犬源化肿瘤坏死因子抗体及其使用方法

犬源化肿瘤坏死因子抗体及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了特异性结合犬肿瘤坏死因子并抑制犬TNF结合TNFR1受体能力的犬源化抗体和嵌合抗体及其抗原结合片段。本发明还延及编码犬源化抗体和嵌合抗体及其抗原结合片段的核酸和使用所述抗体和/或核酸治疗犬慢性炎性疾病如关节炎的方法。
【专利说明】犬源化肿瘤坏死因子抗体及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及充当犬肿瘤坏死因子α抑制剂的结合抗体及其片段。本发明延及制备这些抗体及其片段的方法以及这些结合抗体和片段在治疗犬的由肿瘤坏死因子介导的慢性炎症病症如关节炎中的治疗用途。
[0002]发明背景
[0003]肿瘤坏死因子a (TNF- a、TNF- α、TNF)是在免疫、炎症、细胞增殖控制、分化和细胞凋亡方面发挥多效性功能的有效细胞因子。已经证明，使用肿瘤坏死因子受体(TNFR)免疫球蛋白Fe结构域融合蛋白或抗TNF中和单克隆抗体抑制TNF是治疗包括风湿病关节炎和银屑病性关节炎在内的各种人炎性疾病的成功的治疗途径。
[0004]宠物动物如狗会发生类似的炎性疾病，包括骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎、血浆-淋巴细胞滑膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎和各种自身免疫性皮肤疾病。据估计，在美国五分之一的成年狗有关节炎，并且狗被用作人关节疾病如骨关节炎、前交叉韧带撕裂和半月板损伤的模型。
[0005]已有大量的文件证明TNF在狗发生炎症中的作用。例如，封闭的胸部模型中由球囊闭塞引起缺血再灌注后，用TNF抑制剂依那西普(huTNFR-Fc)处理狗，使心肌损伤降低约25-40%，同时伴随有相关的炎症标记物如ICAM-1和NF_kB的减少。同样，也已经证明，在缺血-再灌注的开胸狗模型中使用2mg/kg TNFR-Fc，梗死面积降低60%。
[0006]而且，在患有膝关节炎的狗的滑液的细胞浸润物中，TNF-α的分泌增加。已经显示，在患有青光眼的狗的中心视网膜和外围视网膜中，作为广泛的炎性反应的一部分，TNF受体和II型TNF受体显著增加。抗犬TNF MAb已用于通过捕捉ELISA法检测用LPS处理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF。还报道过，在犬血管外皮细胞瘤、成视网膜细胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大细胞瘤的皮肤样品中存在TNF-α表达。在骨关节炎的诱导模型中，犬关节软骨中存在TNF- α受体和TNF受体。已经在患剥脱性皮肤型红斑狼疮(ECLE)的两只狗中测试了抗TNF的人源化单克隆抗体阿达木单抗(每两周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病进展照旧且血清TNF- α水平无变化。
[0007]由于TNF参与犬的各种炎性介导的病症，因此需要可用于长期抑制TNF的犬TNF抑制剂，从而预防或治疗所述慢性炎性病症。
[0008]发明概述
[0009]经过大量的努力，本发明人意外地确定出一种制备抗体的方法，该方法产生了特异性结合犬TNF且中和犬TNF的生物活性的抗体和结合片段。特别是，本文表明，尽管在该抗体的框架区中引入了大量的氨基酸修饰，由于这些修饰是以新颖的和创造性的方式作出的，因此本发明的抗体和结合片段仍然以高特异性结合犬TNF。进一步证明，该结合通过抑制犬TNF与TNF受体表达 的细胞膜结合来使犬TNF的生物活性减退。因而，这将能够预防犬的TNF介导的诱导的发生、炎性介导的疾病如关节炎的发展或进展。
[0010]使用重组DNA方法生产本发明的抗体，且本发明的抗体显示对犬TNF的结合特异性，同时还具有犬的框架和恒定结构域序列，以降低将其施用至犬宿主时它们的免疫原性。结果，使异种抗体诱导的风险最小。由于使用标准方法如CDR移植等不能产生该抗体，因此对犬TNF的结合特异性完全是出人意料且意想不到的。
[0011]根据本发明的第一方面，提供了特异性结合犬肿瘤坏死因子(TNF)犬源化抗体或其抗原结合片段。
[0012]在某些实施方案中，通过下述方法制备该抗体，其包括或基本上由以下步骤组成:
[0013]-提供来自犬之外的物种的供体抗体，其中所述供体抗体对肿瘤坏死因子具有结合特异性；
[0014]-将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与存在于一个或多个犬抗体框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及
[0015]-用存在于一个或多个犬抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
[0016]上述方法修饰了犬中使用的供体抗体，通过这种方式使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有对犬中的该位置而言是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保留了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是这种修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，犬中修饰的抗体并不视为是外来的，并因此没有引起可能导致中和抗体功效的免疫反应，尤其是在长期施用后。
[0017]在某些实施方案中，取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括，用存在于对应位置的与所述一个或多个取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基来取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
[0018]在某些实施方案中，该方法还包括用衍生自犬抗体的重链和/或轻链的恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的步骤。
[0019]上述方法并不包括⑶R移植。根据上述方法制备的抗体包含供体抗体的⑶R、根据上述方法制备的犬源化框架区，以及犬的恒定结构域。
[0020]本发明延及根据上述方法制备的抗体例如以下描述的那些抗体及其片段。
[0021]因此，根据本发明的另一方面，提供了包含肽的组合物或编码肽的核酸序列，其中所述肽包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。通常，所述肽结合肿瘤坏死因子α。在某些实施方案中，所述肽是犬源化抗体或嵌合抗体或其结合片段。在某些实施方案中，根据以上描述的制备抗体的方法制备犬源化抗体。
[0022]在某些方面，本发明提供了包含犬肿瘤坏死因子α结合剂的组合物或编码肿瘤坏死因子α结合剂的寡核苷酸，其中所述结合剂包含选自以下的氨基酸序列:SEQ IDN0:USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID Ν0:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
[0023]本发明的另一方面提供了特异性结合犬肿瘤坏死因子(TNF)尤其是犬TNF-α的犬源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。通常，犬源化抗体或嵌合抗体或由其衍生的抗原结合片段中和犬TNF的生物活性。特别是，犬源化抗体或嵌合抗体或结合片段与犬TNF的结合隔绝了犬TNF结合和激活膜相关的犬TNF受体的能力。在某些实施方案中，犬源化抗体或嵌合抗体包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。在某些实施方案中，根据以上描述的制备抗体的方法来制备犬源化抗体。
[0024]本发明的又一方面提供了犬源化抗体，其结合补体且启动补体介导的TNF-α表达细胞的细胞裂解。这类抗体将减少TNF表达炎性细胞的数目，从而导致体内长期抗炎活性。在某些实施方案中，根据以上描述的制备抗体的方法来制备犬源化抗体。
[0025]在本发明的以上方面的某些实施方案中，所述犬源化抗体或嵌合抗体或其结合片段以Kd为IX 10_8或更小的结合亲和力结合TNF。
[0026]在本发明的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合犬肿瘤坏死因子α (TNF-α)，所述抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为轻链可变结构域和/或重链可变区，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQID NO: 2或与其具有 至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列。通常，所述抗体是嵌合抗体或犬源化抗体。
[0027]在所述抗体是犬源化抗体或其片段的某些实施方案中，所述抗体或其片段包含、组成为或基本组成为轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或与其具有至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列。
[0028]在某些实施方案中，所述重链(VH)的可变区结合至包含至少一个免疫球蛋白恒定结构域的另一氨基酸序列。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定结构域衍生自子类IgG(免疫球蛋白G)的抗体，以形成本发明的犬源化抗体的完整重链。已知四种不同的犬重链恒定结构域。通常，所述恒定结构域包含CHl、CH2和CH3区以及位于CHl和CH2区之间的合适的连接体(或“铰链(hinge) ”)。
[0029]在某些实施方案中，犬源化抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为重链，所述重链包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ IDNO: 7，或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述嵌合抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID N0:9或与其具有至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述嵌合抗体包含重链，所述重链具有选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:20,SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22，或与所述氨基酸序列具有至少85、90或95%的序列同源性的氨基酸序列。
[0030]在抗体是犬源化抗体的实施方案中，所述抗体具有氨基酸序列，其中通过缺失、添加和/或取代使残基改变以使序列去免疫，从而当施用至犬个体时不会产生对抗其的异种抗体。特别是，所述抗体包含犬衍生的框架和恒定结构域氨基酸序列。
[0031]在另一方面，本发明延及中和抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬肿瘤坏死因子(TNF)，所述抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本上组成为轻链和重链，其中所述轻链(VL)的可变区包含氨基酸序列SEQ ID N0:1或与其具有至少85、90、95或99%的同一性的氨基酸序列，且其中所述重链(VH)的可变区包含、组成为或基本上组成为与氨基酸序列SEQ ID NO: 2相同或基本上同源的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 2具有至少85、90、95或98 %的同一性的氨基酸序列。
[0032]在某些实施方案中，所述抗体是包含轻链和/或重链的犬源化抗体，所述轻链包含、组成为或基本上组成为氨基酸序列SEQ ID NO: 3,所述重链包含、组成为或基本上组成为选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7，或与所述氨基酸序具有至少85%氨基酸同一'丨生、更优选95%以及最优选至少98%同一'丨生的的序列。通常，所述轻链是K轻链。
[0033]在某些实施方案中，所述抗体是包含轻链和/或重链的嵌合抗体，所述轻链包含、组成为或基本上组成为氨基酸序列SEQ ID NO:8或与其具有至少85%、更优选95%以及最优选至少98%同一性的氨基酸同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本上组成为氨基酸序列SEQ ID N0:9或与其具有至少85%、更优选95%以及最优选至少98%同一性的氨基酸同一性的序列。通常，所述轻链是K轻链。
[0034]在其他的实施方案中，本发明的抗体或结合片段延及非糖基化变体，其中使适合于糖基化的恒定结构域氨基酸残基缺失或用不能被糖基化的残基取代，从而阻止糖基化。
[0035]本发明人进一步限定了一系列可以与互补决定区(CDR)结合以形成犬源化重链可变结构域和犬源化轻链可变结构域的框架区(FR)。每一个重链结构域和轻链结构域都具有4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。
[0036]抗体分子可以包含重链可变结构域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3区以及相关的插入框架区。重链可变结构域(VH)⑶R称为VHCDR，根据卡巴特编号系统(Kabat numberingsystem)在下列位置可以找到这些⑶R:VHCDRl -卡巴特残基31-35、VHCDR2 -卡巴特残基 50-65、VHCDR3 -卡巴特残基 95-102 (Kabat EAet al.(1991) Sequences of proteinsof immunological interest (具有免疫学重要性的蛋白质序列),5thedition.Bethesda:USDepartment of Health and Human Services)。而且，抗体进一步包含轻链可变结构域，其包含⑶R1XDR2和⑶R3区以及相关的插入框架区。轻链可变结构域(VL)⑶R称为VIXDR，根据卡巴特编号系统在下列氨基酸残基位置可以找到这些⑶R:VIXDRl -卡巴特残基24-34、VLCDR2-卡巴特残基50-56、VLCDR3 -卡巴特残基89-97。轻链可变结构域或重链可变结构域包含四个框架区，FRU FR2、FR3 和 FR4，按下列排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3_FR4与Q)R穿插。
[0037]在另一方面，本发明延及抗犬TNF抗体或其犬TNF结合片段，所述抗体或抗体结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含以下中的至少一个:
[0038]由氨基酸序列SEQ ID NO: 10组成或包含所述氨基酸序列的FRl框架区；
[0039]由氨基酸序列SEQ ID NO: 11组成或包含所述氨基酸序列的FR2框架区；
[0040]由氨基酸序列SEQ ID NO: 12组成或包含所述氨基酸序列的FR3框架区；以及
[0041]由氨基酸序列SEQ ID NO: 13组成或包含所述氨基酸序列的FR4框架区；
[0042]所述重链可变区，包含以下中的至少一个:
[0043]由氨基酸序列SEQ ID NO: 14组成或包含所述氨基酸序列的FRl框架区；
[0044]由氨基酸序列SEQ ID NO: 15组成或包含所述氨基酸序列的FR2框架区；
[0045]由氨基酸序列SEQ ID NO: 16组成或包含所述氨基酸序列的FR3框架区；以及
[0046]由氨基酸序列SEQ ID NO: 17组成或包含所述氨基酸序列的FR4框架区。
[0047] 通常，轻链⑶R和重链⑶R衍生自对犬TNF具有结合特异性的抗体。[0048]通常，本发明的犬源化抗犬TNF抗体由重组DNA方法产生，其不需要将回复突变引入轻链可变结构域或重链可变结构域的框架区内。
[0049]在某些实施方案中，包含以上描述的所述至少一个框架区的轻链可变结构域与犬衍生轻链恒定结构域结合，犬衍生轻链恒定结构域通常为轻链K恒定结构域，但任选地为λ轻链。在某些实施方案中，所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的FRl区、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的FR2区、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的FR3区、具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:13的FR4区，或与前述氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
[0050]在某些另外的实施方案中，包含以上描述的至少一个框架区的重链可变区与犬衍生重链恒定结构域结合。在某些实施方 案中，恒定结构域的氨基酸序列没有任何翻译后修饰，或者可以经修饰而除去可能经历N-连接或O-连接糖基化的任何残基或全部残基，这样使得恒定结构域不发生糖基化。在某些实施方案中，重链包含具有氨基酸序列SEQ IDNO: 14的FRl区、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的FR2区、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16的FR3区和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17的FR4区，或具有与前述氨基酸序列有至少60、70、80、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
[0051]在某些另外的实施方案中，可以对本文描述的框架区进行修饰。也就是说，
【发明者】已确认，对于每一框架区中的一些残基来说，可以为指定位置选择氨基酸残基。重要的是，这些框架区修饰不会导致向互补决定区的构象改变，这是由于这可能会不利地改变所得抗体的结合特异性和/或亲和性。在某些实施方案中，本发明延及将2个或多个氨基酸取代引入到轻链可变区和/或重链可变区的框架区的氨基酸残基。
[0052]因此，在某些另外的实施方案中，本发明延及包含具有FRl区的轻链可变结构域的多肽，例如抗体或其抗原结合片段，所述FRl区包含通过以下一个或多个氨基酸取代而修饰的氨基酸序列SEQ ID NO: 10，所述氨基酸的取代为(其中氨基酸用其单字母代码表示):位置5的氨基酸残基T (Τ5)被氨基酸残基M或I取代，S7是T，A 9是L或P，S12是A，L13 是 V，S14 是 T 或 R，Q15 是 P 或 R，Ε16 是 D，Κ18 是 E、A、P、T 或 L，V19 是 A，Τ20是S，Τ22是S或Y，以及C23是Y。
[0053]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的轻链FR2区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:Υ2是F、I或L，Q3是R、L或I，Q4是H，Κ5是R，Ρ6是3或八，67是0，人9是5、1'或卩，1(11是03或1?，1^2是1?、？、6、人或5，114是L，以及Υ15 是 F、N、S、E 或 V。
[0054]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的轻链FR3区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:G1是A、V2是A、P3是S，S4是D，F6是L或V，S7是 I，G8 是 A，T13 是 A，D14 是 E，T16 是 S 或 R，L17 是 F，T18 是 R 或 K，S21 是 R、G 或 T，L22 是 V，P24 是 A，E25 是 D、G、I 或 N，V27 是 A、T、G 或 S，A 28 是 G，以及 V29 是 I 或 L。
[0055]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的轻链FR4区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:G2是S，Q3是A、P或T，G4是E，T5是P，K6是Q或S，V7是L或W，E8是D或R，以及19是L。[0056]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的重链FRl区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:E1是D或G、V2是G、L、E、I或M，Q3是H、R、A、V、E、K、L、P 或 S，L4 是 V 或 P，V5 是 A、L、E 或 M，E6 是 Q 或 A，S7 是 F、L 或 T，G9 是 E，GlO是 D、A、N、E 或 T，L11 是 Q、R、V 或 W，V12 是 A、I 或 M，Q13 是 K、R 或 N，P14 是 F 或 T，G15是 A、E 或 T，G16 是 E 或 A，S17 是 T 或 P，L18 是 R，R19 是 K、T、G 或 V，L20 是 I 或 V，S21是 Y，A 23 是 V、L、I 或 E，人24是1\￥、6、1或5，525是？、6或1'，626是0、1?或1'，以及 F27是 L、1、S、D、T 或 V。
[0057]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的重链FR2区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:W1是C，V2是1、A、F或L，Q4是L或H，A5是S、T、G、P、V 或 D，P6 是 L，G7 是 E、R 或 L，K8 是 R、E、G、A、M 或 Q，G9 是 E、R、D、T 或 V，LlO 是T、P、F*M，Ell 是 Q、H、D、L、P 或 R，W12 是 L、C、S、Y、F 或 M，V13 是 L、I 或 F，以及 S14 是A、T、G 或 L。
[0058]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16的重链FR3区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰:R1是Q，F2是V或L，T3是A、I或S，14是V、L、M或T，S5 是 A、F或 T，R6 是K，D7 是E 或N，N8 是D、T、S、I 或G，A 9 是 G、V、S、D、P 或 T，KlO 是 R、E、N、Q、G 或 M，Nll 是 D、S、K、H 或 R, S12 是 T、M、I 或 A，L13 是 V、M、A 或 I，Y14是 F、H、S 或 T，L15 是 I，Q16 是 H、E、D、R 或 A，M17 是 L，N18 是 D、S、T、H、K、P 或 R，S19 是G、D、R、N 或 T，L20 是 V，R21 是 T、G、K、S 或 I，A 22 是 V、D、T、S、G 或 P，E23 是 D、A 或 V，T25 是 A、S 或 M，A 26 是 G 或 V，V27 是 M、1、L、F、T、K 或 Q，Y28 是 H，Y29 是 F 或 H，A 31是￥、1\6、]?、1?、5、(:或1^ 以及 K32 是 R、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、1、Μ。
[0059]在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17的重链FR4区可以通过以下一个或多个氨基酸取代进行修饰=Wl是L，G2是A或S，Q3是P、H、R或D，Τ5是A、S、I 或 N，L6 是 S、Q、P 或 R，V7 是 L、I 或 P，Τ8 是 F、1、A、S、L、P 或 Y，V9 是 A，SlO 是 A、C、P或Τ，以及Sll是L、A或P。
[0060]在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。通常，所述抗体是犬源化抗体或其片段。或者，所述抗体是嵌合抗体或其片段。
[0061]在某些另外的实施方案中，本发明的犬源化或嵌合TNF中和抗体或由其衍生的结合片段与犬TNF-α (肿瘤坏死因子α )特异性结合且其结合亲和性的平衡解离常数(Kd)为IxlO-8或更小。而且，优选该犬源化抗体或嵌合抗体不与犬内存在的任何其他表位交叉反应，并且进一步，当将本发明的抗体施用于犬时，不产生针对本发明的抗体的异种抗体。此外，优选当体内并不需要短期抗炎活性时，犬TNF结合抗体的恒定结构域不介导任何下游的效应子功能，其包括但不限于补体的结合和激活、A DCC和Fe受体的结合和激活。这类恒定结构域选自由以下组成的重链:SEQ ID Ν0:4、非糖基化的SEQ ID NO:4、非糖基化的SEQID Ν0:5、非糖基化的 SEQ ID NO:6、非糖基化的 SEQ ID Ν0:7 和 SEQ ID Ν0:7。
[0062]在某些其他实施方案中，优选当体内需要短期抗炎活性时，犬TNF结合抗体的恒定结构域介导效应子功能，其包括但不限于补体的结合和激活、A DCC和Fe受体的结合和激活，这导致体内犬TNF表达细胞的除去。这类恒定结构域选自由SEQ ID Ν0:5和SEQ IDNO:6组成的重链。
[0063]在某些另外的实施方案中，可以对本发明的抗体进行重链的恒定区的氨基酸序列修饰。所述修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的添加、取代或缺失。通常为了改变抗体的功能特性而进行这些氨基酸的改变。例如，可以进行氨基酸修饰以防止被抗体恒定结构域介导的下游效应子功能，例如通过防止抗体结合Fe受体、激活补体或诱导ADCC的能力。此外，为了改变当施用于犬时抗体的循环半衰期，可以对重链恒定结构域的氨基酸残基进行修饰。
[0064]本发明延及结合犬TNF并且隔绝其结合TNFR的能力的抗体片段。
[0065]在某些实施方案中，抗体结合片段可以包含通过柔性连接体连接以形成单链抗体的本发明的重链和轻链序列。
[0066]单链Fv (scFv)包含VH结构域和VL结构域。VH结构域和VL结构域结合形成革巴结合位点。这两个结构域通过肽连接体共价连接。scFv分子在N末端需要轻链可变结构域的情况下可以具有VL-连接体-VH的形式，或在N末端需要VH结构域的情况下为VH-连接体-VL的形式。因此，在某些另外的实施方案中，抗原结合片段是单链Fv(ScFv)抗体片段。在某些另外的实施方案中，抗体结合片段选自Fab抗体片段、Fab’抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fv抗体片段、scFV抗体片段等，但并不限于此。[0067]在一些实施方案中，本发明提供了用于联合疗法的多特异性或多价抗体，其包含与具有不同结合特异性的其他抗体偶联或结合的本发明的抗TNF抗体或结合片段。多特异性抗体包含对第一 TNF表位有特异性的至少一个抗体或结合片段，和对TNF上存在的另一表位或对不同的抗原有特异性的至少一个结合位点。多价抗体包含对同一 TNF表位有结合特异性的抗体或抗体结合片段。因此，在某些实施方案中，本发明延及包含本发明的犬源化抗体的四个或更多Fv区或Fab区的抗体融合蛋白。另外的实施方案还延及抗体融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗体的一个或多个Fab区与来自对TNF有特异性的抗体的一个或多个Fab区或Fv区。在某些另外的实施方案中，本发明延及双特异性抗体，其中本发明的抗体或其结合片段与对第二靶标有结合特异性的第二抗体或其结合片段连接，所述靶标不是TNF。优选地，所述第二靶标通过TNFRl受体有助于阻止TNF介导的信号传导。可以通过本领域技术人员熟知的多种重组方法来制得这样的多价抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0068]本发明的另一方面提供了治疗或预防有需要的犬的免疫介导的病症的方法，该方法包括以下步骤:
[0069]提供治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬TNF-α ;以及
[0070]将所述抗体或其抗原结合片段施用至犬。
[0071]在某些实施方案中，该抗体是犬源化抗体。
[0072]在某些实施方案中，所述抗体是犬源化抗体。在某些实施方案中，所述犬源化抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID N0:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0073]在某些实施方案中，所述犬源化抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本组成为:选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%氨基酸同一性、更优选为至少98%同一性的序列。
[0074]在某些实施方案中，所述抗体是包含轻链和/或重链的嵌合抗体，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:8，所述重链具有氨基酸序列SEQ ID N0:9或与其具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述嵌合抗体包含重链，所述重链具有选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:22或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%或95%序列同源性的氨基酸序列。
[0075]在某些实施方案中，免疫介导的病症是慢性炎性疾病。所述慢性炎性疾病可以选自以下:风湿性关节炎(RA)、骨关节炎和其他多发性关节炎、强直性脊椎炎(AS)、克罗恩病和溃疡性结肠炎、银屑病和银屑病性关节炎(PsA)、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭(CHF)、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘和过敏病症，但不限于此。炎性介导的病症还可以包括败血症和休克、糖尿病和神经退化性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。针对TNF-α的单克隆抗体还可以用于预防或治疗癌症恶病质、皮肤肿瘤如基底细胞癌、结肠直肠癌和卵巢癌。
[0076]在某些其他的实施方案中，免疫介导的病症可以是TNF-α相关病症(disorder)或其中TNF-α是关键炎性介质的病症。这类病症包括但不限于:白塞氏病、大疱性皮炎、嗜中性皮炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性血管炎、坏疽性脓皮病、化脓性皮炎、酒精性肝炎、脑型疟、溶血性尿毒综合症、先兆子痫、同种异体移植排斥、中耳炎、蛇咬伤、结节性红斑、骨髓增生异常综合症、移植物抗宿主疾病、皮肌炎和多肌炎。
[0077]根据本发明的又一方面，提供了治疗有需要的犬个体的关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括以下步 骤:
[0078]提供治疗有效量的本发明的抗犬TNF抗体或其抗原结合片段；以及
[0079]将所述抗犬TNF抗体或其抗原结合片段施用至犬。
[0080]在某些实施方案中，该抗体是犬源化抗体。在某些实施方案中，该犬源化抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID N0:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0081]在某些实施方案中，关节炎或关节炎病症包括选自以下的病症:免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊椎炎和相关病症。
[0082]通常，关节炎或关节炎病症的治疗包括减轻、抑制、降低或压制导致关节炎病症、与其相关的或由其引起的免疫反应。
[0083]本发明的又一方面提供了治疗有需要的犬中由犬TNF表达增加或对TNF敏感性增加引起的或与其相关的或导致其的病症的方法，所述方法包括以下步骤:
[0084]提供治疗有效量的本发明的抗犬TNF抗体或其抗原结合片段；以及
[0085]将所述抗犬TNF抗体或其抗原结合片段施用至犬。
[0086]在某些实施方案中，本发明的前述方法进一步包括共施用至少一种另外的药剂的步骤，该药剂可以提高和/或补充本发明的抗TNF抗体的功效。例如，该抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种额外的药物组合物共施用，所述额外的药物组合物包括有助于治疗慢性炎性病症尤其是TNF-α相关病症的药物。特别是，所述额外的药物组合物可以是氨甲喋呤、可溶的p55或p75TNF受体或其衍生物、针对犬TNF的嵌合抗体或犬抗体、抗犬TNF抗体片段、至少一种镇痛剂、抑制抗炎性药物的细胞因子化合物、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子拮抗剂如抗NGF抗体。
[0087]合适的镇痛剂的实例包括但不限于布托啡喏、丁丙诺啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替唳、吗啡、纳布啡及其衍生物。合适的NS A ID包括但不限于对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非罗考昔、罗贝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0088]在某些另外的实施方案中，所述至少一种另外的药剂可以是活性治疗剂，其可以是选自抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒治疗剂或类似治疗剂中的一种或多种。而且，所述至少一种另外的药剂可以是炎症介质(mediator)的抑制剂,例如PGE受体拮抗剂，免疫抑制剂例如环孢霉素，或抗炎糖皮质激素。在某些另外的方面中，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗认知功能障碍或损伤的药剂，例如老龄犬中可能日益普遍的失忆或相关病症。而且，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗心血管疾病的抗高血压药剂或者其他化合物，例如以治疗高血压、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外,所述至少一种另外的药剂可以是利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂或HMG-Co A还原酶抑制剂。
[0089]在某些实施方案中，作为前述方法的一部分，将抗体或抗原结合片段以从约0.01mg/kg体重至约3mg/kg体重,特别是从约0.03mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量施用至犬。
[0090]在各种其它方面，本发明延及包含本发明任何前述方面的抗体或其结合片段的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
[0091]本发明的另一方面提供了用于治疗导致犬慢性疼痛或由犬的慢性疼痛引起的疼痛或病症的药物组合物，其包含药学有效量的本发明的抗犬TNF犬源化抗体，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0092]在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包括氨甲喋呤或至少一种镇痛剂、NSA ID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子的拮抗剂。
[0093]在各种其它方面，本发明延及编码本发明的抗体或抗体结合片段的分离的核酸。
[0094]因此，本发明的另一方面提供了编码根据本发明任意前述方面的抗体或抗原结合片段的分离的核酸或多核苷酸。在某些实施方案中，核酸或多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗犬TNF犬源化抗体或抗体片段的轻链可变结构域或具有氨基酸序列SEQID NO:3的轻链。在某些另外的实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID N0:2的抗犬TNF犬源化抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有选自氨基酸序列SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 的重链。 [0095]在某些另外的实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO: 8的抗犬TNF嵌合抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID N0:9的重链。
[0096]在某些实施方案中，所述分离的核酸还编码与其可操作地连接的一个或多个调控序列。在另一方面，提供了包含多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码本发明的重链可变结构域和/或轻链可变结构域，或重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域。在某些实施方案中，所述表达载体进一步包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。本发明的另一方面提供了包括本发明的前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的又一方面提供了产生本发明的任意前述方面的抗体的宿主细胞。
[0097] 本发明的又一方面提供了产生犬源化抗犬TNF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤:培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达犬源化抗犬TNF中和抗体。
[0098]本发明的又一方面提供了产生本发明的抗犬TNF犬源化抗体的方法，包括以下步骤:在合适的宿主细胞内表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明抗体的轻链和/或重链；回收表达的多肽，其可以在一个宿主细胞内一起表达或者在不同的宿主细胞内单独表达；以及分离抗体。
[0099]本发明的又一方面提供了治疗、减轻或抑制犬的疼痛的方法，所述方法包括:将有效量的本发明任意前述方面的多核苷酸、抗体或片段施用至犬。
[0100]本发明的又一方面提供了本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者核酸，或者包含本发明任意前述方面的核酸的载体，用于治疗或预防犬的疼痛。
[0101]在某些实施方案中，疼痛是急性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手术后疼痛或者由犬的任何手术方案造成的疼痛，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术、阉割手术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛与风湿性关节炎或骨关节炎相关或由其引起。
[0102]本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者核酸，或者包含本发明任意前述方面的核酸的载体，用于治疗关节炎，尤其是免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎或强直性脊椎炎。
[0103]本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者核酸，或者包含本发明任意前述方面的核酸的载体，在制备用于治疗或预防犬的慢性炎性疾病的药物中的用途。
[0104]本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者核酸，或者包含本发明任意前述方面的核酸的载体，在制备用于治疗、抑制、减轻或预防犬的风湿性关节炎或骨关节炎的药物中的用途。
[0105]本发明的另一方面提供了产生本发明的抗犬TNF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。
[0106]本发明的又一方面提供了用于治疗犬的慢性炎性疾病、或者用于治疗与疼痛相关的病症、或者用于治疗、减轻或抑制骨关节炎或风湿性关节炎的试剂盒，所述试剂盒包含本发明任意前述方面的抗犬TNF抗体以及其使用说明。
[0107]本发明的又一方面提供了用于检测体外、离体和体内的流体中抗犬TNF单克隆抗体的诊断试剂盒，用于确定所述抗体的浓度。该试剂盒可以包含本发明的任意抗体或其结合片段。该试剂盒可以包含其使用说明。
【专利附图】

【附图说明】[0108]图1示出本发明的犬源化抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:1。
[0109]图2示出本发明的犬源化抗体的重链可变结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0110]图3示出本发明的犬源化抗体的轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
[0111]图4示出犬源化抗TNF重链可变结构域犬IgG-A重链(caN_HC A)的氨基酸序列(SEQ ID N0:4)。可变结构域残基用黑体表示。
[0112]图5示出犬源化抗TNF重链可变结构域犬IgG-B重链(caN_HCB)的氨基酸序列(SEQ ID N0:5)。可变结构域残基用黑体表示。
[0113]图6示出犬源化抗TNF重链可变结构域犬IgG-C重链(caN_HCC)的氨基酸序列(SEQ ID N0:6)。可变结构域残基用黑体表示。
[0114]图7示出犬源化 抗TNF重链可变结构域犬IgG-D重链(caN_HCD)的的氨基酸序列SEQ ID NO:7。可变结构域残基用黑体表示。
[0115]图8示出嵌合抗TNF抗体的犬K轻链的氨基酸序列(SEQ ID N0:8)。可变结构域用黑体表示。
[0116]图9示出嵌合抗体重链可变结构域犬IgG-B重链(caN-HCB)的氨基酸序列(SEQID N0:9)。可变结构域用黑体表示。
[0117]图10(A)示出使用蛋白A纯化且通过SDS-PAGE分析的犬源化抗体(SEQ ID NO: 3加上SEQ ID NO: 5)和嵌合抗体(SEQ ID N0:8加上SEQ ID NO:9)共表达的结果；而图10 (B)示出显示表达重组蛋白与犬TNF-α结合的ELISA的结果。示出从5ug/ml至0.05ug/ml不同稀释度的抗体的结果。
[0118]图11示出使用NF-kB-EGFP报道构建体pTRHl转染的293-HEK细胞对犬TNF生物活性的抑制。这些细胞通过荧光响应犬TNF。犬源化(SEQ ID N0:3加上SEQ ID N0:5)(图11A)和嵌合(SEQ ID N0:8加上SEQ ID N0:9)(图llB)MAb均同样良好地抑制TNF诱导的荧光(其在图1lC中量化)。
[0119]图12(a)示出与基于CHO细胞中表达的抗TNF MAb克隆148且使用蛋白A层析纯化的另一犬源化MAb (A图，左泳道)的比较。与来自图10的基于犬源化(Ca)和嵌合(Ch)D2E7的MAb比较，测试了 MAb与人TNF(B图)和犬TNF(C图)的结合(背景阴性对照结合用箭头表示)。由该图可知，基于D2E7的犬源化MAb和嵌合MAb以及本发明的主题显示出乎意料的与犬TNF的强结合，其相当于与人TNF的结合，而犬源化MAbl48显示仅与人TNF
结合 ?
[0120]图12(b)示出犬源化MAbl48的重链的氨基酸序列SEQ ID NO: 18。
[0121]图12(c)示出犬源化MAbl48的轻链的氨基酸序列SEQ ID NO: 19。
[0122]图13示出通过共表达SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5构建的犬源化抗TNF单克隆抗体能够诱导补体介导的TNF表达细胞的裂解。
[0123]发明详述
[0124]通过大量的试验，发明人获得了 D2E7抗人TNF抗体，之前并不知道该抗体结合犬TNF，并且出乎意料地用其作为基础产生了特异性结合犬TNF-α的拮抗性抗体。所得到的非免疫原性抗体，其并不是使用标准CDR移植技术产生的，经证明，其显示了结合犬TNF的高亲和性。抗体中和了犬TNF生物功能，最具体的是通过抑制TNF与细胞膜相关的受体TNFRl的结合。而且，还设计成使框架区和恒定区包含仅存在于犬IgG分子中的残基，从而使得当施用至犬时，不大可能产生针对它的异种抗体。因此，本发明的犬源化抗体适合于长期施用以治疗犬的慢性炎性疾病。
[0125]本发明人已使用的产生本发明抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的方法，导致已知非犬原有的特定供体的氨基酸残基在该位置被犬残基取代，基于本发明人的分析，这种取代会在保留CDR区的构象，并因此保留结合特异性和亲合力，同时减少免疫原性表位的存在，如果将抗体以不变的形式施用至犬，所述免疫原性表位可能导致针对该抗体的中和抗体的产生。具体而言，制备本发明抗体的方法(被称为PET化(PETisation))包括:通过将供体抗体框架区的序列与衍生自犬的抗体或抗体库的序列进行比较，评价供体(例如人)抗体框架区的序列施用至犬的适宜性。尽管该比较是在供体序列与靶序列的单个成员之间进行，但是显而易见的是，与靶序列库进行比较是优选的，因为这将扩大靶标种类中每一卡巴特(Kabat)位置的自然选择的数目。这不但将增加供体与靶标之间匹配的可能性，而且还将扩大不存在匹配的取代的选择。因此，将能够选择出与供体特征尽可能相近的取代。当供体序列与犬序列在任何卡巴特编号或对应的位置不同时，修饰供体序列以用犬中该位置的天然的氨基酸残基来取代所提及的氨基酸残基。
[0126]如果需要取代供体免疫球蛋白框架区中存在的氨基酸残基，通常采用保守取代的原则来进行，其中氨基酸残基是用天然位于犬卡巴特位置并且在大小、电荷、疏水性方面与供体序列中被取代的氨基酸尽可能密切相关的氨基酸残基来取代。目的是选择不会引起供体抗体的三维结构扰动或破坏或仅引起至少最低程度的扰动或破坏的取代。在某些情况下，将没有清楚的选择，并且每一选择都有利弊。最终的决定可能需要各种备选序列的三维建模甚至表达。然而，通常利用明显的偏好。作为该步骤的结果，当残基在靶中是外来的并且该取代氨基酸与被其取代的氨基酸尽可能密切相关时，仅对供体序列作出改变。因而，避免了外来表位的产生，但是由于维持了整个三位结构，因此，还维持了亲和性和特异性。
[0127]轻链恒定区和重链恒定区通常衍生自犬(靶)衍生的抗体。如果希望短期抑制TNF,则将重链恒定结构域筛选或修饰成使它们不介导下游的效应子功能，即HC A、HCD或非糖基化HCB或HCC。如果希望长期抑制TNF，则将重链恒定结构域筛选或修饰成使它们介导下游的效应子功能，即HCB或HCC。而且，在以不影响CDR区的三维构造的方式进行框架残基取代时，其与期望的靶标的结合特异性将不会改变。
[0128]在人类和小鼠中存在四种主要的IgG同种型，虽然术语是类似的，但它们在行为和功能上是不同的，包括对细菌产物例如蛋白A和蛋白G的亲和性，激活补体依赖性细胞溶解(⑶C)的能力以及通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导杀死靶细胞的能力。当将抗体设计为清除具有它们的同源抗原的靶细胞时，用CDC和ADCC活性或“防护的”恒定结构域选择IgG同种型在临床上被认为是有益的，例如在肿瘤控制、长期炎性控制或感染控制方面(例如，为了上述目的，在人类医学应用中优选人IgGl同种型)。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小⑶C和ADCC活性的人IgG同种型(例如，在这样的人类医学应用中，常常优选IgG4同种型)。已经描述了犬免疫系统中的四个不同的免疫球蛋白Y (IgG)重链恒定结构域同种型(美国专利号 5852183, Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology andImmunopathology, 80.259-270)以及单个κ和λ恒定结构域序列。并没有按照由其介导的功能活性来表征四个犬重链恒定结构域A、B、C和D。不管与IgG家族的总体同源性如何，与来自其它物种的家族成员相比，编码犬IgG的蛋白彼此更相关，因此如果将任一种认为是四种犬同种型的每一种，那么仅通过同源性来限定是上述哪一个发挥功能是不可能的。
[0129]本发明的抗体包含犬来源的重链恒定结构域和犬来源的轻链恒定结构域。而且，互补决定区衍生自D2E7抗体。D2E7抗体描述于Salfeld et al.，2000和美国专利6090382中。
[0130]将衍生自D2E7抗体的⑶R区与本发明人确定的框架区序列合并来维持⑶R的三级结构，因此维持了结合特异性，同时当将抗体施用至犬时，阻止针对所述抗体产生异种抗体。
[0131]每一轻链可变区和重链可变区都包含四个框架区，称为FR1-FR4。对于这些框架区中的每一个，本发明人已经鉴定出每一特定位置的优选氨基酸残基(所谓的优选残基)，和还可能在该位置接受的另外可选的氨基酸残基。表1至表8示出每一重链和轻链的四个框架区。这些表提供了氨基酸位置，其相对特定框架区，并且还符合用于识别沿完整的重链可变结构域或轻链可变结构域的长度上特定残基位置的卡巴特编号系统。使用单字母系统识别氣基酸残基。 [0132]表1-轻链可变结构域FRl残基
[0133]
【权利要求】
1.犬源化抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬肿瘤坏死因子。
2.如权利要求1所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中通过以下方法制备所述抗体，所述方法包括下列步骤: 提供来自犬之外的物种的供体抗体，其中所述供体抗体对肿瘤坏死因子具有结合特异性； 将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与存在于一个或多个犬抗体框架区氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体抗体框架区的氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体框架区的氨基酸序列内对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及 用所述一个或多个犬抗体中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括:用所述对应位置存在的与一个或多个被取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
4.如权利要求2或3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述方法进一步包括下述步骤:用犬抗体的重链和/或轻链恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链恒定结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID N0:2或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链和/或重链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重链包含选自SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链，所述重链包含选自SEQ ID N0:4、非糖基化SEQ ID N0:4、非糖基化SEQ ID N0:5、非糖基化SEQ ID N0:6、非糖基化SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链，所述重链包含选自SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个: 由氨基酸序列SEQ ID NO: 10组成或包含所述氨基酸序列的FRl框架区； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 11组成或包含所述氨基酸序列的FR2框架区； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 12组成或包含所述氨基酸序列的FR3框架区；以及 由氨基酸序列SEQ ID NO: 13组成或包含所述氨基酸序列的FR4框架区； 所述重链可变区包含以下中的至少一个:由氨基酸序列SEQ ID NO: 14组成或包含所述氨基酸序列的FRl框架区； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 15组成或包含所述氨基酸序列的FR2框架区； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 16组成或包含所述氨基酸序列的FR3框架区；以及 由氨基酸序列SEQ ID NO: 17组成或包含所述氨基酸序列的FR4框架区。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQID NO: 10的FRl区的轻链可变结构域，所述FRl区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:位置.5(T5)的氨基酸残基T被氨基酸残基M或I取代，S7是T，A 9是L或P，S12是A，L13是V, S14 是 T 或 R，Q15 是 P 或 R，E16 是 D，K18 是 E、A、P、T 或 L，V19 是 A，T20 是 S，T22 是S或Y，以及C23是Y。
11.如权利要求9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQID NO: 11的FR2区的轻链可变结构域，所述FR2区已通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:Y2 是 F，I 或 L，Q3 是 R、L 或 I，Q4 是 H，K5 是 R，P6 是 S 或 A，G7 是 D，A 9 是 S、T 或 P，Kll 是 Q、E 或 R，L12 是 R、P、G、A 或 S，114 是 L，以及 Y15 是 F、N、S、E 或 V。
12.如权利要求9-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 12的FR3区的轻链可变结构域，所述FR3区已通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:Gl是A，V2是A，P3是S，S4是D，F6是L或V，S7是I，G8是A，T13是A，D14 是 E，T16 是 S 或 R，L17 是 F，T18 是 R 或 K，S21 是 R，G 或 T，L22 是 V，P24 是 A，E25 是D、G、I 或 N，V27 是 A、T、G 或 S，A 28 是 G，以及 V29 是 I 或 L。
13.如权利要求9-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 13的FR4区的轻链可变结构域，所述FR4区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:G2是S，Q3是A，P或T，G4是E，T5是P，K6是Q或S，V7是L或W，E8是D或R，以19是L。
14.如权利要求9-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 14的FRl区的重链可变结构域，所述FRl区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:E1 是 D 或 G，V2 是 G、L、E、I 或 M，Q3 是 H、R、A、V、E、K、L、P 或 S，L4 是 V 或 P，V5是 A、L、E 或 M，E6 是Q或 A，S7 是F、L或T，G9 是E，G10 是 D、A、N、E或T，L11 是Q、R、V或 W，V12 是 A、I 或M，Q13 是K、R或N，P14 是F 或T，G15 是 A、E 或 T，G16 是E 或 A，S17是 T 或 P，L18 是 R，R19 是 K、T、G 或 V，L20 是 I 或 V，S21 是 Y，A 23 是 V、L、I 或 E，A 24 是T、V、G、I 或 S，S25 是 P、G 或 T，G26 是 D、R 或 T，以及 F27 是 L、1、S、D、T 或 V。
15.如权利要求9-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 15的FR2区的重链可变结构域，所述FR2区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:W1 是 C，V2 是 I，A，F 或 L，Q4 是 L 或 H，A 5 是 S、T、G、P、V 或 D，P6 是 L，G7 是 E、R 或 L，K8 是 R、E、G、A、M 或 Q，G9 是 E、R、D、T 或 V，LlO 是 T、P、F 或 M，Ell 是 Q、H、D、L、P 或 R，W12 是 L、C、S、Y、F 或 M，V13 是 L、I 或 F，以及 S14 是 A、T、G*L。
16.如权利要求9-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 16的FR3区的重链可变结构域，所述FR3区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:R1是Q，F2是V或L，T3是A，I或S，14是V、L、M或T，S5是A、F或T，R6是K，D7 是 E 或 N，N8 是 D、T、S、I 或 G，A 9 是 G、V、S、D、P 或 T，KlO 是 R、E、N、Q、G 或 M，Nll 是D、S、K、H*R，312是1\]\1、1或人，1^13是￥、]\1、人或 I，Y14 是 F、H、S 或 T，L15 是 I，Q16是 H、E、D、R 或八，]\117是1^，附8是0、5、1\!1、1(、？或1?，319是6、0、1?』或1'，1^20是￥，1?21是 T、G、K、S 或 I，A 22 是 V、D、T、S、G 或 P，E23 是 D、A 或 V，T25 是 A、S 或 M，A 26 是 G或 V, V27 是 M、1、L、F、T、K 或 Q，Y28 是 H，Y29 是 F 或 H，A 31 是 V、T、G、M、R、S、C 或 L，以及 K32 是 R、S、N、G、A、T、P、D、Q、V、E、I 或 M。
17.如权利要求9-16中任一项 所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQIDNO: 17的FR4区的重链可变结构域，所述FR4区已通过选自以下的一个或多个氨基酸取代得以修饰:W1 是 L，G2 是 A 或 S，Q3 是 P、H、R 或 D，T5 是 A、S、I 或 N，L6 是 S、Q、P 或 R，V7是 L、I 或 P，T8 是 F、1、A、S、L、P 或 Y，V9 是 A，SlO 是 A、C、P 或 T，以及 Sll 是 L、A 或P。
18.嵌合抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬肿瘤坏死因子，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
21.如权利要求1-20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以I X 10_8或更小的结合亲和性(Kd)与犬TNF结合。
22.如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与犬TNF的结合抑制犬TNF结合TNFRl受体的能力。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自单链Fv(ScFv)抗体片段、Fab抗体片段、Fab’抗体片段和F(ab’)2抗体片段。
24.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多价抗体。
25.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多特异性抗体。
26.治疗、减轻或预防免疫介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤: 提供治疗有效量的权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段；以及 将所述抗体或抗原结合片段施用至有需要的犬。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述免疫介导的病症是慢性炎性疾病。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述慢性炎性疾病选自免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病和银屑病性关节炎、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎和支气管哮喘。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述免疫介导的病症是TNF-α相关的病症，其选自败血症、败血性休克、糖尿病、阿兹海默病、帕金森氏病、中风、缺血性心脏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，进一步包括共同施用至少一种另外的治疗剂的步骤。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自:氨甲喋呤、犬TNF融合蛋白、可溶的p55或p75TNF受体或其衍生物、针对犬TNF的嵌合抗体或犬抗体、抗犬TNF抗体片段、镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇和神经生长因子拮抗剂。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种治疗剂选自抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂和抗病毒治疗剂。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种治疗剂选自:炎症介质的抑制剂、PGE受体拮抗剂、免疫抑制剂、环孢霉素、抗炎糖皮质激素、用于治疗认知功能障碍或认知损伤的药剂、抗高血压药剂、用于治疗心血管功能障碍的化合物、利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂和HMG-CoA还原酶抑制剂。
34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中将所述抗体以约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的剂量施用至所述犬。
35.用于治疗、减轻或预防免疫介导的病症的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其进一步包括选自以下的至少一种另外的治疗剂:氨甲喋呤、犬TNF融合蛋白、可溶的p55或p75TNF受体或其衍生物、针对犬TNF的嵌合抗体或犬抗体、抗犬TNF抗体片段、镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇和神经生长因子拮抗剂。
37.分离的核酸，其编码权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
38.分离的核酸，其编码具有氨基酸序列SEQID NO:1的抗犬TNF犬源化抗体或抗体片段的轻链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链。
39.分离的核酸，其编码具有氨基酸序列SEQID NO: 2的抗犬TNF犬源化抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有选自氨基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7 的重链。
40.如权利要求37-39中任一项所述的分离的核酸，其可操作地连接于一个或多个调控序列。
41.表达载体,其包含权利要求37-39中任一项所述的核酸。
42.如权利要求41所述的表达载体，其进一步包含一个或多个调控序列。
43.如权利要求41或42所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒或逆转录病毒载体。
44.宿主细胞，其包括权利要求41-43中任一项所述的表达载体。
45.产生抗犬TNF中和抗体的方法，所述方法包括以下步骤:培养权利要求44所述的宿主细胞，以使所述细胞表达犬源化抗犬TNF中和抗体。
46.治疗、减轻或抑制犬的免疫介导的病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求37-39中任一项所述的核酸施用至所述犬。
47.权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35或36所述的药物组合物、权利要求37-39中任一项所述的核酸或者权利要求41-43中任一项所述的表达载体，用于治疗或预防犬的慢性炎性疾病。
48.如权利要求47所述的抗体或抗原结合片段，其中所述慢性炎性疾病选自:风湿性关节炎、骨关节炎和其他多发性关节炎、免疫介导的多发性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎、银屑病和银屑病性关节炎、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘和过敏性症状。
49.权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35或36中任一项所述的药物组合物、权利要求37-39中任一项所述的核酸或者权利要求41-43中任一项所述的表达载体，用于治疗关节炎。
50.如权利要求49所述的抗体或抗原结合片段，其中所述关节炎选自骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎或风湿性关节炎。
51.权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35或36所述的药物组合物、权利要求37-39中任一项所述的核酸或者权利要求41-43中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗、减轻或预防犬的慢性炎性疾病的药物中的用途。
52.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段的用途，其中所述慢性炎性疾病选自:风湿性关节炎、免疫介导的多发性关节炎、骨关节炎和其他多发性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病性关节炎、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘和过敏性症状。
53.权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35或36所述的药物组合物、权利要求37-39中任一项所述的核酸或者权利要求41-43中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗、抑制、减轻或预防犬的关节炎的药物中的用途。
54.如权利要求53所述的抗体或抗原结合片段的用途，其中所述关节炎选自:骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎和风湿性关节炎。
55.细胞系或其衍生细胞或后代细胞，其产生权利要求1-25中任一项所述的抗犬TNF中和单克隆抗体或其片段。
56.用于治疗犬的慢性炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-25中任一项所述的抗犬TNF抗体及其使用说明。
【文档编号】C07K16/24GK103958545SQ201280052125
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年8月29日 优先权日:2011年8月30日
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