专利名称：苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，具体涉及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
癫痫是一种常见的神经系统疾病，也是我国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症。目前，抗癫痫类药物仍然是控制癫痫发作的主要手段。传统的抗癫痫类药物苯妥因治疗窗窄、个体差异大、疗效和毒性反应与血药浓度密切相关，临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度。因此，苯妥因血药浓度的监测对癫痫的诊断和治疗具有重要的临床指导意义。目前，国内外测定苯妥因血药浓度的方法主要是高效液相色谱(HPLC)、荧光偏振 免疫分析(FPIA)、微粒酶免法、免疫比浊法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法。采用HPLC法，需要样本前处理，操作相对复杂、且检测成本昂贵；ELISA检测法灵敏度较高，但无法精确定量；荧光偏振免疫分析(FPIA)具有操作简单、灵敏度高等优点，但试剂成本高，不适合常规治疗药物的检测，阻碍个性化治疗的推广。因此开发一种操作简便、周期短、成本低、灵敏度高的检测方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度特异性的苯妥因多克隆抗体及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为步骤a 苯妥因衍生物的活化将特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、IOmM pH为5. O的磷酸钾缓冲液、I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；步骤b:抗原的偶联和纯化将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于IOmLO. 2M pH为8. 5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；步骤c :采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。优选的所述步骤a为苯妥因衍生物的活化将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700 μ L纯二甲基酰胺、700 μ L无水乙醇、I. 4mL IOmM pH为5. O的磷酸钾缓冲液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和IOmg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；步骤b :抗原的偶联和纯化将40mg牛血清白蛋白溶解于IOmLO. 2M pH8. 5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；优选的，所述步骤c为用O. 2M的pH为8. 5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的本妥因免疫抗原稀释至I. Omg/mL,然后用I. OmL的本妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2 3周后，再用I. OmL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。为了解决上述技术问题，本发明所采用的另一个技术方案是提供苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有Rl试剂、R2试剂、 定标液，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法包括以下步骤R1试剂的制备，R2试剂的制备，定标液的制备，所述Rl试剂的制备为步骤a:苯妥因衍生物的活化，将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700yL 二甲基酰胺、700yL乙醇、1.4mL IOmM pH5. O的磷酸钾缓冲液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和IOmg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；步骤b :抗原的偶联和纯化将40mg牛血清白蛋白溶解于IOmLO. 2M pH为8. 5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；步骤c :采用步骤b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体；步骤d :在ILTris缓冲液中依次加入2. 02g脱氢辅酶I和O. 86g葡萄糖_6_磷酸，在室温下搅拌10分钟，所述Tris缓冲液pH为8. 0，所述Tris缓冲液中各组分浓度为55mMTris、质量体积百分比为O. I %的牛血清白蛋白、145. 4mMNaCl、3mMMgCl2，然后将步骤c中得到的苯妥因衍生物特异性多克隆抗体加入该溶液中，稀释比例为I : 1000-1 6000，得到Rl试剂；所述R2试剂的制备为步骤a、将30mg葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24mL O. 05M的Tris缓冲液中，然后依次加入200-500mg还原型辅酶I、I. 0-2. OmL的卡必醇和2. 0-6. OmL的二甲基亚砜混匀；步骤b、将20mg的苯妥因衍生物溶解于840 μ L 二甲基亚砜和360 μ L纯二甲基酰胺的混合溶液中，加入12 μ L三丁胺和6 μ L氯甲酸异丁酯，在2 8°C条件下搅拌30分钟；步骤C、将步骤a和步骤b得到的两种溶液混合，在2 8°C条件下搅拌过夜，得到偶联的酶标抗原，再进行G-25凝胶层析柱纯化得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物；步骤d、将步骤c中的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原稀释于Tris缓冲液中，稀释比例为I 400-1 3000，得到R2试剂；所述Tris缓冲液pH为8. 2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120mM Tris、质量体积百分比为O. 1%的牛血清白蛋白、145.4mMNaCl、3mM MgCl2 ；定标液的制备为将苯妥因校准品溶于空白血清中配制成。优选的，所述Rl试剂的制备中的步骤c为用O. 2M的pH8. 5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至I. Omg/mL，然后用I. OmL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2 3周后，再用I. OmL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。优选的，所述定标液的制备为将苯妥因校准品溶于空白血清中并配制成O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL 共 6 种系列浓度的定标液。
本发明的有益效果为本发明的苯妥因特异性多克隆抗体的特异性强，效价高，在药物交叉反应试验中，对测试的32种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检验苯妥因的血药浓度。本发明的苯妥因药物浓度均相酶免疫检验试剂盒灵敏度高，能够准确检测10ng/mL的标本,苯妥因药物浓度的有效检测范为20ng/mL_40y g/mL。本发明试剂盒的准确率高，回收率在90%以上，简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明图I是苯巴比妥均相酶免疫测定的定标曲线。
具体实施例方式本发明中的检验方法是一种均相酶免疫测定法，该检验的基本原理基于一种竞争反应，即液体样本中游离的苯妥因与偶联在葡萄糖六磷酸脱氢酶(Glucose-6-PhosphateDehydrogena se,G6PDH)上的苯妥因衍生物竞争结合特异性抗体的位点。G6TOH-苯妥因衍生物偶联物是酶标半抗原，具有抗原和酶的活性，G6PDH-苯妥因衍生物偶联物可以被抗体识别。G6PDH既能够氧化磷酸葡萄糖脱氢，同时将氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD+)还原为NADH。这个过程导致吸光度的变化，可以在340nm波长光源下被检测到。抗体与酶-苯妥因衍生物结合后，G6PDH的活性被抑制，液体样本中的苯妥因竞争性的取代与抗体结合的苯妥因酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使G6TOH恢复活性。因此，液体样本中苯妥因的含量越多，游离的G6TOH-苯妥因衍生物偶联物就越多，从而能得到更强的信号。本发明的要点是提供一种简便、快速、灵敏度高和全自动化的苯妥因药物浓度检测试剂盒和制备方法。本发明的核心技术为均相酶免疫检测方法，其中试剂和待测样品均为液相，测定过程中不存在分离步骤，样品与抗体反应后再加入标记的抗原进行反应。本发明的技术方案包括苯妥因免疫原的合成，抗苯妥因特异性抗体的制备，酶标偶联物的制备以及样本的测定。分别通过化学合成的方法制备出G6TOH-苯妥因偶联物和BSA-苯妥因免疫原，并由BSA-苯妥因免疫原免疫动物，制备出特异性的抗苯妥因多克隆抗体。将制备好的抗体和酶标偶联物配制成均相酶免疫试剂Rl和R2，在全自动生化分析仪上进行苯妥因样本的测定。实施例一苯妥因特异性多克隆抗体的制备a、苯妥因免疫抗原的合成I)苯妥因衍生物的活化，称取20mg特异的苯妥因衍生物于小烧杯中，并依次加入700 μ L 纯二甲基酸胺(dimethylformamide, DMF)、700 μ L 无水乙醇、I. 4mL IOmM 的 pH 为5.0的磷酸钾缓冲液、SOmgl-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和IOmgN-羟基硫代琥拍酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, Sulfo-NHS),将这些化学品在室温条件下搅拌溶解反应30min ；2)BSA溶液的制备，称取40mg牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)并在 室温条件下溶解于IOmL O. 2M的pH8. 5的磷酸缓冲液中；3)抗原的偶联和纯化，将活化的苯妥因衍生物滴加到BSA溶液中，在2 8°C条件下搅拌过夜，得到抗原；并将偶联的抗原进行透析纯化。b、采用常规方法制备抗体，大致步骤如下用磷酸缓冲液将合成的苯妥因免疫抗原稀释至I. Omg/mL，然后用I. OmL的抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；2 3周后，再用I. OmL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔四周一次，共两次，获得的抗体效价约为I : 30000。实施例二苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备，包括以下步骤苯妥因衍生物特异多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物的制备，定标液的制备，均相酶免疫试剂的制备和利用全自动生化分析仪进行样本测试a、按实施例I的方法制备苯妥因特异性多克隆抗体。b、苯妥因酶标抗原的制备I)称取30mg葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24mL，0. 05M Tris缓冲液中，然后依次加入200-500mg NADH、I. 0-2. OmL的卡必醇和2_6. OmL的二甲基亚砜混匀；2)将20mg的苯妥因衍生物溶解于840yL 二甲基亚砜和360yL DMF中，加入12 μ L 三丁胺(tributylamine)和 6μ L 氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate),在 2
8O条件下搅拌30min ；3)将上述两种溶液混合，在2 8°C条件下搅拌过夜，并将偶联的酶标抗原进行G-25凝胶层析柱纯化。C、定标液的制备将苯妥因校准品溶于空白血清中并配制成0、2. 5、5、10、20、40μ g/mL共6种系列浓度的定标液，定标液的工作体积为10-35 μ L。d、均相酶免疫试剂的制备I) Rl试剂的制备在ILTris 缓冲液(55mMTris,0. 1% BSA，145. 4mMNaCl, 3mMMgCl2, pH 为 8. 0)中依次加入2. 02gNAD (辅脱氢酶I)和0. 86gG6P(葡萄糖_6_磷酸)，在室温下搅拌lOmin。然后将实施例I中苯妥因衍生物特异多克隆抗体制备中得到的抗体加入溶液中，稀释比例为I 1000-1 6000。2) R2试剂的制备在ILTris 缓冲液(120mMTris,O. 1% BSA, 145. 4mMNaCl,3mM MgCl2,pH8. 2)中加入G6TOH-苯妥因衍生物酶标抗原，稀释比例为I : 400-1 3000。然后加入100-200 μ L试剂Rl和100-200 μ L试剂R2，采用两点速率法，检测主波长为340nm、副波长为405nm的吸光度变化率，建立并优化苯妥因均相酶免疫定标曲线如图I所述，定标曲线的建立和优化在日立7180型全自动生化分析仪上完成。e、利用全自动生化分析仪进行样本测试 I)血清标本的收集，按照常规方法收集血清标本；2)根据日立7180型全自动生化仪的操作说明，打开仪器，进行仪器光密度检测和探针的清洗，检测仪器是否运行正常；3)仪器检测运行正常后，将试剂Rl、R2依次放入Rl、R2试剂仓，血清标本放入样品盘 I (SI),将 O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL 的苯妥因定标液放入样品盘2 (S2)的指定位置；4)仪器在Stand by状态时，设定苯妥因的操作程序和检测参数，具体检测参数如
表一表一血清中苯妥因药物浓度检测参数
检测方法两点速率法
样本量10-35 μι
"TlO分钟
I. 5分钟
试剂 Rl100-200 μ
试剂 R2100-200 uL__
测光点21至31点 检测波长(主/副)340/405 nm
定标类型Logit-Log (4P)
定标液IO pg/mL
定标液22.5 pg/mL
定标液35 pg/mL
定标液410 pg/mL定标液 520 pg/mL
定标液640 pg/mL5)按照设定的检测参数，首先进行定标实验，建立苯妥因的定标曲线，然后根据建立的定标曲线，检测血清标本中苯妥因的浓度。
6)检测血清标本中苯妥因的浓度，仪器将测得的吸光度变化率根据标准曲线换算成药物浓度，并由终端显示打印检测报告。实施例三本妥因检验试剂盒广品的检验实验a、回收实验利用建立的苯妥因定标曲线，测定低(2. 5μ g/mL)、中(10yg/mL))、高(40 μ g/mL)三种浓度的苯妥因血清标本，每个标本重复测定5次。表二 苯妥因试剂盒的回收实验
权利要求
1.苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为 步骤a 苯妥因衍生物的活化将特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、IOmM pH为5. O的磷酸钾缓冲液、I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解，反应30分钟； 步骤b :抗原的偶联和纯化将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于IOmLO. 2M pH为8. 5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原； 步骤c :采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。
2.按权利要求I所述的抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤a : 苯妥因衍生物的活化将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700 μ L纯二甲基酰胺、700 μ L无水乙醇、I. 4mL IOmM pH5. O的磷酸钾缓冲液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和IOmg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟； 步骤b :抗原的偶联和纯化将40mg牛血清白蛋白溶解于IOmL O. 2M pH8. 5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原。
3.按权利要求I所述的抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤c为用O. 2M的pH为8. 5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至I. Omg/mL,然后用I. OmL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对家兔进行注射，2 3周后，再用I. OmL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。
4.苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有Rl试剂、R2试剂、定标液，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法包括以下步骤R1试剂的制备，R2试剂的制备，定标液的制备， 所述Rl试剂的制备为 步骤a:苯妥因衍生物的活化，将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入。700 μ L纯二甲基酰胺、700 μ L无水乙醇、I. 4mL IOmM pH为5. O的磷酸钾缓冲液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和IOmg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟； 步骤b :抗原的偶联和纯化将40mg牛血清白蛋白溶解于IOmL O. 2M pH为8. 5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2 8°C条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原； 步骤c :采用步骤b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体；步骤d :在ILTris缓冲液中依次加入2. 02g脱氢辅酶I和O. 86g葡萄糖_6_磷酸，在室温下搅拌10分钟，所述Tris缓冲液pH为8. O,所述Tris缓冲液中各组分浓度为55mMTris、质量体积百分比为O. 1%的牛血清白蛋白、145. 4mM NaCl、3mM MgCl2，然后将步骤c中苯妥因衍生物特异多克隆抗体的制备中得到的抗体加入该溶液中，稀释比例为I 1000-1 6000，得到 Rl 试剂; 所述R2试剂的制备方法为 步骤a、将30mg葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24mL O. 05M的Tris缓冲液中，然后依次加入200-500mg还原型辅酶I、I. 0-2. OmL的卡必醇和2. 0-6. OmL的二甲基亚砜混匀； 步骤b、将20mg的苯妥因衍生物溶解于840 μ L 二甲基亚砜和360 μ L纯二甲基酰胺的混合溶液中，加入12 μ L三丁胺和6 μ L氯甲酸异丁酯，在2 8°C条件下搅拌30分钟； 步骤C、将步骤a和步骤b得到的两种溶液混合，在2 8°C条件下搅拌过夜，得到偶联的酶标抗原，再进行G-25凝胶层析柱纯化得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物； 步骤d、将步骤c中的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原稀释于Tris缓冲液中，稀释比例为I 400-1 3000，得到R2试剂；所述Tris缓冲液pH为8. 2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120mM Tris、质量体积百分比为O. 1%的牛血清白蛋白、145.4mM NaCl,3mM MgCl2 ； 定标液的制备方法为将苯妥因校准品溶于空白血清中配制成一系列浓度的标准品。
5.按权利要求4所述的苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述Rl试剂的制备中的步骤c为用O. 2M的pH为8. 5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的本妥因免疫抗原稀释至I. Omg/mL,然后用I. OmL的本妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2 3周后，再用I. OmL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。
6.按权利要求3所述的苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述定标液的制备为将苯妥因校准品溶于空白血清中并配制成O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、·10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL共6种系列浓度的定标液。
全文摘要
本发明的目的是提供一种高度特异性的苯妥因多克隆抗体及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，包括苯妥因特异性多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物的制备，定标液的制备。本发明的苯妥因多克隆抗体特异性强，效价高，在药物交叉反应试验中，对测试的32种常见药物和化合物几乎无任何交叉反应，适合临床检验苯妥因的血药浓度。本发明的苯妥因药物浓度均相酶免疫检验试剂盒灵敏度高，能够准确检测10ng/mL的样本，苯妥因药物浓度的有效检测范围为20ng/mL-40μg/mL。本发明试剂盒的准确率高，回收率在90％以上，简便、快速、成本低、灵敏度高、可全自动化。
文档编号C07K16/44GK102807618SQ20111022864
公开日2012年12月5日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者虞留明, 陈瑞东, 李冬, 王金文, 燕启江 申请人:重庆金域医学检验所有限公司