水解酶酶底物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明基于所述水解酶的新底物提供用于检测样品中水解酶的存在或总量的新方法，也提供了高灵敏度的用于检测这类水解酶的新的构思和方法。
【专利说明】水解酶酶底物及其应用
交叉引用相关申请
[0001]该申请要求2011车I月18日提交的申请号为N0.61/433,909的美国临时申请的优先权，该临时申请的内容全部被引用包含于该申请中。
【技术领域】
[0002]本发明主要涉及某种水解酶酶底物及其应用。特别地，本发明提供了作为一些水解酶底物的新化合物，借所述水解酶将水解酶底物转变成容易检测到的水解产物，例如，通过这里所述的酶催化方法。
【背景技术】
[0003]在许多生物化学系统中，酶被广泛用作灵敏的标签，包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)系统，以及核酸分析，例如PCR和测序系统。酶经常被间接地检测到，基于它们的活性，通常基于它们的底物至产物的转换，或辅因子之间的转换，例如氧化态和还原态之间。
[0004]在一些实例中，待检测的酶连接在高度特异的络合或结合剂上，例如抗体。当抗体结合在待检测的目标分子上时，抗体复合体可以通过观察连接着它的酶标的存在而被检测到；基于其活性，所述酶容易被检测到。在其它系统中，待表达的寡核苷酸通过连接编码可以作为标签的酶的核酸来被标记。当寡核苷酸被表达时，包含利于检测酶标的蛋白产物，又是基于酶的活性。
[0005]酶活性的检测提供了非常有效的信号放大。目前并非检测通常小量的酶(或目标化合物)，而是寻找酶的活性，即它对已知的可以加入相对大量的底物的作用。单独的酶分子可以催化大量的底物分子的转化(例如，酶每分钟可以催化IO7个反应:THE ImmlmoassayHandbook，3rded.by David Wild, Elsevier Press, pgl94 (2005)免疫测定指南，第 3 版，大卫.怀尔德(David Wild)主编，爱思唯尔出版社(Elsevier)出版，194页(2005))，因此实际检测到的形式可以是酶形成的产物，或底物的消失，或酶消耗的辅因子，而不是酶本身。固在观察酶活性时，人们检测大量的底物或产物分子而非酶本身，这提供了高度放大的信号。
[0006]许多这样的酶标是已知的:包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶在内的大部分通常用于免疫测定(例如:ELISA)的酶标。其它已经使用的酶标包括乙酸激酶、荧火虫荧光素酶、黄嘌呤氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。识别号194-195(Id.atl94-195)。
[0007]然而，仍然需要新的方法来标记生物化学种类从而有利于极小量的检测，因此需要新的酶标系统。也仍然需要方法来检测痕量水解酶，该酶在其它体系中不只是作为标签。本发明提供了这样的方法以及在这些方法和条件中使用的化合物和成分。
【发明内容】
[0008]—方面，本发明提供了某些水解酶的底物、包含这些底物的成分，以及用这些底物来确定水解酶的存在的方法，该水解酶能够水解所述底物。在一些实施例中，水解酶可以用作试验系统的标记例如ELISA，例如，或者编码水解酶的核酸可以连接在待表达的寡核苷酸上，在这种情况下所述寡核苷酸的表达产生包含所述功能水解酶的多肽:这里描述的成分和方法有助于在这些或其它系统中检测所述水解酶。
[0009]一方面，本发明提供下述化学式的化合物，所述化合物是目标水解酶的底物。
【权利要求】
1.一种水解酶底物，是表达式(I)所示的化合物:
2.权利要求1中的水解酶底物，其中A是任意取代的芳香族基团或杂芳族基团。
3.权利要求2中的水解酶底物，其中A是任意取代的苯基或萘酚；
4.权利要求1中的水解酶底物，其中A是表达式(IV)所示的1-烯烃:
5.权利要求1中的水解酶底物，其中A是表达式(V)所示的1-炔烃:
6.权利要求1中的水解酶底物，其中R是氢原子、甲基或苯基。
7.权利要求1中的水解酶底物，其中X包括糖类。
8.权利要求7中的水解酶底物，其中所述化合物如表达式(VIa)或(VIb)所表示:
9.权利要求1中的水解酶底物，其中所述化合物是表达式(VII)所示的酯类:
10.权 利要求9中的水解酶底物，其中R3是选自甲基、乙基和苯基组成的组的基团，或者其中的HO2C-R3是α氨基酸。
11.权利要求1中的水解酶底物，其中的复合物是表达式(VIII)所示的化合物:
12.权利要求1中的水解酶底物，其中X包括磷酸基团。
13.权利要求12中的水解酶底物，其中所述复合物是表达式(IX)所示的化合物:
14.权利要求1-3或6-13所述任一水解酶底物，其中A是可被任意取代的苯基基团。
15.权利要求14中的水解酶底物，其中所述苯基基团是不可被替代的，或者可被选自halo、氢氧根、CN、NO2, COORj、CONRj 2、NR’ 2、0R’的I~3个基团取代、性地被C1-4烷基、SR，、SO2R，或 SO2NR’ 2 替代，其中每个R’是独立的氢原子或可被任意取代的C1-4烷基，并且在相同或相邻的原子上的两个R’可被同时取代从而形成任意取代的C3-C8杂环。
16.上述权利要求所述的任一水解酶底物，其中烷基和杂环基团的取代物选自halo、0X0、CN、N02、COOR”、CONR” 2、NR” 2、OR”、任意取代 C1-4 烷基、SO2R” 或 S02NR” 2，其中每个 R”都是独立的氢原子或C1-4烷基。
17.权利要求1中的水解酶底物，其中A是表达式(X)所示的基团:
18.前述权利要求中所述的任一水解酶底物，其中R是氢原子。
19.前述权利要求中所述的任一水解酶底物，其中η是I。
20.权利要求1中的水解酶底物，其中X包括糖苷酶底物成分。
21.权利要求20中的水解酶底物，其中所述糖苷酶是β-半乳糖甘酶。
22.权利要求1中的水解酶底物，其中X包括酯酶底物成分。
23.权利要求22中的水解酶底物，其中所述酯酶选自羧酸酯酶、乙酰酯酶和α-氨基酸酯酶组成的组。
24.权利要求1中的水 解酶底物，其中X包括磷酸酶底物成分。
25.权利要求24中的水解酶底物，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
26.组合物,包括: a)权利要求1-25所述任一水解酶底物；和 b)可分解所述水解酶底物并生成由所述水解酶催化的所述裂解反应的产物的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的水解酶，其中所述的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子具有有下列表达式(II)的结构:
27.权利要求26中的组合物，其中所述水解酶是酯酶，磷酸酶或糖苷酶。
28.权利要求27中的组合物，其中所述水解酶来自乙酰酯酶、氨基酸酯酶、羧酸酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶组成的组。
29.权利要求27中的组合物，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
30.权利要求28中的组合物，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
31.权利要求27中的组合物， 其中所述水解酶是β-半乳糖甘酶。
32.权利要求27中的组合物，其中所述水解酶是β-糖甘酶。
33.权利要求26中的组合物，还包括可氧化由所述水解酶催化的裂解反应的产物-芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的氧化剂。
34.权利要求33中的组合物，其中所述氧化剂是在有氧条件下可氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2的芳基醇氧化酶或不饱和脂肪族醇氧化酶。
35.权利要求34中的组合物，进一步包括用于测定H2O2的试剂。
36.权利要求35中的组合物，其中所述用于测定H2O2的试剂包括过氧化物酶、4-AA和/或苯胺类似物。
37.权利要求33中的组合物，其中所述氧化剂是在NAD+orNADP+存在下可氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH的芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶。
38.权利要求37中的组合物，进一步包括NAD+或NADP+。
39.权利要求38中的组合物，进一步包括用于测定NADH或NADPH的试剂。
40.权利要求34中的组合物，进一步包括NADH或NADPH以及在NADH或NADPH存在下可还原芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子的芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶。
41.权利要求40中的组合物，进一步包括用于测量H2O2的试剂。
42.权利要求41中的组合物，其中所述用于测量H2O2`的试剂包括过氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺类似物中的至少一种。
43.权利要求26中的组合物，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β -糖苷酶或β -半乳糖苷酶。
44.权利要求43中的组`合物，进一步包括: a)在有氧条件下可氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化镁；
b)NADH 或 NADPH c)在NADH或NADPH存在下还原芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子的芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶。
45.权利要求44中的组合物，进一步包括用于测量H2O2的试剂。
46.权利要求26中的组合物，其中所述水解酶底物至少包括碱性磷酸酶底物分子的一部分，且水解酶是碱性磷酸酶。
47.权利要求46中的组合物，进一步包括: a)在有氧条件下可氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶；
b)NADH 或 NADPH ； c)在NADH或NADPH存在下可还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶。
48.权利要求47中的组合，至少还包括一种用于测定H2O2的试剂。
49.权利要求26-48所述任一组合物，其中所述组合物的成分包含于试剂盒中。
50.权利要求26-49所述任一组合物，其中的组合物包括于针对靶标物的的分析、分离和/或制备系统中。
51.权利要求50中的组合，其中所述靶标物是无机分子、有机分子和/或它们的化合物。
52.权利要求51中的组合，其中所述靶标物是选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂类和它们的复合物组成的组中的有机分子。
53.权利要求52中的组合，其中所述系统是用于免疫分析、蛋白测序、核酸扩增、杂交和/或测序的系统。
54.用于评估样品中水解酶活性和/或总量的方法，包括: a)将实施例1-25中任一水解酶底物与包含或疑似包含所述水解酶的样品接触，所述水解酶底物具有表达式(I)中的结构:
55.权利要求54中的方法，其中所述水解酶是酯酶，β-半乳糖苷酶或糖苷酶。
56.权利要求55中的方法，其中所述水解酶是选自乙酰胆碱酯酶、氨基酸酯酶、羧基酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶组成的组中的酯酶。
57.权利要求56中的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
58.权利要求56中的方法，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
59.权利要求55中的方法，其中所述水解酶是β-半乳糖苷酶。
60.权利要求55中的方法，其中所述水解酶是β-糖苷酶。
61.权利要求54中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括用氧化反应物氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
62.权利要求61中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成H2O2以及并评估所述H2O2的存在和/或总量来评估。
63.权利要求62中的方法，其中所述所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物接触来评估。
64.权利要求54中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH，并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
65.权利要求54中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过下述方法评估: a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2 ； b)使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子形成反应循环，其中被还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化生成额外的芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2 ;同时 c)评估H2O2的存在和/或总量或NADH、NADPH、NAD+或NADP+的总量。
66.权利要求65中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺类似物进行接触来评估。
67.权利要求54 中的方法，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β -糖苷酶或β -半乳糖苷酶。
68.权利要求67中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括使用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
69.权利要求67中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
70.权利要求69中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、4-ΑΑ和/或苯胺类似物进行接触来评估。
71.权利要求67中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
72.权利要求67中的方法，其中所述芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子存在和/或总量通过下述方法评估: a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2 ； b)使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子形成反应循环，其中被还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化生成额外的被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2 ;同时 c)评估H2O2的存在和/或总量。
73.权利要求72中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物进行接触来评估。
74.权利要求54中的方法，其中所述水解酶底物至少包括碱性磷酸酶底物分子的一部分，且水解酶是碱性磷酸酶。
75.权利要求74中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括使用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
76.权利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
77.权利要求76中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林、和/或苯胺类似物接触来评估。
78.权利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
79.权利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过如下方法评估: a)用所述芳基醇氧化酶或不饱和脂肪族醇氧化膜在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2 ； b)用所述芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子以形成反应循环，其中还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或不饱和脂肪族醇氧化膜在有氧条件下氧化并生成额外的氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2 ;并且 c)评估H2O2的存在和总量。
80.权利要求79中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物进行接触来评估。
81.权利要求54-80所述任一方法，作为针对靶标物的分析、分离和/或制备的一部分来进行。
82.权利要求81中的方法，其中所述靶标物是无机分子、有机分子和/化合物或它们的复合物。
83.权利要求82中的方法，其中的有机分子选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、化合物脂类和它们的复合物组成的组。
84.权利要求82中的方法，作为免疫分析、蛋白测序、核酸扩增、杂交或测序的一部分来进行。
85.权利要求84中的方法，用于监控RNA或DNA测序。
86.权利要求85中的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
【文档编号】C07H15/18GK103889997SQ201280005787
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年1月17日 优先权日:2011年1月18日
【发明者】袁崇生, 陈小茹 申请人:通用原子公司