剂应用于害虫环境，例如土壤和植物。药物组合物本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于诊断、缓解或治疗与智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物可口服、非肠道给药、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。
本发明还涉及特异阻断nAChRs的药物组合物。可应用本发明的芋螺毒素肽作为有用的探针来用于研究动物nAChR的种系发生；作为分子探针来确定nAChR的不同亚型；作为分子模型，设计新药；作为研究、诊断神经性疾病如帕金森氏病、行动障碍、精神分裂症等的工具药和治疗药物；治疗小细胞肺癌的侯选药物等。作为多肽杀虫剂，开发为新型生物农药等。发明的有益效果本发明的α -芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)，并且具有强的
镇痛活性。


图I :显示的是IuM a -CTX LvIA对α 3 β 2 nAChR的电流影响情况。图中“C，，是指的对照电流，图I中，箭头所指的是第一个Ach脉冲形成的电流轨迹( OnA)。图2 :显示的是a -CTX LvIA对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线。图中横坐标为所用α-CTX LvIA摩尔浓度(M)的对数值(Log[LvIA]M);纵坐标为剂量反应百分数(% Response)。图3 :显示的是IuM a -CTX TxIC对α 3 β 2 nAChR的电流影响情况。图中“C，，是指的对照电流，图3中，箭头所指的是第一个Ach脉冲形成的电流轨迹( OnA)。图4 :显示的是a -CTX TxIC对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线。图中横坐标为所用α-CTX TxIC摩尔浓度(M)的对数值(Log[TXIC]M);纵坐标为剂量反应百分数(% Response)。图5 : a -CTX LvIA在小鼠甩尾实验模型上的镇痛作用(η = 10)。Saline组为生理盐水组，浓度为O. 9% ；morphine剂量为lmg/kg ；HC1为阳性对照组吗啡的溶剂，浓度为O. 01mol/L ；C为Txdl，侧脑室给药剂量为2nmol/kg。图中横坐标为给药后的时间(Time)，单位为分钟(min);纵坐标为痛阈值(Threshold),单位为秒(S)。图6 :LvIA对小鼠热板法镇痛作用影响(η = 10)。Saline组为生理盐水组，浓度% 0.9% ；morphine剂量为I. 5mg/kg ；HC1为阳性对照组吗啡的溶剂，浓度为O. 01mol/L ；LvIA(Txdl)侧脑室给药的剂量为2nmol/kg。图中横坐标为给药后的时间(Time)，单位为分钟(min);纵坐标为痛阈值(Threshold),单位为秒(S)。图7 :给药后5min时LvIA对小鼠热板法镇痛作用影响(η = 10)。Saline组为生理盐水组，浓度为0.9% ；morphi ne剂量为I. 5mg/kg ；HC1为阳性对照组吗啡的溶剂，浓度为O. 01mol/L;LVIA(Txdl)侧脑室给药的剂量为2nmol/kg。图中纵坐标为痛阈值(Threshold),单位为秒(S)。图8 :LvIA给药后Ih在CCI模型上的镇痛作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，LvIA (a)的给药剂量为O. 7nmol/kg大鼠体重,LtIA(b)为I. 4nmol/kg大鼠体重,LtIA(C)为
2.8nmol/kg大鼠体重。图中柱状图的纵坐标为痛阈值的平均值和标准误(Mean土SD)。显著性差异比较概率为#P < O. 05，极显著差异比较概率为##p < O. 01。图9 : a -CTX LvIA给药前后在CCI模型上的镇痛作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，LvIA (a)的给药剂量为O. 7nmol/kg大鼠体重,LvIA(b)为I. 4nmol/kg大鼠体重， LvIA(c)为2. 8nmol/kg大鼠体重。图中7d代表术后第7天时的痛阈值；14d(a)代表第14天时给药前的痛阈值；14d(b)代表第14天时给药后痛阈值。图中各个点的纵坐标为痛阈值的平均值和标准误(Mean土SD)。显著性差异比较概率为#p < O. 05，极显著差异比较概率为 ##p < O. 01。图10 : a -CTX LvIA在小鼠福尔马林实验中的镇痛作用(η = 10)。图中阴性对照Saline为生理盐水，阳性对照为吗啡(Morphine)，所测试的芋螺毒素是a-CTX LvIA0图中纵坐标为痛阈值(Threshold)，用舔右足时间表示，单位为秒(s);横坐标为注射福尔马林后的时间(Time),单位为分钟(min)。图11 : a -CTX LvIA对在小鼠福尔马林实验中I相疼痛的抑制作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，阳性对照为吗啡(Morphine)，所测试的芋螺毒素是a -CTX LvIA0图中纵坐标为痛阈值，用舔右足时间表示，单位为秒(S)。图中柱状图的纵坐标为痛阈值的平均值和标准误(Mean 土 SD)。显著性差异比较概率为#p < 0. 05，极显著差异比较概率为##p< 0. 01。图12 : a -CTX LvIA对在小鼠福尔马林实验中II相疼痛的抑制作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，阳性对照为吗啡(Morphine)，所测试的芋螺毒素是a-CTX LvIA0图中纵坐标为痛阈值，用舔右足时间表示，单位为秒(S)。图中柱状图的纵坐标为痛阈值的平均值和标准误(Mean土SD)。显著性差异比较概率为#p < 0. 05，极显著差异比较概率为##p < 0. 01。图13 : a -CTX TxIC在小鼠甩尾实验模型上的镇痛效果。图中Saline组为生理盐水组，浓度为0. 9% ；morphine剂量为lmg/kg ；HC1为阳性对照组吗啡的溶剂，浓度为0. Olmol/L ;A为a-CTX TxIC，侧脑室给药剂量为2nmol/kg.图中横坐标为给药后的时间(Time),单位为分钟(min);纵坐标为痛阈值(Threshold),单位为秒(S)。图14 : a -CTX TxIC在小鼠热板实验模型上的镇痛效果。图中Saline组为生理盐水组，浓度为0. 9% ；morphine剂量为lmg/kg ；HC1为阳性对照组吗啡的溶剂，浓度为0. Olmol/L ;A为a-CTX TxIC，侧脑室给药剂量为2nmol/kg.图中横坐标为给药后的时间(Time),单位为分钟(min);纵坐标为痛阈值(Threshold),单位为秒(S)。图15 :a-CTX TxIC在小鼠福尔马林实验模型上的镇痛效果。图中阴性对照Saline为生理盐水，阳性对照为吗啡(Morphine)，A为所测试的芋螺毒素是a -CTXTxIC0图中纵坐标为痛阈值(Threshold)，用舔右足时间表示，单位为秒(s);横坐标为注射福尔马林后的时间(Time)，单位为分钟(min)。图中各点为痛阈值的平均值和标准误(Mean土SD)。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :芋螺毒素基因的克隆和序列分析
I.芋螺基因组DNA的提取分别以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的抚蒿芋螺(Conus lividus Hwass)和织锦芋螺(C. textile Linnaeus)活体为材料，储存在_80°C备用。先将芋螺毒腺解剖出来，并称重。然后用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司)，提取毒腺的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。步骤简述如下切取少于30mg的毒腺组织，放入装有200ul GA缓冲液(说明书中未提供配方)和40ul (10mg/ml) RNaseA的离心管仲，涡旋振荡15s ;加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，涡旋混匀后56°C水浴I. 5h，直至组织完全溶解；加入200ul GB缓冲液(说明书中未提供配方)，充分颠倒混匀，70°C水浴lOmin，直至溶液变为清亮；加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，观察到有絮状沉淀，简短离心；将上一步所得溶液和絮状沉淀移入试剂盒提供的吸附柱中，12，000r/min离心30s，弃废液；向吸附柱中加500ul GD缓冲液(说明书中未提供配方)，12，000r/min离心30s，弃废液；再向吸附柱中加700ulPW漂洗液，12，000r/min离心30s，弃废液；将吸附柱12，OOOr/min离心2min，弃废液，后于室温中放置几分钟以彻底晾干残留无水乙醇；将提取的芋螺基因组总DNA溶于IOOyL TE中，取5 μ L进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，以λ-EcoTH I digestDNA Marker为标准，检测所得DNA的完整性和大小。用核酸蛋白质分析仪测定DNA溶液的0D260、0D280值以及0D260/0D280比值，并计算DNA的浓度(μ g · πιΓ1)、纯度和DNA产率(μ g · g_0。所提取的完整DNA用于下一步PCR扩增进行芋螺毒素基因克隆的模板。2. PCR 反应根据α-CTX前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’_UTR)序列，设计a-CTX特异引物。上游内含子引物序列为5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’ (SEQ ID NO: 9);下游3’-UTR 引物序列为 5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’ (SEQ ID NO 10) 每条引物均为 18 个碱基的寡核苷酸片段。将所提取的基因组DNA原液均稀释至终浓度为3μ g · ml-1，作为PCR扩增的模板待用。分别对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最后确定最理想的PCR体系为DNA模板 4μ I、引物(各 5ymol/L)各 0·5μ l、2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ I、灭菌双蒸水补充至25 μ I ;反应程序为94°C加热7min进行预变性，然后按照94°C，30s变性；50 0C，Imin退火；72°C，2min延伸进行扩增，共35个循环，72°C延伸lOmin，反应后4°C保存。取8 μ I扩增产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压90V，电泳20min，以DL2000DNA Marker为标准，检测扩增产物的大小。
3. PCR产物的克隆、测序、和序列分析回收上述特异PCR产物,与τ-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XLl菌株(发明人实验室保存)，利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序分析。经序列分析比较，获得了本发明的2种新型α-CTX前体基因LvIAN(SEQ IDNO :1)、和 TxICN (SEQ ID NO 4)。根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出芋螺毒素前肽LvIAP和TxICP，它们分别具有SEQ ID NO 2和5所示的氨基酸序列；根据前肽序列再推测出成熟肽LvIA和TxIC，它们分别具有SEQ ID NO :3、6所示的氨基酸序列。成熟肽LvIA和TxIC都含有a-CTX所特有的CC-C-C半胱氨酸模式，LvIA为4/6型a -CTX, TxIC为4/7型a -CTX。2种基因的核酸序列、所编码的前体肽和相应的成熟肽的氨基酸序列如下LvIAN( a-CTX 基因，167bp,来自抚蒿芋螺(Conus lividus Hwass, Livid Cone))
GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGAATGCTGCAGGCAACGACAAAATGT CCGCCCTGATGGCTCTGACCATCAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATG AGTCCAATCTGTGGCTGAAGACGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGAC (SEQ ID NO :1)。上述序列中的读码框序列如下GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGAATGCTGCAGGCAACGACAAAATGT CCGCCCTGATGGCTCTGACCATCAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATG AGTCCAATCTGTGGCTGA (SEQ ID NO 11)由LvIAN编码的前肽LvIAP由43个氨基酸组成，序列为VVLGPAFDGRNAAGNDKMSALMALTIRGCCSHPVCSAMSPICG(SEQ ID NO :2)。推断由前肽LvI AP经加工产生的成熟肽LvIA由15个氨基酸组成(推断的方法和原理请参考 Luo S, Zhangsun D, Zhang B, Quan Y, Wu Y. Novel alpha-conotoxinsidentified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity. J Pept Sci. 2006,12 (11) :693-704.),序列为GCCSHPVCSAMSPIC#(SEQ ID NO :3，#代表该毒素羧基端被酰胺化)。其编码的核苷酸序列为GGATGCTGTTCCCATCCTGTCTGTAGCGCGATGAGTCCAATCTGT(SEQ ID NO :7)。TxICN( a-CTX基因，170bp,来自织锦芋螺(C. textile Linnaeus, Textile Cone))GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTCGTGGCAGGGACGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCC TGGTTGGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTTCTCATCCTGCCTGTAACGTAGAT CATCCAGAAATTTGTCGTTGAAGACGCTGATGCTCCACGACCCTCTGAACCACGAC(SEQ ID NO :4)。上述序列中的读码框序列如下GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTCGTGGCAGGGACGCCGCAGCCAAAGCGTCTGGCC TGGTTGGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTTCTCATCCTGCCTGTAACGTAGAT CATCCAGAAATTTGTCGTTGA(SEQ IDNO 12)由TxICN编码的前肽(TxICP)由44氨基酸组成，序列为VVLGPAFRGRDAAAKASGLVGLTDRRPECCSHPACNVDHPEICR(SEQ ID NO :5)。推断由前肽TxICP经加工产生的成熟肽TxIC由17个氨基酸组成(推断的方法和原理请参考 Luo S, Zhangsun D, Zhang B, Quan Y, Wu Y. Novel alpha-conotoxinsidentified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity. J Pept Sci.2006,12 (11) :693-704.),序列为PECCSHPACNVDHPEIC (SEQ ID NO :6)。其编码的核苷酸序列为 CCAGAATGCTGTTCTCATCCTGCCTGTAACGTAGATCATCCAGAAATTTGT(SEQ ID NO :8)。实施例2 : α -芋螺毒素LvIA、TxIC的合成根据α -芋螺毒素成熟肽LvIA、TxIC的氨基酸序列(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 6)，采用Fmoc方法人工合成了这两种多肽。具体方法如下。LvIA与TxIC的树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团，其中第I和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对交叉保护。其合成步骤为采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法,在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了 LvIA、TxIC两条芋螺毒素线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为Pmc(Arg)、Trt (Cys)、But (Thr、Ser、Tyr)，OBut (Asp)，Boc (Lys).采用 Fmoc HOBT DCC 方法，Rink 酰胺化树脂及 Fmoc氨基酸，所有半胱氨酸(Cys)都用Trt保护基团，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全，在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂Ifc°ffireagent K(trifluoroacetic acid /water /ethanedithiol/phenol/thioanisole ；90 5 2. 5 7. 5 5，v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为0-50min0_50%buffer B,50_55min 50-100 % buffer B (Buffer B is 0. 05 % TFA(Trifluoroaceticacid,为美国 Tedia(Fairfield, Ohio, USA)公司产品)in 90 % ACN(Acetonitrile,购自美国 Fisher (University of Miami, Miami, FL, USA)公司)· ；Buffer A is 0. I %TFA (trif luoroacetic acid, v/v) in water,下同)，流速为 15mL/min,在 UV 215nm 的波长下监测洗脱情况。纯化后的线性肽用分析型的HPLCC18柱(Vydac)进行纯度检测，洗脱梯度为 0-50min 0-50% buffer B，50_55min 50-100% buffer B，流速为 lmL/min。其纯度达95%以上，并冻干保存，用于氧化折叠，并通过质谱(MS)鉴定分子量。带有2个Acm保护基的LvIA线性肽的分子量为1635. 24，与其理论分子量1635. 81 一致，带有2个Acm保护基的TxIC线性肽的分子量为1996. 2，与其理论分子量1996. 09 一致，说明线性肽合成成功。参照文献McIntosh, J. M. , Azam, L. , Staheli, S. , Dowell, C. , Lindstrom,J. M. , Kuryatov, A. , Garrett, J. E. , Marks, M. J. , and Whiteaker, P. (2004) Analogs ofa -Conotoxin Mil AreSelective for a 6-Containing Nicotinic AcetylcholineReceptors. Mol Pharmacol 65,944-952 的两步氧化法，对 a -CTX LvIA 和 TxIC 的线性肽进行选择性氧化折叠。过程简述如下。首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassiumferricyanide, O. IM Tris, pH 7. 5, 30min)在第I和第3个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(IOmM iodine in H20 trif luoroacetic acid acetonitrile (78 : 2 : 20 by volume, lOmin),移去第 2 和第 4个半胱氨酸上的Acm，同时在第2和第4个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在第1、3个半胱氨酸之间，第2、4个半胱氨酸之间形成二硫键的α -芋螺毒素LvIA和TxIC，并通过质谱(MS)鉴定，LvIA的分子量为1631. 24, TxIC的分子量为1992. 2。经上述两步氧化法折叠后所获得的毒素肽具有Cys I-Cys 3, Cys 2-Cys 4之间正确的二硫键连接方式。
实施例3 : α -芊螺毒素LvIA特异阳.断α 3 β 2 nAChRs的实骀参照 Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino acid residues that conferhigh selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit toalpha-conotoxin Mil[S4A，E11A, L15A], J Biol Chem. 2008 Apr 25 ；283(17) :11625-32.Epub 2008 Feb 25中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitrotranscription kit (Ambion，Austin, TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α 3β 2, α 6/α 3β 2β 3, α 6/α 3β 4, α 9α 10, α 4β 2, α 4β 4, α 3β 4, α 2β 2, α 2β 4,α 7)、以及小鼠肌肉型nAChRs ( α I β I δ ε )的CRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus Iaveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射O. 5-2. 5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。娃卵收集后的1-2天内注射cRNA,注射后1-7天内用于nAChRs的电压钳记录。将I个注射过cRNA的娃卵置于30uL的Sylgard记录槽中(直径4mmX深度2mm),重力灌注ND96或含有ImM atropine的ND96 (ND96A)，流速为lml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有O. lmg/ml BSA(bovine serum albumin)以减少毒素的非特异性吸附,用转换阀·(SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA)可以在灌注毒素或乙酸胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves, model 161T031,Neptune Research,Nor thboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model 0C-725B,Warner Instrument Corp. ,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(X2000)位置时进行在线记录。用Imm外径XO. 75内径 mm 的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries, WPI Inc. , Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在_70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注Is的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α 9 α 10 nAChRs卵为10 μ M ;表达神经型的nAChRs之α 7为200 μ Μ，其他的亚型都为100 μ Μ。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego, CA)进行统计分析,绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC50等多种有关毒素阻断nAChRs的各种参数。结果表明，ΙμΜ a-CTX LvIA(实施例2制备，羧基末端酰胺化)完全阻断了由Ach门控的α 3 β 2 nAChR开放产生的电流(图I)。LvIA阻断α 3 β 2 nAChR的IC50为57. 7nM，且是可逆的。LvIA对α6/α3β4 nAChRs有微弱的阻断作用，其IC50为2660ηΜ，比对α 3 β 2 nAChR的阻断活性弱46. I倍。高浓度的10 μ M a -CTX LvIA对其他的nAChR亚型，没有阻断作用，其IC50大于ΙΟΟΟΟηΜ，这些nAChR亚型包括α6/α3β2β3，α 3β4,α I β I δ ε , α 2β 2, α 2β 4, α 4β 2, α 4β 4, α 7, α9α10 (表 I)。α -CTX LvIA 对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线如图2所示。表I : a -CTX LvIA对各种nAChRs亚型的半阻断剂量与斜率
权利要求
1.一种多肽，其包含选自如下(I)至(4)中任一项所述的氨基酸序列 (1)SEQID NO 3或者SEQ ID NO 6或者SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列； (2)SEQ ID NO 2或者SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列； (3)与上述(I)或(2)所述氨基酸序列至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、最优选至少97%相同的氨基酸序列；或 (4)被1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选I个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述(I)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。
2.一种多肽,其具有 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :2、或者SEQ ID NO : 5所示的氨基酸序列；优选地，SEQ ID NO :3或者SEQ ID NO : 13所示氨基酸序列的羧基末端是酰胺化的。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求I或2所述多肽的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其包含选自如下的(I)至(4)中任一项所述的核苷酸序列 (1)SEQID NO 7或SEQ ID NO 8所示的多核苷酸序列； (2)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :4所示的多核苷酸序列； (3)SEQ ID NO :11或SEQ ID NO : 12所示的多核苷酸序列； (4)在严谨条件下可与上述(I)、(2)、或(3)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
5.—种核酸构建体,其包含权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.—种表达载体,其包含权利要求5所述的核酸构建体。
7.一种转化的细胞,其包含权利要求6所述的表达载体。
8.一种融合蛋白，其包含权利要求I或2所述的多肽以及与之融合的其它氨基酸序列。
9.一种药物组合物，其包含权利要求I或2所述的多肽，或者包含权利要求8所述的融合蛋白；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。
10.一种阻断乙酰胆碱受体的方法，包括使用有效量的权利要求I或2所述的多肽的步骤；具体地,所述乙酰胆碱受体是α 3β 2乙酰胆碱受体。
11.一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂或者确定乙酰胆碱受体亚型的方法，该方法包括通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体与权利要求I或2中所述的多肽进行接触的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体为α 3β 2乙酰胆碱受体。
12.权利要求I或2所述的多肽用于阻断乙酰胆碱受体的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体。
13.权利要求I或2所述的多肽在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α 3β 2乙酰胆碱受体。
14.权利要求I或2所述的多肽在制备治疗或预防神经系统疾病例如成瘾、帕金森症、痴呆、或神经痛的药物，或者用于制备杀灭害虫、镇痛、戒烟、或戒毒的药物的用途；具体地，所述神经痛由如下原因导致癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、叶啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症。
15.权利要求I或2所述的多肽的制备方法，包括下述步骤 1)在ABIPrism 433a多肽合成仪上合成了芋螺毒素线性肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为Pmc (Arg)、Trt (Cys)、But (Thr、Ser> Tyr), OBut (Asp), Boc (Lys)； 2)采用FmocHOBT DCC方法，Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，所有半胱氨酸(Cys)都用Trt保护基团； 3)将步骤2)得到的线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化； 4)将步骤3)得到的产物进行氧化折叠。
16.一种引物对，其包含SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 10所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种α-芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的前肽、其核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。本发明的α-芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)(例如α3β2 nAChR)，并且具有强的镇痛活性、以及戒除成瘾的活性，具有在制备镇痛药物、戒烟或戒毒药物等方面的良好应用前景。
文档编号C07K19/00GK102875653SQ20111019884
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者罗素兰, 长孙东亭, 吴勇, 胡远艳, 朱晓鹏, 陈琴, 保罗·F·阿莱温奥德, J·迈克尔·麦克托什 申请人:海南大学