使用高密度脂蛋白(hdl)相关分子治疗和预防促炎性病状的制作方法
【专利摘要】本发明阐述用于治疗和预防促炎性病状的分子和组合物。高密度脂蛋白HDL相关分子(尤其包括ApoA-I、牛HDL和HDL模拟物)显示可在皮肤细胞中预防UV诱导的细胞死亡和氧化性应激，并在多种癌症中抑制肿瘤生长和发展。HDL相关分子可作为口服补充剂和在其它组合物中用于预防或治疗促炎性皮肤病状和全身性促炎性病状，包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s?disease)和各种癌症。
【专利说明】使用高密度脂蛋白(HDL)相关分子治疗和预防促炎性病状
[0001]本申请案主张2012年5月14日申请的美国临时专利申请案61/646，772、2012年4月15日申请的61/624，333和2011年8月29日申请的61/528，447的权益，所述每一申请案的全部内容是以引用方式并入本文中。
[0002]本申请案涉及2010年10月4日申请的美国临时专利申请案第61/389，618号和2010年8月20日申请的美国专利申请案第12/860，293号(所述申请案第12/860，293号为2009年12月3日申请的申请案第12/630，458号的部分接续案，所述申请案第12/630,458号为2007年7月18日申请的申请案第11/571,986号、现在的专利第7，670，792号的分割案，所述申请案第11/571,986号为2005年7月14日申请的PCT/US2005/024985根据35U.S.C.§ 371的国家阶段申请，所述PCT/US2005/024985主张2005年4月25日申请的美国临时专利申请案第60/674，489号和2004年7月14日申请的60/588，007的权益)，所述每一申请案的全部内容是以引用方式并入本文中。
[0003]在本申请案全文中参考各个公开案。这些公开案的揭示内容是全文由此以引用方式并入本申请案中，以更全面地阐述本发明所属领域的技术状态。
【技术领域】
[0004]本发明一股来说涉及通过使用HDL相关分子预防和治疗促炎性病状和癌症。本发明更特定来说涉及载脂蛋白A-1 (ApoA-1)、HDL和HDL模拟物，以及其在预防和治疗促炎性病状中的用途，所述促炎性病状包括皮肤和全身性促炎性病状，尤其是上皮癌症以及阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、炎症性皮肤病、炎症性肠病和与衰老相关的炎症性疾病。分子(包括全长ApoA-1蛋白质、HDL、抗体和调节和/或模拟这些靶的表达和/或功能的反义/干扰核苷酸)可单独或与其它抗氧化剂组合用于用来治疗各种病状的口服补充剂、疫苗和医药组合物中。
【背景技术】
[0005]促炎作用是与应激高度相关且与各种疾病相关联的普遍现象。一股引发促炎性活性来克服可能有害的生物因子(细菌、病毒、寄生虫等)的感染或侵袭。在对抗侵袭时，促炎作用具有有益且恶化的能力，且可发挥有害效应。不平衡的全身性炎症反应的后遗症包括微循环紊乱、休克、渗出到器官中以及凝固缺陷。不平衡的全身性补偿性抗炎症反应经常导致乏力和免疫抑制。
[0006]业内仍需要预防和治疗促炎性病状、包括促炎性皮肤病状和上皮癌症的改良工具。
【发明内容】
[0007]本发明提供HDL相关分子和使用所述分子治疗和预防促炎性病状和癌症的方法。HDL相关分子包括ApoA-1、牛HDL和HDL模拟物。如下文更详细地阐述，呈天然全长形式的ApoA-1可预防UV诱导的细胞死亡和氧化性应激。下文还更详细地阐述如下意外发现:HDL模拟物、ApoA-1和牛HDL(bHDL)可用于治疗和预防各种癌症。
[0008]在一个实施例中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法。所述方法包含使肿瘤细胞与选自由以下组成的群组的HDL相关分子接触:HDL模拟肽(例如那些显示于SEQ ID N0:U3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。另一实施例提供治疗或预防个体的癌症的方法。所述方法包含向所述个体投与选自由以下组成的群组的HDL相关分子:HDL模拟肽(例如那些显示于SEQ IDNO:1、3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。在本发明的另一实施例中，提供减少暴露于氧化性应激的上皮细胞的死亡和/或氧化性应激的方法。所述方法包含使所述上皮细胞与选自由以下组成的群组的HDL相关分子接触:HDL模拟肽(例如那些显示于SEQ ID NO:1、3-9、12、14或26-28中者)、牛HDL和ApoA-1。在一个实施例中，所述接触是在暴露于氧化性应激之前进行。在典型实施例中，所述接触是在暴露于氧化性应激之前至少12-24小时进行。氧化性应激可包含(例如)暴露于紫外辐射。
[0009]HDL相关分子可任选地作为口服补充剂来投与。待用本发明方法治疗的个体可为(例如)哺乳动物个体，通常是人类个体。
[0010]对于在本发明方法中的使用，ApoA-1可为全长蛋白质，其可作为重组Ap0A-1和/或以未修饰形式投与。在一个实施例中，ApoA-1是天然全长未修饰ApoA-1。
[0011]根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述HDL模拟肽选自由以下组成的群组:SEQ IDNO:1、3-9、12、14 和 26-28。
[0012]在一个实施例中，本发明提供HDL相关分子，其用于治疗癌症、用于抑制肿瘤生长和/或用于减少上皮细胞的死亡和/或氧化性应激。HDL相关分子选自由以下组成的群组:HDL模拟肽(SEQ 10勵:1、3-9、12、14或26-28)、牛邢1^和六?0八-1。在一个实施例中，本发明提供新颖HDL模拟肽，包括那些具有SEQ ID NO:1、3-9、12、14或26-28中所示氨基酸序列者。在典型实施例中，肽由SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:3_9中所示任一序列组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1.棒图，其绘制UV暴露的NIH3T3细胞的细胞活力分析的结果图，且显示ApoA-1处理的保护性效应。
[0014]图2.棒图，其绘制细胞活力图且显示，ApoA-1 (上图)预处理(10μg/ml)保护NIH3T3细胞免受UV诱导的细胞死亡，而同样与HDL样apoA_I相关的蛋白质ApoA-1I (下图)无法预防NIH3T3细胞的UV诱导的细胞死亡。
[0015]图3.肺重量和肿瘤体积的图形和数字显微照相图，其比较在APCmin/+小鼠(人类家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中用bHDL和媒剂对照处理。
[0016]图4A-4E.与用L-4F和L-4F2处理的小鼠相比，在用sc_4F处理的BALB/c小鼠中，对侧腹肿瘤重量和体积的效应的图形和数字显微照相图。图4A和4B分别显示肿瘤重量和体积。图4C和4D分别显示三个组中每一组的重量和体积分数的分布百分比(对照作为100% ) 。三个组的侧腹肿瘤的代表性照片显示于图4E中。
[0017]图5A-5E.在用28AA和28AA-2肽处理的已在侧腹皮下注射CT26细胞的BALB/c小鼠中，对侧腹肿瘤重量和体积的效应的图形和数字显微照相图。在远离CT26细胞注射部位的位点用以每天10mg/kg皮下注射15天的媒剂(η = 12)或28ΑΑ(η = 10)或28ΑΑ-2 (η=11)处理小鼠。图5A和5B分别显示肿瘤重量和体积。图5C和ro显示三个组中每一组的重量和体积分数的分布百分比(对照作为100% )。三个组的侧腹肿瘤的代表性照片显示于图5E中。
[0018]图6A和6B绘制MTS细胞活力分析的结果图。用L-4F、L_4F2、28AA或28AA-2肽(10 μ g/ml)处理CT26细胞且与对照相比(图6A)。还在活体外用所有4种肽处理来测定NIH3T3细胞活力。NIH3T3细胞活力不受4种肽中的任一种影响(图6B)。
[0019]图7A-7D.数字显微照片，其显示ApoA-1模拟肽L_4F在活体内和活体外抑制HIF-1a表达。图7么，&?(^-1模拟肽1^4?在活体内抑制!1正-10表达和血管生成。如实例4中所述在野生型C57BL/6J小鼠中建立侧腹肿瘤。在肿瘤生长后两周，用乱序肽(SC-4F)或L_4F(10mg/kg皮下,每天注射)将小鼠处理3周。对来自经解剖肿瘤的冷冻切片(5 μ m)进行苏木素(hematoxylin)和曙红(eosin, H&E)染色(左)、HIF-1 α染色(中)和CD31染色(右)。对每个载玻片的四个随机选择的视野进行分析(η = 4只小鼠/组)。代表图是以400Χ放大显示。箭头指示HIF-1a阳性染色。图7Β，L-4F预处理抑制人类卵巢癌细胞系中的CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α表达。用媒剂或不同浓度的L_4F(1、3和1yg/ml)将细胞处理lh，且再经4h添加所指示刺激剂。左，在0V2008细胞中，L-4F预处理抑制CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α表达。右，在CA0V-3细胞中，L-4F预处理抑制CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α表达。图7(:和图70，1^-4?降低0￥2008细胞中!1正-10的CoCl2诱导的(图7C)和胰岛素诱导的(图7D)核表达。用小鼠单克隆抗HIF-1 α 一级抗体和作为二级抗体的经阿莱克萨福罗(Alexa Fluor) 568 (红色荧光)标记的山羊抗小鼠IgG对细胞进行免疫染色。使用DAPI对核进行染色(在相应公开原稿中为蓝色)。图像是以200X原始放大显示。虚线和 框显示放大图像的来源区域。显示具有类似结果的两个独立实验的代表性照片。所用刺激剂的浓度为:100 μ M CoCl2和200ηΜ胰岛素。
[0020]图8A-8D.棒图，其显示在0V2008细胞中HIF-1a靶基因表达受L-4F抑制。图8Α，CoCl2刺激的HRE报道基因转录受L-4F预处理的抑制。用pGL3-Epo-HRE-Luc质粒转染0V2008细胞且使其在完全生长培养基中生长24h。在过夜饥饿后，首先用L-4F(10l.! g/ml)将细胞处理lh，然后用CoCl2(10yM)再处理6h。如实例4中所述测定荧光素酶活性。图8B，在CoCl2处理细胞中，L-4F抑制HIF-1 α靶基因的表达。在血清饥饿过夜后，用L-4F(10y g/ml)将0V2008细胞处理lh，然后用CoCl2(10yM)再处理6h。分离总RNA，且通过实时RT-PCR测量VEGF、葡萄糖转运蛋白I(GLUTl)和醛缩酶-A (ALDO-A)mRNA水平的表达。使用GAPDH进行规范化。图8C，胰岛素刺激的HRE报道基因转录受L-4F预处理抑制。用pGL3-Epo-HRE-Luc质粒转染0V2008细胞且使其在完全生长培养基中生长24h。在饥饿过夜后，用L-4F (10 μ g/ml)将细胞处理lh，然后用胰岛素(200nM)再处理16h。如实例4中所述测定荧光素酶活性。图8D，在胰岛素处理细胞中，L-4F抑制HIF-1 α靶基因的表达。在血清饥饿过夜后，用L-4F (10 μ g/ml)将0V2008细胞处理lh，然后用胰岛素(200nM)再处理16h。分离总RNA且通过实时RT-PCR测量VEGF、葡萄糖转运蛋白I (GLUTl)和醛缩酶-A(ALD0-A)mRNA水平的表达。使用GAPDH进行规范化。#，与相应对照组相比，p〈0.05。##，与相应对照组相比，p〈0.01。*，与相应CoCl2-或胰岛素处理组相比，p〈0.05。**，与相应CoCl2-或胰岛素处理组相比，p〈0.01。每一组η = 3。
[0021]图9A-9D.在CoCl2-和胰岛素处理的0V2008细胞中，L-4F的后处理降低HIF-1 a蛋白质水平和活性。用CoCl2(10yM)或胰岛素(200nM)将细胞处理24h，然后用媒剂或L-4F(10y g/ml)再处理1、2或4h。图9A，在CoCl2-和胰岛素处理的0V2008细胞中，用10 μ g/ml L-4F后处理降低HIF-1 α蛋白质水平。图9Β，在0V2008细胞中，用10 μ g/mlL_4F后处理4h降低CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α核水平的增加。用小鼠单克隆抗HIF-1 α 一级抗体和作为二级抗体的经阿莱克萨福罗568(红色荧光)标记的山羊抗小鼠IgG对细胞进行免疫染色。使用DAPI对核进行染色(在相应公开原稿中为蓝色)。图像是以400Χ原始放大显示。显示具有类似结果的两个独立实验的代表性照片。图9C和图9D，在CoCl2-和胰岛素处理细胞中L-4F的后处理对HRE报道基因转录的抑制。用pGL3-Ep0-HRE-Luc质粒转染0V2008细胞且使其在完全生长培养基中培养24h。在饥饿过夜后，用CoCl2(10yM)或胰岛素(200nM)将细胞处理24h，然后用LIF(1ygAil)再处理4h(图9C)或24h (图9D)。如实例4中所述测定荧光素酶活性。**，与相应CoCl2-或胰岛素处理组相比，p〈0.01。每一组η = 3。
[0022]图10Α-10Β.L_4F对0V2008细胞中下游信号传导分子的胰岛素刺激活化的效应。在过夜饥饿后，用L-4F(10 μ g/ml)将0V2008细胞处理lh，并以200nM终浓度添加胰岛素。在不同时间点收集细胞裂解物并对其进行蛋白质印迹(Westernblot)分析。图10A,在0V2008细胞中，L-4F抑制p70s6激酶的胰岛素刺激的磷酸化以及后续HIF-1a表达。图10B，在0V2008细胞中，L-4F对ERK1/2和Akt的胰岛素刺激的磷酸化的效应。
[0023]图11A-11B.在0V2008细胞中，L-4F对HIF-1 α蛋白质稳定性的效应。图11A，左，在0￥2008细胞中，1^-4?的预处理促进!1正-10降解。在过夜饥饿后，用胰岛素(200nM)将0V2008细胞处理3h，用L-4F(10y g/ml)处理lh，并用CHX (20 μ g/ml)处理不同持续时间。收集细胞裂解物并对其进行蛋白质印迹分析。显示来自具有类似结果的三个独立实验的代表性数据。右，在0￥2008细胞中，1^-4?处理促进!1正-1(1降解。在过夜饥饿后，用胰岛素(200nM)将0V2008细胞处理3h，然后同时用L-4F(10μg/ml)和CHX (20 μ g/ml)处理。在不同时间点收集细胞裂解 物且对其进行蛋白质印迹分析。显示来自具有类似结果的三个独立实验的代表性数据。图11B，在胰岛素处理的0V2008细胞中，L-4F的预处理对HIF-1 a的蛋白酶体介导的降解的效应。在过夜饥饿后，用MG-132(10yM)将0V2008细胞处理3h，用L-4F(10y g/ml)处理lh，并用胰岛素(200nM)再处理4h。收集细胞裂解物并对其进行蛋白质印迹分析。显示来自具有类似结果的三个独立实验的代表性数据。
[0024]图12A-12B.L-4F对CoCl2-和胰岛素刺激的ROS产生的效应。用L_4F(10 μ g/ml)将0V2008细胞预处理lh，然后用胰岛素(200nM)/CoCl2(10yM)和DCFH-DA (10 μ Μ)处理30min。在用PBS将细胞洗涤两次后，用荧光显微镜捕捉细胞图像。代表图是以200X原始放大显示。图12A，在0V2008细胞中，L-4F抑制胰岛素刺激的ROS产生。图12B，在0V2008细胞中，L-4F抑制CoCl2刺激的ROS产生。
[0025]图13A-13F.CT26细胞介导的肺肿瘤和侧腹肿瘤在经HDL模拟物L-4F皮下处理的BALB/c小鼠中显著减小。如实例5中所述在BALB/c小鼠(n = 11只/组)中建立肺肿瘤。在通过尾静脉注射投与CT26细胞后3周处死小鼠。采集肺并称重。对肺肿瘤进行计数。图13Α，所显示数据为接受每天以10mg/kg皮下投与的SC-4F或L-4F的小鼠的肺重量。Ρ〈0.01。图13Β，所显示数据为在2组小鼠的肺表面上计数的肿瘤数。Ρ〈0.001。图13C，2组小鼠的代表性肿瘤在肺表面上显示肿瘤结节。图13D和图13E，如实例5中所述在BALB/C小鼠中建立侧腹肿瘤。在皮下投与CT26细胞后15天处死小鼠并测量肿瘤重量。图13D，所显示数据为接受每天以10mg/kg皮下投与的sc-4F或L-4F的小鼠的肿瘤重量。P〈0.05。图13E，显示2组小鼠的代表性肿瘤。w/sc-4F，经sc_4F处理的小鼠；w/L_4F，经L-4F处理的小鼠。F，A中所示实验的血浆IL-6水平。P〈0.05。
[0026]图14A-14D.CT26细胞介导的肺肿瘤在经在鼠粮中投与的L_4F处理的BALB/c小鼠中显著减小。如实例5中所述在BALB/c小鼠中建立肺肿瘤。在通过尾静脉注射投与CT26细胞后3周处死小鼠。采集肺并称重。对肺肿瘤进行计数。图14A，所显示数据为接受以100mg/kg/d(2mg/小鼠/d)混合到鼠粮饮食中的sc_4F(η = 12)或L-4F(η = 9)的小鼠的肺重量。P〈0.05。图14B，所显示数据为在2组小鼠的肺表面上计数的肿瘤数。P〈0.0001。图14C，对肺表面的肿瘤组织进行切片并用抗CD31抗体实施CD31免疫染色以供检测微血管中的内皮细胞。红色染色代表CD31染色。w/sc-4F，经sc-4F处理的小鼠；w/L_4F，经L-4F处理的小鼠。图14D，如实例5中所述测量血浆LPA水平。P〈0.01。
[0027]图15A-15C.在C57BL/6J_APCmin/+小鼠的肠道中，鼠粮饮食中的L_4F处理对肿瘤数和大小的效应。如实例5中所述，在用在鼠粮中投与的sc-4F或L-4F处理8周后处死APCmin7^jHlU图15A，在用在鼠粮中投与的L-4F处理8周后，肠道中的总肿瘤数表示为对照(即，经SC-4F处理的小鼠)的百分比，P〈0.05。图15B，通过肿瘤直径(mm)定义的不同大小类别中的肿瘤数。w/sc-4F，经sc-4F处理的小鼠；w/L-4F，经L-4F处理的小鼠。图15C，与对照小鼠相比，血浆LPA水平在经L-4F处理的C57BL/6J-APCmin/+小鼠中显著降低(>50% )。Ρ〈0.01。
[0028]图16A-16D.在CT26细胞中，HDL模拟物L-4F降低活力，抑制增殖，并影响细胞周期和细胞周期蛋白。CT26细胞是如实例5中所述来培养且与媒剂(对照)或10mg/mL浓度的L-4F —起培育。图1 6A，使用MTS分析试剂盒分析细胞的活力。P〈0.001。图16B，如实例5中所述分析BrdUrd纳入。P〈0.001。图16C，对处于细胞周期的不同阶段中的细胞的定量分析。数据表示为对照细胞的百分比的平均值土SD。图16D，细胞周期蛋白Dl和细胞周期蛋白A的表达。所有实验都是一式三份进行且每一分析都是一式四份进行。
[0029]图17A-17B.在细胞培养基中，HDL模拟物L-4F抑制CT26细胞的LPA诱导的活力并降低LPA水平。图17A，CT26细胞是如实例5中所述来培养且与10mg/mL L-4F或5、10、20mmol/L浓度的LPA —起培育，或用L-4F和LPA 二者将细胞处理48小时。所有实验都是一式三份进行且每一分析都是一式四份进行。数据表示为对照细胞的百分比的平均值土SD。图17B，在处理48小时后测量细胞培养基中的LPA水平。
[0030]图18A-18E.G*(L_[113-122]apoj)肽在活体内和活体外具有与L-4F类似的效应。如实例5中所述在BALB/c中建立肺肿瘤。在将CT26细胞注射到尾静脉中后3周处死小鼠。采集肺并称重。对肺肿瘤进行计数。图18A，所显示数据为接受以100mg/kg/d(2mg/小鼠/d)在鼠粮中投与的sc-4F(nl/412)、G*肽(nl/412)的小鼠的肺重量。Ρ〈0.05。图18Β，所显示数据为A中2组小鼠的肺表面上的肿瘤数。Ρ〈0.0001。图18C，使用MTS分析来分析细胞的活力。P〈0.05。D，如实例5中所述测定图18Α和图18Β中所述小鼠的血清LPA水平。图18Ε，通过蛋白质印迹测量的细胞周期蛋白Dl和细胞周期蛋白A的表达。w/sc-4F，经SC-4F处理的小鼠；w/G*，经G*肽处理的小鼠。
[0031]图19.与经媒剂处理的对照相比，在活体外用不同HDL模拟肽处理的CT26细胞在处理48小时内展现降低的细胞活力(根据MTS分析)。所分析HDL模拟物为L-4F、L-4F2、K4,15-4F、K4,15-4F2 以及从 ApoE 和 G* 形成的 20 个氨基酸的肽 LRKLRKRLLRLVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。
[0032]图20.接受皮下侧腹注射CT26细胞且随后用皮下HDL模拟肽处理的BALB/c小鼠显示肿瘤重量(左图)和肿瘤体积(右图)显著降低。
【具体实施方式】
[0033]本发明係基于以下发现:HDL相关分子可用于治疗和预防促炎性病状。HDL相关分子包括ApoA-1、牛HDL和HDL模拟物。如下文更详细地阐述，呈天然全长形式的ApoA-1可预防UV诱导的细胞死亡和氧化性应激。下文还更详细地阐述如下意外发现:HDL模拟物、ApoA-1和牛HDL (bHDL)可用于治疗和预防各种癌症。ApoA-1和其它HDL相关分子提供有力且有效的治疗和预防促炎性病状、包括皮肤病状和全身性促炎性病状(包括癌症和其它疾病，例如阿尔茨海默氏病)的药剂。待治疗癌症包括上皮癌症，例如阴道癌、外阴癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、结肠癌、乳癌、胰脏癌、肺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、脑癌(例如胶质母细胞瘤)和胃癌。本文所述的HDL相关分子还可用于抗衰老治疗，如其可用于延缓衰老过程并减少或消除氧化性应激；且可用于治疗眼部病状(例如黄斑变性、视网膜色素变性)和自身免疫性疾病(例如关节炎)。
[0034]本发明提供减少暴露于氧化性应激的上皮细胞的死亡和/或氧化性应激的方法。所述方法包含使上皮细胞在暴露于氧化性应激之前与HDL相关分子接触。在一些实施例中，氧化性应激包含暴露于紫外辐射。在典型实施例中，所述接触是在暴露于氧化性应激之前至少12-24小时进行。
[0035]定义
[0036]除非另外指明，否则本申请案中所用的所有科学和技术术语都具有业内常用的含义。如本申请案中所用，以下词语或词组具有指定含义。
[0037]如本文所用“HDL相关分子”意指ApoA-1、牛HDL和HDL模拟物，包括肽和合成分子。
[0038]除非上下文中明确指示其它含义，否则如本文所用“ApoA-1”是指全长且未修饰的ApoA-1。例如，“ApoA-1肽”是指全长ApoA-1的小部分。通常，ApoA-1是人类ApoA-1，一种244个氨基酸的28.2kDa蛋白质。
[0039]如本文所用“HDL模拟物”是指经修饰载脂蛋白，其模拟HDL的功能，通常提供具有增强效能的HDL相关分子。通常，载脂蛋白是通过改变或取代一个或一个以上氨基酸和/或通过组合两个或两个以上HDL肽形成嵌合HDL相关分子来修饰。
[0040]如本文所用“多肽”包括从天然来源分离、通过重组技术产生或化学合成的蛋白质、蛋白质片段和肽。本发明多肽通常包含至少约6个氨基酸。较短多肽(例如长度小于约50个氨基酸的多肽)通常称作“肽”。
[0041]如本文所用“载体”意指构筑物，其能在宿主细胞中递送且优选地表达一种或一种以上所关注基因或序列。载体的实例包括(但不限于)病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞(例如产生细胞)。[0042]如本文所用“表达控制序列”意指引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子(例如组成型或可诱导启动子)或增强子。表达控制序列可操作地连接到待转录的核酸序列。
[0043]术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限制，否则其涵盖天然核苷酸的以类似于天然核苷酸的方式与核酸杂交的已知类似物。
[0044]如本文所用“医药上可接受的载剂”或“赋形剂”包括在与活性成份组合时容许所述成份保留生物活性且不与个体的免疫系统反应的任何材料。实例包括(但不限于)任何标准医药载剂，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各种类型之润湿剂。用于气溶胶或非经肠投与的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9% )盐水。
[0045]包含所述载剂的组合物是通过熟知的常用方法来调配(例如，参见雷明顿氏制药科学(Remington, sPharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.真纳罗(A.Gennaro)编辑，迈克出版公司(Mack Publishing C0.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990)。
[0046]除非明确指示其它含义，否则如本文所用“一 (a) ”或“一 (an) ”意指至少一者。
[0047]HDL樽拟物
[0048]本发明提供HDL模拟物，包括HDL肽的嵌合体和也用作HDL模拟物的经修饰和/或合成分子。在一个实施例中，用α-氨基异丁酸(Aib)取代已知HDL模拟肽中的丙氨酸生成新颖HDL模拟物(NHM)。在典型实施例中，嵌合体包含两个选自肽ApoA-1、ApoE和ApoJ的HDL肽。在一个实 施例中，HDL模拟物是通过在与10个氨基酸的肽Apo Ε)嵌合的18个氨基酸的肽Apo A-1中用α-氨基异丁酸(Aib)取代丙氨酸来获得，从而生成下文阐述的ΝΗΜ1-7。在另一实施例中，HDL模拟物是通过组合ApoE与ApoJ (G*)来获得，从而生成(例如)新颖 HDL 模拟物 LRKLRKRLLR LVGRQLEEFL (SEQ ID NO:1)。
[0049]在Ε18Α (ref)中用Aib取代丙氨酸产生一系列7个NHM。
[0050]E18A 肽(ref) = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAEKLKEAF (SEQ ID NO:2)
[0051]NHM:
[0052]NHMl = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAEKLKEAF(SEQ ID NO:3)
[0053]NHM2 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAibEKLKEAF (SEQ ID NO:4)
[0054]NHM3 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAEKLKEAibF(SEQ ID NO:5)
[0055]NHM4-LRKLRKRLLRDWLKAibFYDKVAibEKLKEAF(SEQ ID NO:6)
[0056]NHM5 = LRKLRKRLLRDffLKAFYDKVAibEKLKEAibF(SEQ ID NO:7)
[0057]NHM6 = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAEKLKEAibF(SEQ ID NO:8)
[0058]NHM7 = LRKLRKRLLRDffLKAibFYDKVAibEKLKEAibF(SEQ ID NO:9)
[0059]参见:奥列格F沙里福夫(OlegFSharifov)等人，2011，载脂蛋白E模拟物和胆固酉享降低性质(Apolipoprotein E Mimetics and Cholesterol Lowering Properties)，美国心血管药物杂志(American Journal of Card1vascular Drugs) 11 (6):371_381。
[0060]令人惊讶的是，本文所述的新颖HDL模拟肽可单独或与其它抗氧化剂组合用于预防和治疗促炎性病状和全身性促炎性病状(包括癌症)。这些分子提供预防和治疗促炎性皮肤病状和全身性促炎性病状(包括癌症)的有力且有效的抗氧化剂。这在原则上已使用细胞培养模型来证实，且已通过活体内研究显示可抑制动物模型中的肿瘤发展。[0061]牛HDL
[0062]如本文所述的牛HDL(bHDL)包括天然蛋白质，且可存在异源序列。通常，bHDL是以其天然全长未修饰形式使用。牛HDL通常是从血清纯化，且可从(例如)生物医学技术公司(B1medical Technologies, Inc.,斯托顿,马萨诸塞州)获得。相对于其它物种的HDL,牛HDL由于其高ApoA-1水平和其高血清水平以及其对投与人类的适宜性而是有利的。
[0063]ApoA-1 多狀
[0064]如本文所述的ApoA-1多肽包括天然蛋白质，且可存在异源序列。通常，ApoA-1是以其天然全长未修饰的成熟形式使用的人类ApoA-1。
[0065]NCBI 参照序列:NP_000030.1 (SEQ ID NO:10):
[0066]
I mkaavltlav Ifltgsqarh fwqqdeppqs pwdrvkdlat vyvdvlkdsg rdyvsqfegs
61 algkqlnlkl Idnwdsvtst fsklreqlgp vtqefwdnle keteglrqem skdleevksk121 xrqpyiddfqk kwqeemelyr qkveplrael qegarqklhe iqeklsplge emrdrarahv181 dairthlapy sdelrqrlaa rlealkengg arleeyhaka tehistisek akpalecUrq241 glipvlesfk vsflsaleey tk；<lntq;
[0067]在上述序列中，信号肽在氨基酸1-18处，成熟前蛋白在氨基酸19-267处，且成熟ApoA-1蛋白质在氨基酸2 5-267处:
[0068]DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO: 11)。
[0069]尽管已研发ApoA-1肽和尤其ApoA-1模拟肽以努力鉴别与全长ApoA-1蛋白质相比具有类似功能和/或易于产生的分子以用于一些应用领域，但对这些ApoA-1模拟肽(例如，α-螺旋肽)的修饰已使其与天然ApoA-1完全不同；事实上，模拟肽与全长ApoA-1蛋白质分子不共有结构相似性。此外，在心血管治疗领域，模拟肽有效性较低且需要较大数量而使得这些肽的治疗性使用不实用。有趣的是，术语模拟肽是在过去20年间产生的术语，其是指鉴别可与全长ApoA-1蛋白质共有一些功能性质的结果上不同的分子的尝试；且事实上，在这些α -螺旋肽与全长ApoA-1分子之间不存在结构相似性。因此，术语“模拟肽”在本文中是误称，因为ApoA-1全长蛋白质与其模拟肽不共有结构共同点。ApoA-1模拟肽只尝试模拟ApoA-1全长蛋白质功能中的一些特征。
[0070]夺体多狀
[0071]本发明多肽可包含天然蛋白质的变体。如本文所用的多肽“变体”是与天然蛋白质相差一个或一个以上取代、缺失、添加和/或插入的多肽，从而使得所述多肽的治疗效能没有实质性减小。换句话说，效能可相对于天然蛋白质有所增强或无变化，或可相对于天然蛋白质减小不到50%，且优选地不到20%。优选变体包括其中已移除一个或一个以上部分(例如N-末端前导序列)的变体。其它优选变体包括其中已从成熟蛋白质的N-和/或C-末端移除小部分(例如，1-30个氨基酸、优选地5-15个氨基酸)的变体。多肽变体优选地展现与所鉴别多肽的至少约70%、更优选地至少约90%且最优选地至少约95%的一致性(如上文所述来测定)。
[0072]优选地，变体含有保守取代。“保守取代”是其中用一个氨基酸取代另一个具有相似性质的氨基酸的取代，从而使得肽化学领域技术人员预期所述多肽的二级结构和亲疏水性质不会发生实质性变化。氨基酸取代一股可基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质中的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有类似亲水性值的具有不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺及谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其它氨基酸基团包括:(I) ala、pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr ； (2) cys、ser、tyr、thr ； (3) val、ile、leu、met、ala、phe ；
(4)lys、arg、his ;和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可或另一选择为含有不保守变化。在优选实施例中，变体多肽与天然序列相差5个或更少氨基酸的取代、缺失或添加。变体还可(或另一选择为)通过(例如)缺失或添加氨基酸来修饰，所述缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲疏水性质的影响最小。
[0073]多肽的制备
[0074]多肽可在蛋白质的N-末端包含以共翻译方式或翻译后方式引导蛋白质转移的信号(或前导)序列。还可将多肽偶联到连接子或其它序列以便于多肽的合成、纯化或鉴别。
[0075]可从天然来源(例如血清)纯化多肽。在一些实施例中，从将投与组合物的同一个体纯化多肽。在其它实施例中，从异源物种纯化多肽，例如用于投与人类的牛HDL或ApoA-10
[0076]由如本文所述的DNA序列编码的重组多肽可使用所属领域技术人员已知的多种表达载体中的任一种容易地从所述DNA序列制备。表达可在已经含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何适宜宿主细胞中实现。适宜宿主细胞包括原核生物、酵母和高级真核细胞。优选地，所采用宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞系(例如COS或CH0)。可首先使用市售滤器浓缩来自将重组蛋白质或多肽分泌到培养基中的适宜宿主/载体系统的上清液。在浓缩后，可将浓缩物施加到适宜纯化基质，例如亲和基质或离子交换树脂。最后，可采用一个或一个以上反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。
[0077]具有少于约100个氨基酸且一股少于约50个氨基酸的部分和其它变体也可通过合成手段使用所属领域技术人员熟知的技术来生成。例如，所述多肽可使用任一市售固相技术来合成，例如梅利菲尔德(Merrifield)固相合成方法，其中将氨基酸依序添加到正在生长的氨基酸链上。参见梅利菲尔德，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.) 85:2149-2146，1963。用于自动合成多肽的设备可自供应商(例如珀金埃尔默(Perkin Elmer)/生物应用系统分部(Applied B1Systems Divis1n)(福斯特城,加利福尼亚州))购得,且可根据制造商说明书来操作。
[0078]多肽可在珀金埃尔默/生物应用系统分部430A肽合成仪上使用FMOC化学和HPTU(O-苯并三唑N，N，N'，N'-四甲基脲達六氟磷酸盐)活化来合成。可将Gly-Cys-Gly序列附接到肽的氨基末端以提供偶联方法，从而结合到固定表面或对肽进行标记。从固体载体裂解肽可使用以下裂解混合物来实施:三氟乙酸:乙二硫醇:苯甲硫醚:水:苯酚(40:1: 2: 2: 3)。在裂解2小时后，可将肽在冷甲基-叔丁基醚中沉淀。然后可将肽沉淀溶解于含有0.1 %三氟乙酸(TFA)的水中并冻干，之后通过C18反相HPLC纯化。可使用于水中的O % -60%乙腈(含有0.1% TFA)的梯度来洗脱肽。在冻干纯净流份后，可使用电喷雾或其它类型的质谱法以及氨基酸分析来表征肽。
[0079]融合蛋白质
[0080]在一些实施例中，多肽是包含多个如本文所述的多肽或包含至少一个如本文所述的多肽和无关序列的融合蛋白质。在一些实施例中，融合蛋白质包含ApoA-1多肽和免疫原性多肽。免疫原性多肽可包含(例如)另一蛋白质的全部或一部分。
[0081]可添加其它融合配偶体。融合配偶体可通过帮助提供T辅助表位、优选地人类识别的T辅助表位来用作(例如)免疫融合配偶体。作为另一实例，融合配偶体可用作表达增强子，从而帮助以高于天然重组蛋白质的产率表达蛋白质。某些优选融合配偶体是同时增强免疫和表达的融合配偶体。可选择其它融合配偶体以提高蛋白质的溶解度或使蛋白质能够靶向所需细胞内区室。其它融合配偶体包括有助于蛋白质纯化的亲和标签。
[0082]融合蛋白质一股可使用标准技术(包括化学共轭)来制备。优选地，融合蛋白质表达为重组蛋白质，从而容许在表达系统中以相对于非融合蛋白质增加的水平来产生。简单来说，编码多肽组份的DNA序列可单独组装，并接合到适宜表达载体中。编码一种多肽组份的DNA序列的3'端用或不用肽连接子接合到编码第二多肽组份的DNA序列的5'端，从而使得所述序列的阅读框同相。这允许翻译成保留两种组份多肽的生物活性的单一融合蛋白质。
[0083]可采用肽连接子序列将第一与第二多肽组份隔开足够大的距离，以确保每一多肽折叠成其二级和三 级结构。使用业内熟知的标准技术将这一肽连接子序列纳入融合蛋白质中。适宜肽连接子序列可基于以下因素来选择:(I)其采取灵活延伸构象的能力；(2)其采取可与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的无能；和(3)可与多肽功能性表位反应的疏水或带电荷残基的缺乏。优选的妝连接子序列含有Gly、Asn和Ser残基。还可在连接子序列中使用其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala。可有效地用作连接子的氨基酸序列包括以下文献中揭不的序列:马拉泰亚(Maratea)等人，基因(Gene)40:39~46,1985 ；墨菲(Murphy)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)83:8258-8262，1986 ;美国专利第4，935，233号和美国专利第4，751，180号。连接子序列一股可长I到约50个氨基酸。在第一和第二多肽具有可用于隔开功能性结构域并防止立体干扰的非必需N-末端氨基酸区域时，不需要连接子序列。
[0084]接合DNA序列可操作地连接到适宜转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件位于编码第一多肽的DNA序列的5'方。类似地，结束翻译所需的终止密码子和转录终止信号存在于编码第二多肽的DNA序列的Y方。
[0085]还提供包含本发明多肽以及无关免疫原性蛋白质的融合蛋白质。优选地，免疫原性蛋白质能激发记忆反应。所述蛋白质的实例包括破伤风、结核和肝炎蛋白质(例如，参见斯托特(Stoute)等人,新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.) 336:86-91,1997)。
[0086]在优选实施例内，免疫融合配偶体源自蛋白质D，一种革兰氏(gram)-阴性细菌流感嗜血菌(Haemophilus influenza)B的表面蛋白质(W091/18926)。优选地，蛋白质D衍生物包含所述蛋白质的大约前三分之一(例如，N-末端的前100-110个氨基酸)，且蛋白质D衍生物可经脂化。其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白质NS I (血凝素)。通常，使用N-末端的81个氨基酸，但可使用包括T-辅助表位的不同片段。
[0087]在另一实施例中，免疫融合配偶体是称为LYTA的蛋白质或其部分(优选地C-末端部分)。LYTA源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),其合成称作酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因43 =265-292,1986)。LYTA是特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白质的C-末端结构域负责对胆碱或对一些胆碱类似物(例如DEAR)的亲和性。这个性质已用于研发可用于表达融合蛋白质的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已阐述在氨基末端含有C-LYTA片段的杂合蛋白质的纯化(参见生物技术(B1technology) 10 =795-798,1992)。在优选实施例内，可将LYTA的重复部分纳入融合蛋白质中。重复部分发现于始于残基178的C-末端区域。特别优选的重复部分纳入残基 188-305。
[0088]一股来说，如本文所述的多肽(包括融合蛋白质)和多核苷酸经分离。“经分离”多肽或多核苷酸是从其原始环境中移除者。例如，如果将天然蛋白质与天然系统中的一些或所有共存材料相分离，则所述天然蛋白质经分离。优选地，所述多肽为至少约90%纯，更优选地至少约95%纯且最优选地至少约99%纯。如果(例如)将多核苷酸克隆到并非是天然环境中的一部分的载体中，则认为所述多核苷酸经分离。
[0089]本发明多核苷酸
[0090]本发明提供编码一种或一种以上HDL相关多肽(包括bHDL、ApoA-1和HDL模拟物)的多核苷酸。本发明也涵盖与任何所述序列完全互补的多核苷酸。多核苷酸可为单股(编码或反义)或双股，且可为DNA (基因组、cDNA或合成)或RNA分子(包括siRNA)。RNA分子包括含有内含子且与DNA分子一一对应的HnRNA分子以及不含内含子的mRNA分子。本发明多核苷酸中可能但并非需要存在其它编码或非编码序列，且多核苷酸可能但并非需要连接到其它分子和/或载体材料。所述多核苷酸的部分可用作用于相关分子的扩增和检测的引物和探针。 [0091]多核苷酸可包含天然序列(即，编码HDL相关多肽或其部分的内源序列)或可包含这一序列的变体。多核苷酸变体含有一个或一个以上取代、添加、缺失和/或插入，以使得所编码多肽的免疫原性相对于天然蛋白质不减小。变体优选地展现与编码天然蛋白质或其部分的多核苷酸序列的至少约70%—致性、更优选地至少约80%—致性且最优选地至少约90% —致性。
[0092]如果两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列在如下文所述进行比对以获得最大对应性时相同，则称所述两个序列“一致”。两个序列之间的比较通常是通过在比较窗上比较所述序列以鉴别并比较序列相似性的局部区域来执行。如本文所用的“比较窗”是指至少20个、通常30个到约75个、40个到约50个邻接位置的区段，其中在使序列和具有相同邻接位置数的参照序列达成最佳比对后比较所述两个序列。
[0093]所比较序列的最佳比对可使用激光基因(Lasergene)生物信息学软件包(DNA星公司(DNASTAR, Inc.),麦迪逊,威斯康辛州)中的Megalign程序使用默认参数来实施。此程序体现以下参考文献中所述的若干比对方案:戴霍夫，M.0.(Davhoff，M.0.) (1978)蛋白质的进化变化模型-用于检测远缘关系的矩阵(A model of evolut1nary change inproteins-Matrices for detecting distant relat1nships),戴霍夫，M.0.(编辑)蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure),国家生物医学研究基金会(Nat1nal B1medical Research Foundat1n)，华盛顿 DC,第 5 卷，增刊 3,第 345-358 页；海因 J.(Hein J.) (1990)比对和种族发生的统一方法(Unified Approach to Alignment andPhylogenes)，第 626-645 页，酶学方法(Methods in Enzymology)，第 183 卷，学术出版社公司(Academic Press, Inc.),圣地亚哥,加利福尼亚州;希金斯,D.G.(Higgins, D.G.)和夏普，P.M.(Sharp, P.M.) (1989)生物科学中的计算机应用(CAB1S) 5 =151-153 ;迈尔斯，E.ff.(Myers, E.w.)和穆勒i (Muller w.) (1988)生物科学中的计算机应用4:11-17 ;罗宾逊，E.D.(Robinson, E.D.) (1971)组合理论学报(Comb.Theor.) 11:105 ;桑图，N.(Santou,N.)、内斯，M.(Nes, M.) (1987)分子生物学与进化(Mol.B1l.Evol.)4 =406-425 ;斯尼思，P.H.A.(Sneath，P.H.A.)和索卡，R.R.(Sokal，R.R.) (1973)数值分类法:数值分类法的原理与实践(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy)，弗里曼出版社(Freeman Press),圣弗兰西斯科,加利福尼亚州；威尔伯，W.J.(Wilbur, w.J.)和李普曼，D.J.(Lipman, D.J.) (1983)美国国家科学院院刊80:726_730。
[0094]优选地，“序列一致性百分比”是通过在至少20个位置的比较窗中比较两个经最佳比对的序列来测定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20%或更少、通常5%到15%或10%到12%的添加或缺失(即空位)以达成两个序列的最佳比对。所述百分比是通过以下方式来计算:测定在两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以获得匹配位置数，用匹配位置数除以参照序列(即窗大小)的总位置数，且将结果乘以100以获得序列一致性百分比。
[0095]变体还可或另一选择为与天然基因或其一部分或补体实质上同源。所述多核苷酸变体能在中等严格条件下与编码天然蛋白质的天然DNA序列(或互补序列)杂交。
[0096]适宜的“中等严格条件”包括在5XSSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中预洗；在50°C _65°C、5XSSC下杂交过夜；之后在65°C下用含有0.1% SDS的2X、0.5X和
.0.2 X SSC中的每一者洗涤两次，每次20分钟。
[0097]如本文所用“高度严格条件”或“高度严格性条件”是如下条件:(I)洗涤采用低离子强度和高温，例如在50°C下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1 %十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，例如甲酰胺，例如在42°C下的含有0.1%牛血清白蛋白/0.1%蔗聚糖(FicolD/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5，含有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)的50% (v/v)甲酰胺；或(3)在42 °C下采用50%甲酰胺、5 X SSC (0.75M NaCl、0.075M 柠檬酸钠)、50mM 磷酸钠(pH6.8)、0.I %焦磷酸钠、5 X 邓哈特溶液(Denhardt’ s solut1n)、经超声波处理的鲑鱼精 DNA(50 μ g/ml)、0.1% SDS 和 10%硫酸葡聚糖，且在42°C下在0.2 X SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤，且在55°C下在50%甲酰胺中洗涤，之后在55°C下进行由含有EDTA的0.1XSSC组成的高度严格性洗涤。所属领域技术人员将了解如何根据需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
[0098]所属领域技术人员应了解，由于遗传密码的简并性，有许多核苷酸序列编码如本文所述的多肽。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。但是，本发明明确涵盖因密码子使用差异而变化的多核苷酸。此外，包含本文所提供多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是由于一个或一个以上突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可能但并非需要具有经改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴别。
[0099]多核苷酸可使用多种业内已知技术中的任一种来制备。编码ApoA-1蛋白质的DNA可得自从表达相应mRNA的组织制备的cDNA文库。因此,人类ApoA-1 DNA可便捷得得自从人类组织制备的cDNA文库。编码ApoA-1蛋白质的基因还可得自基因组文库或通过寡核苷酸合成来获得。可使用经设计以鉴别所关注基因或其所编码蛋白质的探针(例如针对ApoA-1或至少约20-80个碱基的寡核苷酸的抗体)来筛选文库。用所选探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准程序来实施，例如阐述于以下文献中的标准程序:桑布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(纽约:冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989)。分离编码 ApoA-1 的基因的替代方法是使用PCR方法(桑布鲁克等人，见上文；迪芬巴赫(Dieffenbach)等人，PCR引物:实验室手册(PCR Primer:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社，1995))。
[0100]选作探针的寡核苷酸序列应足够长且足够明确以使假阳性降到最低。寡核苷酸优选地经标记以使其在与所筛选文库中的DNA杂交后可被检测。标记方法为业内所熟知，且包括使用放射性标记(例如32P-标记的ATP)、生物素化或酶标记。杂交条件(包括中度严格性和高度严格性)参见桑布鲁克等人(见上文)。
[0101]多核苷酸变体一股可通过业内已知的任何方法来制备，包括通过(例如)固相亚磷酰胺化学合成来化学合成。也可使用标准诱变技术在多核苷酸序列中引入修饰，例如寡核苷酸引导的位点特异性诱变(参见阿德尔曼(Adelman)等人，DNA2:183，1983)。另一选择为，RNA分子可通过活体外或活体内转录编码ApoA-1蛋白质的DNA序列或其部分来生成，前提是将所述DNA纳入具有适宜RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体中。可使用某些部分来制备如本文所述的所编码多肽。另外，或另一选择为，可将一部分投与患者以使得在活体内生成所编码多肽。
[0102]可进一步修饰任何多核苷酸以提高活体内稳定性。可能的修饰包括(但不限于)在5'和/或3'端添加侧翼序列；在主链中使用磷硫酰酯或2' O-甲基而不是磷酸二酯酶键；和/或包括非传统碱基，例如肌苷、辫苷(queosine)和怀丁苷(wybutosine)以及腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基_、甲基_、硫基-和其它修饰形式。
[0103]可使用已确立的重组DNA技术将核苷酸序列接合到多种其它核苷酸序列。例如，可将多核苷酸克隆到多种克隆载体(包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒)中的任一种中。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。一股来说，载体将含有在至少一种有机体中发挥功能的复制起点、便捷的限制性内切核酸酶位点和一种或一种以上可选标记。其它元件将取决于所需使用，且将为所属领域技术人员所了解。
[0104]在某些实施例内，多核苷酸可经调配以允许进入哺乳动物细胞中且允许在其中表达。所述调配物尤其可用于治疗性目的，如下文所述。所属领域技术人员将了解，有多种方式来实现多核苷酸在靶细胞中的表达，且可采用任何适宜方法。例如，可将多核苷酸纳入病毒载体中，例如(但不限于)腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或牛痘或其它痘病毒(例如，禽痘病毒)。将DNA纳入所述载体中的技术为所属领域技术人员所熟知。逆转录病毒载体可另外转移或纳入用于可选标记(以帮助鉴别或选择经转导细胞)和/或靶向部分的基因(例如编码特定靶细胞上的受体的配体的基因)以使载体具有靶特异性。还可使用抗体通过所属领域技术人员已知的方法来完成靶向。
[0105] 用于治疗性目的的其它调配物包括胶体分散系统(例如高分子复合物)、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作活体外和活体内递送媒剂的优选胶体系统是脂质体(即，人造膜囊)。所述系统的制备和使用为业内所熟知。
[0106]医药纟目合物
[0107]本发明提供纳入医药组合物中的ApoA-1多肽、多核苷酸和相关分子。在典型实施例中，多肽是呈天然全长未修饰形式的ApoAI。如业内所理解，ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的重要组份。因此，可通过投与HDL来投与ApoAI。
[0108]医药组合物包含一种或一种以上所述化合物和任选地生理上可接受的载剂。用惰性脂质制备以(例如)形成胶束有助于ApoAI的投与。在典型实施例中，ApoAI是作为口服补充剂的一部分经口投与。另一选择为，其可通过(例如)附着到个体皮肤的贴剂经皮投与。
[0109]尽管在本发明医药组合物中可采用所属领域技术人员已知的任何适宜载剂，但载剂类型将根据投与模式而变。本发明组合物可经调配用于任何适宜的投与方式，包括(例如)局部、经口、经鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下、真皮内、经皮或肌内投与。对于非经肠投与(例如皮下注射)，载剂优选地包含脂肪和任选地水、盐水、醇、蜡或缓冲液。对于经口投与，可采用上述载剂中的任一者或固体载剂，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可采用生物可降解微球体(例如，聚乳酸-聚乙醇酸)作为本发明医药组合物的载剂。
[0110]另外，载剂可含有其它药理上可接受的赋形剂用于改变或维持调配物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌度、稳定性、溶解率或气味。类似地，载剂可含有其它药理上可接受的赋形剂用于改变或维持分子的稳定性、溶解率、释放或穿过血脑屏障的吸收或渗透。所述赋形剂是那些通常且按惯例用于调配剂量的物质，所述剂量用于以单位剂量或多剂量形式非经肠投与，或用于通过从植入泵连续或周期性输注直接输注到CSF中。
[0111]所述组合物还可包含缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)和/或防腐剂。另一选择为，可将本发明组合物调配为冻干产物。还可使用熟知技术将化合物囊封在脂质体内。
[0112]医药组合物可含有编码一种或一种以上如上文所述的多肽的DNA，以使得可在原位生成所述多肽。如上文所述，DNA可存于所属领域技术人员已知的多种递送系统中的任一种内，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。多种基因递送技术为业内所熟知，例如以下文献中所阐述的技术:罗兰(Rolland),治疗药物载剂系统评论综述(Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems) 15:143_198，1998和其中引用的参考文献。适宜核酸表达系统含有在患者中表达所需的DNA序列(例如适宜启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及投与细菌(例如卡介苗(Bacillus-Calmette-Guerrin)),所述细菌表达其细胞表面上的多肽的免疫原性部分或分泌此一表位。
[0113]在优选实施例中，可使用病毒表达系统(例如，牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入DNA，所述系统可涉及使用非致病性(缺陷型)的有复制能力的病毒。适宜系统揭示于(例如)以下文献中:菲希尔-霍克(Fisher-Hoch)等人，美国国家科学院院刊86:317-321，1989 ;弗莱克斯纳(Flexner)等人，纽约科学院纪事(Ann.N.Y.Acad Sc1.)569:86-103,1989 ;弗莱克斯纳等人，疫苗(Vaccine)8:17-21，1990 ;美国专利第4，603，112号、第4，769，330号和第5，017，487号；W089/01973 ;美国专利第4，777，127 号；GB2, 200，651 ；ΕΡ0, 345，242 ；W091/02805 ;伯克纳(Berkner)-生物技术(B1techniques) 6:616-627,1988 ;罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，科学(Science) 252:431-434,1991 ;科尔斯(Kolls)等人，美国国家科学院院刊91 =215-219,1994 ;卡斯-艾斯勒(Kass-Eisler)等人，美国国家科学院院刊90:11498-11502，1993 ;古斯曼(Guzman)等人，循环(Circulat1n) 88:2838-2848,1993 ;和古斯曼等人，循环研究(Cir Res.) 73:1202-1207，1993。用于将DNA纳入所述表达系统中的技术为所属领域技术人员所熟知。DNA还可为“裸的”，如(例如)厄尔默(Ulmer)等人，科学259:1745-1749，1993中所述且由科恩(Cohen)，科学259:1691-1692，1993所综述。裸DNA的摄取可通过将DNA涂布到有效转运到细胞中的生物可降解珠粒上来增加。
[0114]在本发明组合物中可采用多种佐剂中的任一种。大多数佐剂含有经设计以防止肽快速分解代谢的物质(例如氢氧化铝或矿物油)和免疫反应的刺激剂(例如脂质A、百日咳博德特菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)源蛋白质)。适宜佐剂可从市场购得，如(例如)弗氏不完全佐剂(Freund' s IncompleteA djuvant)和完全佐剂(狄福科实验室(Difco Laboratories),底特律,密歇根州)；默克(Merck)佐剂65(默克公司(Merck and Company, Inc.),罗韦，新泽西州)；招盐,例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸酰化糖的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈生物可降解微球体；单磷酰基脂质A和奎尔(quil)A。还可使用细胞因子(例如GM CSF或白介素-2、-7或-12)作为佐剂。
[0115]本文所述组合物可作为持续释放调配物(即，在投与后实现化合物的缓释的调配物，例如胶囊或海绵剂)的一部分来投与。所述调配物一股可使用熟知技术来制备且通过(例如)经口、经直肠或皮下植入或通过在所需靶位点、例如手术切除肿瘤的位点植入来投与。持续释放调配物可含有分散于载剂基质中和/或含于由控速膜包围的储药器内的多肽、多核苷酸或抗体。用 于所述调配物内的载剂是生物相容的，且也可为生物可降解的；优选地，所述调配物提供相对恒定的活性组份释放水平。含于持续释放调配物内的活性化合物的量取决于植入位点、释放的速率和预期持续时间以及待治疗或预防的病状的性质。
[0116]投与和剂暈
[0117]组合物经常以任何适宜方式与医药上可接受的载剂一起或以医药上可接受的盐的形式来投与。可获得在本发明情况下将ApoA-1投与个体的适宜方法，且尽管可使用一种以上途径来投与具体组合物，但一种具体途径经常可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
[0118]在本发明情况下,投与患者的剂量应足以随时间在患者中实现有益治疗反应,或抑制疾病进展。因此，将组合物以足以激发减轻、减少、治愈或至少部分阻止疾病的症状和/或并发症的效果的量投与个体。将足以实现此效果的量定义为“治疗有效剂量”。一股来说，对于包含一种或一种以上多肽的医药组合物，每一种多肽存于剂量中的量介于约100 μ g/kg宿主到5mg/kg宿主范围内。适宜分量将随患者大小而变,但通常将介于约0.1mL到约5mL范围内。
[0119]投与本文所揭示治疗组合物的途径和频率以及剂量将随个体而变，且可使用标准技术容易地确立。一股来说，医药组合物可通过注射(例如,皮内、瘤内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸气)或经口投与。优选地，可经52周时期投与介于I次与10次之间的剂量。优选地，以I个月的间隔投与6次剂量且在之后周期性地给予加强疫苗接种。替代方案可能适合于个别患者。在一个实施例中，隔10天投与2种或2种以上口服补充剂。
[0120]一股来说，适宜剂量和治疗方案以足以提供治疗性和/或预防性益处的量提供活性化合物。此一反应可通过在所治疗患者中建立与未治疗患者相比改良的临床结果(例如，更频繁的缓和、完全或部分或更久无疾病存活)来监测。
[0121]治疗包括预防和治疗。预防或治疗可通过在单一时间点或多个时间点向单一或多个位点单一投与来完成。还可几乎同时向多个位点投与。患者或个体包括哺乳动物，例如人类、牛、马、犬、猫、猪和羊动物。个体优选地是人类。在典型实施例中，治疗包含向个体投与呈其天然未修饰全长形式的ApoAI。
[0122]实魁
[0123]呈现以下实例以阐释本发明并辅助所属领域技术人员制备和使用本发明。决不将所述实例视为原本会限制本发明的范围。
[0124]实例1:AroA_I在NIH-3T3成纤维细朐中预防UV诱导的细朐死亡和氣化件应激
[0125]此实例显示，ApoA-1处理在NIH-3T3成纤维细胞(皮肤细胞)中预防UV诱导的细胞死亡和氧化性应激。将NIH3T3 (I X 16)细胞接种于96孔板的4个单独板中。在24hr后，将细胞饥饿过夜。以浓度(10 μ g/ml)使用Apo A-1将细胞处理24hr。在处理后用PBS洗涤细胞。使用一个板作为对照，不经UV处理。使用其余三个板以5、10和20mJ/cm2进行UV处理。在UV处理后，给予细胞完全培养基且将其再培养24hr。如先前所述测量所有板的细胞活力(加纳帕蒂E (Ganapathy E)等人,2011, ApoA-1模拟肽D-4F通过上调抗氧化酶MnSOD来抑制上皮卵巢癌细胞的增殖和致肿瘤性(D-4F, an apoA-lmimetic peptideinhibits proliferat1n and tumorigenicity of epithelial ovarian cancer cel Isby upregulating the ant1xidant enzyme MnSOD),国际癌症杂志(Int J Cancer) 130:1071-1081)。
[0126]结果显示，UV处理降低NIH3T3细胞的细胞活力(图1)。ApoA-1处理(10 μ g/ml)防止NIH3T3细胞发生UV诱导的细胞死亡(图2)。也与HDL样apoA_I相关的蛋白质ApoA-1I无法预防NIH3T3细胞的UV诱导的细胞死亡(图2)。因此，ApoA-1在NIH-3T3成纤维细胞(皮肤细胞)中有效预防UV诱导的细胞死亡和氧化性应激。ApoA-1在预防和治疗促炎性皮肤病状中具有潜在作用。
[0127]实例2:使用牛HDL对肿瘤生长和发展的抑制
[0128]此实例显示，bHDL(牛HDL)在结肠癌的小鼠模型中影响促炎性病状，例如肿瘤生长和发展。在皮下或经口投与时，在BALB/c小鼠中，bHDL降低CT26细胞(小鼠结肠腺癌细胞系)的活力和增殖并减少CT26细胞介导的肿瘤负担。结肠癌的血清生物标记溶血磷脂酸(LPA)的血浆水平在接受bHDL模拟物的小鼠中也显著降低，表明结合并移除促炎性脂质是bHDL抑制肿瘤发展的潜在机制。此外，在APCmin/+小鼠(人类家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，bHDL显著减小息肉的大小和数目。
[0129]最新研究表明，HDL水平与结肠癌风险逆相关。从多种具有不同结构的肽和蛋白质构筑的HDL模拟物具有使人联想到HDL的抗炎症和抗氧化剂性质。此实例中呈现的结果显示，bHDL分子可有效抑制诱导型和自发型促炎性病状(例如结肠癌)的发展。这些结果首次将bHDL鉴别为用于治疗促炎性病状的新颖治疗策略,本文中例示为预防和治疗结肠癌。
[0130]小鼠
[0131]洛杉肌加利福尼亚大学(University of California)的动物研究委员会(Animal Research Committee)批准了所有小鼠方案。6周龄BALB/c雌性小鼠和6周龄C57BL/6J-APCMm/+ 雄性小鼠购自杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)。
[0132]bHDL
[0133]bHDL得自生物医学技术公司。对于在饮食中投与bHDL，使用基本上如先前针对西方饮食(Western diet)所述的技术(18)将bHDL混合到标准鼠粮(罗尔斯顿普瑞纳(Ralston Purina))中。然而，在本文所报告的任一实验中未投与西方饮食；小鼠仅接受含或不含bHDL的标准鼠粮。
[0134]细胞培养实验
[0135]源自N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯诱导的BALB/c来源的小鼠结肠癌的CT26细胞系是购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collect1n, ATCC)。首先在96孔培养板的完全培养基中培养CT26细胞(2，000个细胞/孔)，且在24小时后将培养基更换为无血清培养基。在过夜培育后，用媒剂(对照)处理细胞，或用lOyg/mL的任一bHDL处理。将bHDL溶解于H20中。将细胞再培育48小时并使用MTS分析试剂盒(普洛麦格(Promega))根据制造商的方案分析活力。对于增殖分析，在48小时培育的最后4小时中用BrdU标记细胞。随后对细胞进行洗涤，固定，且与小鼠抗BrdU抗体在室温下一起培育I小时，并通过过氧化 物酶偶合的山羊抗小鼠二级抗体(卡尔生物化学(Calb1chem))进行检测。使用双波长450nm和540nm测量吸光度。
[0136]肿瘤负荷研究
[0137]向6周龄BALB/c雌性小鼠给予100 μ L皮下注射的制备为PBS中的单细胞悬浮液的IX 106CT26细胞，并用每天以10mg/kg皮下(SQ)投与15天的bHDL或BHDL处理小鼠。处死小鼠并测量肿瘤重量。
[0138]活体内肺转移。
[0139]通过尾静脉注射向BALB/c小鼠静脉内注射于100 μ L PBS中的2X104CT26细胞，并用以10mg/kg/天SQ投与3周的bHDL处理小鼠；或用以100mg/kg/天在鼠粮饮食中投与3周的bHDL处理。在3周处理后,处死小鼠；采集肺,称重并用布安溶液(Bouin' ssolut1n,西格玛(Sigma))固定。对肺表面上的肿瘤结节进行计数。
[0140]APCmw+小鼠研究
[0141]用以100mg/kg/天在鼠粮饮食中投与的bHDL处理基于C57BL/6J背景的6周龄APCmw+雄性小鼠。在8周处理后，处死小鼠。立刻移除全肠，在福尔马林(formalin)和70%乙醇中固定。打开肠并在解剖显微镜下检查以对肿瘤进行计数和测量。
[0142]免疫组织化学(IHC)染色
[0143]用石蜡固定并包埋肺表面的肿瘤组织，以5μπι厚度切片。用二甲苯将切片脱石蜡，用100 %、90 %、70 %和50 %乙醇再水合，用20 μ g/mL蛋白酶K处理30min，并在室温下用3% H2O2处理30min以抑制内源过氧化物酶，用在PBS中制备的10%正常山羊血清和4%BSA封闭3h，且随后在4°C下与1: 50大鼠抗小鼠单克隆⑶31抗体一起培育过夜。将切片与相应生物素化二级抗体一起培育I小时，之后与维克塔斯顿ABC精英试剂(VectastainABC Elite reagent) 一起培育。
[0144]细胞周期分析
[0145]将CT26细胞在6孔板中培养过夜，然后血清饥饿48小时。用媒剂(对照)处理细胞，或用1(^8/1^8册1^或6朴册1^处理，且再培育48小时。收集细胞，用PBS洗涤，并用70%冰冷甲醇在4°C下固定过夜。通过离心收集经固定细胞，用PBS洗涤，且再悬浮于含有40 μ g/mL RNaseA和100 μ g/mL碘化丙啶的0.3ml PBS中，并通过来自BD生物科学(BDB1sciences)的FACScan实施流式细胞技术细胞周期分析。
[0146]蛋白质印迹分析
[0147]在于50mM Tris 缓冲液(pH7.5)中含有 0.1M NaCl、5mM EDTA、50mM 正钒酸钠、I %曲拉通(Triton)X-1OO和蛋白酶抑制剂片剂的细胞裂解缓冲液中处理后，收集总细胞蛋白质。通过SDS-PAGE分离20 μ g总蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上，之后与一级抗体在4°C下在5%脱脂乳和0.1%吐温(TWeen)-20中一起培育。以1: 1000稀释度使用抗细胞周期蛋白Dl和抗细胞周期蛋白A兔多克隆抗体，且以1: 2000稀释度使用抗β-肌动蛋白多克隆抗体。
[0148]ELISA 分析
[0149]通过竞争性ELISA根据制造商的方案(英杰(Invitrogen))测量血浆中的11-6浓度。
[0150]LPA结合亲和性和血清LPA水平
[0151]LPA(20: 4)购自阿凡提极性脂质(Avanti Polar Lipids)。如先前所述测定LPA水平(墨菲等人，2007，酶学方法(Methods Enzymol) 433:1-25)。
[0152]统计学分析
[0153]数据显示为每组的平均值土SD。通过不成对t测试来执行统计学分析。在P〈0.05下的所有结果都视为统计学上显著。
[0154]结果
[0155]结果显示于图3中。对肺重量和肿瘤体积二者的评估以及目测显示，在APCmin/+小鼠(人类家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，bHDL显著降低息肉的大小和数目。
[0156]实例3:使用HDL模拟物对肿瘤发展的抑制
[0157]此实例显示，HDL模拟物可用于在结肠癌小鼠模型中抑制肿瘤发展。
[0158]小鼠
[0159]洛杉矶加利福尼亚大学的动物研究委员会批准了所有小鼠方案。6周龄BALB/c雌性小鼠购自杰克逊实验室。
[0160]肽
[0161 ] apoA-1 模拟肽 L-4F (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 ；SEQ ID NO:12)和含有与 4F肽中相同但以序列(Ac-D-W-F-A-K-D-Y-F-K-K-A-F-V-E-E-F-A-K-NH2 ；SEQID NO:13)排列以防止形成A类两亲性螺旋的氨基酸的乱序肽(SC-4F)都是全部从L-氨基酸合成。还测试名为 L-4F2 的另一种肽(Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-Aib-E-K-F-K-E-Aib-F-NH2 ；SEQ ID NO: 14)，其中 A11 和 A17 经 α -氨基异丁酸(Aib)取代。肽 Ac-hE18A_NH2 (28ΑΑ)具有氨基酸序列 L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F (SEQ ID NO:2)，其具有双结构域且是通过将apoE的肝素结合结构域141-150 (L-R-K-L-R-K-R-L-L-R ；SEQ ID NO:15)共价连接到A类两亲性螺旋肽18A衍生的。具有序列L-R-K-L-R-K-R-L-L-R-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-Aib-E-K-L-K-E-Aib-F (SEQ ID NO:7)的肽 28AA-2，其中 A11 和 A17经α-氨基异丁酸(Aib)取代。将所有肽溶解于H2O中。
[0162]细胞培养实验
[0163]首先在96孔培养板中的完全培养基中培养CT26和ΝΙΗ3Τ3细胞(2，000个细胞/孔)，且在24小时后将培养及更换为无血清培养基。在过夜培育后，用媒剂(对照)处理细胞，或用10 μ g/mL L_4F或L-4F2或28AA或28AA-2肽处理。将细胞再培育48小时并使用MTS分析试剂盒(普洛麦格)根据制造商的方案分析活力。
[0164]肿瘤负荷研究
[0165]向6周龄BALB/c雌性小鼠给予制备为PBS中的单细胞悬浮液的10ul皮下注射的1X106CT26细胞，用以10mg/kg每天SQ投与15天的肽处理。杀死小鼠并测量肿瘤重量。使用公式V = 1/2 (LXff2)测量肿瘤体积。
[0166]LPA结合亲和性和血清LPA水平
[0167]LPA(20: 4)购自阿凡提极性脂质。如先前所述测定血清LPA水平(18)。
[0168]统计学分析 [0169]数据显示为每组的平均值土SD。通过不成对t测试来执行统计学分析。在P〈0.05下的所有结果都视为统计学上显著。
[0170]在BALB/c小鼠中在CT26细胞注射后，肽抑制肿瘤发展。
[0171]CT-26是结肠腺癌细胞系，其在静脉内引入免疫活性BALB/c小鼠中时产生转移性肺肿瘤。首先检查以10mg/kg/天SQ投与的L-4F、L-4F2和sc_4F(乱序肽，其含有与4F肽中相同但以防止形成A类两亲性螺旋的序列排列的氨基酸)在侧腹皮下注射IX 16个CT26细胞的BALB/c小鼠中对侧腹肿瘤形成的作用。在远离CT26细胞注射部位的部位用以1mg/kg每天皮下注射15天的sc-4F (η = 9)或L_4F (η = 8)或L-4F2 (η = 10)处理小鼠。与经L-4F处理的小鼠相比，在经SC-4F处理的BALB/c小鼠中，侧腹肿瘤重量和体积显著较大，如所预期(273mg 对 179mg, Ρ〈0.05 ；555mm3 对 313mm3, Ρ〈0.05，图 4Α、4Β);且与经 L-4F2 处理的小鼠相比，在经sc-4F处理的小鼠中，肿瘤重量和体积同样显著较大(273mg对118mg，Ρ〈0.001 ;555mm3对197mm3, P<0.001，图4A、4B)。来自经L-4F2处理的小鼠的肿瘤与经L-4F处理的小鼠相比显著较小(179mg对118mg, Ρ〈0.05 ;313mm3对197mm3,图4A、4B)。三个组的侧腹肿瘤的代表性照片显示于图4E中。图4C和4D显示三个组中每一组的重量和体积计分的分布百分比(对照作为100% )。
[0172]随后检查28AA和28AA-2肽处理是否影响BALB/c小鼠侧腹中的肿瘤发展。6周龄BALB/c雌性小鼠在侧腹皮下注射I X 16个CT26细胞。在远离CT26细胞注射部位的部位用以10mg/kg每天皮下注射15天的媒剂(η = 12)或28ΑΑ(η = 10)或28ΑΑ-2 (η = 11)处理小鼠。与经28ΑΑ处理的小鼠相比，在经媒剂处理的BALB/c小鼠中，侧腹肿瘤的大小和重量显著较大(371mg对188mg，Ρ〈0.05)(图5A、5B)。图5C和显示三个组中每一组的重量和体积计分的分布百分比(对照作为100% )。三个组的侧腹肿瘤的代表性照片显示于图5E中。
[0173]在活体外，肽抑制CT26细胞活力，但不抑制NIH3T3细胞。
[0174]为检查在小鼠中肽抑制CT26细胞介导的肿瘤发展的机制，在活体外测定肽对CT26细胞活力的作用。在与对照相比时，在经LIF(1ygAil)处理的CT26细胞中，细胞活力降低超过20% (Ρ〈0.05)(图6Α);且与对照相比，在经L-4F2 (10 μ g/ml)处理的CT26细胞中，细胞活力也降低超过30% (Ρ〈0.0001)(图6A)。此外，与L-4F处理相比，用L-4F2处理显著降低CT26细胞活力(Ρ〈0.05)(图6Α)。CT26细胞活力是在活体外通过用28AA和28ΑΑ-2肽处理来测定。在与对照相比时，细胞活力在经28ΑΑ肽(10 μ g/ml)处理的CT26细胞中降低70% (P〈0.0001)，且在经28AA-2(10μg/ml)处理的细胞中降低64% (Ρ〈0.0001)(图6Α)。还在活体外通过用所有4种肽处理来测定ΝΙΗ3Τ3细胞活力。ΝΙΗ3Τ3细胞活力不受4种肽中任一种的影响(图6Β)。
[0175]实例4:在人类卵巢癌细胞系和小鼠卵巢癌模型中，载脂蛋白A-1模拟肽抑制缺氧诱导因子-1的表达和活性
[0176]此实例显示，apoA-1模拟肽抑制缺氧诱导因子_1 a (HIF_1 α )的表达和活性，所述缺氧诱导因子在血管生成因子的产生和血管生成中具有关键作用。使用免疫组织化学染色来检查肿瘤组织中HIF-1 α的表达。使用免疫印迹法、实时聚合酶链式反应、免疫荧光和荧光素酶活性分析来测定人类卵巢癌细胞系中HIF-Ια的表达和活性。免疫组织化学染色显示，L-4F处理显著减少小鼠卵巢肿瘤组织中的HIF-Ια表达。在两种人类卵巢癌细胞系0V2008和CA0V-3中，L-4F抑制由低氧浓度、氯化钴(CoCl2，缺氧模拟化合物)、溶血磷脂酸和胰岛素诱导的HIF-1 α的表达和活性。L-4F对胰岛素诱导的Akt磷酸化无影响，但抑制细胞外信号调节激酶和P70s6激酶的活化，从而导致抑制HIF-1 α合成。在胰岛素和CoCl2处理细胞二者中，L-4F预处理显著加快HIF-1a的蛋白酶体依赖性蛋白质降解。L-4F对HIF-1 α表达的抑制作用部分是通过L-4F的活性氧物质清除作用来介导。在活体内和活体外模型二者中，ApoA-1模拟肽抑制HIF-1 α的表达和活性，从而表明对HIF-1 α的抑制可为负责apoA-1模拟肽压制肿瘤进展的关键机制。 [0177]肿瘤血管生成在实体瘤(包括卵巢癌)的生长和进展中具有关键作用(福克曼(Folkman), 1971 ;哈纳汗(Hanahan)和福克曼，1996 ;卡莫利特(Carmeliet)和杰恩(Jain)，2000 ;注意，对整个实例4中参考文献的完整引用可参见高(Gao)等人，2012，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharm.Exper.Ther.) 342: 255-262)。在血管生成因子中，血管内皮生长因子(VEGF)参与新血管形成的每一个步骤，包括增殖、迁移、侵袭、内皮细胞的血管形成和各种类型的血管生成相关细胞(包括VEGF受体I阳性细胞和内皮祖细胞)的募集(拉斐(Rafii)等人，2002 ;阿当斯(Adams)和阿利塔洛(Alitalo)，2007 ;埃利斯(Ellis)和希克林(Hicklin)，2008)。最近，显示对肿瘤生长的压制至少部分是通过抑制VEGF的产生和随后的肿瘤血管生成来介导的(高等人，2011)。
[0178]缺氧诱导因子I(HIF-1)的表达和活性对肿瘤组织中VEGF和其它血管生成因子的产生至关重要。HIF-1是异源二聚转录因子，其由组成型表达的HIF-Ια和可诱导的α-亚单位HIF-1a组成。在肿瘤组织过度生长时，位置距血管100 μ m以上的肿瘤细胞处于缺氧状况。由于HIF-1a降解的氧依赖性，低氧浓度导致蛋白质降解降低，从而导致HIF-1 α积累。另一方面，一些激素和生长因子(包括胰岛素和溶血磷脂酸(LPA))也在常氧状况下通过活化各种信号传导路径促进HIF-1 α的蛋白质积累(曹(Cao)等人，2004;李(Lee)等人，2006、2009)。HIF-1 α结合到HIF-1 α，移位到核中，并通过下游基因的转录活化促进肿瘤发生，其蛋白质产物为血管生成(包括VEGF和血管生成素)、葡萄糖转运和细胞存活所需要(西门扎(Semenza), 2003 ;鲍瑟戈(Pouysse' gur)和麦克塔-格里格瑞(Mechta-Grigor1u)，2006 ;鲍瑟戈等人，2006)。在此实例中，在人类卵巢癌细胞系和小鼠卵巢肿瘤组织中检查L-4F和L-5F对HIF-1 α的表达和活性的效应，以描述在apoA_I模拟肽的抗血管生成和抗肿瘤发生效应背后的机制。
[0179]细胞、细胞培养和试剂。在含有以下物质的RPMI1640培养基中培养0V2008细胞:10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100g/ml)、lX最低必需培养基非必需氨基酸溶液(英杰，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和胰岛素(0.25U/ml)(英杰)。在由以下物质组成的完全培养基中培养CA0V-3细胞:达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’ s modifiedEagle’ s medium)，其含有高葡萄糖和L-谷氨酰胺(2mM)、10 %胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100 μ g/ml)和胰岛素(0.02U/ml)。为产生缺氧状况，将细胞转移到缺氧室(3130型；赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific),沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中，其中将所述细胞维持在37°C下的含有5% C02U% 02和94% N2的气氛中。将L_4F(全部从L氨基酸合成的肽 Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 (SEQ ID NO:12))以 Img/ml (每次新制备)溶解于水中并以介于I μ g/ml与10 μ g/ml之间使用。L-5F是由肽合成公司(Peptisyntha Inc.,托伦斯,加利福尼亚州)合成，将其以lmg/ml溶于ABCT缓冲液(50mM碳酸氢铵，？!17.0，含有0.lmg/ml吐温20)中，且在使用前稀释到所需浓度。氯化钴(CoCl2)、胰岛素、环己酰亚胺(CHX)和N-(苯甲氧基羰基)亮氨酰基亮氨酰基亮氨酸缩醒-Z-Leu-Leu-Leu-al (MG-132)购自西格玛奥尔德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易，密苏里州)。如制造商所推荐干燥氯仿中的LPA(阿凡提极性脂质，阿拉巴斯特，阿拉巴马州)，将其以20mM浓度溶于乙醇中作为母液，且在使用前在相应细胞培养基中稀释到所需浓度。
[0180]定量实时PCR。通过使用PureLink RNA小量试剂盒(英杰)从细胞提取总RNA。通过使用SmartSpec3000分光光度计(伯乐实验室(B1-Rad Laboratories),海格力斯,加利福尼亚州)评价RNA的 数量和质量。cDNA是根据制造商说明通过使用高容量cDNA逆转录试剂盒(生物应用系统，福斯特城，加利福尼亚州)来合成。PCR是通过使用CFX96实时PCR系统(生物应用系统)来执行。循环条件如下:在95°C下3min，之后进行40个在95°C下1s ；在60°C下1s ;在721:下30s ;然后最终在72°C下延伸1min的循环。每一 25 μ I反应在无核酸酶水中含有 0.4 μ g cDNA、12.5μ I SYBR 绿色 qPCR 超混合剂(Green qPCR SuperMix,伯乐实验室)和250nM正向和反向引物。所用引物为:HIF-1 α，5' -TCC AGT TAC GTT CCTTCG ATC A-3' (SEQ ID NO:16)和 5' -TTT GAG GAC TTG CGC TTT CA-3/ (SEQ ID NO:17)；VEGF, 5' -CGG CGA AGA GAA GAG ACA CA-3' (SEQ ID NO: 18)和 5' -GGA GGA AGG TCA ACC ACTCA-3/ (SEQ ID NO:19);葡萄糖转运蛋白-1，5' -CGG GCC AAG AGT GTG CTA AA-3' (SEQ IDNO:20)和 5' -TGA CGA TAC CGG AGC CAA TG-3' (SEQ ID NO:21);醛缩酶 _A，5' -TGC TACTAC CAG CAC CAT GC-3' (SEQ ID NO:22)和 5' -ATG CTC CCA GTG GAC TCA TC-3' (SEQ IDNO:23);以及 GAPDH，5' -GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3' (SEQ ID NO:24)和 5' -GTC ATTGAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3' (SEQ ID NO:25)。实验重复进行一次，且在每一实验中以一式三份测量。
[0181]蛋白质印迹分析。蛋白质印迹分析是如先前所述来执行(高等人，2011)。简单地说，在裂解缓冲液中收集细胞裂解物，所述裂解缓冲液在50mM Tris缓冲液(pH7.5)中含有0.现似(:1、51111^0了4、5(^1正钒酸钠、1%曲拉通乂-100和蛋白酶抑制剂片剂(罗氏诊断设备(Roche Diagnostics),印第安纳波利斯，印第安纳州)，将所述细胞裂解物加载到4%到12% Bis-Tris凝胶(英杰)上，转移到聚偏氟乙烯膜上，并与适当抗体一起培育。抗pThr2°2/Tyr2CI4-Erk、抗 Erk、抗 pThr389-p70S6 激酶、抗 p70S6 激酶、抗 pSer473_Akt 和抗 Akt抗体购自细胞信号传导技术(Cell Signaling Technology,丹佛斯,马萨诸塞州)；小鼠抗人类HIF-1 α抗体购自BD菲铭真(BD Pharmingen,圣地亚哥,加利福尼亚州);兔抗小鼠HIF-1a抗体购自艾碧康公司(Abeam Inc.，剑桥，马萨诸塞州)；且抗GAPDH抗体购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz B1technology Inc.,圣克鲁斯,加利福尼亚州)。
[0182]细胞活性氧物质的测量。如先前所述(周(Zhou)等人，2007 ;李等人，2009)，将0V2008细胞以4X104个细胞/孔平铺到24孔板的玻璃片(赛默飞世尔科技)上，在正常培养条件中培养过夜，在无血清培养基中饥饿过夜，并用L-4F(10l.! g/ml)处理lh。然后，添加二氯荧光素二乙酸酯(DCFHDA，10 μ M)和胰岛素(200nM)/CoCl2 (100 μ Μ)并与细胞一起再培育0.5h。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤两次。用荧光显微镜(奥林巴斯(Olympus)1X70 ;奥林巴斯，东京，日本)捕捉图像。
[0183]缺氧反应元件报道基因分析。简单地说，将0V2008细胞以2X105个细胞/孔平铺于6孔板中并在完全培养基中生长过夜。然后，通过使用阳离子脂质体(Lipofectamine) 2000 (英杰)将pGL3_Epo-缺氧反应元件(HRE) -Luc质粒转染到细胞中。在24h后，将细胞饥饿过夜并在刺激剂存在或不存在下实施L-4F处理。使用报道基因分析系统(普洛麦格，麦迪逊，威斯康辛州)测量荧光素酶活性。
[0184]HIF-1a的免疫荧光染色。免疫荧光染色是如先前所述来执行(李等人，2006)。简单地说，将0V2008细胞以4X 14个细胞/孔平铺到24孔板中的玻璃片(赛默飞世尔科技)上且在完全培养基中生长过夜。在饥饿过夜后，在刺激剂存在或不存在下对细胞实施L-4F处理。然后，在室温下在4%中性缓冲甲醛中将细胞固定25min，用PBS中的0.5%曲拉通X-100渗透化处理lOmin，并用在PBS中制备的10%正常山羊血清、I %牛血清白蛋白和0.3M甘氨酸封闭lh。将细胞与小鼠抗HIF-1 a (1:200)在4°C下一起培育过夜，且与阿莱克萨福罗568山羊抗小鼠IgG(英杰)一起培育lh。最后，用含有DAPI的维克塔芒特(VectaMount)溶液(媒介实验室(Vector Laboratories),伯灵格姆,加利福尼亚州)覆盖细胞，并用荧光显微镜(奥林巴斯1X70)捕捉图像。
[0185]活体内肿瘤模型。向9周龄C57BL/6J雌性小鼠给予0.5ml皮下注射的5X 106ID8细胞，所述细胞制备为在与等体积的冷基质胶(Matrigel，BD生物科学，圣约瑟，加利福尼亚州)混合的PBS中的单细胞悬浮液。在2周后，小鼠开始通过在远离ID8细胞注射部位的位点每天皮下注射3周接受乱序4F肽(sc-4F)或L-4F(10mg/kg)。在3周后，处死小鼠以供收集肿瘤和进一步分析。
[0186]免疫组织化学染色。对冷冻肿瘤组织以5 μ m厚度进行切片并在_20°C下用冷丙酮固定lOmin。用在PBS中制备的10%正常山羊血清和4%牛血清白蛋白将切片封闭3h，且立即与兔抗小鼠多克隆HIF-1a抗体(I: 200)(艾碧康公司)或大鼠抗小鼠单克隆CD31抗体(I: 25)(艾碧康公司)在4°C下一起培育过夜。然后将切片与相应生物素化二级抗体(媒介实验室)在室温下一起培育30min，之后与维克塔斯顿ABC精英试剂(媒介实验室)一起培育以使染色可见。最后，用苏木素对切片进行轻度复染色，脱水，且用维克塔芒特溶液(媒介实验室)加盖玻片。[0187]统计学。数据显示为每组的平均值土S.D.。通过不成对t测试执行统计学分析。如果P〈0.05，那么认为所有测试结果都显著。
[0188]L-4F在活体内抑制HIF-1a表达和血管生成。先前数据显示，在使用上皮癌症细胞系ID8的卵巢癌的免疫活性小鼠模型中，apoA-1模拟肽L-4F和L-5F抑制肿瘤生长和血管生成(高等人，2011)。考虑到HIF-1a在VEGF (肿瘤血管生成中涉及的关键生长因子)的产生中的重要性，首先通过使用相同模型检查L-4F对HIF-1 α表达的效应。免疫组织化学染色显示，与对照肽(SC-4F)处理组相比，L-4F处理在肿瘤组织中降低HIF-1 α表达(图7A)。与先前报道(高等人，2011) —致，观察到与对照组相比，L-4F处理小鼠中血管数减少(图7A ;还参见高等人，2012，JPET342: 255-262的网上版中包括的补充材料)。
[0189]1^-4?和1^-5?在细胞培养物中抑制!1正-10表达。为检查L_4F是否在缺氧状况下的细胞中抑制HIF-1 α表达，在人类卵巢癌细胞系0V2008中使用低氧浓度(1% O2)和缺氧模拟化学物质CoCl2来诱导HIF-1 α表达。蛋白质印迹分析显示，L-4F以剂量依赖性方式压制缺氧诱导的HIF-1 α蛋白质表达(图7B ;还参见网上版的补充材料)。在用10nM和200nM的胰岛素(图7B)和20 μ M的LPA处理0V2008细胞时观察到类似结果(还参见补充材料)。
[0190]为进一步确认L-4F在HIF-1 α表达中的抑制性作用，研究另外两种人类卵巢癌细胞系CA0V-3和SK0V3。与0V2008细胞的数据一致，L-4F在CA0V-3细胞(图7A)和SK0V3细胞二者中以剂量依赖性方式抑制CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α表达。
[0191]为检查对HIF-1 α的抑制性效应是否对L_4F具有特异性，使用另一种apoA_I模拟肽L-5F来处理0V2008细胞。与L-4F处理类似，L-5F以剂量依赖性方式抑制低氧和CoCl2刺激的HIF-1 α表达(参 见补充材料)。
[0192]作为转录因子，HIF-1a在核中发挥功能并活化下游基因的表达。使用免疫荧光染色来检查L-4F对HIF-1 α蛋白质的核水平的效应。CoCl2和胰岛素处理显著增加HIF_1 a在0V2008细胞核中的积累，且L-4F的预处理显著逆转这些效应(图7C和D)。
[0193]1^-4?对!1正-10依赖性基因转录的抑制。为确定L-4F是否抑制HIF-1 α驱动的基因转录，用含有HRE的荧光素酶报道基因质粒转染0V2008细胞。L-4F处理显著抑制CoCl2-和胰岛素介导的对荧光素酶活性的诱导(图8A和C)。此外，L-4F处理消除CoCl2-和胰岛素诱导的HIF-1 α靶基因(包括VEGF、葡萄糖转运蛋白I和醛缩酶-A)的mRNA水平的增加(图8B和D)，从而表明L-4F抑制HIF-1 α蛋白质表达和活性二者。
[0194]在CoCl2-和胰岛素处理的0V2008细胞中，L-4F的后处理降低HIF-1 α蛋白质水平和活性。由于HIF-1 α表达在临床上呈现的晚期肿瘤中升高，所以随后检查在缺氧或生长因子刺激后给予的L-4F是否抑制HIF-1 α表达。首先用CoCl2或胰岛素将0V2008细胞刺激3h (参见补充材料)或24h (图9)，随后用L-4F处理不同持续时间。L-4F的后处理在0V2008细胞中显著降低HIF-1 α表达(图9A ;还参见补充材料)。免疫荧光分析显示，L-4F的后处理降低HIF-1 α的核表达(图9B ;还参见补充材料)。此外，核中HIF-1 α蛋白质的下调与对下游HIF-1 α靶基因的转录的抑制有关(图9C ;还参见补充材料)。
[0195]1^-4?不影响!1正-10转录。为确定L-4F是否在转录水平上影响HIF-1 α合成，对HIF-1 a mRNA含量进行定量以确定HIF-1 a mRNA水平变化是否先于蛋白质。实时RT-PCR分析指示，L-4F对HIF-1 a mRNA的基础水平无影响(参见补充材料)。此外，与先前报道(西门扎，2003 ;鲍瑟戈等人，2006 ;李等人，2009) —致，低氧和胰岛素不影响HIF-1 α基因转录(参见补充材料)，表明L-4F对HIF-1 α蛋白质表达的调节是在转录后水平上发生。
[0196]L-4F以ERK依赖性方式抑制S6激酶磷酸化。S6激酶的活化对胰岛素诱导的HIF-1 α的从头合成至关重要(西门扎，2003)。为测定L-4F抑制HIF-1 α的分子机制，测试L-4F是否影响胰岛素刺激的HIF-1 α蛋白质合成。数据显示，10 μ g/ml的L-4F防止S6激酶的磷酸化(图10A)。S6激酶磷酸化受上游信号传导分子ERK和Akt的活化的调节。如图1OB中所示，L-4F抑制ERK1/2的活化，但除了在0.5h以外，对Akt的磷酸化无影响，表明对S6激酶活化的抑制最有可能是压制ERK磷酸化的结果。值得注意的是，在0V2008细胞中未观察到CoCl2对ERK、Akt和S6激酶的磷酸化的效应(参见补充材料)。此结果并不出人意料，因为CoCl2处理模拟缺氧，此导致HIF-Ια蛋白质降解降低(鲍瑟戈和麦克塔-格里格瑞，2006)。
[0197]L-4F处理促进蛋白酶体依赖性蛋白质降解。随后检查L-4F是否改变HIF-1 α蛋白质的稳定性。使用防止新蛋白质合成的化合物CHX来抑制HIF-Ια蛋白质从头合成。数据显示，经CHX与胰岛素的组合处理的0V2008细胞展现HIF-1 α随时间逐渐减少，且同时L-4F处理加快HIF-1 α蛋白质的降解(图11Α)。观察到L-4F对CoCl2处理的0V2008细胞具有类似效应(参见补充材料)。此外，蛋白酶体抑制剂MG-132导致L-4F对胰岛素介导的HIF-1 α表达的抑制性效应逆转(图11Β)。这些结果表明，L-4F在卵巢癌细胞中部分通过加快HIF-1 α蛋白质的降解来抑制胰岛素-和CoCl2诱导的HIF-1 α表达和活性。
[0198]L-4F处理对胰岛素-和CoCl2诱导的ROS产生的抑制。据报道，胰岛素处理(周等人，2007 ;李等人，2009)和CoCl2处理(钱德勒(Chandel)等人，2000 ;格里盖(Griguer)等人，2006)显著提高细胞ROS水平，此随后促进HIF-1 α的合成并抑制其降解。如二氯荧光素氧化分析所示(图12)，在0V2008细胞中胰岛素和CoCl2处理提高细胞ROS水平。L-4F的预处理显著防止胰岛素和CoCl2诱导的细胞ROS产生(图12)，表明L-4F对HIF-1 α表达的抑制性作用可为抑制ROS积累的结果。
[0199]讨论
[0200] HIF-1在缺氧下是关键细胞存活蛋白质，且在多种实体瘤中与肿瘤进展和转移相关(西伯(Seeber)等人，2011)。靶向HIF-Ια可为有吸引力的抗癌治疗策略(西门扎，2003 ;别罗泽洛夫(Belozerov)和范梅尔(Van Meir)，2005 ;西伯等人，2011)。缺氧和非缺氧刺激会增加HIF-1a的表达。低氧浓度或用缺氧模拟化合物CoCl2处理抑制HIF-1 α的降解并增加HIF-1 α蛋白质稳定性和积累。一些生长因子(包括胰岛素和LPA)也促进转录后蛋白质合成并上调HIF-1 α的表达和活性(西门扎，2003 ;鲍瑟戈和麦克塔-格里格瑞，2006 ;鲍瑟戈等人，2006)。在本文中显示:1)在小鼠肿瘤组织中，L-4F抑制HIF-1 α表达(图7A) ；2)在人类卵巢癌细胞系中，L-4F和L-5F的预处理和后处理降低低氧-XOCl2-、胰岛素-和LPA诱导的HIF-1 α的表达和核水平(图7和9 ;还参见补充材料)；以及3) L-4F抑制CoCl2-和胰岛素刺激的HRE驱动的报道基因的表达以及HIF-1 α靶基因的活化(图8和9;还参见补充材料)。实时奶-?0?分析指示，在(^2008细胞中，1^4?对!1正-10基因转录无影响(参见补充材料)，表明1^4?对!1正-1(1蛋白质的调节是在转录后水平上发生。
[0201]有强有力的证据表明，在常氧以及缺氧下，ROS是调节HIF-1 α的关键参与者(鲍瑟戈和麦克塔-格里格瑞，2006)。如先前所报道，用低氧浓度(钱德勒等人，2000;古奇(Guzy)等人，2005 ;古奇和舒马克(Schumacker)，2006)、CoCl2 (钱德勒等人，2000 ;格里盖等人，2006)、胰岛素(周等人，2007 ;李等人，2009)和LPA(陈(Chen)等人，1995;桑德斯(Saunders)等人，2010)处理细胞导致ROS生成。ROS产生对细胞中的HIF-1 α表达至关重要，且移除ROS会损害由缺氧和胰岛素诱导的HIF-Ια积累(布鲁内尔(Brunelle)等人,2005 ;曼斯费尔德(Mansfield)等人,2005 ;卡尔内塞基(Carnesecchi)等人,2006 ;比斯瓦斯(Biswas)等人,2007)。加纳帕蒂等人(2012)报道，apoA_I模拟肽D-4F显著降低超氧化物和H202的产生并改良ID8细胞上的氧化态。然而，尚未得知肽处理是否会影响缺氧-或生长因子介导的ROS产生。在本文中报道，L-4F处理在0V2008细胞中显著抑制胰岛素-和CoCl2诱导的ROS产生(图12)。此外，在暴露于胰岛素和CoCl2的癌细胞中，L-4F加快HIF-1 α降解(图1lA ;还参见补充材料)。26S蛋白酶体抑制剂MG-132逆转L-4F对胰岛素介导的HIF-1 α表达的抑制性效应(图11Β)。总得来说，这些数据显示，L-4F降低HIF-1 α的蛋白质稳定性并至少部分通过其ROS-清除作用抑制转录活性HIF-1 α的积累。
[0202]在寻找HIF-1a抑制的分子机制的努力中，确定了 L_4F是否影响HIF_1 α蛋白质的合成。胰岛素活化受体酪氨酸激酶和下游信号传导分子(最有名的是S6激酶)，从而导致增加HIF-1 α的mRNA翻译和从头合成(特莱茵(Treins)等人，2002 ;西门扎，2003)。L-4F在各个时间点抑制胰岛素刺激的S6激酶的磷酸化，从而导致降低HIF-1 α蛋白质水平(图10A)。其它实验显示，S6激酶活性的下调可能是抑制ERK1/2而不是Akt的活化的结果(图10B)。值得注意的是，据报道，ROS参与胰岛素刺激的ERK1/2和S6激酶而不是Akt的磷酸化(周等人，2007)，指示ROS移除可能也参与L-4F对HIF-1 α的从头合成的抑制。
[0203]先前报道显示，在对照和糖尿病大鼠的主动脉中，D-4F (apoA-1模拟肽与L-4F相同但全部用D氨基酸合成)增加两种抗氧化酶血红素氧化酶I和细胞外超氧化物歧化酶(SOD)的表达和活性(克鲁格(Kruger)等人，2005)。最近还显示，D-4F在ID8细胞中上调抗氧化酶Mn-SOD，且 Mn-SOD的敲除导致D-4F在小鼠卵巢癌模型中完全丧失抗肿瘤发生效应(加纳帕蒂等人，2012)。因为SOD活性调节ROS产生和细胞氧化性应激，SOD的诱导可为apoA-1模拟肽的作用机制的重要部分。
[0204]综上所述，数据显示，apoA-1模拟肽在活体内和在细胞培养物中抑制HIF-1 α的表达和活性。对HIF-Ια的抑制可为apoA-1模拟肽的负责压制肿瘤进展的关键机制。
[0205]参考文献
[0206]在整个实例4中提供的参考文献的完整引用列表可参见高等人，2012，药理学与实验治疗学杂志342: 255-262。此文章的网上办也含有实例4中提到的补充材料。
[0207]实例5:HDL模拟物在诱导型和自发型结肠癌小鼠模型二者中抑制肿瘤发展
[0208]此实例显示，HDL模拟物L-4F (载脂蛋白A-1模拟肽)和G* (载脂蛋白J模拟肽)在结肠癌小鼠模型中影响肿瘤生长和发展。在BALB/c小鼠中，HDL模拟物在皮下或经口投与时降低CT26细胞(小鼠结肠腺癌细胞系)的活力和增殖并减小CT26细胞介导的肿瘤负担。溶血磷脂酸(LPA)(结肠癌的一种血清生物标记)的血浆水平在接受HDL模拟物的小鼠中显著降低，表明促炎性脂质的结合与移除是HDL模拟物抑制肿瘤发展的潜在机制。此外，在APCmin/+小鼠(人类家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中，L-4F显著降低息肉的大小和数目，表明HDL模拟物有效抑制诱导型和自发型结肠癌二者的发展。这些结果将HDL模拟物鉴别为治疗结肠癌的新颖治疗策略。[0209]小鼠
[0210]洛杉矶加利福尼亚大学的动物研究委员会批准了所有小鼠方案。6周龄BALB/c雌性小鼠和6周龄C57BL/6J-APC min/+雄性小鼠购自杰克逊实验室。
[0211]肽
[0212]HDL 模拟物 apoA-1 肽 L-4F (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2 ； SEQID NO:12)和含有与 4F肽相同但以序列(Ac-D-W-F-A-K-D-Y-F-K-K-A-F-V-E-E-F-A-K-NH2 ；SEQ IDNO:13)排列以防止形成A类两亲性螺旋的氨基酸的乱序肽(sc_4F)以及名为G*肽的 apoj 模拟物(Ac-L-V-G-R-Q-L-E-E-F-LNH2 (SEQ ID NO:26)，对应于 apoJ(L-[113_122]apoj)中的氨基酸113到122}是全部从L-氨基酸合成。将所述肽溶于H2O中以供注射投与。对于在饮食中投与肽，使用基本上如先前针对西方饮食所述的技术(18)将肽混合到标准鼠粮(罗尔斯顿普瑞纳)中。然而，在本文所报告的任一实验中未投与西方饮食；小鼠仅接受含或不含肽的标准鼠粮。
[0213]细胞培养实验
[0214]源自N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯诱导的BALB/c来源的小鼠结肠癌的CT26细胞系购自美国典型培养物保藏中心。首先在96孔培养板中的完全培养基中培养CT26细胞(2，000个细胞/孔)，在24小时后将培养基更换为无血清培养基。在过夜培育后，用媒剂(对照)处理细胞或用10mg/mL L-4F或G*肽处理。将肽溶于H2O中。将细胞再培育48小时并使用MTS分析试剂盒(普洛麦格)根据制造商的方案分析活力。对于增殖分析，在48小时培育的最后4小时中用溴脱氧尿苷(BrdUrd)标记细胞。随后对细胞进行洗涤，固定，并与小鼠抗BrdUrd抗体在室温下一起培育I小时并通过过氧化物酶偶合的山羊抗小鼠二级抗体(卡尔生物化学) 进行检测。使用双波长450nm和540nm测量吸光度。
[0215]肿瘤负荷研究
[0216]向6周龄BALB/c雌性小鼠给予制备为PBS中的单细胞悬浮液的10mL皮下注射的I X 106CT26细胞，并用以10mg/kg每天皮下投与15天的sc_4F或L-4F处理小鼠。处死小鼠并测量肿瘤重量。
[0217]活体内肺转移
[0218]通过尾静脉注射向BALB/c小鼠静脉内注射10mL PBS中的2 X 104CT26细胞，并用以10mg/kg/d皮下投与3周的L-4F或sc-4F处理小鼠，或用以100mg/kg/d在鼠粮饮食中投与3周的sc-4F或L-4F或G*肽处理。在3周处理后，处死小鼠；采集肺，称重并用布安溶液(西格玛)固定。对肺表面上的肿瘤结节进行计数。
[0219]APC 小鼠研究
[0220]用以100mg/kg/d在鼠粮饮食中投与的L-4F或sc_4F处理基于C57BL/6J背景的6周龄APCmin/+雄性小鼠。在8周处理后，处死小鼠。立刻移除全肠，在福尔马林和70%乙醇中固定。打开肠并在解剖显微镜下检查以对肿瘤进行计数和测量。
[0221]免疫组织化学染色
[0222]用石蜡固定并包埋肺表面的肿瘤组织，以5_厚度切片。用二甲苯将切片脱石蜡，用100 %、90 %、70 %和50 %乙醇再水合，用20mg/mL蛋白酶K处理30分钟，并在室温下用3% H2O2处理30分钟以抑制内源过氧化物酶，用在PBS中制备的10%正常山羊血清和4%牛血清白蛋白封闭3小时，然后与1: 50大鼠抗小鼠单克隆CD31抗体在4°C下一起培育过夜。将切片与相应生物素化二级抗体一起培育I小时，之后与维克塔斯顿ABC精英试剂一
起培育。
[0223]细胞周期分析
[0224]将CT26细胞在6孔板中培养过夜，然后将其血清饥饿48小时。用媒剂(对照)处理细胞，或用10mg/mL L-4F或G*肽处理，且再培育48小时。收集细胞，用PBS洗涤，并用70%冰冷甲醇在4°C下固定过夜。通过离心收集经固定细胞,用PBS洗涤，并将其再悬浮于0.3mL含有40mg/mL RNaseA和100mg/mL碘化丙啶的PBS中，并通过来自BD生物科学的FACScan实施流式细胞术细胞周期分析。
[0225]蛋白质印迹分析
[0226]在于50mmol/L Tris 缓冲液(ρΗ7.5)中含有 0.lmol/L NaCl、5mmol/L EDTA,50mmol/L正钒酸钠、I %曲拉通X-100和蛋白酶抑制剂片剂的细胞裂解缓冲液中处理后，收集总细胞蛋白质。通过SDS-PAGE分离20微克总蛋白质并将其转移到硝酸纤维素膜上，之后与一级抗体在4°C下在5%脱脂乳和0.1%吐温-20中一起培育。以1: 1，000稀释度使用抗细胞周期蛋白Dl和抗细胞周期蛋白A兔多克隆抗体，且以1: 2，000稀释度使用抗b-肌动蛋白多克隆抗体。
[0227]ELISA 分析
[0228]通过竞争性ELISA根据制造商的方案(英杰)测量血浆中的白介素(IL) _6浓度。
[0229]LPA结合亲和性和血清LPA水平
[0230]LPA(20: 4)购自阿凡提极性脂质。如先前所述测定LPA水平(19)。
[0231]统计学分析
[0232]数据显示为每组的平均值土SD。通过不成对t测试来实施统计学分析。在P〈0.05下的所有结果都视为统计学上显著。
[0233]在BALB/c小鼠中注射CT26细胞后，HDL模拟物L-4F抑制肿瘤发展
[0234]CT26是在静脉内引入免疫活性BALB/c小鼠中时产生转移性肺肿瘤的结肠腺癌细胞系(20-22)。CT26细胞系已广泛用作同源肿瘤模型用于在小鼠模型中研究癌症的治疗性应用，且因此在HDL模拟研究中选择CT26细胞进行结肠癌研究。首先检查以10mg/kg/d皮下投与3周的L-4F和sc-4F(乱序肽，其含有与4F肽中相同但以防止形成A类两亲性螺旋的序列排列的氨基酸)在通过尾静脉注射2X 104CT26细胞的BALB/c小鼠中对肺肿瘤形成的效应。经L-4F处理的BALB/c小鼠(n= 11只/组)的肺重量(图13A)和在肺表面上计数的肿瘤数(图13B)与经sc-4F处理的小鼠相比显著降低(280mg对225mg，P〈0.01 ;33对18，P〈0.001)。2组的肺肿瘤的代表性照片显示于图13C中。随后检查L-4F处理是否影响在BALB/c小鼠侧腹中的肿瘤发展。向6周龄BALB/c雌性小鼠在侧腹中皮下注射I X 106CT26细胞。在远离CT26细胞注射部位的位点用以10mg/kg每天皮下投与15天的sc_4F (η = 9)或L-4F (η = 8)处理小鼠。与经L-4F处理的小鼠相比，在经sc_4F处理的BALB/c小鼠中，侧腹肿瘤重量显著较大(778mg对389mg，P〈0.05 ;图13D)。2组的侧腹肿瘤的代表性照片显示于图13E中。还测量来自图13A中所示实验的血浆中的IL-6水平。与对照组相比，在经L-4F处理的小鼠中IL-6显著降低(图13F)。
[0235]在经在鼠粮中投与的L-4F处理的小鼠中，在CT26细胞注射后的肿瘤发展显著降低[0236]最近报道，不论是皮下投与或经口投与，4F在动脉粥样硬化的动物模型中有效
(18)。为测定L-4F在经口投与时是否可降低肿瘤发展，通过尾静脉向BALB/c小鼠注射2 X 104CT26细胞，并用以100mg/kg/d在鼠粮饮食中投与3周的L-4F (ηI/4 = 9)或sc-4F (η=12)处理。与经L-4F处理的小鼠相比，经sc-4F处理的BALB/c小鼠中的肺重量(图14A)和肿瘤数(图14B)显著较大(296mg对238mg, Ρ〈0.05 ；21对12，Ρ〈0.0001)。先前报道，L-4F在活体内抑制血管生成(23)。来自此实验的肿瘤切片的免疫组织化学染色显示，与对照小鼠相比，源自经L-4F处理的小鼠的肿瘤中的⑶31表达显著降低(图14C)。此外，在接受L-4F肽的小鼠中，与其相应对照小鼠相比，血浆LPA水平显著降低，P〈0.01 (图14D)。
[0237]在经在鼠粮中投与的L-4F处理的C57BL/6J-Apc min/+小鼠中，肠道中的肿瘤数目和大小显著降低
[0238]随后检查HDL模拟物是否可在结肠癌的自发模型中影响结肠肿瘤的发展。APCmin7+小鼠是已确立的结肠癌小鼠模型且反映人类家族性腺瘤性息肉病的发展(24、25)。用以100mg/kg/d在鼠粮中投与 8 周的 L-4F (η = 5)或 sc_4F (η = 6)处理 6 周龄 CSTBL/ej-Apc1^"7+雄性小鼠。与经SC-4F处理的小鼠相比，来自经L-4F处理的小鼠的肠道中的肿瘤数目和大小显著降低(100%对 60%，Ρ〈0.05 ；l-3mm:56.5 对 36.8，P〈0.05 ；>3mm:12.8 对 5，Ρ〈0.05 ；图15Α和15Β)。与对照小鼠相比，在接受L-4F肽的小鼠中，来自此实验的血浆LPA水平显著降低，Ρ〈0.01(图 15C)。
[0239]L-4F在活体外改变CT26细胞活力、增殖、细胞周期和细胞周期相关蛋白质的表达
[0240]为检查HDL模 拟物L-4F在小鼠中抑制CT26细胞介导的肿瘤发展的机制，在活体外测定L-4F对CT26细胞活力的效应。在经L-4F (10mg/mL)处理的CT26细胞中，在与对照相比时，细胞活力降低25%以上(P〈0.001)(图16A)。此外，如通过BrdUrd纳入所测量，L-4F显著抑制CT26细胞的增殖(P〈0.001)(图16B)。为研究L-4F是否通过改变细胞周期进展来抑制细胞增殖，在CT26细胞中评价L-4F对细胞周期特征的效应。细胞周期分析显示，48小时的L-4F处理诱导G0/G1期的延长和S期的中止(图16C)。此外，蛋白质印迹分析显示，在经L-4F处理的细胞中，细胞周期蛋白质细胞周期蛋白Dl和细胞周期蛋白A的表达显著较低(图16D)。
[0241 ] HDL模拟物L-4F抑制LPA诱导的CT26细胞的活力
[0242]已将LPA鉴别为人类肿瘤发展、进展和转移的重要介质(26、27)。先前已显示，在注射ID8细胞的小鼠中，apoAI模拟肽抑制LPA诱导的ID8细胞的活力并降低血清LPA水平
(17)。如所预期，L-4F结合LPA (17)，LPA (10-20mmol/L)显著改良CT26细胞生长，且L-4F在所测试所有剂量下都显著降低LPA诱导的活力，P〈0.001(图17A)。通过液相色谱_质谱法测量细胞培养基中的LPA水平，且发现，与对照培养基相比，L-4F处理显著减少LPA16: O和18: O。LPA20: 4和18:1在细胞培养基中检测不到(图17B)。
[0243]HDL模拟物G*肽(L-[113-122] apoj)抑制CT26细胞生长和CT26介导的肿瘤发展
[0244]使用G*(L-[113_122]apoJ)肽重复活体内和活体外研究。在经以100mg/kg/d在鼠粮中投与3周的G*肽处理的小鼠中，在CT26细胞注射后的肺肿瘤发展显著降低(肺重量为296mg 对 250mg, Ρ〈0.05 ;肿瘤数为 21 对 10，Ρ〈0.0001 ;图 18Α 和 18Β)。在经 G* 肽(1mg/mL)处理的CT26细胞中在与无处理相比时，细胞活力降低约40% (图18C)。在图18A和18B中所示的小鼠实验中，在接受G*肽的小鼠中，与其相应对照小鼠相比，血浆LPA水平显著降低，？〈0.05(图180)。蛋白质印迹显示，与无处理相比，使用G*肽处理的细胞周期蛋白Dl和细胞周期蛋白A的表达较低(图18E)。
[0245]讨论
[0246]脂质代谢与癌症之间显著相关，且早已认为炎症性氧化性应激与癌症的病理生理学有关(28-30)。脂质氧化和所得氧化脂质介导的炎症似乎对于多种炎症性疾病的病因学来说很常见(31、32)，所述疾病涉及脂蛋白在若干种疾病(包括癌症)的发展和进展中的作用。已承认HDL是先天免疫系统的组成部分。HDL是复合高分子，其功能清单包括抗氧化剂、抗炎症和抗微生物活性。与LDL不同，HDL是蛋白质与脂质的异质性混合物，这决定了HDL的结构和功能完整性。HDL的若干种蛋白质/酶组份(包括磷脂转移蛋白、胆固醇酯转移蛋白和卵磷脂胆固醇酰基转移酶)对其形成和成熟很重要，而其它蛋白质/酶组份(例如载脂蛋白A-1 (apoA-1)、apoJ和对氧磷酶-1 (PONl))赋予HDL功能性(33)。在过去十年间，HDL模拟物已在多种炎症性疾病的临床前研究中显示杰出的治疗前景(34-40)。
[0247]最近显示，在皮下或经口投与时，2种apoA-1模拟肽L-4F和L-5F降低小鼠卵巢癌细胞(ID-8细胞)和顺钼抗性人类卵巢癌细胞的活力和增殖，并在C57BL/6J小鼠中减小ID-8细胞介导的肿瘤负担(17)。另外显示，apoA-1模拟肽通过以下方式抑制肿瘤发生:
(i)抑制血管生成(23)和(ii)诱导MnSOD的表达和活性(41)。由于血管生成和氧化还原路径是许多癌症的共同特征，所以检查2种HDL模拟物apoA-1模拟肽L-4F和apoj模拟肽G*在结肠癌的发展和进展中的效应(42)。与假设一致，结果显示，HDL模拟物抑制通过将CT26细胞注射到免疫活性BALB/c小鼠中生成的结肠癌的发展。此外，本文首次使用FAP的小鼠模型(APCmin/+)显示，经口投与HDL模拟物能压制结肠癌在小鼠模型中的自发发展。
[0248]已使用4F肽进行2组临床试验。布鲁顿(Bloedon)与同事(43)发现，经口投与4.3mg/kg和7.14mg/kg剂量的4F尽管血衆水平极低(8_16ng/mL),但仍显著改良HDL抗炎症性性质。布鲁顿与同事(43)还发现,投与0.43mg/kg和1.43mg/kg剂量的肽无效。沃森(Watson)与同事(44)以血浆水平为目标且在冠状动脉心脏病患者中将L-4F每天通过静脉内输注投与7天或皮下投与28天。沃森与同事(44)使用0.43mg/kg剂量实现极高的血楽；水平，但未对HDL抗炎症性质产生任何改良。综上所述，在人类中改良HDL功能所需的剂量可能远高于沃森与同事(44)使用的剂量，且至少与布鲁顿与同事(43)使用的剂量一样高。最近，纳瓦卜(Navab)与同事(45)报道，所投与HDL模拟肽4F的剂量且不是所获得的血浆水平决定效能，且不管使用哪种投与途径，肠都可为所述肽的主要作用位点。结果显示，在小鼠模型中，在大于布鲁顿与同事(43)所使用剂量的剂量下，不论是经口给予或皮下给予，HDL模拟物都有效。考虑到在小鼠结肠癌模型中使用HDL模拟物的结果和纳瓦卜与同事(45)的结果(指示剂量且不是血浆水平决定效能)，重要的是在任何未来临床试验中测试本文使用的高剂量。
[0249]HDL模拟物的抗肿瘤发生活性的一股机制的一个下游靶似乎是血管生成，如通过经处理肿瘤中的⑶31染色减少可见。LPA在炎症、血管生成和癌症中具有重要作用，且已成为有前景的治疗靶(46)。此外，与先前发现(17、23)和当前发现一致，促炎性/促血管生成脂质(例如LPA)的结合和移除可为HDL模拟物的作用机制的主要部分。
[0250]综上所述，结果显示，HDL模拟物抑制诱导型和自发型结肠癌二者在小鼠中的发展。HDL模拟肽对促肿瘤发生脂质的结合和移除可能改变肿瘤细胞的增殖能力以及与肿瘤相关的血管生成。在描绘这些HDL模拟物的特定作用机制时，鉴别靶脂质是重要的后续步骤。
[0251]参考文献
[0252]在整个实例5中提供的参考文献的完整引用列表(使用括号中的数字来标识)可参见苏(Su)等人，2012，分子癌症治疗(Mol.Cancer Ther.)11(6): 1311-1319。
[0253]实例6:其它HDL模拟物在结肠癌的小鼠模型中抑制肿瘤生长和发展
[0254]此实例显示，在活体外经各种HDL模拟肽处理的CT26细胞在处理48小时内展现与媒剂处理对照相比降低的细胞活力(根据上述MTS分析，图19)。所分析HDL模拟物是 L-4F (SEQ ID NO:12)、L-4F2 (SEQ ID NO:14)、K4, 15_4F(SEQ ID NO:27)、K4, 15_4F2(SEQID NO:28)和新颖的 20 个氨基酸的肽(“20AA”)LRKLRKRLLR LVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。K4, 15-4F(SEQ ID NO:27)和 K4, 15_4F2(SEQ ID NO:28)肽是基于纳亚尔(Nayyar)等人，2012，脂质研究杂志(J.Lipid Res) 53 (5):849-58中阐述的K14，15肽，其中在残基4和15处赖氨酸经精胺酸取代，且后者K4，15-4F2进一步经修饰以在位置11和17处引入取代丙氨酸的Aib。新颖的20个氨基酸的肽是从ApoE和G*肽形成以产生所述肽:LRKLRKRLLRLVGRQLEEFL(SEQ ID NO:1)。
[0255]另外，接受皮下侧腹注射CT26细胞且随后经皮下HDL模拟肽处理的BALB/c小鼠显示肿瘤重量和肿瘤体积显著降低(图20)。这些结果确认，在癌症治疗中可使用多种HDL模拟物。
[0256]根据上文应了解 ，尽管本文已出于阐释性目的阐述了本发明的特定实施例，但在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出各种修改。因此，本发明不受除了所附权利要求书以外的任何限制。
【权利要求】
1.一种抑制肿瘤生长的方法，所述方法包含使肿瘤细胞与选自由以下组成的群组的高密度脂蛋白HDL相关分子接触=HDL模拟肽(SEQ ID NO:1、3到9、12、14或26至Ij 28)、牛HDL和 ApoA-1。
2.一种治疗或预防个体的癌症的方法，所述方法包含向所述个体投与选自由以下组成的群组的HDL相关分子=HDL模拟肽(SEQ ID NO:1、3到9、12、14或26到28)、牛HDL和ApoA-1 ο
3.一种减少暴露于氧化性应激的上皮细胞的死亡和/或氧化性应激的方法，所述方法包含使所述上皮细胞与选自由以下组成的群组的HDL相关分子接触:HDL模拟肽(SEQ IDNO:1、3 到 9,12,14 或 26 到 28)、牛 HDL 和 ApoA-1?
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述接触是在暴露于氧化性应激之前进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述接触是在所述暴露于氧化性应激之前至少12到24小时进行。
6.根据权利要求3、4或5所述的方法，其中所述氧化性应激包含暴露于紫外辐射。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是全长蛋白质。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是作为重组ApoA-1 投与。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中所述ApoA-1是以未修饰形式投与。
10.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述HDL相关分子是作为口服补充剂投与。
11.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述HDL模拟肽选自由以下组成的群组:SEQ IDNO:1、3到9、12、14和26到28。
12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述个体是人类。
14.一种用于治疗癌症的HDL相关分子，其中所述HDL相关分子选自由以下组成的群组:HDL 模拟肽(SEQ ID NO:1、3 到 9、12、14 或 26 到 28)、牛 HDL 和 ApoA-1。
15.一种肽，其是由SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列或SEQ ID NO:3到9的一者中显示的氨基酸序列组成。
【文档编号】C07K7/00GK104039810SQ201280052367
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年8月29日 优先权日:2011年8月29日
【发明者】罗宾·法里亚斯-艾斯纳, 斯里尼瓦桑·T·雷迪 申请人:加利福尼亚大学董事会