超临界CO₂萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法

专利名称：超临界CO₂萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法
技术领域：
本发明属于天然生物资源的提取与精制纯化的技术方法，主要是涉及从一种雨生红球藻孢子粉中超临界CO2流体萃取虾青素的方法。
背景技术：
大量研究表明雨生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，雨生红球藻中虾青素的结构以3S-3' S型为主，当前，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点.雨生红球藻可在强光、高温、营养盐(氮、磷)饥饿、·高盐等逆境胁迫件下能够迅速合成并大量积累虾青素，其积累量最高可达藻细胞干质量的4.0%，远远高于从水产品废弃物(虾、蟹等甲壳)中提取和利用红发夫酵母发酵生产虾青素的产量(O. 15% 0.4%，)因此被公认是目前自然界中生产天然虾青素最理想的工具。天然虾青素(Astaxanthin)是发现于水生动物体内的一种类胡萝卜素，呈艳丽红色，为脂溶性，具有高效抗氧化、抗癌变、增强免疫及着色等功能，目前已被广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料等的行业。研究表明，天然虾青素是唯一能通过血脑屏障的一种类胡萝卜素，由于虾青素两端的羟基(-0H)旋光性原因，虾青素具有3S-3' S、3R-3' S、3R-3, R(也称为左旋、消旋、右旋)这3种异构型态，其中人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物(左旋占25%、右旋占25%，消旋50%左右)，极少抗氧化活性，酵母菌源的虾青素是100%右旋(3R-3, R)，有部分抗氧化活性；上述两种来源虾青素主要用在非食用动物和物资的着色上。只有藻源的虾青素是100%左旋(3S-3, S)结构，具有最强的生物学活性，是迄今为止人类发现自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有的抗氧化齐U。其清除自由基的能力是天然VE的1000倍，天然β-胡萝卜素的10倍，葡萄籽的17倍，黄体素的200倍，OPC的150倍，QlO的60倍，多酚的200倍，硫辛酸的75倍，茄红素的7倍。超强的抗氧化活性赋予了天然虾青素突出的生理功能，如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。天然虾青素具有广泛的应用价值，天然藻源的虾青素及其提取物在欧美、日本、东南亚等发达国家已经得到广泛应用，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域具有极大的应用潜力。如在医药领域有望在他汀类和抗血小板药之后掀起第三次预防性药物的浪潮。在化妆品领域，全球差不多一线的化妆品品牌均添加了天然虾青素作为其超强抗氧化剂的成分，包括雅诗兰黛、欧莱雅的DermaE，尤其是日本的品牌高丝(KOSE)、芳凯(FancL)、及曼秀雷登等推出了专门的虾青素系列保湿霜、抗皱眼霜、面膜、口红等，保健品领域，全球的保健品企业也推出了大约200多款虾青素软、硬胶囊、口服液的保健食品。尤其是在日本这个寿命最长的国家最为受到欢迎，近3年来虾青素成为日本最火爆的健康食品。由于雨生红球藻的厚壁细胞细胞壁不但阻碍提取溶剂向细胞内渗透，也影响虾青素溶液的扩散。因此在提取前必须先对雨生红球藻孢子进行破壁处理，以破坏雨生红球藻孢子的细胞结构，从而提高虾青素的提取率。目前，利用雨生红球藻孢子粉提取天然虾青素的技术在国内外已取得一定的进展，文献报道的传统提取方法有溶剂法、超声法、微波法、超高压法、液相色谱法、酶法、这些方法由于虾青素对光、热及有剂溶剂等得不稳定性，存在溶剂残留、环境污染、工艺复杂等局限性，很难实现产业化。近年来利用超临界CO2流体萃取法萃取天然虾青素的研究相继报道，认为高压高温低流量有利于天然虾青素的提取，如申请号200910102291. 4，一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法；申请号201010548303. 9 一种雨生红球藻提取物的制备方法等，这些报道虽然对虾青素的萃取过程作了些研究，但相关研究基本停留在单因子研究上，没有综合考虑各因素之间的相关性，而且对影响其萃取效率的雨生红球藻孢子粉前期处理及影响其成品的品质后其纯化过程没有作深入研究。雨生红球藻在一定逆境条件下，大量合成并积累虾青素过程中造成其细胞壁较厚且存在胶质，加大了虾青素的提取难度，同时藻类中的虾青素大部分以酯类形式存在，其实，从藻类中提取得虾青素其纯度较差，该提取物不是真正的虾青素，是一种虾青素酯类混合物，通常虾青素的转化率只能达到80%左右；且现有技术中超临界C02萃取技术萃取的虾青素萃取率较低，通常只能在7%左右。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，目的在于进一步提高超临界CO2流体萃取技术水平，提高雨生红球藻孢子粉有效成分萃取率，降低生产成本，提高产品品质，萃取物中无有机溶剂；以便超临界0)2流体萃取技术在雨生红球藻孢子粉提取虾青素中得到产业化推广应用；且该方法工艺简单，操作方便。为了解决上述技术问题，本发明超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其中，包括步骤如下a、以雨生红球藻孢子粉为原料，雨生红球藻孢子粉中虾青素含量> 1.5% ;水分(5% (重量百分比)；重金属彡12PPM ；b、对雨生红球藻孢子粉进行预处理；C、将经过预处理的雨生红球藻孢子粉在萃取釜进行网格化充填；将经过预处理的雨生红球藻孢子与玻璃珠混合形成物料，混合重量比为经过预处理的雨生红球藻孢子玻璃珠=4.1；d、进行超临界CO2萃取先在萃取压力35 45Mpa、萃取温度40 70°C，CO2流速20-40L/hr条件下，萃取2小时；再通入95%乙醇为携带剂，萃取I小时，乙醇为物料的
3-7% (按重量百分比)；含有虾青素的CO2流体进行分离釜进行二级分离，一级分离压力8 12Mpa，温度40 50°C;二级分离压力5 7Mpa，温度35 45°C，得到虾青素提取物。上述的超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其中，步骤b中包括如下步骤bl、破壁，破壁率达92%以上，粒度为100 200目；b2、制粒，采用酒精湿法制粒，粒度为14 20目；b3、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对制粒后的雨生红球藻孢子粉颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉颗粒食用酒精=I 1-10按质量比，浸泡时间为4-8小时。
上述的超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其中，可对步骤d萃取的虾青素提取物进行纯化，包括如下步骤E1、阜化，将步骤d萃取的奸青素提取物进行阜化，阜化的水解液为浓度为
O.06-0. lmol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间10-12小时、皂化温度4_6°C ;皂化后冷藏静置3小时，冷藏温度为0-i°c，再分层离心；
E2、将上述加工的虾青素提取物采用高效液相色谱法进行液相色谱分离纯化，分离雨生红球藻中有效色素组分得到虾青素即可。上述超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其中，所述优选萃取温度为65°C，萃取压力为40Mpa，CO2流速为25L/h，萃取时间3. 5小时。本发明的有益效果本发明采用雨生红球藻孢子粉为原料，通过破壁、制粒、浸润的方法对原料进行预处理，并玻璃珠做生物膜载体与雨生红球藻孢子粉混合，进行网格化充填，利用流体与物料颗粒间的传质、传热，通过颗粒与流体间的流化扩散一溶解一分离的循环过程，使CO2流体自下向上流过生物膜载体，从而在单位时间加大雨生红球藻孢子粉颗粒同CO2流体接触面积和充分传质，这样CO2流体在萃取釜中均匀分布，避免出现勾流短路现象，提高CO2流体渗透性及扩散速率，从而增强CO2携带能力，增强雨生红球藻孢子粉有效成分得率，提高了虾青素提取物的萃取率，雨生红球藻孢子粉有效成分萃取率可达到10. 6%左右；提高了雨生红球藻孢子粉有效成分中活性成分含量，使虾青素的转移率达90%左右；另外，对萃取后的虾青素提取物进行纯化处理，可提高虾青素的品质；且通过超临界CO2流体萃取雨生红球藻孢子粉有效成分，可使虾青素提取物无溶剂残留，可有效除铅；另外，本发明工艺简单，生产成本低，可促进超临界CO2流体萃取虾青素技术的推广应用，使超临界CO2流体萃取雨生红球藻孢子粉提取物广泛应用于保健食品、药品和化妆品上。


图I是前处理对虾青素提取率的影响示意图。
图2是萃取压力对虾青素提取率的影响示意图。
图3是萃取温度对虾青素提取率的影响示意图。
图4是最佳实施例的指标意图。
图5是正交因素试验水平表。
图6是萃取温度对虾青素提取率的指标示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。为了解决上述技术问题，本发明超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其中，包括步骤如下a、以雨生红球藻孢子粉为原料，雨生红球藻孢子粉中虾青素含量> 1.5% ;水分(5% (重量百分比)；重金属彡12PPM ；b、对雨生红球藻孢子粉进行预处理；预处理的步骤包括(但不限于)bl、破壁，破壁率大于92%，粒度为100 200目；雨生红球藻孢子粉的厚壁细胞细胞壁不但阻碍提取溶剂向细胞内渗透，也影响虾青素溶液的扩散，因此在提取前必须先进行破壁处理，以破坏雨生红球藻孢子粉的细胞结构，从而提高虾青素的提取率。破壁可采用液氮低温研磨纯物理破壁技术进行破壁处理，也可采用超声纯物理破壁技术进行破壁处理，雨生红球藻孢子粉经过破壁处理后，不仅杜绝了外源性污染，而且保证雨生红球藻孢子粉中有关生物活性成分-虾青素在破壁过程中不被破坏，能最大限度地保留虾青素的生理活性；b2、制粒，使雨生红球藻孢子粉制成的颗粒粒度达到14 20目；将破壁后雨生红球藻孢子粉经酒精进行物理特性湿法制粒，颗粒粒度14-20目；制粒是为了增加物料间的间隙度，解决了物料板结与管路堵塞的问题；且制粒增加了雨生红球藻孢子粉与超临界CO2流体的接触面，雨生红球藻孢子粉中虾青素的萃取更加彻底，大大提高了虾青素的萃取率；
b3、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对雨生红球藻孢子粉制成的颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉制成的颗粒食用酒精=I 1-10按质量比，浸泡时间为
4-8小时，由于虾青素结构式含有两个羟基，极性较大，而CO2流体极性较小，依据相似相溶原理，虾青素在CO2流体溶解度相对较低。因此，将制得的雨生红球藻孢子粉颗粒与95 %食用酒清按重量比I : 1-10浸润4-8小时，目的是增强相极性，提高萃取效率。C、将经过预处理的雨生红球藻孢子粉在萃取釜进行网格化充填；将经过预处理的雨生红球藻孢子与玻璃珠混合形成物料，混合重量比为经过预处理的雨生红球藻孢子玻璃珠=4.1；d、进行超临界CO2萃取先在萃取压力35 45Mpa、萃取温度40 70°C，CO2流速20-40L/hr条件下，萃取2小时；再通入95%乙醇为携带剂，萃取I小时，乙醇为物料的3-7% (按重量百分)；含有虾青素的CO2流体进行分离釜进行二级分离，一级分离压力8 12Mpa，温度40 50°C ;二级分离压力5 7Mpa，温度35 45°C，得到虾青素提取物。以玻璃珠做生物膜载体与雨生红球藻孢子粉颗粒混合并进行网格化充填，利用流体与物料颗粒间的传质、传热，通过颗粒与流体间的流化扩散一溶解一分离的循环过程，使CO2流体自下向上流过生物膜载体，从而在单位时间加大雨生红球藻孢子粉颗粒同CO2流体接触面积和充分传质，这样CO2流体在萃取釜中均匀分布，避免出现勾流短路现象，提高CO2流体渗透性及扩散速率，从而增强CO2携带能力，增强雨生红球藻孢子粉有效成分得率，提高了虾青素提取物的萃取率，使其萃取率达到10 %左右，虾青素的转移率达90 %左右。为了得到纯化的虾青素，提高虾青素的纯度，去除杂质，可对萃取后的虾青素提取物进行纯化，纯化包括如下步骤E1、阜化,将步骤d萃取的奸青素进行阜化,阜化的水解液为浓度为O. 06-0. Imol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间10-12小时、皂化温度4-6°C ;皂化后冷藏静置3小时，冷藏温度为0-1 C，再分层尚心；E2、将上述加工的虾青素采用高效液相色谱法进行液相色谱分离纯化，分离雨生红球藻中有效色素组分，即可；雨生红球藻中虾青素主要以虾青素酯的形式存在，后者组成复杂，且无标准物质，利用传统的高效液相色谱法(HPLC)法来分离雨生红球藻中有效色素组分。实施例一
取虾青素含量重量百分比为I. 5%雨生红球藻孢子粉经低温液氮冷冻粉碎破壁，破壁率为92%，粒度为100目、制粒，将破壁后雨生红球藻孢子粉经酒精进行物理特性湿法制粒，颗粒粒度14-20目、再经过整粒、过筛、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对雨生红球藻孢子粉制成的颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉制成的颗粒食用酒精=I I按质量比，浸泡时间为4小时；将IOOOg玻璃珠干燥后与4000g雨生红球藻孢子粉颗粒混合均匀后进行网格化充填装釜，混合网格化填充采用人工方法，充填过程要注意物料松紧结构，充填结束后按超临界CO2流体萃取操作规程进行流体萃取，萃取控制条件萃取温度为40°c，萃取压力为35Mpa，分离温度32V，分离压力为8Mpa，C02流速为20L/h。萃取时间3. 5小时，萃取结束后收集虾青素提取物358g，萃取率为8. 95%，虾青素含量14. 4%，虾青素转移率为85. 9%。再经皂化、皂化的水解液为浓度为O. 06-0. lmol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间10小时、皂化温度6°C ;皂化后冷藏静置3小时，冷藏温度为0°C，再分层离心高效液相纯化处理，得虾青素成品。实例二
取虾青素含量为I. 5%雨生红球藻孢子粉经低温液氮冷冻粉碎破壁、破壁率为96 %，粒度为400目，制粒，将破壁后雨生红球藻孢子粉经酒精进行物理特性湿法制粒，颗粒粒度16目、整粒、过筛、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对雨生红球藻孢子粉制成的颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉制成的颗粒食用酒精=I 10按质量比，浸泡时间为8小时。IOOOg玻璃珠干燥后与4000g雨生红球藻孢子粉颗粒混合均匀后进行网格化充填装釜，混合网格化填充采用人工方法。充填过程要注意物料松紧结构。充填结束后按超临界CO2流体萃取操作规程进行流体萃取，萃取控制条件萃取温度为50°C，萃取压力为40Mpa，分离温度35V，分离压力为lOMpa，CO2流速为25L/h。萃取时间3. 5小时.萃取结束后收集虾青素提取物424g，萃取率为10.6%，虾青素含量12.8%，虾青素转移率为90. 45%。再经皂化，皂化的水解液为浓度为O. 06-0. lmol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间11小时、皂化温度5°C;皂化后冷藏静置3小时，冷藏温度为1°C，再分层离心、高效液相纯化处理，得虾青素成品.实例三取虾青素含量为I. 5%雨生红球藻孢子粉经低温液氮冷冻粉碎破壁、破壁率为94%,粒度为150目制粒、整粒，将破壁后雨生红球藻孢子粉经酒精进行物理特性湿法制粒，颗粒粒度20目、过筛、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对雨生红球藻孢子粉制成的颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉制成的颗粒食用酒精=I 5按质量比，浸泡时间为6小时，IOOOg玻璃珠干燥后与4000g雨生红球藻孢子粉颗粒混合均匀后进行网格化充填装釜，混合网格化填充采用人工方法。充填过程要注意物料松紧结构。充填结束后按超临界CO2流体萃取操作规程进行流体萃取，萃取控制条件萃取温度为65°C，萃取压力为45Mpa，分离温度40V,分离压力为lOMpa，CO2流速为40L/h。萃取时间3. 5小时.萃取结束后收集虾青素提取物404g，萃取率为10. I%，虾青素含量13.2%，虾青素转移率为88. 9%。再经皂化、皂化的水解液为浓度为O. 06-0. lmol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间12小时、皂化温度6V ;阜化后冷藏静置3小时，冷藏温度为1°C，再分层离心高效液相纯化处理，得虾青素成品。以上实施的实例以虾青素转移率为考核指标，通过考察物料的处理方法、萃取的压力、萃取温度、萃取时间及流体的流速对指标的影响，通过响应面曲线对萃取参数进行优化，通过对提取的皂化及纯化，从而建立了一种从雨生红球藻孢子粉萃超临界CO2流体取并纯化虾青素的最佳工艺方法。 I、萃取得率及虾青素转移率计算方法
萃取物质量(g)
萃取率 = --X100%
雨生红球藻孢子粉颗粒质量(g) 萃取物质量(g) X奸青素含量
虫下青素转移率= - X 100%
雨生红球藻孢子粉颗粒质量(g) X奸青素含量2、虾青素含量检测水法高效液相色谱法色谱条件色谱柱LichrospherC18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相乙腈甲醇水(75 25 10)；流速0.8mL/min ；检测波长476nm；进样量IOyL; 柱温室温。3、试验因素影响3. I物料前处理的影响雨生红球藻孢子粉细胞壁厚，提取前必须要经过破壁处理，不同的破壁方式对提取效果有所不同；但破壁后由于粉过细，原料间的空隙小，物料易板结，导致流体勾流，不利于CCV流体的传质传热效果，影响其提取效率；因些需对破壁细粉进行制粒，并用95%的食及酒精对颗粒进行浸润，使乙醇渗入到经破壁的细胞组织，使细胞壁膨胀，同时增强溶剂的相极性，有利于萃取过程中提高萃取溶剂对溶质的溶解度。3. 2萃取压力实验萃取压力对雨生红球藻孢子粉中虾青素提取率的影响如图分离釜中虾青素酯的得率随萃取压力的增加呈上升趋势；高压有利于虾青素的释放，当萃取压力> 45MPa，分离釜中的油脂量则随萃取压力的升高而又重新缓慢递增。尽管压力越大，萃取得率越高。然而由于压力过高，生产成本将增加，同时增加了不安全因素。因此选取合适的萃取压力为35 45MPa范围。表2萃取压力对虾青素提取率的影响
压力 MPa I 25 I 3035404550
萃取率 ％ ~62 6.48~ 8.77 ~ 10.17 10.01 9. 53
3. 3萃取温度实验结果表明在萃取流量和萃取压力恒定时，萃取得率在一定范围内随温度升高而增加，但超过一定温度，萃取率反而下降。这是由于温度升高到一定程度时，因密度变化引起的溶解能力占主导地位，从而使总的萃取能力下降。3. 4萃取时间实验4.结果表明只有当萃取时间大于2h以后,取效果才会明显,萃取时间的最佳条件为3. 5h左右。当萃取时间延长至4h以上时，萃取得率增长十分缓慢。正交试验根据因素实验的结果，以萃取压力(A)、萃取温度(B)、颗粒度(C)萃取时间(D)(作为主要因素，安排了四个因素的三水平正交实验。以确定它们对超临界流体萃取效果的影响主次关系以及最终确定较优的超临界CO2流体萃取工艺参数，CO2流速为25L/h。正交试·验表设计如表(图5)。本实施以虾青素转移率为指标，通过考察物料的处理方法、萃取的压力、萃取温度、萃取时间对指标的影响，确定了萃取最佳工艺条件萃取温度为65 C，萃取压力为40Mpa，粒径16目，CO2流速为25L/h。萃取时间
3.5小时.效果虾青素提取物萃取率达10. 6%，虾青素转移率达90. 45%。
权利要求
1.超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其特征在于，包括步骤如下 a、以雨生红球藻孢子粉为原料，雨生红球藻孢子粉中虾青素含量>1.5% ;水分< 5%(重量百分比)；重金属彡12PPM ； b、对雨生红球藻孢子粉进行预处理； C、将经过预处理的雨生红球藻孢子粉在萃取釜进行网格化充填；将经过预处理的雨生红球藻孢子与玻璃珠混合形成物料，混合重量比为经过预处理的雨生红球藻孢子玻璃珠= 4:1; d、进行超临界CO2萃取先在萃取压力35 45Mpa、萃取温度40 70°C，CO2流速20-40L/hr条件下，萃取2小时；再通入95 %乙醇为携带剂，萃取I小时，乙醇为物料的3-7% (重量百分比)；含有虾青素的CO2流体进行分离釜进行二级分离，一级分离压力8 12Mpa，温度40 50°C ;二级分离压力5 7Mpa，温度35 45°C，得到虾青素提取物。
2.如权利要求I所述的超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其特征在于，步骤b中包括如下步骤 bl、破壁，破壁率达92%以上，粒度为100 200目； b2、制粒，采用酒精湿法制粒，粒度为14 20目； b3、浸润，采用质量百分比浓度为95%食用酒精对制粒后的雨生红球藻孢子粉颗粒进行浸泡，雨生红球藻孢子粉颗粒食用酒精=I 1-10按质量比，浸泡时间为4-8小时。
3.如权利要求I或2所述的超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其特征在于，可对步骤d萃取的虾青素提取物进行纯化，包括如下步骤 El、阜化，将步骤d萃取的奸青素提取物进行阜化，阜化的水解液为浓度为O.06-0. lmol/L的KOH甲醇溶液，皂化时间10-12小时、皂化温度4_6°C ;皂化后冷藏静置3小时，冷藏温度为ο-rc，再分层离心； E2、将上述加工的虾青素提取物采用高效液相色谱法进行液相色谱分离纯化，分离雨生红球藻中有效色素组分得到虾青素即可。
4.如权利要求I所述超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，其特征在于，所述优选萃取温度为65°C，萃取压力为40Mpa，CO2流速为25L/h，萃取时间3. 5小时。
全文摘要
本发明公开了一种超临界CO2萃取雨生红球藻孢子粉有效成分的方法，针对雨生红球藻中虾青素的结构以3S-3’S型为主的特性，对雨生红球藻孢子粉进行液氮低温研磨物理破壁，制粒、浸润等生物处理后，再经超临界CO2流体进行萃取分离，萃取分离过程中通过调节流体的温度、压力及流量及萃取时间来收集虾青素提取物，再经皂化，液相色谱分离纯化，制得高品质的虾青素，使虾青素的转化率达到90％左右；大大提高了虾青素的萃取率。
文档编号C07C403/24GK102911095SQ201110329219
公开日2013年2月6日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者毛日文, 邵兴军, 蒋云云 申请人:江苏江大源生态生物科技有限公司