肽纳米粒子及其用途

肽纳米粒子及其用途
【专利摘要】本文提供的发明涉及两亲性肽和包含所述两亲性肽的粒子。本文所述的此类两亲性肽和粒子可用作递送系统(例如用于治疗目的或诊断目的)，或用作细胞穿透运载体或细胞转染试剂。
【专利说明】肽纳米粒子及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求2011年8月23日提交的美国临时申请号61/526，526的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号R01GM090317的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
【技术领域】
[0005]本发明涉及两亲性肽和包含所述两亲性肽的粒子。
【背景技术】
[0006]纳米粒子可用于药物的稳定化和递送:纳米粒子改善溶解性、延长保存期限、降低副作用并使药物持续暴露，从而延长治疗效果。用于靶向药物递送的基质通常由脂类、聚合物或金属组成，并组装入囊泡、胶束或粒子中。参见Torchilin V.(2006)Adv DrugDeliv.58:1532 ；Stark W(2011) Angew Chem Int Ed.50:1242 ;SoussanE等，(2009) ACIE.48:274。决定粒子体内适用性的主要独立变量包括大小、表面电荷和分散性(dispersibility) (主要由疏水效应支配)。Nel A等，(2009)Nat Matter.8:543。与这些经典载体材料相反，仅从氨基酸设计胶体递送系统是非常困难的，这主要是由于短疏水性肽的溶解性问题。
[0007]疏水性肽的溶解耗时冗长，因此经常需要精妙的溶剂添加规程[14]。不管如何尝试，许多疏水性肽仍是完全不溶的，从而难以通过Fmoc或Boc保护基团化学作用进行合成:合成期间肽在固相上的沉淀使得产率低下且副产物占优势量。
[0008]然而，由于可降解为单个氨基酸，由肽组成的粒子基质是合乎期望的。并且，与其它基质材料(例如聚合物)不同,肽合成的产品可纯化至高达98%，避免了分子多分散性并因此解决了物理化学性质的可重复性。此外，可容易地对肽结构的性质进行调节，例如通过引入氨基酸点突变来进行调节。因此，对于将可通过简单工艺合成和纯化的可降解药物载体工程化仍然存在强烈需求。

【发明内容】

[0009]本文提供的多个方面和实施方式涉及两亲性肽、包含本文所述一个或多个实施方式的两亲性肽的肽粒子、以及本文所述的两亲性肽或肽粒子的用途。可通过控制两亲性肽的氨基酸残基上存在的带电基团的数量(例如，通过(例如用乙酰化)掩蔽(masking) —个或多个带电的氨基)，调整本文所述的两亲性肽的净电荷。因此，本文所述的两亲性肽和肽粒子可用作递送不同类型活性试剂(例如带电或不带电的分子，或极性或非极性分子)的载体(carriers)或运载体(vehicles)。另外,还可通过控制存在于肽粒子中的两个以上实施方式的两亲性肽之比来对本文所述的肽粒子(例如在生理条件下)的溶解性进行调整。举例来说，完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽通常可形成不溶的肽粒子，而与完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽形成的粒子相比，由部分掩蔽(例如部分乙酰化)或未掩蔽(例如未乙酰化)的肽形成的粒子通常具有(例如生理条件下的)更高的溶解性。因此，在一些实施方式中，可通过用这些具有不同溶解性的两亲性肽的混合物形成所述肽粒子并相应改变这些两亲性肽在肽粒子中的含量，控制本文所述的肽粒子的(例如生理条件下的)溶解性。
[0010]本文所提供的一个方面涉及包含疏水性肽片段和亲水性肽片段的两亲性肽。发明人已经发现，通过对亲水性片段的亲水性进行调节，可控制由两亲性肽自聚集而形成的粒子的类型。
[0011]因此,本发明的一方面提供了一种包含疏水性肽片段(peptidyl segment)和亲水性肽片段的两亲性肽，其中，所述疏水性肽片段包含2-10个交替的D-氨基酸和L-氨基酸的序列，所述氨基酸选自于:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸(Trp);其中，所述亲水性肽片段包含带电、或不带电但为极性的氨基酸，或以上氨基酸的衍生物。
[0012]在本文所述的这一方面和全部其它方面的某些实施方式中，所述疏水性肽片段可包含如下氨基酸序列:(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu) q,其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L_Leu，m和p独立地为1-20的整数、且η和q独立地为O或I，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu,或反之亦然。
[0013]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段可包含存在于N-末端或氨基酸残基的至少一个电荷。在此类实施方式中，所述至少一个电荷既可以为阳离子电荷也可以为阴离子电荷。在一些实施方式中 ，所述至少一个阳离子电荷可位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中:Lys、Arg、His,以及以上氨基酸残基的任意组合。在一些实施方式中，所述至少一个阴离子电荷可位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中:Asp或Glu，以及以上氨基酸残基的任意组合。
[0014]在替代的实施方式中，所述亲水性肽片段可包含不带电但为极性的氨基酸。在其它实施方式中，所述亲水性肽片段可包含至少一个电荷和至少一个不带电但为极性的氨基酸。在多个实施方式中，所述至少一个不带电但为极性的氨基酸残基可选自于由下列氨基酸残基所组成的组:Ser、Thr、Asn或Gln，以及以上氨基酸残基的任意组合。
[0015]在本文所述的这一方面以及全部其它方面的特定实施方式中，所述亲水性肽片段可包含氨基酸序列(Lysh，其中！为1-15的整数。在一些实施方式中，r可以为2-5的整数。在一些实施方式中，r可以等于3。
[0016]在本文所述的这一方面以及全部其它方面的一些实施方式中，所述疏水性肽片段可包含聚合物。在一些实施方式中，可将与疏水性肽片段的连接调整为共价连接至所述聚合物。在某些实施方式中，所述聚合物可以为生物相容聚合物和/或可生物降解的聚合物。所述聚合物的实例包括但不限于:PEG、PGG、ΡΕ0、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkaboates)、葡聚糖、聚酸酐、PLA-PGA、聚原酸酯、聚富马酸酯、水凝胶、任何本领域认可的生物相容聚合物和/或可生物降解的聚合物，以及以上聚合物的任意组合。
[0017]在本文所述的这一方面以及全部其它方面的某些实施方式中，可对所述两亲性肽中的至少一个氨基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。在此类实施方式中，所述至少一个氨基可以为两亲性肽的N-末端氨基。在其它实施方式中，所述至少一个氨基可以位于亲水性肽片段的Lys残基之上。
[0018]在本文所述的这一方面以及全部其它方面的一些实施方式中，可对所述亲水性肽片段中的全部氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在其它实施方式中，可对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段中的至少一个氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在又一实施方式中，可对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段中的全部氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lysh的一些实施方式中，对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段的至少一个(包括至少2个、至少3个或更多个)Lys残基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。在所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lysh的一个实施方式中，对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段的全部Lys残基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。
[0019]在多个实施方式中，可将所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
[0020]在某些实施方式中，Leu为D-Leu。在一些实施方式中，Trp为L_Trp。在一些实施方式中，Lys为L-Lys。在一些实施方式中，m或p可独立地为1_3。在一个实施方式中，m或P为3。在一个实施方式中，η或q为I。因此，一个实施方式的两亲性肽包含如下氨基酸序列:(L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu)-(L-Trp),其中至少一个L-Lys残基被乙酰化。
[0021]在一些实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列=Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp)。在此类实施方式中，至少一个L-Lys残基可被乙酰化。
[0022]在其它实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列-Ac- (L-Lys (Ac)) - (L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))- (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
[0023]两亲性肽可具有任意长度的氨基酸序列。在一些实施方式中，两亲性肽的长度可为约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基。
[0024]可对两亲性肽的疏水性肽片段或亲水性肽片段进行修饰。例如,疏水性肽片段或亲水性肽片段中至少一者可包含至少一个点突变。在多个实施方式中，至少一个骨架酰胺连接(linkage)可包括酰胺替代连接(amide replacement linkage)。在其它实施方式中，所述两亲性肽可包含至少一个氨基酸、Y-氨基酸，或以上氨基酸的任意组合。
[0025]在一些实施方式中，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(AA11-AA12)b- (AA13) d，其中，每次出现的AAn、AA12和AA13分别为独立选定的疏水性氨基酸残基，b为1-20的整数、且d为O或1，只要AA11和AA12具有相反的(即，D-和L-)构型且AA12和AA13具有相反的(即，D-和L-)构型；所述亲水性肽片段包含一个或多个亲水性氨基酸或其衍生物；并且所述两亲性肽被全部或部分掩蔽。
[0026]在一些实施方式中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys) r，_( (L-Trp)-(D-Leu))m，-(L-Trp)，其中，r’为3_21的整数、且m’为3_20的整数，并且其中至少一个N-末端氨基或至少一个Lys残基的侧链氨基缀合有氮保护基团或氨基保护基团。
[0027] 发明人已经发现，本文所述一些实施方式的两亲性肽可具有细胞穿透(cellpenetration)能力。因此,在一些实施方式中，可将本文所述的两亲性肽作为细胞穿透试剂和/或转染试剂。在这些实施方式中，可将两亲性肽设计为带正电。因此，本文提供了包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段。所述带正电的两亲性肽的疏水性肽片段包含如下氨基酸序列:(Trp-Leu) m- (Trp) n 或者(Leu-Trp) p- (Leu) ^ 其中，每个 Trp 为 D-Trp 或 L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L_Leu,m和p独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或I,只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu,或反之亦然；同时所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(LyS)p其中r为1-15的整数。另外，在所述带正电的两亲性肽中，所述两亲性肽的至少一个Lys残基或N-末端氨基未被乙酰化。在一些实施方式中，所述带正电的两亲性肽的全部Lys残基和N-末端氨基均未被乙酰化。
[0028]在一些实施方式中，所述带正电的两亲性肽可包含如下氨基酸序列:(L-LyS)-(L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X,其中 X不存在或X为NH2。
[0029]在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含待递送进入细胞的核酸分子(例如，DNA 或 RNA)。
[0030]另外，本文所述的两亲性肽可单独使用或作为递送系统的一部分使用，用于将感兴趣的化合物(例如活性试剂)递送至细胞。所述递送系统可以是靶向递送系统。待递送的化合物可包括治疗试剂、诊断试剂以及它们的任意组合。因此，本发明一方面提供了用两亲性肽作为递送系统 的方法，所述方法包括将活性试剂与两亲性肽复合(complexing)并将细胞与复合物相接触。在一些实施方式中，所述方法可用于治疗目的或诊断目的。
[0031]另一方面，本发明提供了包含本文所述的两亲性肽的粒子。发明人尤其发现，由本
文所述的两亲性肽所形成的粒子与c.Dittrich, Ph.D.Thesis, Universitiit Basel, 2007中
描述的粒子有所区别。明确地说，由本文所述的两亲性肽制造的粒子与Dittrich(2007)中描述的并不相同。Dittrich(2007)中描述的肽并不包含掩蔽的氨基。就此而言，由这类肽形成的粒子为胶束(例如中空粒子)，而非本文所述的实心粒子。因此，在某些实施方式中，本文所述的肽粒子并非胶束(例如中空粒子)。换言之，在某些实施方式中，本文所述的肽粒子为实心粒子。
[0032]在一些实施方式中，本文所述的包含两亲性肽的粒子可进一步包含配体。因此，在一个实施方式中，本文所述的肽粒子包含两亲性肽，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中，所述疏水性肽片段包含如下氨基酸序列=(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp) p-(Leu)q,其中，每个 Trp 为 D-Trp 或 L_Trp、且每个 Leu 为 D-Leu 或 L-Leu, m 和P独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；并且其中所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)P其中r为1-15的整数；并且其中所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
[0033]在一个实施方式中，所述配体可以是细胞表面受体的配体或者抗体。示例性的细胞表面受体的配体包括但不限于:转铁蛋白、EGF、叶酸(folate)，以及以上配体的任意组合。在某些实施方式中，所述配体可存在于粒子的外表面上。例如，所述配体可吸附于本文所述的粒子的外表面上。在替代的实施方式中，所述配体可共价连接至所述两亲性肽。在一个实施方式中，所述配体共价连接至所述两亲性肽的亲水性肽片段。[0034]本文所述的粒子外表面上存在的配体的厚度部分地依赖于配体分子的大小。在一些实施方式中，所述粒子外表面上存在的配体的厚度范围可为约Inm至约lOOnm。在一个实施方式中，所述粒子外表面上存在的配体的厚度为约10nm。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围可为约1:10至约1:1，000，000。
[0035]可基于待将肽粒子递送至的靶标类型(例如但不限于，细胞、细菌、蛋白和/或核酸)对肽粒子上存在的配体进行选择。例如，为了促进将本文所述的肽粒子递送至细胞，可选择对细胞表面受体具有特异性的配体。因此，使用所述肽粒子作为递送载体或运载体，可将本文所述的一些实施方式的肽粒子用于靶向递送活性试剂。在此类实施方式中，可将所述肽粒子用于将活性试剂递送至细胞，在以其自身递送时所述活性试剂不能穿透细胞。
[0036]因此，在本文所述的这一方面和全部其它方面的多个实施方式中，所述肽粒子可包含一种或多种活性试剂。在此类实施方式中，所述活性试剂可分散于所述粒子内部。所述活性试剂可不带有净电荷或带净电荷。在一些实施方式中，所述活性试剂可包含至少一个芳基。活性试剂的实例不受限制地包括:蛋白、肽、抗原、抗体或抗体部分、抗体样分子、酶、核酸、适配子(aptamers)、小分子、抗生素、药物活性试剂、治疗试剂、造影剂(contrastagents)，以及以上试剂的任意组合。在一个实施方式中，所述活性试剂为药物活性试剂或治疗试剂。在一个实施方式中，所述活性试剂为核酸分子，包括但不限于:siRNA、miRNA>shRNA、DNA,以及以上核酸分子的任意组合。在特定的实施方式中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围可以是约1:1至约1:100，000、约1:1至约1:10，000、约1:1至约1:1，000、约 1:1 至约 1:100、或约 1:1 至约 1:10。
[0037]本文所述的这一方面和全部其它方面的肽粒子可为任意大小。在一些实施方式中，所述肽粒子的大小可为约5nm至约5，OOOnm。在一些实施方式中，所述肽粒子的大小可以为约30nm至约150nm。
[0038]在一些实施方式中，所述肽粒子可包含完全掩蔽(例如完全乙酰化)和部分掩蔽(例如部分乙酰化)的本文所述的两亲性肽的混合物。在这些实施方式中，完全乙酰化的两亲性肽与部分掩蔽的两亲性肽之比的范围可为约95:5至约1:1。在某些实施方式中，所述粒子可进一步包含未掩蔽(例如未乙酰化)的两亲性肽。
[0039]因此，本文还提供了混合肽粒子，所述混合肽粒子包含完全乙酰化的两亲性肽和部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽。在特定的实施方式中，所述混合肽粒子包含第一两亲性肽和第二两亲性肽，其中所述第一两亲性肽和第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp) p-(Leu)q,其中，每个 Trp 为 D-Trp 或 L_Trp、且每个 Leu 为 D-Leu 或 L-Leu, m 和P独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D_Leu，或反之亦然；同时所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys) P其中r为1-15的整数。另外，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；而所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。在一些实施方式中，所述第二两亲性 肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
[0040]在特定的实施方式中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽可各自独立地包含如下氨基酸序列:(L-Lys)) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-TrP) - (D-Leu) - (L-Trp) -X，其中 X 不存在或 X 为 NH2。[0041]所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽之比可基于多个因素而变化，所述因素例如但不限于:肽粒子期望的溶解性和/或稳定性、和/或所述肽粒子中将装载的活性试剂的性质。在一些实施方式中，所述第一两亲性肽与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:1至约1000:1。在其它实施方式中，所述第一两亲性肽与所述第二两亲性肽之比的范围可为约5:1至约100:1。
[0042]在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步包含本文所述的活性试剂。所述活性试剂可以任意量存在于所述混合肽粒子中，例如，所述量取决于肽粒子的装载能力和/或所述第一两亲性肽或所述第二两亲性肽的结合能力。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可为约1:1000至1: 1、或约1:100至约1:10。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可为约1:10至约1:2。
[0043]不希望受理论约束，存在于所述混合肽粒子中的第二两亲性肽可提供用于与阴离子核酸分子结合的阳离子电荷。因此，在一些实施方式中，所述活性试剂可包含核酸分子。
[0044]在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步在其外表面上包含配体。如先前所述，可基于混合肽粒子所结合的靶分子(例如但不限于，细胞、细菌、蛋白、核酸)来确定对配体的选择。配体的非限制性实例可包括细胞表面受体的配体或蛋白(如抗体)。在一些实施方式中，配体可共价连接至第一两亲性肽和第二两亲性肽中的至少一者(例如，第一两亲性肽和第二两亲性肽中至少一者的亲水性肽片段)。
[0045]可用本文所述的混合肽粒子封装任何本文所述的活性试剂。在特定的实施方式中，可用混合肽粒子封装核酸分子。因此，本发明进一步的方面提供了一个或多个实施方式的混合肽粒子用于将核酸分子递送至细胞的用途，所述混合肽粒子包含第一两亲性肽和第二两亲性肽。在一些实施方式中，所述核酸分子可包括RNA(例如但不限于，siRNA、miRNA、shRNA)、DNA，或以上核酸分子的任意组合。
[0046]本文还提供了用于制造一个以上实施方式的肽粒子或混合肽粒子的组合物或试剂盒。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的两亲性肽。所述组合物或试剂盒中提供的两亲性肽可储存于容器中。根据用户对待制备的本文所述的肽粒子或混合肽粒子的选择，在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的第一两亲性肽和第二两亲性肽。所述两亲性肽可以粉末或冻干粉末提供。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含至少一种试剂，所述试剂例如用于粉末化两亲性肽的复溶、用于粒子组装混合物的乳化、或两者均有，在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含本文所述的配体(例如提供于单独的容器中)。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含待封装入肽粒子的活性试剂。所述活性试剂可在单独的容器中提供。
【专利附图】

【附图说明】
[0047]图1A-图1B示出了根据本发明的一个或多个实施方式的纯化的CD3ac的表征结果。图1A示出了以轨道阱(orbitrap)质谱仪测量的质谱。图1B示出了测得的⑶3ac和合成中间体CD3在280nm处吸收的叠加(overlaid) RP-HPLC洗脱曲线。在两种情况下产物纯度均高于95%。
[0048] 图2A-图2C示出了根据本发明的一个或多个实施方式的⑶3ac肽纳米粒子的SEM图像。图2A-图2B示出了冻干⑶3ac珠的SEM图像。图2C示出了冻干过程中破裂的⑶3ac珠的SEM图像。图像显示了肽沉淀的实心性质。
[0049]图3A-图3B示出了动态光散射(DLS)结果的线性拟合。确定了粒子浓度(图3A)和探测角度(图3B)均不太可能对CD3ac珠在水溶液中的扩散特性产生影响。
[0050]图4示出了⑶3ac衍生物⑶1、⑶2、⑶3和⑶4的一组圆二色性谱。显示的数字与连接至N-末端的赖氨酸残基的数量相等。
[0051]图5A-图5B示出了仅有L-氨基酸对于肽纳米粒子的性质的影响。图5A示出了沉淀的IXD3ac的SEM图像。在沉淀的IXD3ac中未能观察到在⑶3ac粒子中观察到的球状组装体。图5B示出了 CD3(实线)和LCD3(虚线)的圆二色性谱，表明由于亮氨酸的手性而导致二级结构存在差异。IXD3表现出α-螺旋特征。
[0052]图6Α-图6C示出了与虎红(rose bengal,RB)、5_羧基突光素(CF)或两者的混合物共组装的⑶3ac珠的共聚焦显微图像。图6A示出了与RB共组装的⑶3ac珠的共聚焦显微图像。图6B示出了与CF共组装的⑶3ac珠的共聚焦显微图像。图6C示出了载有RB和CF的CD3ac珠，表明该肽珠具有同时封装在水溶液中具有高溶解性和低溶解性的化合物的能力。如图6A-图6C所示，观测到含有RB的CD3ac珠为单独的球体，而仅含有CF的珠倾向于聚集。在图6A-图6C中，左上子图:RB的荧光发射；右下子图:CF的荧光发射；右上子图:相差图像；左下子图:两个荧光通道的共定位。一个子图的宽度对应于55 μ m。
[0053]图7A-图7B示出了⑶3ac纳米粒子中虎红(RB)的封装效率。图7A示出了 RB与CD3ac的共沉淀效率的结果。X轴描述了 CD3ac与RB在溶剂交换和组装前的初始溶解浓度t匕。左侧y轴:沉淀物的摩尔组成(〇)。右侧y轴:封装的RB与总RB的摩尔比(Λ )。举例来说，在RB:⑶3ac = 1:4的初始比处，所述珠的约15mol%由RB组成，且约33%的初始溶解的RB被封装入组装体中。图7B示出了含有不同量RB的沉淀部分(▲)和上清液部分(.)的色氨酸吸收，表明CD3ac组装并未被等摩尔浓度的RB负载物(cargo)削弱。
[0054]图8A-图81示出了在AF568标记的转铁蛋白(Tfn_AF568)和Flutax_2以及转铁蛋白(Tfn)存在下组装的⑶3ac肽粒子的表征结果。图8A-图SC显示胰蛋白酶处理(trypsination)前肽粒子的红色(图8A)和绿色(图8B)荧光的荧光显微图像。叠加的图像(图8C)示出了 Tfn-AF-568(环形)和Flutax-2 (均等分布)不同的荧光分布。图8D-图8F示出了相同样品在胰蛋白酶处理6小时后的荧光图像。Tfn-AF-568荧光的特征环消失(图8D)、且Flutax-2的发射强度增长13.5倍(图8E)。图8G-图8H示出了胰蛋白酶处理前后粒子(η = 10)在红色通道(图SG)和绿色通道(图8Η)中的平均灰度水平曲线。图81示出了胰蛋白酶处理前后具有蛋白冠(corona)(例如Tfn-AF568)的CD3ac肽粒子的示意图。
[0055]图9A-图9D示出了 CD3ac肽纳米粒子内Flutax-2和Tfn_AF568的组成的结果。图9a和9B分别示出了与Tfn-AF568 (图9A)和Flutax-2 (图9B)自组装的肽粒子的定量组成。X轴描述了初始溶解的Tfn-AF568或Flutax-2与⑶3ac (123 μ Μ)在溶剂交换和组装前的浓度比。左侧y轴(空心符号):肽纳米粒子(PNP)的摩尔组成。右侧y轴(实心符号):封装的Tf n-AF568(或Flutax-2)与总Tf n_AF568 (或Flutax-2)的摩尔比。作为图9B 中的实例，在 Flutax-2:Q)3ac = 0.1 的初始比处,约 7.5mol % StJ PNP 由 Flutax-2 组成，且约80%的初始溶解的Flutax-2被封装。80%左右的Flutax-2稳定封装率对应于5.25的对数分配系数(partition coefficient)。图9C示出与Tfn竞争前后PNP的Tfn_AF568荧光强度分布。粒子在?ο μ g/mL Tfn-568存在下组装，并在形成后立即成像。黑色柱对应于所得的突光光斑的强度分布。由灰色柱表不的分布描述了相同的PNP在1360 μ g/mL Tfn存在下、在37°C的24小时孵育期后的荧光强度。图9D示出如图9C所示的与Tfn竞争前后PNP的Tfn-AF568荧光强度分布的累计数据曲线。
[0056]图1OA-图1OK示出了粒子直径控制和通过TEM进行的纳米粒子形态表征。图1OA-图10(:示出了由492“]\1、246 4]\1和123 μ M CD3ac组装的肽粒子上的Tfn_AF568荧光。比例尺对应于I μ m。图1OD示出了 3个叠加的荧光强度曲线，每一曲线示出10个粒子的平均结果。结果由平均值土标准差表示。图1OE示出了强度曲线的原理示意图，说明了粒子尺寸、冠的荧光和光学显微镜的有限分辨率之间的关系。图1OF-图101示出了在不存在(图1OF-图10G)和存在(图1OH-图101) 10 μ g/mL Tfn下组装的CD3ac粒子的负染色TEM图像。含蛋白(例如含Tfn)的样品可由肽粒子周围的中等对比度层(layerof intermediatecontrast)得以区分。偶发的孔洞(黑色箭头指出)是由TEM中使用的真空导致的，类似的观测在Hyuk 1.等，(2005)Nat Matter4:671中已有描述。图1OJ-图1OK表明最终粒子尺寸依赖于组装期间Tfn的存在。在无Tfn-AF568存在下形成粒子导致平均粒子直径为IOOnm(图10J)，而粒子组装期间存在蛋白使直径降低为51nm(图10K)。蛋白冠的厚度对应于9.0±2.Inm(图1OK的插图)。
[0057]图1lA-图1lH示出了 Tfn的竞争对于/WP==568结合至CHO细胞的影响。本文用
作为在负载物(例如本文使用的Flutax-2)和冠(例如本文使用的Tfn_AF568)
存在下自组装的⑶3ac肽纳米粒子的缩略词。图1lA-图1lC示出了与I 小时的CHO细胞的荧光显微图像。绿色通道(Flutax-2)和红色通道(Tfn-568)中荧光光斑的共定位表明在细胞上累积的粒子的同一性。图1lD-图1lF示出了在17 μ MTfn存在下与
RV/fSf/68孵育I小时的CHO细胞。PNP缔合显著减少。比例尺对应于ΙΟμπι。图1lG示
出了每细胞(例如CHO或TRVb)的平均肽纳米粒子(PNP)数量。阴性对照(NC)值对应于
在无八存在而具有相同浓度的Tfn-AF568和Flutax-2下孵育的CHO细胞上的假
阳性突光光斑。结果为平均值土 s.e.m.,双星号表不P〈1(T9, Kolmogorov-Smirnov检验。图1lH示出了显示与8孵育I小时后的CHO细胞的一组图像。上面一行和下面一行
分别示出了无Tfn和存在17 μ M Tfn时孵育的细胞。在白色方框中圈出的区域在图1IA-图1lF中放大显示。比例尺对应于20μπι。
[0058]图12Α-图12Μ示出了纳米粒子的内化作用(internalization)的实验结果。图12A-图12D示出了与孵育！小时的CH0细胞的荧光显微图像。图12E示出了将
CHO细胞与PM5HH568孵育I小时后，的Flutax-2/Tfn-AF568荧光的分布(G/
R)。灰色柱表示载玻片上的G/R,黑色柱对应于细胞周长(cell perimeter)之内得到的G/
R0图12F示出了 I小时后粒子缔合和内化的示意图。图12G-图12J示出了与
孵育6小时的CHO细胞的荧光显微图像，其中粒子向更高G/R值的移动作为粒子内化的表示(surrogate)。图12K显示在较长的孵育期后G/R值的分布显著增加(黑色柱)。相反，在载玻片上的G/R值分布(灰色柱)无法与I小时后的相同亚群的G/R值在统计上有所区另O。图12L示出了 6小时后粒子缔合和内化的示意图。对于溶酶体腔内的粒子，冠被蛋白水解消化，使得Tfn-AF568荧光减弱而Flutax-2荧光增强。图12M示出表明層盅，色移
(color shift)的图。上面一行示出了与孵育I小时的CHO细胞，与此相对，下
面一行示出相同细胞系与孵育6小时。在白色方框中圈出的区域在图12A-图12D和12G-图12J中放大显示。比例尺对应于20 μ m。
[0059]图13A-图131示出了与PNPUm孵育24小时后的负载物的释放。图13A-图
13C示出了与67nM Flutax-2和0.09 μ g/mL Tfn_AF568孵育24小时的CHO细胞的荧光显
微图像。图13D-图13G示出了与和⑶3ac自组装形成的相同量的Flutax-2和
Tfn-AF568孵育24小时的CHO细胞的荧光图像。图13H示出了与细胞系(CH0、TRvb)以及与溶解的未标记的Tfn竞争相关的平均Flutax-2荧光强度。阴性对照(NC)对应于绿色通道中的细胞自发荧光。结果为平均值土s.e.m.，单星号表示P〈0.01，双星号表示P〈10_9，Kolmogorov-Smirnov检验。比例尺对应于10 μ m。图131不出了与Flutax-2孵育24小时后的CHO细胞的图像。两个样品(上面一行和下面一行)均含有66.7nM Flutax-2。上面一行示出了与溶解于细胞培养基中的Flutax-2孵育的细胞培养物，下面一行为与预先自
组装为AVP^tf2568的Flutax-2孵育的相同细胞系。在白色方框中圈出的区域在图13A-图
13G中放大显示。比例尺对应于20 μ m。 [0060]图14示出了与Flutax-2和Tfn_AF568组装的肽粒子(例如⑶3ac)的一组荧光显微图像。上面一行示出了胰蛋白酶处理前的样品。由于分散的粒子的移动，且在由激发和发射滤器改变引起图像间存在时间延迟，红色和绿色通道并不一致。将相同粒子标示于括号中，并在图8A-图8F中叠加。下面一行示出了与胰蛋白酶孵育6小时后的相同样品。红色冠消失，残存的粒子粘附至盖玻片的表面。
[0061]图15A-图15B示出了 Tfn-AF568(图15A)和Flutax-2 (图15B)的荧光校准曲线。两者均在60% H20,30% DMSOUO% FBS的溶液中测量。需要用有机溶剂溶解沉淀部分中的纳米粒子，FBS的存在使得标记的被分析物在塑性(plastic)表面的吸附最小化，提供了荧光团浓度和测得的荧光之间的线性关系。
[0062]图16A-图16B示出了本发明的一个或多个实施方式的肽纳米粒子。图16A示出了以EGF分子官能化的CD3ac粒子的示意图，可(为了可视化的目的)任选地用Texas Red标记该肽纳米粒子。图16B为显示细胞摄取的EGF官能化的⑶3ac粒子的一组荧光图像。
[0063]图17A-图17K示出了以一个实施方式的肽纳米粒子处理的细胞(例如HeLa细胞)的实验结果，所述肽纳米粒子封装有诺考达唑(nocodazole,—种可使微管解聚、并可用作抗肿瘤剂的化学试剂)。图17A示出了四种不同实验条件的图示，其中PBle表示封装有20 μ M诺考达唑的EGF官能化的⑶3ac纳米粒子，实验结果如图17B-图17F所示。图17B示出了一组荧光图像，显示在图17A给出条件下孵育I小时后的细胞的微管结构。细胞内的红色荧光信号表示由细胞摄取的PBle纳米粒子。图17C示出了一组荧光图像，显示在给定的不同时间段后细胞摄取的PBle纳米粒子。图17D-图17F示出了在不同给定条件下处理的HeLa细胞的微管结构的荧光图像。图17G示出了四种不同实验条件的图示，其中PBle表示封装有40 μ M诺考达唑的EGF官能化的⑶3ac纳米粒子，实验结果如图17H-图17K所示。图17H-图171示出了在给出的不同条件下孵育4小时后的细胞图像。图171示出了不同条件下的细胞的微管结构(用绿色表示)的荧光图像。细胞内的红色信号表示细胞摄取的PBle纳米粒子。图17J-图17K示出了在给定的不同条件下孵育24小时后的细胞图像。图17K示出了不同条件下的细胞的微管结构(用绿色表示)的荧光图像。细胞内的红色信号表示细胞摄取的PBle纳米粒子。
[0064]图18A-图18C示出了本发明另一实施方式的肽纳米粒子，其中以抗体对CD3ac纳米粒子进行官能化。图18A示出了以一抗或二抗官能化的CD3ac纳米粒子的示意图。图18B显示以兔抗转铁蛋白IgG官能化的CD3ac纳米粒子可结合至转铁蛋白(以A568标记)，并因此在右图显不为売点。图18C显不以兔抗转铁蛋白IgG官能化的⑶3ac纳米粒子可结合至抗兔IgG(以Alexa555标记)，并因此在右图显示为亮点。
[0065]图19A-图19B示出了未乙酰化的肽纳米粒子(CD3)用作体外转染试剂的荧光图像。图19A显示⑶3粒子可用于在细胞内部递送寡核苷酸。图19B显示在无⑶3粒子时不发生寡核苷酸对细胞的转染。
[0066]图20A-图20B示出了在未乙酰化的肽粒子中的寡核苷酸封装效率。图20A为一组时程图像，显示在电泳时寡核苷酸和蛋白在琼脂糖凝胶中的迁移。在图20A中，将含有~21yMCD3 肽(H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW_NH2)4+、~5.4 μ MssDNA(5’ -TTGTGCCGCCTTTGCAGGT GTATC-3’)24'~0.24 μ M AF488_ssDNA (AF488-5’ -TTGTGCCGCCTTTGC AGGTGTATC-3’)24'以及~4.14 μ g/mL Tfn_AF568的混合物加样至上侧泳道，而下侧(对照)泳道加入类似的混合物，但不含⑶3肽。在电泳约40min后，过量的ssDNA和Tfn穿过琼脂糖凝胶向正极移动，而在琼脂糖凝胶的加样区形成的肽粒子(由AF488信号和AF568荧光信号共定位证实)因其较大的尺寸而不能在琼脂糖凝胶中迁移。图20B为一组HP-WAX(弱阴离子交换)色谱数据，显示大多数CD3肽和ssDNA被封装入肽粒子(沉淀)，且几乎不残留在上清液中。~1.5min处的峰:⑶3肽；~14.5min和~15min处的峰:分别为单独的ssDNA和部分杂交的ssDNA。
[0067]图21为显示由HeLa细胞摄取含有核酸的肽粒子的显微荧光图像。在这一实施方式中，由包含⑶3肽、⑶3ac肽、寡核苷酸(例如ssDNA)和转铁蛋白的混合物形成肽粒子。ssDNA-AF488荧光信号与肽粒子的共定位(由转铁蛋白-AF568荧光表示，其中转铁蛋白在粒子外表面上形成)表明了肽粒子在生理条件下的稳定性以及此类肽粒子将核酸分子或寡核苷酸递送至细胞的能力。
[0068] 图22A-图22D示出了含有ssDNA的肽粒子在血清(例如~10%血清)中的稳定性的数据和使用该肽粒子进行细胞转染的效率的数据。图22A显示PNPl粒子(含有ssDNA的⑶3肽粒子)在水中的稳定性依赖于温度，在更高温度下更多PNPl粒子趋向于解离。图22B显示PNPl粒子在水中的稳定性的时程研究数据，表明PNPl粒子在水中的稳定性依赖于温度，并且在更高温度下(例如，在高于4°C的温度下)PNPl粒子趋向于更快地解离。图22C为一组荧光图像，显示在PNPl粒子或PNP2粒子(含有ssDNA的⑶3/⑶3ac肽粒子)存在下，在约4°C和约37°C的温度下孵育的HeLa细胞。图22C的上侧子图显示，当细胞与PNPl粒子在约37°C孵育时，在细胞质中检出弥散性的且更强的Tfn-AF568荧光信号，相比之下在约4°C孵育时，在细胞中检出更多的点状Tfn-AF568荧光。然而，如图22C的下侧子图所示，在与PNP2粒子孵育的细胞中并未观测到这一差别。相反，图22C的下侧子图显示，在PNP2粒子存在下，在约4°C和约37°C两个条件孵育的细胞中均观测到点状且相当的Tfn-AF568荧光信号。这些发现表明，PNPl粒子在约37°C在血清(例如~10%血清)中倾向于解离；而PNP2粒子在约37°C至少约30min，在血清(例如~10%血清)中显得更加稳定。图22D为阴性对照细胞(即，在ssDNA存在、而无PNPl粒子或PNP2粒子或相应的肽存在下孵育的HeLa细胞)的荧光图像，表明与在与PNPl粒子或PNP2粒子孵育的细胞中相t匕，在阴性对照中观测到的AF488-SSDNA的荧光强度低得多。
【具体实施方式】
[0069]本文提供的多个方面和实施方式涉及两亲性肽、包含本文所述一个或多个实施方式的两亲性肽的肽粒子、以及本文所述的两亲性肽或肽粒子的用途。可通过控制两亲性肽的氨基酸残基上存在的带电基团的数量(例如，通过(例如用乙酰化)掩蔽一个或多个带电的氨基)，调整本文所述的两亲性肽的净电荷。因此，本文所述的两亲性肽和肽粒子可用作不同类型活性试剂(例如带电或不带电的分子，或极性或非极性分子)的递送载体或运载体。另外，还可通过控制存在于肽粒子中的两个以上实施方式的两亲性肽之比来对本文所述的肽粒子(例如在生理条件下)的溶解性进行调整。举例来说，完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽通常可形成不溶的肽粒子，而与完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽形成的粒子相比，由部分掩蔽(例如部分乙酰化)或未掩蔽(例如未乙酰化)的肽形成的粒子通常具有 (例如在生理条件下)更高的溶解性(或更低的稳定性)。因此，在一些实施方式中，可通过用具有不同溶解性的两亲性肽的混合物形成肽粒子并相应改变这些两亲性肽在肽粒子中的含量，控制本文所述的肽粒子的(例如在生理条件下的)溶解性或稳定性。因此，可对本文所述的两亲性肽和肽粒子的verstability和稳定性进行调整以用于多种应用，例如药物递送和/或活性试剂的缓释。
[0070]本文所使用的术语“稳定性”或“稳定的”是指在指定条件(例如，生理条件)下，肽粒子在一段时间(例如,至少约30min或更久，包括至少约I小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时或更久)内，维持其初始体积(例如,至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%以上的初始体积)的能力。肽粒子的稳定性部分受控于其在指定条件下的溶解性。在指定条件下肽粒子的溶解性越高，则该指定条件下肽粒子越不稳定。在一个实施方式中，本文所使用的术语“稳定性”或“稳定的”是指肽粒子在指定条件下(例如，在指定温度下在水性介质中)不溶。在一些实施方式中，所述水性介质为水。在一些实施方式中，所述水性介质为生理介质(例如，具有某一盐浓度、PH和/或蛋白/血清浓度的生理介质)。
[0071]在一方面，本文提供了包含疏水性肽片段和亲水性肽片段的两亲性肽。发明人尤其发现，通过对两亲性肽中亲水性氨基酸残基的亲水性进行调节，可对所述两亲性肽的两亲性作出调节，从而出乎意料地使得所述肽自组装为固体粒子。可通过将亲水基团缀合至亲水性肽片段的氨基酸、或通过掩蔽亲水性肽片段的亲水基团、或掩蔽两亲性肽的N-末端氨基来对两亲性进行调节。例如，当所述亲水性氨基酸为带电氨基酸时，可通过将分子的带电部分与保护基团相缀合来调节亲水性。因此，在一些实施方式中，两亲性肽中的至少一个氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。[0072]在一些实施方式中，所述两亲性肽被完全掩蔽。本文所使用的“完全掩蔽的肽”指的是N-末端氨基和亲水性肽片段中全部侧链氨基均缀合有氮保护基团或氨基保护基团的两亲性肽。
[0073]在一些实施方式中，所述两亲性肽被部分掩蔽。本文所使用的“部分掩蔽的肽”是指N-末端氨基或亲水性肽片段中的侧链氨基中的一个或多个未缀合有氮保护基团或氨基保护基团的两亲性肽；然而，所述两亲性肽仍包含至少一个缀合有氮保护基团或氨基保护
基团的氣基。
[0074]本文所使用的“氮保护基团”或“氨基保护基团”是指封闭(block)或掩蔽册12基团的部分。示例性的氨基保护基团包括但不限于:氨基甲酸酯保护基团，如2-三甲基硅基乙氧基擬基(Teoc)、1_甲基-1-(4-联苯基)乙氧基擬基(Bpoc)、叔丁氧基擬基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9_芴基甲氧基羰基(Fmoc)、以及苄氧基羰基(Cbz);酰胺保护基团，如甲酰基、乙酰基，三卤代乙酰基、苯甲酰基以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，如苯二甲酰亚胺基(phthalimido)和二硫杂琥拍酰基(dithiasuccinoyl)。进一步的氨基保护基团以及其它典型的保护基团在Greene和 Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,第二章，2d ed., John ffiley&Sons, NewYork, 1991,以及Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein,F.Ed.,IRL Press, N.Y, 1991中公开，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
[0075]在一些实施方式中，氮保护基团或氨基保护基团为酰基或烷基，例如:乙酰基(Acetyl, ethanoyl)、丙酰基、叔丁酰基、甲基、乙基、丙基、丁基、戍基或己基。
[0076]在一些实施方 式中，两亲性肽中的N-末端氨基与氮保护基团或氨基保护基团相
三双口 ο
[0077]在一些实施方式中，两亲性肽的氨基酸的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10个或更多个)侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。其侧链氨基待缀合的氨基酸可存在于两亲性肽的任何位置。侧链缀合的氨基酸可彼此相邻或彼此不相邻。当存在三个以上的侧链缀合的氨基酸时，所述侧链氨基酸中的一些可与另一侧链缀合的氨基酸相邻存在，而一些侧链缀合的氨基酸不与另一侧链缀合的氨基酸相邻。另外，当存在两个以上的氮保护基团或氨基保护基团时，其可为全部相同、全部不同、或相同与不同的任意组合。
[0078]在一些实施方式中，亲水性肽片段中的氨基酸的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10个或更多个)侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。不受限制地，侧链缀合的氨基酸可位于亲水性肽片段的任何位置。例如，由N-末端起算，位于亲水性肽片段的I位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
[0079]在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的至少一个侧链氨基(包括例如，至少一个、至少两个、至少三个或更多个侧链氨基)与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的至少一个侧链氨基(包括例如，至少一个、至少两个、至少三个或更多个侧链氨基)被乙酰化。
[0080]在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的全部侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的全部侧链氨基被乙酰化。[0081]不希望被理论限制，两亲性肽中氮保护基团或氨基保护基团的存在调节了两亲性肽的亲水性。因此，可通过改变两亲性肽中氮保护基团或氨基保护基团的数量来调整两亲性肽的两亲性。
[0082]两亲性肽可具有任何长度的氨基酸序列。在一些实施方式中，两亲性肽的长度可为约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基。在一个实施方式中，两亲性肽的长度为约10个氨基酸残基。
[0083]疏水性肽片段
[0084]本文所使用的术语“疏水性肽片段”指的是具有相对高含量的疏水性氨基酸的肽片段。例如，疏水性肽片段是指这样一种肽片段，其中至少约50%以上(包括至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更高)的氨基酸残基为疏水性氨基酸残基。在一个实施方式中，疏水性肽片段为全部氨基酸均为疏水性氨基酸的肽片段。
[0085]因此，在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(AA11-AA12)b-(AAu)d，其中，每次出现的AA11、AA12和AA13分别为独立选定的疏水性氨基酸残基，b为1_20的整数、且d为O或1，只要AA11和AA12具有相反的(即，D-和L-)构型且AA12和AA13具有相反的构型。例如，若由AA11表示的氨基酸具有D-构型，则由AA12表示的氨基酸具有L-构型且AA13 (若存在的话)具有D-构型。或者,若由AA11表不的氨基酸具有L-构型,则由AA12表示的氨基酸具有D-构型且AA13 (若存在的话)具有L-构型。
[0086]在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含2-10个交替的D-氨基酸和L-氨基酸的序列，所述氨基酸选自于由下列氨基酸所组成的组:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸(Trp)，以及以上氨基酸的任意组合。
[0087]本文所使用的术语“疏水性氨基酸”指的是根据Eisenberg, 1984，J.Mol.Biol.179:125-142 (1984)的标准化共有疏水性级别(normalized consensushydrophobicity scale)表现出的疏水性高于零的氨基酸。示例性的疏水性氨基酸包括但不限于:Ala、Val、lie、Leu、Phe> Tyr> Trp> Pro、Met、Gly,以及以上氨基酸的衍生物。
[0088]在一些实施方式中，疏水性氨基酸为芳香族氨基酸。本文所使用的术语“芳香族氨基酸”指的是其侧链具有至少一个芳环或杂芳环的疏水性氨基酸。所述芳环或杂芳环可含有一个或多个取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br,-1、_N02、-NO、_NH2、-NHR、-NRR、-C (0)R、-C(O) OH、-C(O) OR、-C(O)NH2, -C(O) NHR、-C (0) NRR 等，其中 R 独立地为(C1-C6)烷基、取代的(C2-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C2tl)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基或者取代的6-26元烷杂芳基。示例性的芳香族氨基酸包括但不限于Phe、Tyr和Trp。
[0089]在一些实施方式中，疏水性氨基酸为脂肪族氨基酸。本文所使用的术语“脂肪族氨基酸”是指具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。示例性的脂肪族氨基酸包括但不限于Ala、Val、Leu 和 lie。
[0090] 在一些实施方式中，疏水性氨基酸为非极性氨基酸。本文所使用的术语“非极性氨基酸”是指带有的侧链在生理PH下不带电的疏水性氨基酸，该氨基酸具有的键中由两个原子共用的电子对通常由两个原子中的每一者均等控制(即，所述侧链是非极性的)。示例性的非极性氨基酸包括但不限于Leu、Val、lie、Met、Gly和Ala。
[0091]本领域技术人员将理解的是，本文所述的氨基酸的分类并不是互斥的。因此，具有的侧链表现出两种以上物理化学性质的氨基酸可归于多个类别中。例如，具有被极性取代基进一步取代的芳香部分的氨基酸侧链，如Tyr，可同时表现出芳香族疏水性和极性或亲水性，因此可包含在芳香族和极性两个类别中。特别是在本文提供的详细公开内容的基础之上，对任何氨基酸的适当分类对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0092]在一些实施方式中，每次出现的AAn、AA12和AA13独立地选自于由以下氨基酸所组成的组:Pro、lie、Phe> Val、Leu、Trp> Met、Ala、Gly、Tyr,以及以上氨基酸的任意组合。 [0093]不受限制地，全部AA11和AA12可相同或全部不同、或者为相同和不同的任意组合。因此，在一些实施方式中，全部AA11是相同的。在一些实施方式中，全部AA12是相同的。在一些实施方式中，全部AA11是相同的、全部AA12是相同的、且AA11与AA12不同。
[0094]在一些实施方式中，AA11、AA12和AA13中至少一者不为Tyr或Leu。
[0095]在一些实施方式中，至少一个AA11不为Tyr。
[0096]在一些实施方式中，至少一个AA12不为Leu。
[0097]在一些实施方式中，AA13不为Try或Leu。
[0098]在一些实施方式中，AA11为Tyr。
[0099]在一些实施方式中，AA12为Leu。
[0100]在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)n1-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，m和P独立地为3_20的整数、且η和q独立地为O或I。每个Trp可为D-Trp或L-Trp、且每个Leu可为D-Leu或L_Leu。当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D_Leu。类似地，当Leu为L-Leu时Trp就为D_Trp、且当Leu为 D-Leu 时 Trp 就为 L-Trp。
[0101]在一些实施方式中，m和P独立地为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或
15。在一些实施方式中，m和P独立地为1-5的整数(例如，整数1、2、3、4或5)。在一些实施方式中，m或P为整数1、2或3。在一个实施方式中，m或p为整数3。
[0102]在一个实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列((L-Trp) - (D-Leu)) 3- (L-Trp)。
[0103]亲水性肽片段
[0104]本文所使用的术语“亲水性肽片段”是指具有相对于烃部分而言具有亲水性的肽片段。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段是指相对于本文所述的两亲性肽的疏水性肽片段而言具有亲水性的肽片段。通常，亲水性肽片段包含至少一个亲水性氨基酸。本文所使用的术语“亲水性氨基酸”是指根据Eisenberg，J.Mol.Biol.179:125-142(1984)(以引用的方式将其内容并入本文)的标准化共有疏水性级别表现出的疏水性小于零的氨基酸残基。示例性的亲水性氨基酸包括但不限于:Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ser> Thr> Asn> Gin,以及以上氨基酸的衍生物。
[0105]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为带电或不带电的氨基酸。本文所使用的术语“带电氨基酸”是指带有净电荷的氨基酸残基。因此，带电氨基酸可以是阳离子氨基酸或阴离子氨基酸。本文所使用的术语“不带电氨基酸”是指不带有净电荷的氨基酸残基。可以通过掩蔽氨基酸的电荷(例如，通过将保护基团缀合至带电原子上)将带电氨基酸残基修饰为不带电氨基酸。在一个实施方式中，可通过乙酰化将带电氨基酸残基修饰为不带电氨基酸。
[0106]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为极性氨基酸。本文所使用的术语“极性氨基酸”是指带有的侧链在生理PH值下带电或不带电的亲水性氨基酸，该氨基酸具有的至少一个键中由两个原子共用的电子对通常由其中一个原子更紧密地控制。示例性的极性氨基酸包括但不限于:Asn、Gin、Ser、Thr,以及以上氨基酸的任意组合。
[0107]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为带电或不带电的极性氨基酸。
[0108]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为阳离子氨基酸。本文所使用的术语“阳离子氨基酸”是指含有的侧链在正常生理条件下带正电的氨基酸残基。因此，术语“阳离子氨基酸”包括其含有的侧链在正常生理条件下由此带正电的任何天然存在的氨基酸或氨基酸模拟物。一般而言，在其可变侧链中包含氨基的氨基酸残基被认为是阳离子氨基酸。示例性的阳离子氨基酸包括但不限于 :赖氨酸、组氨酸、精氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸，以及以上氨基酸各自的衍生物、类似物和立体异构构型。
[0109]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为阴离子氨基酸。本文所使用的术语“阴离子氨基酸”是指带负电的亲水性氨基酸。示例性的阴离子氨基酸包括但不限于:Glu、Asp,以及以上氨基酸的衍生物。
[0110]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为酸性氨基酸。本文所使用的术语“酸性氨基酸”是指带有的侧链PK值小于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常由于失去氢离子而具有在生理pH下带负电的侧链。示例性的酸性氨基酸包括但不限于:Glu、Asp，以及以上氨基酸的衍生物。
[0111]在一些实施方式中，亲水性氨基酸为碱性氨基酸。本文所使用的术语“碱性氨基酸”是指带有的侧链PK值大于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常由于与水合氢离子(hydronium ion)缔合而具有在生理pH下带正电的侧链。示例性的碱性氨基酸包括但不限于:His、Arg、Lys,以及以上氨基酸的衍生物。
[0112]在一些实施方式中，亲水性肽片段包含至少一个带电氨基酸、或至少一个不带电的极性氨基酸，或以上氨基酸的组合。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含至少一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸:Lys、Arg、HiS、ASp和Glu，或至少一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸:Ser、Thr、Asn和Gln，或以上氨基酸的任意组合。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段可包含一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸:Lys> Arg 和 His。
[0113]在一些实施方式中，以氮保护基团或氨基保护基团对所述亲水性肽片段中的至少一个氨基进行掩蔽或缀合。
[0114]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(AA21)f，其中AA21为亲水性氨基酸，每次出现的AA21均独立选择，且f是1-21的整数。
[0115]不受限制地，全部AA21可相同、全部不同、或为相同和不同的任意组合。
[0116]在一些实施方式中，f为 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15。
[0117]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)y其中r为1_15的整数。在一些实施方式中，r为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方式中，r为2-5的整数(例如，r为整数2、3、4或5)。在一个实施方式中，r为整数3。[0118]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含选自于由以下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列:(L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys)、(L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys (Ac))、(L-Lys) - (L-Lys (Ac)) - (L-Lys)、(L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - (L-Lys)、(L-Lys) - (L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))、(L-Lys (Ac))- (L-Lys) -(L-Lys(Ac))、(L-Lys (Ac)) - (L-Lys (Ac)) - (L-Lys)、L-Lys (Ac)) - (L-Lys (Ac)) - (L-Lys (Ac)),以及以上氨基酸序列的任意组合，其中，“Ac”指的是Lys氨基酸残基的乙酰化。
[0119]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含亲水性聚合物或者为亲水性聚合物。本文所使用的术语“亲水性聚合物”是指相对于烃部分而言具有亲水性的聚合物。在一些实施方式中，术语“亲水性聚合物”是指相对于本文所述的两亲性肽的疏水性肽片段而言具有亲水性的聚合物。聚合物的亲水性可以通过例如ASTM D570测试来确定。通常而言，亲水性聚合物是水溶性的。示例性的亲水性聚合物包括但不限于:聚(乙二醇)、聚(环氧乙烧)、聚(丙二醇)(poly (propylene glycol))、聚(环氧乙烧-共-环氧丙烷)、透明质酸、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、肝素、聚乙烯基(吡咯烷酮)、硫酸软骨素、壳聚糖(chitosan)、葡糖胺聚糖(glucosaminoglucans)、葡聚糖、糊精、硫酸葡聚糖、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、轻乙基纤维素、纤维素质(cellulosic)、聚(丙二醇)(poly (trimethylene glycol))、聚丁二醇(poly (tetramethylene glycol))、多肽、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰亚胺、聚(乙烯胺)、聚(烯丙基胺)，以及以上聚合物的共混物。
[0120]示例性的肽修饰
[0121]在一些实施方式中，本文所述的两亲性肽可包含至少一个(例如，I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)选自于由下
列氨基酸所组成的组的氨基酸:丙氨酸；精氨酸；天冬酰胺；天冬氨酸；半胱氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；甘氨酸；组氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；赖氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；脯氨酸；丝氨酸；苏氨酸；色氨酸；酪氨酸；缬氨酸；同型半胱氨酸；磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；磷酸酪氨酸；轻脯氨酸；Y-羧基谷氨酸(Y-carboxyglutamate);马尿酸(hippuric acid);八氢口引哚-2-羧酸；抑胃酶氨酸(statine) ;1，2，3，4_四氢异喹啉_3_羧酸；青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；鸟氨酸(Orn);瓜氨酸(citruline) ; α -甲基-丙氨酸；对苯甲酰基苯丙氨酸；对氨基苯丙氨酸；对氟苯丙氨酸；苯基甘氨酸；炔丙基甘氨酸；Ν-甲基甘氨酸(肌氨酸，Sar);以及叔丁基甘氨酸；二氨基丁酸；7_羟基-四氢异喹啉羧酸；萘基丙氨酸；联苯基丙氨酸；环己基丙氨酸；氨基-异丁酸(AiB);正缬氨酸；正亮氨酸(Nle);叔亮氨酸；四氢异喹啉羧酸；哌唳酸(pipecolic acid);苯基甘氨酸；高苯丙氨酸；环己基甘氨酸；脱氢亮氨酸；2，2- 二乙基甘氨酸；1-氨基-1-环戊烷羧酸；1-氨基-1-环己烷羧酸；氨基-苯甲酸；氨基-萘甲酸；Y -氨基丁酸；二氟苯基丙氨酸；哌唳甲酸(nipecotic acid) ;Ν_ α -咪唑乙酸(IMA)；噻吩基-丙氨酸；叔丁基甘氨酸；脱氨基-Tyr ;氨基戍酸(Ava);焦谷氨酸(pyroglutaminicacid,〈Glu) ;α -氨基异丁酸(a Aib) ; Y -氨基丁酸(Y Abu) ; α -氨基丁酸(a Abu)；α Y-氨基丁酸(α Y Abu) ;3-吡啶基丙氨酸(Pal);异丙基-α-Νε赖氨酸(ILys);萘基丙氨酸(Napthyalanine, Nal) ;α-萘基丙氨酸(a-Nal) ;β_萘基丙氨酸(β-Nal)；乙酰基-β-萘基丙氨酸(Ac-β-萘基丙氨酸)；α，萘基丙氨酸；NE-piColoyl-赖氨酸(PicLys) ；4-卤代苯基；4-吡咯烷基丙氨酸(4-pyrolidylalanine);异哌唳羧酸(isonipecotic carboxylic acid, inip) ； β -氨基酸；以及以上氨基酸的异构体、类似物和衍生物。本领域技术人员将领会的是，这一定义包括D-氨基酸和L-氨基酸；α -氨基酸、β-氨基酸和Y-氨基酸；化学修饰的氨基酸；天然存在的非成蛋白性(non-proteogenic)氨基酸；稀有氨基酸；以及具有本领域中已知为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。此外，每一实施方式可包括所述基团的任意组合。
[0122]此外，本文所使用的术语“氨基酸”包括偏离天然存在的氨基酸的结构的化合物或分子，但所述化合物或分子大致上具有氨基酸的结构，从而可将其用于替换肽中天然存在的氨基酸，替换后所述肽的活性(例如形成聚集体的活性)仍然保留。因此，例如，在一些实施方式中，氨基酸也可以包括具有侧链修饰或取代的氨基酸，并且还可以包括相关的有机酸、酰胺等。不受限制地，氨基酸可以是成蛋白性氨基酸或非成蛋白性氨基酸。本文所使用的术语“成蛋白性”表示该氨基酸可通过公知的代谢通路并入细胞中的蛋白。
[0123]在一些实施方式中，两亲性肽包含至少一个(例如，I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个 、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)化学修饰的氨基酸。本文所使用的术语“化学修饰的氨基酸”是指经一种或多种试剂处理的氨基酸。化学修饰的氨基酸可存在于所述两亲性肽的任何位置。当存在多于一个的化学修饰的氨基酸时，其位置可彼此相邻或不彼此相邻。当存在三个以上的化学修饰的氨基酸时，一些化学修饰的氨基酸可彼此相邻，而一些化学修饰的氨基酸不与另一化学修饰的氨基酸相邻。
[0124]在一些实施方式中，亲水性肽片段包含化学修饰的氨基酸。不受限制地，化学修饰的氨基酸可存在于所述亲水性肽片段的任何位置，例如，由N-末端起算，位于亲水性肽片段的I位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
[0125]在一些实施方式中，疏水性肽片段包含化学修饰的氨基酸。不受限制地，化学修饰的氨基酸可以存在于疏水性肽片段的任何位置，例如，从N-末端起算，位于疏水性肽片段的I位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
[0126]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段各自均可包含至少一个化学修饰的氨基酸。当所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段均包含化学修饰的氨基酸时，存在于每一肽片段中的此类化学修饰的氨基酸的数目可相同或不同。
[0127]在一些实施方式中，两亲性肽包含至少一个(例如，I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)β-氨基酸。当存在多于一个的氨基酸时，其位置可以彼此相邻或不彼此相邻。当存在三个以上的氨基酸时，一些氨基酸可以与另一β-氨基酸相邻，而一些氨基酸不与另一氨基酸相邻。
[0128]在一些实施方式中，亲水性肽片段包含氨基酸。不受限制地，氨基酸可存在于所述亲水性肽片段的任何位置，例如，从N-末端起算，位于亲水性肽片段的I位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
[0129]在一些实施方式中，疏水性肽片段包含氨基酸。不受限制地，氨基酸可存在于所述疏水性肽片段的任意位置，例如，从N-末端起算，位于疏水性肽片段的I位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
[0130]在一些实施方式中，所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段各自均可包含至少一个氨基酸。当所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段均包含氨基酸时，每一肽片段中此类氨基酸的数目可相同或不同。
[0131]示例性的氨基酸包括但不限于丄-β-高脯氨酸盐酸盐；(±)-3-(Boc-氨
【权利要求】
1.一种包含两亲性肽的肽粒子，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段， 其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu) m- (Trp) n或(Leu-Trp) p- (Leu) q,其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu, m和p独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu,或反之亦然；以及 其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)P其中r为1-15的整数，并且 其中，所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
2.如权利要求1所述的肽粒子，其中，所述亲水性肽片段的至少一个Lys残基或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
3.如权利要求1或2所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D -Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
4.如权利要求3所述的肽粒子，其中，至少一个L-Lys残基被乙酰化、和/或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
5.如权利要求1-4中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体包括细胞表面受体的配体或抗体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽粒子，其中，所述肽粒子包含完全乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽和部分乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽的混合物；并任选地包含未乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
8.如权利要求7所述的肽粒子在靶向递送活性试剂中的用途。
9.包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中，所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段， 其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu) m- (Trp) n或(Leu-Trp) p- (Leu) q,其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu, m和p独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu,或反之亦然；以及 其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)P其中r为1-15的整数，并且 其中，所述两亲性肽的至少一个Lys残基或N-末端氨基未被乙酰化。
10.如权利要求9所述的用途，其中，所述两亲性肽的全部Lys残基和N-末端氨基均未被乙酰化。
11.如权利要求9或10所述的用途，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
12.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其中，所述组合物进一步包含待递送至细胞中的核酸分子。
13.一种包含第一两亲性肽和第二两亲性肽的肽粒子，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段， 其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu) m- (Trp) n或(Leu-Trp) p- (Leu) q,其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu, m和p独立地为1-5的整数、且η和q独立地为O或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L_Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu,或反之亦然；以及 其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)P其中r为1-15的整数，并且 其中，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；以及 其中，所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。
14.如权利要求13所述的肽粒子，其中，所述第二两亲性肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
15.如权利要求13或14所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
16.如权利要求15所述的肽粒子，其中，所述活性试剂包含核酸分子。
17.如权利要求13-16中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
18.如权 利要求13-17中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含氨基酸序列(L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp)-(D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X，其中，X 不存在或 X 为 NH2。
19.如权利要求13-18中任一项所述的肽粒子在将核酸分子递送至细胞中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述核酸分子包括siRNA、miRNA、shRNA、DNA，或以上核酸分子的任意组合。
【文档编号】C07K14/00GK104011065SQ201280052123
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2011年8月23日
【发明者】克里斯蒂安·迪特里希, 高登茨·达努斯尔 申请人:哈佛大学校长及研究员协会