基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体的制作方法

专利名称：基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体。
背景技术：
制备具有多种功能或结合特异性的基于抗体的试剂的现有技术存在很多限制。对于通过重组工程制备的试剂而言，此类限制可包括生产成本高、表达产率低、在血清中不稳定、在溶液中不稳定(导致形成聚集体或解离的亚基)、不确定的批组成(由于存在多种产物形式)、污染性副产物、功能活性或者结合亲和性/亲和力降低(由于空间因素或者构象改变)等。对于通过各种化学交联方法产生的试剂而言,高生产成本和纯化产物的异质性是两大限制。近年来，对抗体或可与多于一个抗原决定簇(也称为表位)结合的其他结合部分的关注日益增加。一般而言，天然存在的抗体和单克隆抗体具有两个识别相同表位的抗原结合位点。相反，双功能或者双特异性抗体(下文将仅使用术语“双特异性抗体”)是经合成或遗传改造的可与两个不同表位结合的结构。因此，同一分子构建体具有与两个不同抗原决定簇结合的能力。双特异性抗体可用于许多生物医学应用。例如，具有肿瘤细胞表面抗原和T细胞表面受体两个结合位点的双特异性抗体可引导T细胞对特定的肿瘤细胞的裂解。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已成功用于治疗人类患者的脑肿瘤(Nitta等，Lancet.1990 ；355 =368-371)。最近，已报道称为“双特异性T细胞啮合体” (BiTE)的一类新的双特异性抗体克服了参与效应细胞募集以发挥生物活性的大多数肿瘤靶向双特异性抗体的局限(Kufer 等，Trends in Biotechnol.2004 ;22:238-244)。BiTE 是重组的双特异性单链抗体，其由导向靶细胞表面抗原和T细胞上的CD3的两个不同单链Fe片段(scFv)通过柔性多肽连接体串联连接而成(Mack等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995 ；92:7021-7025)。BiTE产生于哺乳动物细胞，并且与其他⑶3定向双特异性抗体相反，其能够有效地再引导人外周T淋巴细胞杀伤靶细胞，而无需任何的效应T细胞的预刺激或共刺激(Mack 等，J Immonol.1997 ；158:3965-3970 ；Loffler 等，Blood.2000 ；95:2098-2103)。已表明，低至10-100pg/mL( 0.1_2ρΜ)的BiTE浓度足以在体外实现最大靶细胞裂解的一半(Dreier 等，Int J Cancer.2002 ; 100:690-697)，而在小鼠模型中，亚微克量的 BiTE可以阻止肿瘤生长(Dreier 等，J Immunol.2003 ；170:4397-4404 ；Schlereth 等，CancerRes.2005；65:2882-2889)。已知有多种制备双特异性抗体的方法。例如，2004年2月11日提交的第20050002945号美国专利申请公布(其完整内容通过引用结合入本文)公开了双特异性和多特异性抗体的构建和使用的方法。双特异性抗体可通过四源杂交瘤方法制备，该方法包括两个不同杂交瘤的融合，每个杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature, 1983 ；305 =537-540)。融合的杂交瘤能够合成两种不同的重链和两种不同的轻链，它们可以随机缔合产生10种不同抗体结构的异质群体，其中只有一个(占总抗体分子的1/8)是双特异性的，因此必须进一步将其从其他形式中纯化出来，但是即使这方法可行，其也不具备成本效益。此外，融合的杂交瘤经常在细胞遗传学上比亲本杂交瘤更不稳定，使制备细胞系的产生更加困难。另一种制备双特异性抗体的方法使用异双功能交联剂来化学拴结两个不同的单克隆抗体，以便所得的杂交轭合物将与两个不同祀标结合(Staerz等，Nature, 1985 ；314:628-631 ；Perez等，Nature, 1985 ；316 =354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上为两个IgG分子组成的异轭合物，其缓慢扩散入组织，并且很快被从循环中清除。双特异性抗体还可通过下述方法制备:将两个亲本单克隆抗体中的每一个均还原为相应的半分子，然后将这些半分子进行混合和再氧化以获得杂种结构(hybrid structure) (Staerz和Bevan,Proc Natl Acad Sci U S A.1986 ;83:1453-1457)。替代的方法包括使用适当的连接体化学交联两个或三个单独纯化的Fab’片段。例如，欧洲专利申请0453082公开了将三马来酰亚胺化合物用于制备双特异性或三特异性抗体样结构。第6，511，663号美国专利提供了通过连接结构将三个或四·个Fab片段彼此共价连接，以制备三价和四价单特异性抗原结合蛋白的方法。所有这些化学方法均不适合商业化开发，原因是生产成本高、生产过程费力、纯化步骤多、产量低(< 20% )和产品不纯。其他方法包括提高产生杂交瘤的效率，其通过逆转录病毒衍生的穿梭载体将不同的选择标志物基因转入相应的亲本杂交瘤，然后对亲本杂交瘤进行融合(DeMonte等，ProcNatl Acad Sci U S A.1990,87 =2941-2945);或者，使用包含不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。这些方法也面临上文讨论的不可避免的纯化问题。第5，582，996号美国专利公开了制备由来自相同或不同抗体的Fab片段组成的重组双特异性抗体的方法，所述Fab片段通过插入抗体重链恒定区区域的互补相互作用结构域缔合在一起。所述互补相互作用结构域选自互补的亮氨酸拉链或者一对肽段，一个肽段包含一系列带正电的氨基酸残基，而另一肽段则包含一系列带负电的氨基酸残基。此方法的一个限制在于:除非同时包括两个Fab亚基，否则包含融合的互补相互作用结构域的单个Fab亚基对其靶抗原的亲和力大大下降。
通过重组DNA技术制备的抗体离散型Vh和\结构域可以彼此配对形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(第4，642，334号美国专利)。但是，此类非共价缔合分子在生理条件下不具有足以具备任何实际用途的稳定性。同源Vh和\结构域可用具有适当组成和长度的肽连接体(通常由超过12个的氨基酸残基组成)连接，以形成具有结合活性的单链Fv(ScFv)。制备scFv的方法参见第4，946，778号美国专利和第5，132，405号美国专利。将所述肽连接体的长度减至少于12个氨基酸残基，可防止V1^P'结构域在同一链上配对，而迫使Vh和\结构域与其他链上的互补结构域配对,从而形成功能性多聚体。用具有3至12个氨基酸残基的连接体连接的V1^P '结构域多肽链主要形成二聚体(称为二链抗体(diabody))。使用O至2个氨基酸残基的连接体则有利于形成三聚体(称为三链抗体(triabody))和四聚体(称为四链抗体(tetrabody)),但是除了连接体长度之外,低聚的精确模式还显示依赖于V-结构域的组成和方向(Vh-连接体或连接体-Vh)。已经使用由5个或更少氨基酸残基组成的肽连接体获得了多价单特异性二链抗体、三链抗体和四链抗体。双特异性二链抗体也已制得，其是由两个不同scFv组成的异型二聚体，每个scFv由通过短的肽连接体与另一抗体的\结构域连接的一个抗体的Vh结构域组成；其制备方法是使用双顺反子表达载体，该载体在一个顺反子中包括具有Vh1-连接体_'2的重组基因构建体，且在另一顺反子中包括具有Vh2-连接体-Vu的第二个重组基因构建体(Holliger 等，Proc Natl Acad Sci USA.1993 ；90:6444-6448 ；Atwell 等，Mol Immunol.1996；33:1301-1302 ;Holliger 等，Nature Biotechnol.1997；15:632-631 ；Helfrich 等，Int.J Cancer.1998 ；76:232-239 ；Kipriyanov 等，Int J Cancer.1998 ；77:763-772 ；Holliger 等，Cancer Res.1999 ；59:2909-2916)。最近还报道了具有双特异性的四价串联二链抗体(称为tandab) (Cochlovius等，Cancer Res.2000 ；60:4336-4341)。该双特异性tandab是两个相同多肽的二聚体，每个多肽均包含两个不同抗体的四个可变区(VH1、VU、VH2、'2)，这些可变区的连接方向有利于自缔合后形成两个各自具有两个不同特异性的潜在的结合位点。到目前为止,构建表达双特异性或者三特异性的三链抗体的载体尚未成功。不过，已报道包含胶原凝素颈区的多肽可三聚化(Hoppe等，FEBSLetters.1994 ；344 =191-195)。第6，190，886号美国专利公开了`从包含胶原凝素颈区的融合蛋白制备同型三聚体或异型
三聚体。第5，844，094号美国专利、第5，837，242号美国专利和W098/44001公开了通过改变连接体长度制备多价和多特异性的基于scFv的试剂的方法。第5，989，830号美国专利和第6，239，259号美国专利公开了通过构建两个多肽链(一个包含来自至少两个抗体的Vh结构域，且另一个包含相应的\结构域)制备多价和多特异性的基于scFv的试剂的方法。与使用先前技术方法产生多价和多特异性的基于scFv的试剂时常相关的共同问题是表达水平低、产物形式不纯、在溶液中不稳定(导致聚集)、在血清中不稳定和亲和力降低。第6，809，185号美国专利公开了重组制备的双特异性或三特异性抗体，其中CHl的C-末端和Fab的Cl各自融合至来自相同或不同单克隆抗体的scFv。此“三体(Tribody) ”技术的主要缺陷包括所连接的scFv的结合亲和力降低、产物形式不纯和在溶液中不稳定(导致聚集)。因此，本领域仍需要制备具有单特异性或多特异性或功能性的多价结构的方法，所述多价结构具有确定的组成、同质纯度和不变的亲和力，并可以高产率被制备而无需过多的纯化步骤。此外，此类结构还必须在血清中足够稳定以适于在体内应用。需要易于构建和/或获得相对纯的形式、并具有单特异性或多特异性或功能性的稳定的多价结构。发明概述本发明公开了产生稳定栓结结构(tethered structures)的平台技术,所述结构可以是单特异性和/或单功能性的，或者可以具有多种功能或结合特异性，并且适合在体外和体内应用。在优选实施方案中，此类稳定拴结结构被制备为两种组分(本文称为A和B)通过两个不同肽序列(一个称为二聚化和停靠结构域(dimerization and dockingdomain, DDD),另一个则称为锚定结构域(anchoring domain, AD))之间特异的相互作用形成的复合体。在更优选实施方案中，所述DDD序列(在图1中表示为DDDl和DDD2)衍生自cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调节亚基(R)，且所述AD序列(在图2中表示为ADl和AD2)衍生自在各种A激酶锚定蛋白(AKAP)中发现的、介导与PKA的R亚基缔合的特定区域。但是，技术人员将了解:其他二聚化和停靠结构域以及锚定结构域是已知的，且任何此类已知结构域都可在本发明要求保护的主题的范围内使用。本发明公开的方法和组合物实现了具有DDD/AD偶联系统的任何两个复合体的定点共价或非共价缔合。发现作为DDD结构特征的 X-型四螺旋束二聚化模体(Newlon 等,EMBO J.2001 ；20: 1651-1662 ；Newlon 等，NatureStruct Biol.1999 ；3:222-227)也存在于其他蛋白类别，如SlOO蛋白(例如，S100B和钙周期蛋白)，和转录因子中的肝细胞核因子(HNF)家族(例如，HNF-1 α和HNF-1 β )。由于S100蛋白具有如肿瘤发生等生物活性，它们可能不太适用于此用途。参与信号转导或者转录激活的300多种蛋白质包含被称为不育α模体(SAM)结构域的65-70个氨基酸的模块，该模块具有存在于其二聚化界面的X-型四螺旋束的变异。对于S100B，此X-型四螺旋束使得每个二聚体能够与衍生自C-末端调节结构域(残基367-388)的两个ρ53妝以微摩尔亲和力结合(Rustandi等,Biochemistry, 1998 ；37:1951-1960)。相似地，已表明HNF-1 a (HNF-pl)的N-末端二聚化结构域通过HNF-pl的二聚体与DCoH(HNF_l的二聚化辅助因子)的二聚体缔合(Rose等,Nature Struct Biol.2000 ；7:744-748)。在替代实施方案中，这些天然存在的系统也可用于本发明要求保护的方法和组合物，以提供具有多种功能或结合特异性的稳定的多聚结构。其他结合事件(如酶与其底物/抑制剂之间的结合，例如角质酶与磷酸酯(Hodneland等，Proc Natl Acd SciUSA.2002 ；99:5048-5052))，也可用于产生所述的两个缔合组分(“停靠”步骤)，然后使这两个组分共价稳定(“锁定”步骤)。其他具有潜在用途的AD序列可参见序号为US2003/0232420A1的专利申请，其完整内容通过引用结合入本文。在示例性实施方案中，二元复合体的一个组分A是通过重组工程或者经由间隔区基团的化学轭合将DDD序列连接至A的前体(称为A)而得到Α/DDD结构(下文简称a)来制备的。因为a中的DDD序列影响二聚体的自发形成，所以A由a2组成。二元复合体的另一个组分B是通过重组工程或者经由间隔区基团的化学轭合将AD序列连接至B的前体(称为B)而得到B/AD结构(下文简称b)来制备的。％中包含的二聚化结构产生了用于结合b中包含的AD序列的停靠位点，该事实导致a2与b容易缔合而形成组成为a2b的二元复合体。在不同的实施方案 中，此结合事件通过随后共价固定装配体的两个组分(例如通过二硫桥)的反应而得到进一步的稳定，其高效率地发生，因为初始的结合相互作用引导活性硫醇基团位点特异性地连接。通过使半胱氨酸残基置于DDD和AD两个序列的关键位置(如DDD2和AD2中所示)，a2和b之间可通过二硫桥发生共价结合相互作用，进而形成更有利于在体内应用的稳定拴结结构。所述稳定拴结结构同时保留了两个前体A和B的完整功能特性。本发明人不知道具有此独特的特征组合的双特异性组合物的任何先前技术。上文公开的设计性质上是模块化的本质，因为所选的两个前体中的每一个都可与DDD或AD连接，然后再进行组合。所述两个前体还可以相同(A = B)或者不同(A古B)。当A = B时，所得的a2b复合体由三个亚基的稳定拴结装配体(下文简称a3)组成。可作为前体的物质包括蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNA1、寡糖、天然或合成的多聚物、纳米粒子、量子点以及有机或无机化合物。其他具有潜在用途的前体的非限制性实例列于下面的表6-表10。除了使用二硫键连接防止组成性亚基解离外，也可使用增强稳定拴结结构的整体稳定性的其他方法。例如，可选择可商业途径获得的或者研究中使用的各种交联剂或方法用于此类目的。可能有用的试剂包括戊二醛，它已广泛用于通过交联组成性亚基以形成稳定的轭合物，进而探测非共价缔合的多聚蛋白的结构(Silva等，Food TechnolBiotechnol.2004 ；42:51-56)。同样值得注意的还有两种包括蛋白质亚基的氧化交联的化学方法。一种是使用六组氨酸标签蛋白(Fancy等，Chem Biol.1996 ；3 =551-559)或N-末端甘氨酸-甘氨酸-组氨酸标签蛋白(Brown等,Biochemistry.1998 ；37:4397-4406)的近位标记技术。这些标签紧密结合Ni (II)，并且在用高酸氧化时生成能够介导包括蛋白质-蛋白质交联在内的多种氧化反应的 Ni (III)物类。另一种技术称为PICUP(光诱导的非修饰蛋白交联)，该技术使用[Ru(II) (bipy)3]2+、过硫酸铵和可见光来诱导蛋白质-蛋白质交联(Fancy 和 Kodadek，Proc Natl Acad Sci USA.1999 ；96:6020-6024) 但是，如下文所述，许多用于化学交联肽、多肽、蛋白质或其他大分子物类的方法是本领域已知的，任何此类已知的方法均可用于共价稳定所述二元a2b复合体。在更优选的实施方案中(更详细公开于下文实施例23-35)，可以形成单特异性或双特异性的六聚复合体。例如，如图10、图11和图13所示，此类复合体可通过下列方法形成:在IgG部分的每个C-或N-末端连接一个AD2，然后所述IgG部分可与DDD2轭合的Fab片段或其他DDD2轭合的抗体或抗体片段结合，以形成六聚复合体。如实施例23-35中所述，与亲本抗体或片段相比，此类单特异性或双特异性六聚复合体表现出更高的结合亲和力和增强的效力。实施例23-35中公开了很多单特异性或双特异性的六聚稳定拴结结构。但是，技术人员应了解:这些实例是非限制性的，所公开的六聚结构中可包括多种抗原结合或者其他功能部分，表6-10对其中的一部分进行了讨论。技术人员应了解:上文所述的IgG或Fab片段可用其他类型的抗体、抗体片段或非抗体蛋白(在下文详细讨论)替代。所述稳定拴结结构可包含抗原结合组分和/或效应组分的不同组合。例如，与激活的血小板和组织纤溶酶原激活物(tPA)皆可反应的双特异性抗体不但通过抑制血小板聚集来防止进一步形成凝块，其还可通过将内源tPA募集到血小板表面来溶解已存在的凝块(Neblock等，Bioconjugate Chem.1991,3:126-31) 与毒素(如核糖核酸酶)连接的、包含针对内化肿瘤相关抗原(如CD74)的多价抗体结合组分的稳定拴结结构，对于选择性递送该毒素以破坏靶肿瘤细胞将非常有用。包含IL-4受体可溶组分(SIL-4R)和IL-13受体可溶组分(sIL_13R)的稳定拴结结构是治疗哮喘或变态反应的潜在治疗剂。在防止凝块再形成方面，包含抗GPIIb/IIIa Fab片段的六聚、单特异性稳定栓结结构由于具有更高的结合亲和力而比其单价(ReoPro, Centocor)或双价类似物更加有效。在治疗类风湿性关节炎和某些其他自身免疫疾病(AID)时，包含多拷贝TNFa-R可溶组分的稳定栓结结构应该比Enbrel (Amgen)更有效地抑制TNF。本发明要求保护的方法和组合物还包括由连接至稳定拴结结构的一个或多个效应物或载体组成的轭合物。所述效应物或载体可非共价或者共价连接至所述稳定拴结结构，例如通过化学交联或者通过与双特异性或者多特异性稳定拴结结构结合，其中第一个特异性针对疾病相关靶标，而第二个特异性针对效应物和/或连接至所述效应物的半抗原，详见下文。根据预定用途，所述效应物可选自诊断剂、治疗剂、化疗剂、放射性同位素、显像剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、激素、可光检测的标记、染料、肽、毒素、造影齐 、顺磁标记、超声标记、促凋亡剂、脂质体、纳米粒子或其组合。此外，轭合物还可包含多于一个的相同或不同的效应物，或者多于一个的相同或者不同的载体。效应物和载体也可出现在同一轭合物中。当所述效应物为螯合剂时，所得的轭合物通常与放射性或非放射性的金属进行进一步络合。包含载体的轭合物还可进一步包括具有适合预定用途的诊断或治疗功能的试剂。在某些实施方案中，所述效应物或载体可在稳定拴结结构之后被施用至受治疗者，例如在下文讨论的预靶向策略中。可首先将所述稳定拴结结构施用至受治疗者，以允许其在病组织(如肿瘤·)中定位。然后加入所述效应物或载体，以允许其与已定位的稳定拴结结构结合。当所述效应物或载体与毒性部分(如放射性核素)轭合时，此预靶向方法减少所述受治疗者与毒性的全身接触，从而允许将毒性试剂成比例更多地递送至靶组织。任选地，可在施用可靶向的构建体之前施用清除剂，以从循环中清除未定位的稳定拴结结构。这些方法在本领域是已知的，详细描述参见第4，624，846号美国专利、TO92/19273和Sharkey等，Int.J.Cancer51:266(1992)。可靶向的构建体的示例可具有 X-Phe-Lys (HSG)-D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Y) -NH2的结构，其中该化合物在X或Y处包括硬酸阳离子螯合剂、和在剩余的X或Y处包括软酸阳离子螯合剂；并且其中该化合物进一步包含至少一种诊断性或治疗性阳离子，和/或一种或多种螯合的或者化学结合的治疗剂、诊断剂或酶。例如，所述诊断剂可以是:Gd(III) ,Eu(III)、Dy(III)、Pr(III) ,Pa(IV) ,Mn(II)、Cr(III)、Co(III) ,Fe(III)、Cu(II)、Ni (II)、Ti (III)、V(IV)离子或自由基。第二个构建体示例可具有式X-Phe-Lys (HSG) -D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Y) -NH2,其中该化合物在X或Y处包括硬酸阳离子螯合剂或软酸螯合剂，且在剩余X或Y处不包含任何物质；并且其中该化合物进一步包含至少一种诊断性或治疗性阳离子，和/或一种或多种螯合或者化学结合的治疗剂、诊断剂或酶。在此类实施方案中，所述A亚基可例如包含肿瘤相关抗原的结合位点，而所述B亚基可包含效应物或载体、或者轭合至效应物或载体的半抗原的结合位点。本发明的稳定拴结结构(包括其轭合物)适合用于多种治疗和诊断用途。例如，基于抗体结合结构域的六价构建体可用于此类构建体未与其他功能剂轭合的治疗场合，其方式与使用裸抗体的治疗相同。替代地，可使用一种或多种功能剂对这些稳定拴结结构进行衍生，以用于诊断或治疗用途。所述其他试剂可使用常规轭合化学共价连接至所述稳定拴结结构。稳定拴结结构的使用方法可包括检测、诊断和/或治疗疾病或其他医疗病症。此类病症可包括但不限于:癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化、中风、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、代谢性疾病、增生症(hyperplasia)、糖尿病性视网膜病变(retinopathy)、黄斑变性、炎性肠病、克罗恩(Crohn)病、溃瘍性结肠炎、类风湿性关节炎、结节病(sarcoidosis)、哮喘、水肿、肺高压(pulmonary hypertension)、牛皮癣、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、Osler-Webber综合征、心肌血管生成(myocardial angiogenesis)、斑块新生血管(plaque neovascularization)、再狭窄、血管损伤后新生内膜形成(neointimaformation)、毛细血管扩张、血友病关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、淀粉样变性病、器官移植排斥反应、深静脉血栓形成或创面肉芽(wound granulation)。在特定实施方案中，本发明公开的方法和组合物可用于治疗自身免疫疾病，如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西德纳姆氏(Sydenham)舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎(post-streptococcalnephritis)、结节性红斑、Takayasu氏动脉炎、艾迪生氏病(Addison’ s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃瘍性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊椎炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture' ssyndrome) > thromboangitisubiteran、Sjogren氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏(Wegener’ s)肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。不同的实施方案可包含治疗炎性和免疫失调性疾病、传染性疾病、病理性血管生成或癌症的方法。在本申请中，所述稳定拴结结构与选自由以下成员组成的组的两个不同靶标结合:(A)先天性免疫系 统的促炎效应物，⑶凝血因子，(C)补体因子和补体调节蛋白，以及(D)与炎性或免疫失调性疾病，或者与病理性血管生成或癌症特异性相关的靶标，其中后者的靶标不是(A)、⑶或(C)。所述靶标中至少有一个为(A)、⑶或(C)。革巴标的合适组合请参见2005年12月8日提交的题为“Methods and Compositions forImmunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune-Dysregulatory Disease,Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer，，(免疫治疗和检测炎性和免疫失调性疾病、传染性疾病、病理性血管生成和癌症的方法和组合物)的序号为11/296,432的美国专利申请，其内容通过引用整体结合入本文。可与所述结合分子结合的先天性免疫系统的促炎效应物可以是促炎效应细胞因子、促炎效应趋化因子或促炎效应受体。适合的促炎效应细胞因子包括MIF、HMGB-1 (高迁移率族盒蛋白l)、TNF_a、IL_1、IL_4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15 和 IL-18。促炎效应趋化因子的实例包括 CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP_10、GR0B 和嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)。促炎效应受体包括IL_4R(白介素_4受体)、IL_6R(白介素_6受体)、IL-13R(白介素-13受体)、IL-15R(白介素-15受体)和IL_18R(白介素-18受体)。所述结合分子还可与至少一种凝血因子、特别是组织因子(TF)或凝血酶发生特异性反应。在其他实施方案中，所述结合分子与至少一种补体因子或补体调节蛋白发生特异性反应。在优选实施方案中，所述补体因子选自由03、05、03&、0313和05&组成的组。当所述结合分子与补体调节蛋白发生特异性反应时，所述补体调节蛋白优选地选自由CD46、CD55、CD59和mCRP组成的组。在某些实施方案中，所述稳定拴结结构可用于治疗癌症。预期可以靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可以靶向的肿瘤的示例类型包括急性淋巴母细胞性白血病、急性脊髓白血病、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金氏(Hodgkin’ s)淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和尿膀胱癌。可以靶向的肿瘤相关抗原包括但不限于:碳酸酐酶IX、A3、A33抗体的特异性抗原、BrE3-抗原、CD 1、CD I a、CD3、CD5、CD 15、CD 16、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR, NCA95、NCA90、HCG 及其亚基、CEA (CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、缺氧诱导因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4 抗原、PSA、PSMA, RS5、S100、TAG-72, p53、生腱蛋白、IL-6, IL-8、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、胎盘生长因子(PlGF)、17_1A抗原、血管生成标志物(如ED-B纤连蛋白)、致癌基因标志物、致癌基因产物和其他肿瘤相关抗原。有关肿瘤相关抗原的近期报告包括Mizukami等(2005,Nature Med.11:992-97)；Hatfield 等(2005,Curr.Cancer Drug Targets5:229-48) ;Vallbohmer 等(2005,J.Clin.0ncol.23:3536-44);和 Ren 等(2005，Ann.Surg.242:55-63)，其均通过引用结合入本文。特别优选的实施方案可包括具有CD20或CD22结合位点的六价单特异性构建体。其他优选的实施方案可包括具有CD20和CD22两个结合位点的六价双特异性构建体。

其他实施方案可包含通过向受治疗者施用单个或多个剂量的稳定拴结结构，来治疗受治疗者的淋巴瘤、白血病或自身免疫疾病的方法，其中第二个前体的结合位点与淋巴细胞抗原结合，且第一个前体的结合位点与相同或不同的淋巴细胞抗原结合。所述一个或多个结合位点可结合不同的表位、或结合选自由以下组成的组的抗原的表位:CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD 126、CD 138、CD 154、B7、MUCl、la、I1、HMl.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、致癌基因、致癌基因产物、NCA66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-Rl (DR4)和TRAIL-R2 (DR5)。例如，所述组分可按单位剂量20-1500毫克蛋白、单位剂量20-500毫克蛋白、单位剂量20-100毫克蛋白、或单位剂量20-1500毫克蛋白的剂量进行肠胃外施用。在其他实施方案中，所述稳定拴结结构可用于治疗病原生物(如细菌、病毒或真菌)感染。可治疗的真菌示例包括小孢子菌属(Microsporum)、发癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞衆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念球菌(Candida albicans)。病毒示例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疫病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒(Sendai virus),猫白血病病毒、呼肠孤病毒(Reo virus)、脊髓灰质炎病毒、人类血清细小(parvo_like)病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疫病毒(rubella virus)、麻疫病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、小鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯(Sindbis)病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。细菌示例包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋球奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、月市炎双球菌(Pneumococcusspp.)、流感嗜血杆菌 B (Hemophilis influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原体(Mycoplasma)。虽然不是限制，但是在不同实施方案中，包括于所述稳定拴结结构的前体可包含一种或多种蛋白质，如细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶1、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内 毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TP0、EPO(促红细胞生成素)、凝块溶解剂(clot-dissolving agent)、酶、突光蛋白、sTNF a-R、avimer、scFv、dsFv 或纳米抗体。在其他实施方案中，抗血管生成剂可形成部分或全部前体，或者可连接至稳定拴结结构。使用的抗血管生成剂示例包括制管张素(angiostatin)、baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应素(thrombospondin)、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑(carboxyamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、戍聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素《!、除莠霉素八、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide (利诺胺)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。在其他实施方案中，一种或多种治疗剂可以被轭合至或包括于稳定栓结结构，所述治疗剂如aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺钼、伊立替康(CPT-1l)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯咪胺、多西紫杉醇、放线菌素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、地塞米松、二乙基己烯雌酚、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-D0X)、氰基吗啉阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、氟脲嘧啶脱氧核苷(FUdR)^i，5' -O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、乙酸甲羟孕酮(medroprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6_巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、苯丁酸、泼尼松、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PS1-341、司莫司汀链脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉烷类、紫杉酚、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓泊替康、尿B密唳氮芥、万河(velcade)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、豹娃酶(onconase)、rapLRl、DNA酶1、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、绿脓杆菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。不同的实施方案可涉及稳定拴结结构和使用其用于诱导病变细胞凋亡的方法。进一步的详情可参见第20050079184号美国专利申请公布，其完整内容通过引用结合入本文。此类结构可包含对选自由以下组成的组的抗原具有结合亲和性的前体:CD2、CD3、CD8、CD10、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR,CEA、CSAp、CA-125、TAG-72,EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met, PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TNFRl、TNFR2、NGFR、Fas (CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更加特定的实施方案中，用来诱导凋亡的稳定拴结结构可包含单克隆抗体、Fab片段、嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体或片段。在优选的实施方案中，所述稳定拴结结构可包含下列组合:抗CD74X 抗 CD20、抗 CD74X 抗 CD22、抗 CD22X 抗 CD20、抗 CD20X 抗 HLA-DR、抗 CD19X 抗 CD20、抗CD20X 抗 CD80、抗 CD2X 抗 CD25、抗 CD8X 抗 CD25、抗 CD2X 抗 CD147、抗 CEACAM5X 抗 CD3、抗CEACAM6X 抗 CD3、抗 EGFR X 抗 CD3、抗 HER2/neu X 抗 CD3、抗 CD20X 抗 CD3、抗 CD74X 抗 CD3和抗CD22X抗CD3。在其他优选实施方案中，所述稳定拴结结构可以是单特异性或多特异性抗⑶20、抗⑶22、抗HLA-DR和/或抗⑶74。技术人员应了解:多价的稳定拴结结构可包含多个抗原结合部分，例如，所述抗原结合部分与CD20或CD22抗原的不同表位结合；或者任选地可包含均结合相同的表位的单个抗原结合部分的多个拷贝。在更优选的实施方案中，所述嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或者抗体片段可衍生自LL2 (抗CD22)、LL1 (抗CD74)、L243 (抗 HLA-D R)和 A20 (抗 CD20)的可变区。一方面，本发明公开了一种六聚稳定拴结结构，其包含与两个AD2 (SEQ ID NO:4)部分连接的IgG抗体和四个相同或不同IgG的抗体片段，其中每个片段均与DDD2 (SEQ IDNO:2)部分连接；所述AD2部分与所述DDD2部分结合。在一些实施方案中，所述AD2部分可通过二硫键与所述DDD2部分共价连接。在一些实施方案中，所述结构可包含6个Fab片段和I个Fe片段。在一些实施方案中，每个所述Fab片段都可与相同的抗原表位结合。在一些实施方案中，2个所述Fab片段可与第一抗原表位结合，且4个所述Fab片段可与第二抗原表位结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段可为人、人源化或嵌合的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述Fab片段可选自由hMN-14、L19、hA20、hLL2、hL243、hCC49、7E3、hLLl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、抗 CD14、抗 CD111、阿达木单抗、英利昔单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗和hMN-15的Fab片段组成的组。在一些实施方案中，所述IgG抗体和/或抗体片段可与选自由以下组成的组的抗原结合:碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba733、BrE3抗原、CA125、CD1、CDla, CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原 p(CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP_1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-1、Flt_3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、缺氧诱导因子(HIF-1)、la、IL-2、IL-6, IL-8、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4抗原、KS-1 抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE, MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL 受体、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物或致癌基因产物。在一些实施方案中，所述结构还可包含通过共价或非共价连接与所述结构轭合的一个或多个效应物或载体。在进一步的实施方案中，所述效应物可为诊断剂、治疗剂、化疗剂、放射性同位素、显像剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、激素、可光检测的标记、染料、肽、毒素、造影剂、顺磁标记、超声标记、促凋亡剂、脂质体、纳米粒子或其组合。在一些实施方案中，所述IgG抗体和抗体片段具有对靶分子、复合物、聚集体、细胞、抗原或组织的结合亲和力。在一些实施方案中,所述IgG抗体具有对祀分子、复合物、聚集体、细胞、抗原或组织的结合亲和力，并且至少一个抗体片段具有半抗原的结合位点。在进一步的实施方案中，所述IgG抗体具有对以下物质的结合亲和力:细胞表面受体、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素、尿激酶、CA19-9、CEA、CEACAM6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-B 纤连蛋白、EGFR、GD2、G250 抗原、HER2/neu、hTR、II类 HLA、HMW/MAA、HN/NDV、IGF1R、IL_2R/Tac、IL-17、MUC1、PSMA、M13外壳蛋白、6卩1113/111&、0)7436 -1、0)25广^(3、1^、间皮素3吐-8241^-83』 〇八皿、6 240、GPIIb/IIIa、p97、CD3、IL-4R、IL-4, IL-13、VEGFR-2、CD14、CDl 11/ 连接素-1、叶酸受体 α、gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-U β -胰蛋白酶、CD105/ 内皮糖蛋白、TNF a、RSVF 蛋白、CEA 的 AlBl、CEA 的 N 结构域、PfMSP-1、TAG-72、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR 或 VEGRF3/Flt_4。在更进一步的实施方案中，其中至少一个抗体片段具有对IL-17、组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)、铟-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt_4、⑶3、⑶16、⑶64、⑶89、⑶2、腺病毒纤突结、M13外壳蛋白、GpIIb/IIIa、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素或尿激酶的结合亲和力。在其他进一步的实施方案中，所述IgG抗体具有对选自由CEA、ED-B纤连蛋白、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGFlR、VEFGRl/Flt-l、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、HER2/neu、CD30、CD33、PfMSP-1、HN/NDV、EpCAM/17-lA、hTR、IL_2R/Tac、CA19-9、MUC1、II 类 HLA、Gd2, G250、TAG-72、PSMA、CEACAM6、HMWMAA, CD40、M13 外壳蛋白和 GPIIb/IIIa 组成的组的细胞表面抗原的结合亲和力，并且其中至少一个抗体片段具有对选自由组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)和铟-DTPA 组成的组的半抗原或者选自由 CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2和腺病毒纤突结组成的组的细胞表面抗原
的结合亲和力。在一些实施方案中，所述IgG抗体具有对选自由M13外壳蛋白和GpIIb/IIIa组成的组的细胞表面抗原或者选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶组成的组的生物分子的结合亲和力，并且其中至少一个抗体片段具有对选自由M13外壳蛋白和GpIIb/IIIa组成的组的细胞表面抗原或者选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β_半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶组成的组的生物分子的结合亲和力。在一些实施方案中，所述IgG抗体和所述抗体片段可与相同抗原结合，所述抗原选自由 CD14、CDlll/ 连接素-1、叶酸受体 α、gpl20、IL-6, IL-5, IL_8、CD154、IgE、LFA_l、β-胰蛋白酶、CD105/内皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、TNFa、RSV F蛋白、CEA的AlBl和CEA的N结构域组成的组。在其他的实施方案中，所述IgG抗体和所述抗体片段可与下述抗原组合结合:CD20/CD22 ;CD20/CD74 ;CD20/HLA_DR ;CD22/CD74 ;CD22/HLA_DR ;CD74/HLA_DR ；CD74/CEA或 HLA-DR/CEA。另一方面，本发明公开了一种方法，其包括:a)获得本发明的六聚稳定拴结结构；和b)将该结构施用至患有疾病或病症的受治疗者；其中所述结构对所述疾病或病症具有治疗效果。在一些实施方案中， 所述疾病或病症可为癌症或自身免疫疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症可为癌症，并且所述IgG抗体和/或至少一个所述抗体片段具有对选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原的结合亲和力:碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33 抗体特异性抗原、Ba733、BrE3 抗原、CA125、CDl、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD 138、结肠特异性抗原 P (CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-U Flt-3,叶酸受体、G250抗原、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、缺氧诱导因子(HIF-1)、la、IL-2、IL-6, IL-8、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4 抗原、KS-1 抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物和致癌基因产物。在一些实施方案中，所述方法还可包括将一种或多种抗癌治疗与所述稳定拴结结构联合施用。在一些实施方案中,所述治疗可包括施用化疗剂、细胞因子、放射治疗、免疫治疗、放射免疫治疗、局部过热、激光照射、抗血管生成剂或手术切除。在一些实施方案中，至少一个所述抗体片段具有对半抗原的结合亲和力。在一些实施方案中，所述方法还可包括将所述半抗原施用至所述受治疗者。在进一步的实施方案中，所述半抗原可连接至选自由抗血管生成剂、化疗剂、细胞因子、药物、前体药物、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、激素、结合分子、脂质、聚合物、胶束、脂质体、纳米粒子或其组合所组成的组的试剂。在一些实施方案中，所述疾病或病症可由真菌、病毒、细菌或寄生虫引起。在一些实施方案中，所述疾病或病症可为自身免疫疾病。在一些实施方案中，所述结构可包含选自由以下组成的组的IgG抗体和抗体片段的组合:抗 CD74X 抗 CD20、抗 CD74X 抗 CD22、抗 CD22X 抗 CD20、抗 CD20X 抗 HLA-DR、抗 CD19X抗 CD20、抗 CD20X 抗 CD80、抗 CD2X 抗 CD25、抗 CD8X 抗 CD25、抗 CD2X 抗 CD147、抗 CEACAM5X抗 CD3、抗 CEACAM6X 抗 CD3、抗 EGFR X 抗 CD3、抗 HER2/neu X 抗 CD3、抗 CD20X 抗 CD3、抗⑶74X抗⑶3和抗⑶22X抗⑶3。在一些实施方案中，所述疾病或病症可为神经退行性疾病、阿尔茨海默病、代谢性疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化或器官移植排斥反应。在一些实施方案中，所述癌症可选自由上皮癌、间充质癌、血液系统肿瘤、神经肿瘤、恶瘤、黑色素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤和骨髓瘤组成的组。另一方面，本发明公开了一种诊断疾病或病症的方法，其包括:a)获得本发明的稳定拴结结构，其中所述IgG抗体与和所述病症相关的靶分子、复合物、聚集体、细胞、抗原或组织结合，并且至少一个抗体片段与诊断性半抗原结合；

b)将所述结构施用至疑似患有疾病或病症的受治疗者；c)向同一受治疗者施用与所述至少一个抗体片段结合的诊断性半抗原；和d)检测与所述稳定拴结结构结合的所述半抗原的存在；而所述半抗原至所述病症相关的组织的定位确诊所述受治疗者中所述疾病或病症的存在。在一些实施方案中，所述半抗原可与诊断性放射性核素、磁共振成像(MRI)造影齐U、超声成像增强剂、PET显像剂、荧光剂或发光剂轭合。


图1显示两个DDD示例性序列。DDDl (SEQ ID NO:1)中标有下划线的序列对应于人PKA的RII α中发现的前44个氨基末端残基。DDD2 (SEQ ID NO:2)的两个N-末端氨基酸残基与DDDl的不同。图2显示两个AD示例性序列。ADl (SEQ ID NO:3)标有下划线的序列对应于优化的RII选择肽AKAP-1s，其Kd报道为0.4ηΜ。同时还显示了 AD2 (SEQ ID NO:4)。图3显示N-DDD2-Fab-hMN_14的示意图(A)，以及通过DDD2介导的二聚化作用形成的假定的a2结构(B)。图4显示N-DDD2-VH-hMN-14_pdHL2质粒表达载体的设计。图5显示C-DDD2-Fab-hMN_14的示意图(A)，以及通过DDD2介导的二聚化作用形成的假定的a2结构(B)。图6显示C-DDD2-VH-hMN-14_pdHL2质粒表达载体的设计。图7显示下列结构的图式表征:(A)在还原条件下混合N-DDD2-Fab_hMN-14和h679-Fab-AD2而形成的非共价a2b复合体；(B)通过二硫桥形成的共价TFl结构。图8显示TF2的示意图。
图9为C-H-AD2_IgG的简图。(A)重链-AD2和轻链的cDNA/多肽序列排列。(B)C-H-AD2-1gG的图式表征。图10为C-H-AD2_IgG和Fab_DDD2模块结合得到的单特异性HIDS (基于IgG的六价DNL结构)的图式表征。图11为C-H-AD2_IgG和Fab_DDD2模块结合得到的双特异性HIDS的图式表征。图12为N-K-AD2-1gG的简图。(A)重链和AD2-轻链的cDNA/多肽序列排列。(B)N-K-AD2-1gG的图式表征。图13为N-K-AD2_IgG和Fab_DDD2模块结合得到的双特异性HIDS的图式表征。图14显示下列载体的简图:(A)Fc-AD2-pdHL2穿梭载体，(B) IgG_pdHL2哺乳动物表达载体和(C)C-H-AD2-1gG-pdHL2哺乳动物表达载体。图15显示经蛋白A纯化的C-H-AD2-hLL2-1gG的SE-HPLC分析。指出了代表单体和二聚体形式的峰。图16显示经蛋白A纯化的C-H-AD2-hLL2-1gG在还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析。指出了还原泳道中代表重链-AD2、重链和K轻链的条带。指出了非还原泳道中代表C-H-AD2-hLL2-1gG和所述共价二聚体的条带。指出了分子量标志物的位置。图17显示经蛋白A纯化的N-K-AD2-hLL2-1gG的SE-HPLC分析。(A)箭头指出了代表单体、二聚体和三聚体形式的峰。(B)谷胱甘肽还原之后的分析显示二聚体和三聚体形式转化为单体形式。图18显示N-K-AD2-hLL2-1gG的二聚体(A)和三聚体(B)形式的假定结构的简图，它们通过温和还原转化为单体形式(C)。图19显示经蛋白A纯化的Hex_hA20的SE-HPLC分析。图20显示六种基于C-H-AD2-hLL2-1gG的HIDS的SDS-PAGE分析。(A)非还原条件下的SDS-PAGE。(B)还原条件下的SDS-PAGE。箭头指出了代表重链-AD2、Fd_DDD2和κ轻链的条带。指出了分子量标志物的位置。图21显示经蛋白A纯化的Hex_hLL2的SE-HPLC分析。图22 显示(A)DNLl 和(B)DNLlC 的 SE-HPLC 分析。图23 显示 DNL2 的 SE-HPLC 分析。图24显示DNL3和K-Hex_hA20在还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析。代表重链、AD2-K链、Fd-DDD2和κ轻链的条带显示在还原泳道中。代表DNL3和K-Hex_hA20的条带显示在非还原泳道中。指出了分子量标志物的位置。图25 显示 DNL3 的 SE-HPLC 分析。图26显示两个竞争ELISA实验的结果，比较了 DNLl、DNL2Hex_hA20和Hex_hLL2与亲本IgG对hA20/hLL2的相对结合亲和力。用5 μ g/ml的hA20或hLL2IgG涂布微滴定板。HIDS的稀释系列与特异性针对hA20或hLL2IgG的抗Id (保持2nM的恒定浓度)混合。使用过氧化物酶轭合的山羊抗大鼠IgG和OPD底物溶液检测抗Id与涂布孔之间的结合水平。结果用％抑制(与涂布孔结合的抗Id)和HIDS浓度图表示。使用Prism软件获得EC50(造成50%抑制的有效浓度)值。HIDS用于竞争结合(A)hA20涂布孔中的WI2(hA20大鼠抗Id)或(B)hLL2涂布孔中的WN(hLL2大鼠抗Id)。图27显示两个 竞争ELISA实验的结果，比较了 DNL2和DNL3对hA20/hLL2的相对结合亲和力。实验如图26所描述的进行。使用DNL2、DNL3和亲本IgG竞争结合(A)hA20涂布孔中的WI2(hA20大鼠抗Id)或(B)hLL2涂布孔中的WN(hLL2大鼠抗Id)。图28显不用DNLl、DNL2、Hex_hA20或利妥昔单抗(rituximab)处理Daudi淋巴瘤细胞后的细胞计数分析结果。向组织培养瓶中接种IxlO5个Daudi细胞/ml,于补充了不同浓度HIDS或利妥昔单抗中的一种的RPMI1640培养基中。每天使用Guava PCA对活细胞进行计数。(A) IOnM浓度处理后的生长曲线比较。(B)选定浓度下的生长曲线比较。图29显示用不同HIDS处理Daudi细胞的剂量响应实验结果。用细胞涂布96孔板(5，000个细胞/孔，于RPMI1640培养基中)。采用五倍系列稀释，将浓度从2xl0_8降到
6.4xl(T12M，三个重复。将平板孵育四天后，向其中加入MTS试剂，然后继续孵育另外四小时，然后在490nm下对平板进行读数。结果表示为未处理孔OD49tl的百分比与HIDS摩尔浓度的log值。测量每个剂量响应曲线的EC4tl(造成40%生长抑制的有效浓度)值。图30显示使用DNL2或Hex_hA20处理带有人伯基特淋巴瘤(Daudi)小鼠的体内治疗实验的结果。小鼠(4只/组)静脉内(1.V.)接种1.5xl07个Daudi细胞(第O天)。在第1、4和7天，对小鼠腹膜内(1.p.)施用4yg或20yg的DNL2或Hex-hA20。如果小鼠出现后肢瘫痪或者体重下降>20%即予以处死。结果用％存活和时间(天)图表示。显示了中位存活期和长期存活者。图31显示用双特异性HID(DNL2-四个hLL2Fab片段拴结至hA20IgG)和单特异性HID (Hex-hA20)处理Daudi细胞、Raji细胞和Ramos细胞，通过MTS细胞增殖分析得到的相对剂量响应曲线(与hA20IgG对照进行比较)。在Daudi细胞(上图)中，与hA20IgG相t匕，DNL2显示出> 100倍，Hex-hA20显示出> 10，000倍的有效抗细胞增殖活性。在Raji细胞(中图)中，与hA20IgG相比，Hex-hA20显示出有效的抗细胞增殖活性，而DNL2仅显示极小活性。在Ramos细胞( 底图)中，与hA20IgG相比，DNL和Hex_hA20均显示出有效的抗细胞增殖活性。图32显示交联对hA20IgG、DNL2和Hex_hA20抗细胞增殖活性的影响。如图中所示，交联加强了 hA20IgG的抗细胞增殖活性，但对DNL2或HeX-hA20的活性则无增强作用。图33显示DNLl和DNL2在人血清中的稳定性，采用双特异性ELISA分析确定。10 μ g/ml的所述蛋白结构与新鲜采集的人血清在37°C和5% CO2条件下孵育五天。对于第O天的样品，等分试样在用血清稀释后立即用液氮冷冻。用hA20IgG的抗Id涂布ELISA平板，然后用hLL2IgG的抗Id检测双特异性结合。DNLl和DNL2均显示了高度的血清稳定性，并保持了完全的双特异结合活性。图 34 显示 DNLl、DNL2、Hex-hA20、hLL2、hA20-1gG 和 hA20_IgG_AD2 的补体依赖性细胞毒作用(OTC)或其缺失。令人惊奇的是，虽然hA20IgG和hA20-1gG-AD2在体外实验中表现出对Daudi细胞的有效CDC活性，但是所有六价DNL结构均未在此分析中表现出CDC活性。DNL2和Hex-ha20均包含显示出与hA20IgG相似的CDC活性的hA20_IgG_AD2。图35比较了 DNL1、hA20IgG、利妥昔单抗和hLL2IgG的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，分析采用新鲜分离的外周血单核细胞。利妥昔单抗和hA20IgG均表现出有效的ADCC活性，而DNLl则未表现出任何可检测的ADCC。
具体实施方式
本申请引用的所有文档，或者其部分内容，包括但不限于专利、专利申请、论文、专著和论著，均明确地通过弓I用整体结合入本文。在某些实施方案中，提供了 a2b形式的新的稳定拴结结构以及制备这些复合体的方法。一般而言，该二元复合体由非共价连接的同型二聚体结构(称为A*a2)组成，该同型二聚体结构与另一结构(称为B或b)进行位点特异性缔合。得到的a2b结构可通过A和B之间的非共价或者优选地共价(例如，二硫键)相互作用进行稳定。A由两个相同的亚基形成，其中每个亚基由连接至肽序列(称为二聚化和停靠结构域，DDD)的前体组成；在优选实施方案中，所述肽序列衍生自cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)。所述亚基中包含的DDD结构域自发缔合形成稳定的同型二聚体，而此缔合又进一步生成另一肽序列(称为锚定结构域，AD)的高亲和结合位点，AD发现于例如各种A-激酶锚定蛋白(AKAP)，并包含在B中。因此，B由连接至AD的前体组成。所述二元复合体的组装通过AD肽与(DDD)2结合位点的相互作用很容易发生。DDD肽可插入基本上任何多肽序列或拴结至任何前体，条件是这种衍生不干扰其二聚化和与AD肽结合的能力。相似地，AD肽可插入基本上任何多肽序列或拴结至任何前体，条件是这种衍生不干扰其与同型二聚体DDD结合位点的结合。这种模块化方法具有高度的通用性，可用于组合基本上任何A和任何B，以形成包含衍生自A的前体的两个亚基(a2)和衍生自B的前体的一个亚基(b)的二元装配体。如果A和B的前体均包含能够与另一抗体结构域缔合而产生抗原结合位点的抗体结构域(例如，Fab或scFv)，得到的a2b复合体是双特异性且三价的。例如，在一些实施方案中，所述二元复合体可通过化学轭合连接至效应物(如配体或药物)，连接至载体(如葡聚糖或纳米粒子)，或同时连接至效应物和载体，以实现此类修饰允许的其他应用。在优选实施方案中，此主题的变化可用于制备为同型六聚体或异型六聚体的六聚复合体。由于二元复合体的稳定性主要依赖于A中包含的DDD对B中包含的AD的结合亲和力，且使用平衡尺寸排阻HPLC分析估测由C 末端融合ADl的构建体(h679-Fab-ADl，参见实施例 3)与 C-或 N-末端融合 DDDl 的构建体(C-DDDl-Fab-hMN-14 或 N-DDD1-Fab_hMN_14，均请参见实施例4)形成的两种原型a2b结构(参见实施例5)的此亲和力不大于8nM,因此共价连接a2b复合体中包含的A和B将会防止各亚基间出现不希望的解离，进而有助于在体内应用。为了稳定该二元复合体，可在DDD和AD序列的关键位置同时引入半胱氨酸残基，以使DDD和AD之间形成二硫键连接。还可应用其他方法或策略来实现经由a2和b交联形成稳定的复合体。例如，使用戊二醛或PICUP方法，组成亚基彼此之间可以较低效率的低特异性方式共价连接。也可使用其他已知的共价交联方法。定义本文使用的“一个”或“一种”可指一个(种)或多于一个(种)的项目。如此处所用，术语“和”和“或”可用于表示合取或析取。即，除非另外指明，二者均应理解为等同于“和/或”。“二聚化和停靠结构域(DDD) ”指允许包含DDD序列的两个同型单体自发形成二聚体的肽序列。所得同型二聚体在DDD序列内包含锚定结构域的停靠位点。虽然示例性DDD序列可从cAMP依赖性蛋白激酶获得，但是也可使用其他已知的DDD序列。“锚定结构域(AD) ”是对二聚化DDD序列具有结合亲和力的肽序列。虽然示例性AD序列可衍生自任何A-激酶锚定蛋白(AKAP)，但是也可使用其他已知的AD序列。术语“前体”使用其普通含义，即可从其形成更加稳定、确定或终产物的物质。如此处所用，“结合分子”、“结合部分”或“靶向分子”是任何可以特异结合靶分子、细胞、复合体和/或组织的分子。结合分子可包括但不限于抗体或其片段、类似物或模拟物、avimer、适体或祀向肽。如此处所述，“抗体”指全长(即天然存在的或者通过正常的免疫球蛋白基因片段重组技术形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)，或者具有免疫活性(即特异性结合)的免疫球蛋白分子的部分或类似物，像抗体片段。“抗体片段”是抗体的一部分,如F(ab)2、F(ab' )2、Fab、Fv、sFv等。无论结构如何，抗体片段与完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括通过结合特异抗原以形成复合体来发挥抗体类似作用的任何合成或基因工程蛋白。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段，轻链和重链可变区通过肽连接体连接形成的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)和由氨基酸残基组成的模仿高变区的最小识别单位(CDR)。“效应物”是产生选定结果的原子、分子或化合物。效应物可包括治疗剂和/或诊断剂。“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(SiRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。其他示例性的治疗剂和使用方法参见第20050002945,20040018557,20030148409 和 20050014207 号美国专利公布，其均通过引用结合入本文。“诊断剂”是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如与生物素-链霉亲和素复合体一起)、造影剂、荧光化合物或分子和磁共振成像(MRI)的增强剂(如顺磁离子`)。“免疫轭合物”是结合分子(如抗体组分)与原子、分子或更高级结构(如载体、治疗剂或诊断剂)的轭合物。“裸抗体”是未与任何其他试剂轭合的抗体。“载体”是能够与治疗剂或诊断剂缔合以利于此试剂向靶细胞的递送的原子、分子或更高级结构。载体可包括脂质(如能够形成更高级结构的两亲性脂质)、多糖(如葡聚糖)或其他更高级结构(如胶束、脂质体或纳米粒子)。如此处所用，术语“抗体融合蛋白”是重组制备的抗原结合分子，其中连接了具有相同或不同特异性的两个或多个相同或不同的scFv或抗体片段。该融合蛋白的价位指示其对单个抗原或表位具有多少结合臂或位点；即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价位意味着它在与抗原结合时可以利用多个相互作用，因而增强与抗原结合的亲和力。特异性表示抗体融合蛋白能与多少种抗原或表位结合；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。根据这些定义，天然抗体如IgG为双价的，因为它有两个结合臂，但是它是单特异性的，因为它结合一个表位。单特异性、多价融合蛋白具有多于一个的表位结合位点，但是只与一个此类表位结合，例如具有与同一抗原反应的两个结合位点的双链抗体。该融合蛋白可包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合，或者同一抗体组分的多个拷贝。该融合蛋白还可含抗体或抗体片段和治疗剂。适合用于此类融合蛋白的治疗剂实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一个优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选为重组RNA酶。如果抗体或者免疫轭合物制品，或者本文所述的组合物的施用量是生理学上显著的，即被称为施以“治疗有效量”。如果试剂的存在引起受体哺乳动物生理发生可检测的变化，即被视为生理学上显著的。在特定实施方案中，如果抗体制品的存在引起了抗肿瘤反应或者减轻了自身免疫疾病状态的征兆或者症状，即被视为生理学上显著的。生理学上显著的效应还可以是引发了受体哺乳动物的体液和/或细胞免疫反应，导致靶细胞生长受到抑制或者死亡。“治疗有效量”并不限于对受治疗者产生最优选效应的试剂量，而可以指对受治疗者、细胞、组织或器官产生所述试剂的任何可能已知的效应的量。制备模块化亚基的稳定拴结装配体的方法 本发明公开的方法和组合物提供了制备由模块化亚基组成的稳定拴结装配体的平台技术。一个实施方案涉及由优选分别制备的两种确定组分A和B形成的稳定拴结的二元复合体。但是，在替代实施方案中，A和B可以一起制备，例如，通过使用既编码A又编码B的载体，或者使用分别编码A和B的两个不同载体转染单个细胞系。当A和B 二者均为Fab片段时，优选为分别制备，否则共同制备时会因轻链乱序而导致异质产物。在某些实施方案中，由两个相同亚基(a2)组成的A与由一个亚基(b)组成的B结合，形成a2b结构的装配体。A和B的缔合是位点特异并且自发的缔合，原因在于分别构建入A和B的DDD和AD序列之间强烈的结合作用。A和B均可以为任何实体，且DDD连接的A的前体可以与AD连接的B的前体不同或者相同。在后一种情况下，所得a2b复合体(称为a3)由三个亚基组成，每个亚基均包含相同的前体但是均同时连接至DDD和AD。本申请要求保护的方法和组合物的模块化本质允许任何A和任何B的组合。只要不干扰DDD的二聚化或者DDD与AD的结合，A和B所连接或包含的前体类型基本上没有限制。当通过重组工程方法构·建时，A和B可以独立在不同的宿主细胞中生成、被纯化和存储(或者替代地，按上述方法在相同宿主细胞中生成)。但是，在组装之前对A和B进行纯化并不是完全必需的。含有A和B的细胞提取物或培养物可以在适当条件下直接进行混合，以实现二元复合体的形成，然后通过氧化后的二硫键来稳定该复合体，之后再对该复合体进行纯化。在某些应用中，在纯化之后且在与A结合之前，B可能需要与效应物或载体轭合。或者，在纯化之后且在与B结合之前，A可能需要与效应物或载体轭合。还有可能是在结合之前，A和B均需要用效应物或载体进行修饰。此外，在某些应用中，a.b复合体可能需要轭合效应物或载体。当A和B在同一宿主细胞中制备时，它们可自发组装为a2b复合体。优选的实施方案利用cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)调节亚基和A-激酶锚定蛋白(AKAP)锚定结构域之间自然发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用。PKA首次报道于1968年(请参见Walsh等，J.Biol.Chem.243:3763-65 (1968))。全酶结构在20世纪70年代中期得到阐明，其由两个催化亚基组成，催化亚基被调节(R)亚基二聚体置于失活状态(请参见 Corbin 等，J.Biol.Chem.248:1813-21 (1973))。发现 R 亚基有两种类型(RI 和 RII)，每种类型均有α和β亚型。R亚基只能通过分离得到稳定的二聚体，且表明二聚化结构域由前44个氨基末端残基组成(请参见Hausken等，J.Biol.Chem.271:29016-22 (1996))。PKA是广谱丝氨酸/苏氨酸激酶，其信号转导特异性是通过全酶的区隔化实现的，而全酶的区隔化则是借助于称为A-激酶锚定蛋白(AKAP)的停靠蛋白(Scott等，J.Biol.Chem.265:21561-66(1990))ο第一个AKAP,即微管相关蛋白-2,是在1984年鉴定的(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.81:6723-27(1984))。截至目前为止，已在从酵母到人类等诸多物种中鉴定了 50 多种结构各异的 AKAP (请参见 Wong 等，Nat Rev Mol Cell Biol.12:959-70 (2004))。AKAP的PKA锚定结构域为14-18个残基的两亲螺旋(请参见Carr等，J.Biol.Chem.266:14188-92(1991))。AKAP的PKA锚定结构域的氨基酸序列相当多样化，并且其对RII 二聚体的结合亲和力为2-90nM，而对RI 二聚体的结合亲和力约小100倍(请参见Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.100:4445-50 (2003))。该锚定结构域与RII 二聚体上由RII氨基末端的前23个残基形成的疏水表面结合(Colledge等，Trends Cell Biol.6:216-21 (1999))。因此，RII 二聚化结构域和AKAP结合结构域均位于相同的44氨基酸序列内。此外，AKAP仅与RII 二聚体而非单体结合。图7显示了此相互作用的结构模型。通过DDD和AD序列之间的相互作用形成的非共价复合体可被共价稳定以实现体内应用。这可通过在DDD和AD两个序列的关键位置(如DDD2和AD2中所示)引入半胱氨酸残基，以利于形成二硫键来实现。替代地，可使用其他已知类型的共价交联方法。当采用重组工程方法制备时，二元复合体的两个组分(A和B)可在同一宿主细胞中合成，或者更优选地，在两个单独的宿主细胞系中合成。引导A的合成的表达载体将包含目标多肽⑷的DNA序列，该序列与编码PKA R-亚基的DDD (如DDDl或DDD2)的序列融合，DDD可由RI α、RI β、RII α、RH β或者任何天然或者合成的功能类似物的前30个或更多氨基酸组成。DDD可偶联至A的氨基末端或羧基末端，直接轭合或者优选使用包含适当长度和组成的氨基酸残基的间隔区。替代地，DDD可位于融合蛋白的内部，条件是DDD的结合活性和该多肽融合配偶体所需的活性不受影响。一旦合成以后，A/DDD融合蛋白将与DDDl全部形成稳定的同型二聚体，或者与DDD2大部分形成稳定的同型四聚体。形成稳定同型六聚体或异型六聚体的方法请参见下文的实施例。引导B合成的另一表达盒可位于引导A合成的同一载体中或者优选地位于独立载体中，该表达盒将包含与编码锚定结构域(AD)(如ADl或AD2)的序列融合的目标多肽(B)的DNA序列，所述锚定结构域可衍生自US2003/0232420A1 (其通过引用结合入本文)公开的任何AKAP蛋白或者其天然或合成类似物。AD可偶联至B的氨基末端或羧基末端，直接偶联或者优选使用包含适当长度或组成的氨基酸残基的间隔区。在二硫化物还原剂存在下将B/AD2融合蛋白(b)和A/DDD2融合蛋白(主要是a4)混合，形成由a2b组成的二元复合体，然后可通过加入合适的氧化剂(如二甲基亚砜，DMS0)，以利于形成二硫键，进而对该复合体进行稳定。这些亚基的模块化本质允许任何DDD2-多肽二聚体和任何AD2-多肽的组合。多种模块化亚基的贮存物可以作为纯化产物或未纯化的细胞培养物上清液单独保存，然后在需要时合并以得到各种a2b结构。在另一实施方案中，A或B在纯化后可利用适当的轭合化学而偶联效应物(如药物或螯合剂)或者载体(如葡聚糖或纳米粒子)。替代地，此类修饰也可在该结构形成并纯化以后进行，或者在混合之前对A和B进行。衍生自重组抗体结合结构域的模块化亚基的稳定拴结装配体
本发明公开的方法和组合物可用于提供基于重组抗体的、可以为单特异性或双特异性的多价结合结构。例如，DDD2序列可与单链Fv融合以获得单特异性结合结构。更为普遍的，DDD序列可与抗体可变区融合，该可变区可与互补抗体可变区缔合以形成抗原结合位点。例如，DDDl或DDD2序列可融合至包含Vh结构域和CHl结构域(Fd/DDD)的抗体序列，或者替代地，融合至\结构域和CL结构域(L/DDD)。然后，Fd/DDD或L/DDD可分别与互补的L或Fd缔合以形成Fab/DDD，以及进一步形成Fab/DDDl 二聚体或Fab/DDD2四聚体/ 二聚体。相似地，AD序列(如AD2)可融合至单链Fv，或者更为普遍地，融合至包含Vh结构域和CHl结构域的抗体序列(Fd/AD2)，该抗体序列与同源L链配对时形成Fab/AD2。替代地，AD序列(如AD2)可融合至包含\结构域和CL结构域的抗体序列，该抗体序列与同源Fd链配对时形成Fab/AD2。将Fab/DDD2的四聚体/ 二聚体与Fab/AD2混合，然后进行还原和氧化，即得到可以是单特异性或双特异性的三价结合结构的稳定拴结装配体。所述结合结构的Vh和\区可衍生自“人源化”单克隆抗体或人抗体。替代地，Vh和/或'区可包含衍生自从重组免疫球蛋白文库分离的人抗体片段的序列。例如，请参见Barbas 等，METHODS:A companion to Methods in Enzymology (方法:酶学方法指南)2:119(1991)和 Winter 等，Ann.Rev.1mmunol.12:433 (1994)。例如，可从 STRATAGENE CloningSystems (La Jolla, Calif.)获得用于制备人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体。人抗体Vh或'序列可衍生自从小鼠中制备的人单克隆抗体。此类抗体获自经过“改造”以在响应抗原刺激时产生特异人抗体的转基因小鼠。在此技术中，人重链和轻链基因座元件被引入含有被靶向破坏的内源重链和轻链基因座的胚胎干细胞系衍生而来的小鼠种系。这种转基因小鼠可合成对人抗原特异的人抗体，并且所述小鼠可用于制备分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法请参见Green等，Nature Genet.7:13 (1994)，Lonberg 等，Nature368:856 (1994)和 Taylor 等，Int.Tmmun.6:579 (1994)。制备包含抗体片段的重组融合蛋白的一般方法

编码识别特定表位的抗体片段的核酸序列可通过本领域公知的技术获得。例如，分泌具有所需特异性的抗体的杂交瘤可用于获得编码抗体的DNA，所述DNA可使用已知技术制备，例如通过PCR或者传统的cDNA克隆技术。替代地，可构建Fabi表达文库或抗体噬菌体展示文库以筛选具有所需特异性的抗体片段。然后可以直接或者通过编码肽间隔区的序列，将编码所述抗体片段的核酸连接至编码DDD或AD的核酸。制备编码这些类型的融合蛋白的核酸序列的方法在本领域为公知，并将在实施例中进一步提供。在另一实施方案中，主要由Α/DDD或B/AD组成的模块化亚基的N-或C-末端可添加额外的氨基酸残基，其中准确的融合位点可能取决于DDD或AD是连接至N-末端还是C-末端(或者在内部位置)。所述额外的氨基酸残基可包含肽标签、信号肽、细胞因子、酶(例如前体药物激活酶)、激素、毒素、肽药物、膜相互作用肽或其他功能蛋白质。在希望的宿主细胞中制备重组蛋白的方法在本领域为公知。为了便于纯化，所述稳定拴结结构可包含合适的肽标签，如FLAG序列或多聚-HIS序列，以利于使用相应的亲和柱对它们进行纯化。适合表达所述稳定栓结结构的组成亚基的不例性表达系统为pdHL2载体,该载体具有可扩增的鼠dhfr基因，允许通过甲氨蝶呤处理进行选择和扩增。请参见Gillies等，J.1mmunol.Methods 125:191(1989)。pdHL2载体提供由两个金属硫蛋白启动子和IgH增强子单独控制的两个基因的独立表达。适合表达所述稳定拴结结构的组成亚基的宿主细胞或细胞系对本领域的技术人员为已知。使用人宿主细胞会使任何表达的分子能够用人糖基化模式进行修饰。但是，并没有迹象暗示本发明公开的方法必须或者优选使用人宿主细胞。作为示例，可通过电穿孔方法用编码所述稳定拴结结构的组成亚基的线性化pdHL2载体转染鼠骨髓瘤细胞系(如Sp2/0)。转染48小时后，可通过将细胞与含有0.05-0.1 μ M甲氨蝶呤的培养基孵育而开始选择。然后可通过将甲氨蝶呤浓度递增至5 μ M来扩增所选克隆。所述稳定拴结结构的轭合物上述稳定拴结结构还可轭合其他部分。例如，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒性蛋白、螯合剂、细胞因子和其他功能剂可轭合至所述稳定拴结结构的一个或多个亚基。例如，可通过共价连接轭合至侧链含有胺、羧基、巯基或羟基基团的氨基酸残基。有各种常规连接体可用于此用途，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、二(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛及类似物。试剂与所述稳定拴结结构的轭合优选不显著影响未修饰结构中包含的各个亚基的活性。可以分开对模块化亚基进行轭合，然后将亚基组装为稳定拴结构建体，或者替代地，也可使用完全形成的稳定拴结构建体或者该稳定拴结构建体形成过程中的任何中间体进行轭合。此外，可先将细胞毒性试剂或其他试剂偶联至多聚物载体，然后将该载体轭合至稳定拴结结构。有关此方法的详情，请参见 Ryser 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75:3867-3870,1978 ；U.S.4，699，784 和U.S.4，046, 722，其通过引用结合入本文。此处所述轭合物可通过本领域已知的各种方法制备。例如，稳定拴结结构可用mI进行放射性标记，然后与脂质轭合，以便所得轭合物可以形成脂质体。该脂质体可包括一个或多个治疗剂(如FUdR-dO等药物)或诊断剂。替代地，除了所述载体之外，稳定拴结结构可以轭合131K如在酪氨酸残基处)和药物(如在赖氨酸残基的ε氨基)，并且该载体可包括其他治疗剂或诊断剂。治疗剂和诊断剂可与所述稳定拴结结构的一个或多于一个的亚基共价缔合。脂质体和胶束的形成在本领域为已知。例如，请参见Wrobel和Collins，Biochimica et Biophysica Acta (1995)，1235:296-304 ;Lundberg 等，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51:1099-1105 ;Lundberg 等，Int.J.Pharm.(2000), 205:101-108 ；Lundberg, J.Pharm.Sc1.(1994) ,83:72-75 ；Xu 等，Molec.Cancer Ther.(2002) , I:337-346 ；Torchilin 等，Proc.Nat ' 1.Acad.Sc1.，U.S.A.(2003)，100:6039-6044 ；U.S.5，565，215 ；U.S.6，379，698 和 U.S.2003/0082154。由聚合物、二氧化硅或金属形成的可用于药物递送或成像的纳米粒子或纳米胶囊也已有报道。例如，请参见West等，Applications of Nanotechnology toBiotechnology (2000)，11:215-217 ；U.S.5，620，708 ；U.S.5，702，727 和 U.S.6，530，944。抗体或结合分子与脂 质体轭合形成治疗剂或诊断剂的靶向载体已有报道。例如，请参见 Bendas，Biodrugs(2001)，15:215-224 ；Xu 等，Mol.Cancer Ther(2002)，1:337-346 ；Torchilin 等，Proc.Nat ' I Acad.Sc1.U.S.A(2003)，100:6039-6044 ;Bally 等，J.Liposome Res.(1998) , 8:299-335 ；Lundberg, Int.J.Pharm.(1994),109:73-81 ；Lundberg, J.Pharm.Pharmacol.(1997),49: 16-21 ；Lundberg, Ant1-cancer DrugDesign (1998), 13 =453-461 另请参见 U.S.6，306，393 ;序号为 10/350, 096 的美国专利申请；序号为09/590，284的美国专利申请和1999年6月9日提交的序号为60/138，284的美国专利申请。所有这些参考文献均通过引用结合入本文。多种诊断剂和治疗剂可有利地用于形成所述稳定拴结结构的轭合物，或者可连接至与所述稳定拴结结构上的识别位点结合的半抗原。诊断剂可包括放射性同位素、用于MRI的增强剂或用于超声成像的造影剂和荧光化合物。许多合适的显像剂，以及它们与蛋白质或肽的连接方法在本领域为已知(例如，请参见美国专利5，021，236和4，472，509，其均通过引用结合入本文)。某些连接方法包括金属螯合络合物的使用，例如，使用连接至蛋白质或肽的有机螯合剂(如DTPA)络合物(美国专利4，472，509)。为了向稳定拴结结构加载放射性金属离子或顺磁离子，可能需要先让该结构与连接了多个拷贝的用于结合放射性金属离子或顺磁离子的螯合基团的载体反应。此载体可为多聚赖氨酸、多糖或者具有侧基的衍生多聚物或可衍生多聚物，所述侧基可结合已知可用于此用途的螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚厢(polyoximes)等。包含螯合剂的载体可通过使用标准的化学方法来以最小化聚集和免疫活性损失的方式偶联至所述稳定拴结结构。可用于制备此类轭合物的其他较为不常见的方法和试剂公开于U.S.4，824，659，其通过引用整体结合入本文。特别有用的金属-螯合剂组合包括2-苯甲基-DTPA及其单甲基类似物和环己基类似物，它们可与60-4，OOOkeV的总能量范围内的诊断性同位素配合使用。一些有用的诊断性核素可包括 18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94TC、94nTC、99mTc或mIn。当与本发明公开的稳定拴结结构和载体一起使用时，与非放射性金属(如锰、铁和钆)络合的相同螯合剂 可用于MRI。大环螯合剂，如N0TA、D0TA和TETA，可用于多种金属和射电金属，最特别的是分别用于镓、钇和铜放射性核素。通过根据目标金属调节环的大小，可使此类金属-螯合剂络合物非常稳定。可使用其他环类型的螯合剂，如用于络合223Ra的大环聚醚。例如，治疗剂包括化疗药物,如长春碱类、蒽环类、表叶毒素(epidophyllotoxin)、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是来自这些和其他抗癌剂类别的阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜树碱和其他物质及类似物。其他癌症化疗药物包括氮芥类、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、钼配合物、激素及类似物。合适的化疗剂请参见 REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿氏药物科学)，第 19 版(MackPublishing C0.1995)以及 GOODMAN AND GILMAN’ S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS(G00DMAN和GILMAN的治疗学的药理学基础)，第7版(MacMillan PublishingC0.1985)，以及这些出版物的修订版。其他合适的化疗剂(如实验药)对本领域技术人员为已知，并可用本领域所知的方法轭合至本文所述的稳定拴结结构。另一类治疗剂由发射α-粒子(如 212Pb、212B1、213B1、211At、223Ra、225Ac)、β_ 粒子(如 1311,142Pr,153Sm^161Tb,166Ho,166Dy,177Lu,186Re,18W89Re)或俄歇电子(如 niIn、1251、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)的放射性核素组成。所述稳定拴结结构可使用上述一个或多个放射性核素进行标记，方法同诊断剂所用方法。包含可检测标记(如荧光分子)或细胞毒剂(如放射性碘)的合适的肽可以共价、非共价或其他方式与所述稳定拴结结构缔合。例如，可通过将光敏剂或染料包括在稳定拴结结构上以获得可用于治疗的轭合物。荧光组合物(如荧光染料)和其他对可见光敏感的显色剂或染料(如卟啉)已经用于检测和治疗病变，方法是用合适的光照射病变部位。在治疗中，这被称为光辐射、光疗法或光动力疗法。请参见Jori等编，PH0T0DYNAMICTHERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (肿瘤和其他疾病的光动力疗法)(LibreriaProgettol985) ；van den Bergh, Chem.Britain (1986), 22:430。此外，还将单克隆抗体与光活化染料偶联以实现光疗法。请参见Mew等,J.1mmunol.(1983), 130:1473 ；idem., CancerRes.(1985) ,45:4380 ；0seroff 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1986) ,83:8744 ；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46:83 ；Hasan 等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288:471 ；Tatsuta 等，Lasers Surg.Med.(1989), 9:422 ;Pelegrin 等，Cancer (1991), 67:2529 还包括内窥镜或腹腔镜应用。内窥镜检测和治疗方法请参见U.S.4，932，412 ；U.S.5，525，338 ；U.S.5，716，595 ；U.S.5，736，119 ；U.S.5，922，302 ；U.S.6，096，289 ;和 U.S.6，387，350，其均通过引用整体结合入本文。在某些实施方案中，本文公开的新构建体和方法可用于靶向递送RNAi进行治疗性干预。递送介质(vehicle)可以是以融合至人精蛋白( 50个氨基酸残基的肽)的内化抗体结合结构域作为前体的稳定拴结结构。使用的a2构建体的实例为VH-CHl-hPl-DDDl//'-CL*VH-CHl-hP2-DDDl//\-CL，其中hPl和hP2分别为人精蛋白I和人精蛋白2; 二者均可在体内应用中形成稳定的DNA复合体(Nat Biotechnol.23:709-717,2005 ；GeneTherapy.13:194-195，2006)。使用的 a4 构建体的实例为 Vh-CH1-hP1-DDD2//Vl-CL 或VH-CHl-hP2-DDD2//\-CL，其可提供四个活性Fab片段，每个片段均携带人精蛋白以与RNAi结合。该多价复合体将有利于与靶细胞的结合以及受体介导的内化进入靶细胞的作用，其中非共价结合的RNAi在内体中解离并释放到细胞质中。因为不涉及氧化还原化学，所以hPl或hP2中存在的3个分子内二 硫键并不会产生问题。除了递送RNAi之外，这些构建体还可用于靶向递送治疗基因或DNA疫苗。此技术的另一应用领域是制备胞内抗体，胞内抗体是RNAi在功能方面的蛋白质类似物。治疗剂药物组合物在某些实施方案中，可向受治疗者(如有癌症的受治疗者)施用稳定拴结结构和/或一个或多个其他治疗剂。此类试剂可以药物组合物的形式施用。一般而言，这必须制备成基本不含对人或动物有害的杂质的组合物。本领域技术人员知道，药物组合物可通过各种途径施用至受治疗者，例如，所述途径包括口服或肠胃外(如静脉内)。在某些实施方案中，必须向受治疗者施用有效量的治疗剂。“有效量”是产生所需效应的试剂量。有效量将取决于，例如，该试剂的效力和预期的效果。例如，与癌症治疗中要减小或消灭实体肿瘤、或者阻止或减少其转移所需的量相比，治疗增生状况(如黄斑变性或子宫内膜异位症)可能需要较少量的抗血管生成剂。具体用途中特定试剂的有效量可使用本领域技术人员公知的方法来确定。
化疗剂在某些实施方案中，可施用化疗剂。有用的抗癌化疗剂包括但不限于:5_氟尿嘧啶、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡钼、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、雌激素受体结合剂、足叶乙甙(VP16)、法尼西基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、plicomycin,甲基节肼、雷洛昔芬、三苯氧胺、紫杉醇、替莫唑胺(temozolomide) (DTIC的水化形式)、反钼(transplatinum)、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱或前述化合物的任何类似物或衍生物。有用的抗传染性生物体的化疗剂包括但不限于，阿昔洛韦、阿苯达唑、金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明(bactrim)、Batrafenu (巴特芬)、联苯苄唑、羧苄青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑啉、头孢菌素、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、西多福韦、Ciprou (环丙沙星)、克拉霉素、克拉维酸、克霉唑、氯唑西林、强力霉素、益康唑、红环化素(erythrocycline)、红霉素、灭滴灵、氟康唑、氟胞嘧啶、膦甲酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑酮、美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奥司他韦、苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、戊烷脒、哌拉西林-他唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、磺胺甲噁唑、柳氮磺胺吡唆、四环素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧苄啶磺胺甲噁唑、万乃洛韦、万古霉素、扎那米韦(zanamir)和阿奇霉素。化疗剂和施用方法、剂量等对本领域技术人员为公知(例如，请参见“PhysiciansDesk Reference”(医师用药参考)、古德曼和吉尔曼的 “The Pharmacological Basis ofTherapeutics”(治疗学的药理学基础 )和“Remington, s Pharmaceutical Sciences”(雷明顿氏药物科学)，其相应部分通过引用结合入本文)。必须根据治疗的受治疗者的状况对剂量进行一些调整。在任何情况下，负责给药的人员都必须根据具体受治疗者确定合适的剂量。激素糖皮质激素可增加其他化疗剂的效力，因此它们经常用于联合治疗。糖皮质激素的实例如泼尼松和地塞米松。孕激素，如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮，已用于治疗子宫内膜癌和乳腺癌。雌激素，如二乙基己烯雌酚和炔雌醇，已用于治疗前列腺癌等癌症。抗雌激素，如三苯氧胺，已用于治疗乳腺癌等癌症。雄激素，如丙酸睾酮和氟羟甲睾酮也已用于治疗乳腺癌。血管生成抑制剂在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂，如制管张素、baculostatin、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PIGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Fit-1抗体和肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酸胺三唑(carboxiamidotriazole)、CMlOK Marimastat (马立马司他)、戊聚糖多硫酸盐、血管形成素-2、干扰素α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide (利诺胺)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制管张素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
免疫调节剂如此处所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素和造血因子，如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如，干扰素-α、-β和-Y)和命名为“SI因子”的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素Y、TNF_a及类似物。术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的、作为细胞间介导物而作用于另一细胞的蛋白质或肽的总称。如此处广泛所用，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。细胞因子包括:生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-a和-β ;苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO);神经生长因子，如NGF-β ;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ;胰岛素样生长因子-1和-1I ;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、_β和-Y ;集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)，如 IL-U IL-1 α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5, IL-6, IL-7、IL-8, IL-9、IL-10, IL-1U IL-12 ；IL-13、IL-14、IL-15、IL·-16、IL-17,11-18、11-21、HF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit 配体或FIT-3、制管张素、血小板反应素、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。如此处所用，术语细胞因子包括自然来源或者重组细胞培养物来源的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等同物。趋化因子一般充当化学引诱物，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达位点。趋化因子包括但不限于，RANTES、MCAF、MIPl-a、ΜΙΡ1_β和IP-10。熟练的技术人员了解，某些细胞因子已知同样具有化学引诱效应，并可归于术语趋化因子下。相似地，术语免疫调节剂和细胞因子各自的成员也有重叠。放射性同位素治疗和放射免疫治疗在某些实施方案中，所述肽和/或蛋白质可用于放射性核素治疗或放射免疫治疗方法(例如，请参见 Govindan 等，2005, Technology in Cancer Research&Treatment,4:375-91 ；Sharkey 和 Goldenberg,2005，J.Nucl.Med.46: 115S-127S ;Goldenberg等(J Clin 0ncol2006 ;24:823-834), “Antibody Pre-targeting Advances CancerRadioimmunodetect ion and Radio immunotherapy, (抗体预祀向改善了癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗)，其均通过引用结合入本文)。在特定实施方案中，稳定拴结结构可直接用放射性同位素进行标记并施用至受治疗者。在替代实施方案中，一种或多种放射性同位素可用上述预靶向方法施用，使用了半抗原肽或配体，所述半抗原肽或配体是放射性标记的并在施用定位于病组织中表达升高的部位的双特异性稳定拴结结构之后注射。可用于治疗病组织的放射性同位素包括但不限于:mIn、mLU、212B1、213B1、211At、62Cu,67Cu,90Y, 1251 , 131 1 , 32P,33P,47Sc, 111Ag,67Ga,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy, 166Ho,186Re, 188Re,189Re,212Pb、223Ra' 225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109PcU 143Pr、149Pm' 169Er、194Ir、198Au、199Au 和211Pb。治疗性放射性核素的衰变能优选在20-6，OOOkeV范围内，俄歇辐射源的衰变能优选为60_200keV范围内，β辐射源的衰变能优选为100-2，500keV，α辐射源的衰变能优选为
4,000-6, OOOkeV0有用的β粒子辐射核素的最大衰变能优选为20_5，OOOkeV，更优选地为100-4，OOOkeV，最优选地为500-2，500keV。基本上通过辐射俄歇粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br_80m、Tc_99m、Rh_103m、Pt-109、In-1lU Sb-119、1-125、Ho-161、0s-189m和Ir-192。有用的β粒子辐射核素的衰变能优选为< 1，OOOkeV，更优选地为< IOOkeV,最优选地为< 70keV。基本上通过产生α -粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于:Dy-152、At-211、B1-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、B1-211、Ac-225, Fr-221、At-217、B1-213 和 Fm-255。有用的 a -粒子辐射的放射性核素的衰变能优选为2，000-10, OOOkeV,更优选地为3，000-8, OOOkeV,最优选地为4，000-7，OOOkeV0例如，由于具有61.5小时的半衰期并供应大量β粒子和Y射线，67Gu被视为放射免疫治疗的一种更有前景的放射性同位素，其可通过使用螯合剂P-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)轭合至蛋白质或肽。替代地，放射含能β粒子的9°Υ，可通过使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)偶联至肽、抗体、融合蛋白或其片段。其他可用的放射性同位素包括nC、13N、150、75Br、198AU、224AC、1261、1331、77Br、113mIn、95Ru,97Ru, 103Ru, 105Ru,107Hg,203Hg,121mTe,122mTe,125mTe,165Tm^167Tm, 168Tm, 197Pt,109Pd,105Rh,142Pr,143Pr^161Tb,166Ho,199Au^57Co,58Co,51Cr^59Fe,75Se^201TU225Ac,76Br^169Yb 及类似同位素。在另一实施方案中,可使用放射增敏剂。添加放射增敏剂可导致效力增强。放射增敏剂描述于 D.EGoldenberg 编，CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES (使用放射标记抗体治疗癌症)，CRC Press (1995)，其通过引用整体结合入本文。具有用于热中子活化治疗的硼附加物(boron addend)负载载体的稳定栓结结构通常有几种起效方式。但是，在执行中子辐照之前，最好等待非定位免疫轭合物清除完毕。可使用与所述配体结合的抗体来加速清除。有关此基本原理的描述，请参见第4，624，846号美国专利。例如，可在抗体上连接硼附加物(如碳硼烷)。如本领域公知的，可以制备在侧链具有羧基官能的碳硼烷。碳硼烷与载体(如氨基葡聚糖)的连接可通过激活碳硼烷的羧基并与载体上的胺缩合来实现。然后将此中间轭合物轭合至所述抗体。施用所述轭合物之后，硼附加物被热中子辐照激活并转化为放射性原子，后者通过α辐射进行衰变，产生高毒性的短程作用。试剂盒不同实施方案可包括含有适合用于治疗或诊断受治疗者病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可包含至少一种稳定拴结结构。如果包含施用成分的组合物未制成通过消化道(如通过口服)递送，则试剂盒还可包括能够通过其他途径递送试剂盒组分的设备。一种用于肠胃外递送等的设备类型为注射器，其用于将所述组合物注射到受治疗者体内。也可使用吸入设备。所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多独立的容器中。在某些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建(reconstitution)的组合物的无菌、冻干制剂的管形瓶。试剂盒还可包含适用于重建和/或稀释其他试剂的一 种或多种缓冲液。其他可使用的容器包括但不限于:袋、盘、盒、管或类似容器。试剂盒组分可无菌包装并保存在所述容器中。可包括的另一组成部分为给使用试剂盒的人员的使用说明。
配制和施用所述稳定拴结结构(包括其轭合物)可进一步进行配制以获得组合物，该组合物包含一种或多种药学适宜赋形剂、一种或多种其他成分、或者这些赋形剂和成分的某些组合。这些可通过制备药学有用剂型的已知方法实现，其中有效成分(即所述稳定拴结结构或轭合物)与一种或多种药学适宜赋形剂组合成混合物。无菌的磷酸盐缓冲液即为药学适宜赋形剂的一个实例。其他合适的赋形剂对本领域技术人员为公知。例如，请参见Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂型和药物递送系统)，第 5 版(Lea&Febigerl990)，和 Gennaro 编，REMINGTON' S PHARMACEUTICALSCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Companyl990),及其修订版本。本文所述组合物的优选施用途径为肠胃外注射。在肠胃外注射中，所述组合物将与药学可接受赋形剂一起制成单位剂量可注射形式，如溶液、悬浮液或乳剂。此类赋形剂本身无毒，并且无治疗作用。此类赋形剂的实例有生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和Hank' s溶液。也可使用非水相赋形剂，如脂肪油和油酸乙酯。优选的赋形剂为5%葡萄糖生理盐水溶液。赋形剂可包含少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲液和防腐剂。还考虑其他给药方法，包括口服给药。包含稳定拴结结构的配制组合物可用于静脉内施用，例如通过推注或连续输注。用于注射的组合物可与添加的防腐剂以单位剂量形式提供在例如安瓿或多剂量容器中。组合物还可采取诸如油相或水相介质的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可包含制剂用剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，所述组合物可以是粉末形式，以便在使用前用合适介质(例如，无菌无热原水)构成制剂。所述组合物可以溶液形式施用。该溶液的pH应在pH5-9.5范围内，优选为PH6.5-7.5。其制剂应 为具有合适的药学可接受缓冲液的溶液，所述药学可接受缓冲液如磷酸、三羟甲基氨基甲烷-盐酸或柠檬酸盐等。缓冲液浓度应在1-1OOmM范围内。配制的溶液还可包含盐类，如浓度为50-150mM的氯化钠或氯化钾。还可包括有效量的稳定剂，如甘油、白蛋白、球蛋白、去污剂、明胶、精蛋白或精蛋白盐。如果所述稳定拴结结构使用抗体的人源化形式作为模板，则配制的组合物的全身用药通常为每两天或三天进行或者一周一次。替代地，可以每天施用。通常的施用方式为肌肉注射或血管内输注。所述组合物可通过皮下或其他肠胃外途径施用至哺乳动物。此外，可通过连续输注或者单次或多次推注施用。对抗体或免疫轭合物有用的方法可用于本文所述组合物。一般而言，人的免疫轭合物、融合蛋白或裸抗体施用剂量取决于诸如受治疗者年龄、体重、身高、性别、总体健康状况和先前的治疗历史等因素。通常情况下，需要向受体提供约lmg/kg至20mg/kg范围内的有效成分剂量作为单次静脉内输注，但是也可根据情况需要施用更低或更高的剂量。可按需要重复此剂量，例如，每周一次，持续4-10周；优选为每周一次，持续8周；更优选地，每周一次，持续4周。给药频率也可降低，如每两周一次，持续若干个月。可通过不同的肠胃外途径给药，并相应调整剂量和用药时间。在不同示例性实施方案中，对于抗体、抗体片段或融合蛋白施用，可用的剂量范围为100-500mg，200-1000mg, 500-2000mg,100-250mg, 250-500mg, 500_1000mg，或已知的其他范围。可对本文所述的配制组合物应用用于控制免疫轭合物或抗体作用持续时间的药学方法。控释制剂可通过使用生物相容性聚合物络合或者吸附所述免疫轭合物或裸抗体来实现，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。请参见Sherwood等,Bio/Technology (1992), 10:1446。免疫轭合物或抗体从此基质上释放的速率取决于该免疫轭合物或抗体的分子量、基质内的免疫轭合物或抗体量和分散粒子的大小。请参见Saltzman等,Biophys.J(1989) ,55:163 ;Sherwood等，同上。其他固体剂型描述于 Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (药物剂型和药物递送系统)，第5版(Lea&Febigerl990)，和Gennaro编，REMINGTON' S PHARMACEUTICALSCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Companyl990),及其修订版本。用于治疗目的时，所述组合物以治疗有效量施用至哺乳动物。本文公开的治疗和诊断方法的合适受治疗者通常为人，但也包括非人动物受治疗者，如哺乳动物、猫、狗、马、猪、山羊、牛、羊驼、骆驼或绵羊。本文公开的稳定拴结结构在序号为09/590,284的美国专利申请(待通过)公开的治疗自身免疫疾病方法中特别有用，该专利申请于2000年6月9日提交，题为“Immunotherap y of Autoimmune Disorders using Antibodies that TargetB-Cells ” (使用靶向B细胞的抗体治疗自身免疫疾病的免疫疗法)，其通过弓I用整体结合入本文。包含此类结合结构的组合物优选采用静脉内或肌肉内施用方式，剂量为20-5000mg。还可使用鼻内或其他非肠胃外施用途径。组合物还可通过微球、脂质体或置于某些组织(包括血液)内的其他微粒化递送系统施用。所述组合物可通过气溶胶施用，以实现定位递送到肺部。可使用水相气溶胶或非水相(如氟碳推进剂)悬浮液。制备气溶胶时优选使用声波喷雾器，以最大限度减少组合物中的稳定拴结结构暴露于剪切力，那样会导致其降解和活性的损失。一般而言，施用剂量取决于诸如受治疗者年龄、体重、身高、性别、总体健康状况和先前的治疗历史等因素。优选向患者施用饱和剂量的稳定拴结结构。通常情况下，需要向受体提供剂量约50-500毫克范围内的稳定拴结结构，但是也可根据情况需要而施用更低或更高的剂量。剂量实例包括单位剂量20-1500毫克蛋白、单位剂量20-500毫克蛋白、单位剂量20-100毫克蛋白、单位剂量20-1000毫克蛋白、单位剂量100-1500毫克蛋白。在所述组合物包含放射性核素的实施方案中，剂量可以毫居里测量。对于 9°Y,剂量可为 15-40mC1、10-30mC1、20-30mCi 或 10_20mCi。连接放射性核素的稳定拴结结构对于微生物治疗特别有效。确定所述稳定拴结结构定位于受治疗者体内的一个或多个感染部位之后，注射较高剂量的所述标记组合物，一般为单位剂量20mCi至150mCi (131I)，单位剂量5mCi至30mCi (90Y)，或者单位剂量5mCi至20mCi (186Re),均基于患者体重为70kg。可采取静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、或腔内(即肠胃外)注射，并可重复注射。对于某些治疗，可有利地采取多次、分剂量的施用方式，以提供较高的微生物毒性剂量，而不会引起通常情况下发生的正常组织的辐射相应增加的情况。未化学连接至所述稳定拴结结构的化疗剂、抗菌剂、细胞因子、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、血小板生成素及类似物，可在所述组合物之前、之后或者与所述组合物同时施用。替代地，此类试剂可连接至所述稳定拴结结构。a2b形式的稳定拴结结构特别适合用作预靶向剂。示例性结构将由与靶组织或细胞双价结合的两个scFv或Fab亚基(作为a2)，以及与半抗原结合的一个scFv或Fab亚基(作为b)组成。可先将此双特异性三价结构施用至受治疗者，任选地可接着施用清除剂，然后施用其中半抗原与功能剂结合的试剂，所述功能剂如诊断用的可检测标记，或治疗方法所用的治疗剂。熟练的技术人员了解，已知的使用双特异性抗体的其他方法也可使用所述稳定拴结结构来实施。这些诊断和治疗方法基本上可用于其中已使用基于抗体的试剂进行诊断或治疗的任何场合。如下文所述，双特异性六价稳定拴结结构也可用于和双特异性三价结构相同的目的。治疗和诊断用途:不涉及预祀向的应用所述稳定拴结结构(包括其轭合物)适合用于多种使用抗体或免疫轭合物并且不需要预靶向的治疗和诊断应用。例如，所述三价结构可作为“裸”构建体、以与裸抗体的治疗相同的方式用于治疗，即此结构未轭合其他功能剂的实施方案。替代地，所述稳定拴结结构被一种或多种功能剂衍生化，以实现诊断或治疗应用。如上所述，其他试剂可共价连接至稳定栓结结构。还包括连接至所述稳定拴结结构的放射性和非放射性诊断剂的用途。合适的非放射性诊断剂是那些用于磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)或超声的诊断剂。例如，MRI剂包括与合适的螯合剂(如2-苄基-DTPA及其单甲基类似物和环己基类似物)络合的非放射性金属，如锰、铁和钆。请参见2001年10月10日提交的序号为09/921，290的美国专利申请，其通过引用整体结合入本文。可使用有助于进行诊断成像的放射性同位素标记所述稳定拴结结构。合适的放射性同位素可包括处于60-4，OOOKeV能量范围内的同位素，或者更具体地，18F、52Fe、62Cu、64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc,45Ti,111In, 1231 , 1241 , 1251 , 1311 , 154^158Gd,177Lu,32P,188Re及类似的同位素或其组合。例如，请参见题为“Labeling Targeting Agents withGallium-68”(使用镓-68标记定位剂)的美国专利申请(发明人:G.L.Griffiths和W.J.McBride)，和第60/342，104号美国临时专利申请，其公开了用于成像目的的正电子辐射源，如18F、68Ga、94mTc及类似物；二者均通过引用整体结合入本文。例如，可通过单光子发射计算机断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)进行检测。也可应用于外科手术期间的诊断，以鉴定隐蔽的赘生性肿瘤。在另一实施方案中，可使用一种或多种有效杀伤赘生性或其他快速分裂细胞的放射性同位素标记所述稳定拴结结构，所述放射性同位素包括β_辐射源(如32P、33P、47Sc、
电子辐射源 OnmIn、1251、67Ga、1910s、193mPt、195mPt、195mHg)，α -辐射源(如 212Pb、212B1、213B1、211At、223Ra、225Ac)，或其组合。所述稳定拴结结构可通过连接一种或多种成像增强剂而用于MRI，所述成像增强剂可包括选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、铷(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钦(III)和铒(III)组成的组的金属的络合物。相似地，所述稳定拴结结构可通过连接一种或多种市售的成像增强剂而用于超声成像。第6，331，175号美国专利介绍了 MRI技术和轭合MRI增强剂的抗体的制备，其通过引用整体结合入本文。功能蛋白(如 毒素)可以多种方式存在于所述稳定拴结结构中。例如，通过与DDD2或AD2融合，功能蛋白可充当所述二元复合体的任一组分的前体，然后DDD2或AD2与靶向实体复合，分别构成例如Fab/AD2或Fab/DDD2。替代地，功能蛋白可融合至靶向结构以充当A的前体，所得A可任选地与合适的B配对。可用于此用途的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶1、金葡菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和绿脓杆菌内毒素。例如，请参见Pastan.等，Cell (1986)，47:641 和 Goldenberg, CA-ACancer Journal for Clinicians (1994), 44:43。适合用于本发明的其他毒素对本领域技术人员为已知并描述于U.S.6，077，499，其通过引用整体结合入本文。其他值得关注的功能蛋白包括各种细胞因子、溶栓剂(clot-dissolving agent)、酶和荧光蛋白。本发明还提供了通过按上文所述方法向受治疗者施用“裸”稳定拴结结合结构，以治疗该受治疗者的肿瘤性疾病的方法，所述稳定拴结结合结构中至少有一个抗原结合位点与选自由以下组成的组的抗原结合:碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba733、BrE3 抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、CEACAM6、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD 138、结肠特异性抗原 P (CSAp)、EGFR、EGP-1、EGP-2、Flt-1、Flt_3、叶酸受体、HER2/neu、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素、la、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素样生长因子、KC4抗原、KS-1、KS1-4、Le (y)、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE, MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、坏死抗原、p53、PAM-4抗体结合抗原、胎盘生长因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA, RS5、S100、TlOUTAC、TAG-72、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、生腱蛋白、TRAIL受体、ED-B纤连蛋白、VEGF、17-1A抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物或致癌基因产物。抗TRAIL受体(如TRAIL-Rl和TRAIL-R2)的抗体在本领域为公知(例如，请参见Georgakis等，Br.J.Haematol.2005，130:501-510 ；Mori 等，FEBS Lett.2005，579:5379-84)。此类抗体或片段可单独或者与抗TAA抗体组合用于治疗癌症。所述肿瘤性疾病可选自由癌组织、肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病和黑色素瘤组成的组。可靶向的肿瘤的示例类型包括急性成淋巴细胞白血病、急性脊髓白血病、胆管癌、乳腺癌、宫 癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性脊髓白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和尿膀胱癌。还提供了通过向受治疗者施用一个或多个剂量的治疗性组合物来治疗受治疗者的B细胞恶性肿瘤、或B细胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述组合物包含上文所述的稳定拴结结合结构和药学可接受载体，其中每个抗原结合位点结合CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位。所述治疗组合物可按单位剂量20-1500毫克蛋白、或单位剂量20-500毫克蛋白、或单位剂量20-100毫克蛋白的剂量进行肠胃外施用。受治疗者可接受单位剂量20-100毫克蛋白的重复肠胃外用药，或者单位剂量20-1500毫克蛋白的重复肠胃外用药。在这些方法中，所述结合结构的亚组分可用放射性同位素进行标记，如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、90Y^111Ag, 111In, 1251 , 131 1 , 142Pr,153Sm,161Tb,166Dy,166Ho,177Lu,186Re,188Re,189Re,212Pb,212Bi,213Bi,211At^223Ra 和 225Ac,或其组合。还提供了通过为受治疗者施用诊断性组合物来检测或诊断受治疗者的B细胞恶性肿瘤、或B细胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述诊断性组合物包含稳定拴结结合结构(其中每个抗原结合位点结合⑶19、⑶20、⑶22或IL-17的不同表位)，药学可接受载体，和选自由 18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTC、94TC、99mTC、inIn、1231、1241、1251、m^154_158Gd、mLu、32P、45Ti和188Re,或其组合组成的组的放射性核素。可按上文所述通过SPECT或PET进行检测。还可应用于外科手术期间的诊断，以鉴定隐蔽的赘生性肿瘤。本发明还提供了通过向受治疗者施用诊断性组合物来检测或诊断受治疗者的B细胞恶性肿瘤、或B细胞免疫或自身免疫疾病的方法，所述诊断性组合物包含稳定拴结结合结构(其中每个抗原结合位点结合CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位)，药学可接受载体和用于磁共振成像(MRI)的一种或多种成像增强剂。所述成像增强剂可选自上文所述增强剂。本发明还提供了通过向患有非肿瘤性疾病或病症的受治疗者施用稳定拴结结合结构来诊断和/或治疗所述疾病或病症的方法，所述稳定拴结结合结构上连接了可检测标记或治疗剂，并且有特定于该疾病或病症标志物的一个或多个抗原结合位点。所述疾病或病症可由真菌或病毒引起，所述真菌如小孢子菌属、发癣菌属、表皮癣菌属、申克氏孢子丝菌、新型隐球菌、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌和白色念球菌；所述病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人类血清细小病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疫病毒、麻疫病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、小鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和蓝舌病毒。所述疾病或病症可由细菌引起，如炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋球奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌B、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌和结核分枝杆菌，或支原体。所述疾病或病症可由寄生虫引起 ，如疟疾。所述疾病或病症可为自身免疫疾病，如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜皮肌炎、西德纳姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu' s动脉炎、艾迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊椎炎、肺出血肾炎综合征、thromboangitisubiterans、Sjogren氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎(Hashimoto; s thyroiditis)、甲状腺功能允进、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。所述疾病或病症可为心肌梗死、缺血性心脏病、或动脉粥样硬化斑块、或移植排斥反应、或阿尔茨海默氏病、或由特应性组织引起的疾病。所述疾病或病症可为活化的粒细胞、单核细胞、淋巴样细胞或巨噬细胞在炎症部位合生而引起的炎症，并且该炎症由传染剂引起。此外，也可使用稳定拴结结构靶向表达特定受体或者过表达受体的细胞，其中A或B组分包含该受体的配体，此配体可指导所述结构与携带所述受体的细胞结合。所述结构的一个或多个亚基可融合或者轭合至治疗剂或诊断剂，以允许诊断和治疗方法。治疗和诊断用途:涉及预靶向的应用预靶向是最初为了解决直接靶向抗体血液清除慢而开发的多步骤过程，直接靶向抗体对正常组织(特别是骨髓)有不良毒性。在预靶向中，放射性核素或其他治疗剂连接至可在几分钟内从血液中清除的小化合物。先施用能够识别放射标记的小化合物和靶抗原的预靶向剂；当所述预靶向剂稍后从血液中充分清除时再施用所述放射标记化合物。预靶向方法的开发目的是增加检测或治疗剂的靶标:本底比率。预靶向和生物素/亲和素方法的实例请参见，例如，Goodwin等，第4，863，713号美国专利；Goodwin等，J.Nucl.Med.29:226，1988 ；Hnatowich 等，J.Nucl.Med.28:1294，1987 ；0ehr 等，J.Nucl.Med.29:728，1988 ；Klibanov 等，J.Nucl.Med.29:1951，1988 ；Sinitsyn 等，J.Nucl.Med.30:66,1989 ；Kalofonos 等，J.Nucl.Med.31:1791,1990 ；Schechter 等，Int.J.Cancer48:167,1991 ；Paganelli 等，Cancer Res.51:5960,1991 ；Paganelli 等，Nucl.Med.Commun.12:211,1991 ；第 5，256，395 号美国专利；Stickney 等，Cancer Res.51:6650,1991 ; Yuan 等，Cancer Res.51:3119,1991 ;第 6, 077, 499 号美国专利；美国序号09/597，580 ;美国序号10/361，026 ;美国序号09/337，756 ;美国序号09/823，746 ;美国序号10/116，116 ;美国序号09/382，186 ;美国序号10/150，654 ;第6，090，381号美国专利；第6，472，511号美国专利；美国序号10/114，315 ;第60/386，411号美国临时专利申请；第60/345，641号美国临时专利申请；第60/3328，835号美国临时专利申请 ’第60/426，379号美国临时专利申请；美国序号09/823，746 ;美国序号09/337，756 ;第60/342，103号美国临时专利申请；和第6，962，702号美国专利，其均通过引用结合入本文。在特定的、非限制性实例中，基于所述稳定拴结结构的预靶向剂包含特定于CEA的两个相同的肿瘤抗原结合位点和特定于组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)半抗原的第三个结合位点。在替代实施方案中，可靶向不同的肿瘤相关抗原以及相同或不同的半抗原。在预靶向应用中，所述可靶向剂可为脂质体，该脂质体脂膜的外表面共价连接了双价HSG-肽。所述脂质体可·充气作为对照，或者可填充治疗剂或诊断剂。治疗或诊断受治疗者的疾病或病症的预祀向方法提供如下:(I)向该受治疗者施用上述双特异性三价或六价结合结构，其中第一个抗原结合位点针对特定于所述病症的一种或多种标志物，且第二个抗原结合位点针对包含双价半抗原的可靶向构建体；(2)任选地向该受治疗者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构从循环中清除；和(3)向该受治疗者施用所述包含双价半抗原的可祀向构建体，其中所述可祀向构建体进一步包含一个或多个螯合或者化学结合的治疗剂或诊断剂。所述疾病或病症可为上文所述疾病或病症。本发明还提供了抗体依赖性酶前体药物疗法(ADEPT)，具体为:(I)按上文所述方法向患有肿瘤性疾病的患者施用结合结构，其中该结构包含共价连接的、能够激活前体药物的酶，(2)任选地向该受治疗者施用清除组合物，并允许该组合物将所述结合结构从循环中清除，和(3)向该患者施用所述前体药物。其他用途一般而言，所述稳定拴结结构可替换为表现出治疗癌症或非癌疾病效力的基于抗体的试剂。众所周知，放射性同位素、药物和毒素可轭合至特异性结合癌症细胞产生的或与癌症细胞相关的标志物的抗体或抗体片段，并且此类抗体轭合物可用于将放射性同位素、药物或毒素靶向至肿瘤部位，以增强其治疗效力并最大限度减少副作用。Wawrzynczak和 Thorpe (Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer(癌症的细胞和分子生物学介绍)，L.M.Franks和N.M.Teich编，第18章，第378-410页，OxfordUniversity Press.0xford, 1986)，Immunoconjugates (免疫辄合物)(选自 “AntibodyConjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer”(癌症放射显像和治疗中的抗体轭合物)，C.W.Vogel 编，3-300, Oxford University Press，N.Y.，1987)，和 Dillman，R.0.(CRCCritical Reviews in Oncology/Hematologyl:357, CRC Press, Inc., 1984)对这些试剂和方法进行T综述。另请参见 Pastan 等，Cell (1986)，47:641 ；Vitetta 等，Science (1987)，238:1098-1104 ;和 Brady 等，Int.J.Rad.0ncol.Biol.Phys.(1987)，13:1535_1544。在某些实施方案中，可使用多价稳定拴结结构对正常或病组织和器官进行治疗和/或成像，例如，使用下列专利中介绍的方法:第6，126,916 ;6，077，499 ;6，010，680 ；5，776，095 ;5，776，094 ;5，776，093 ;5，772，981 ;5，753，206 ;5，746，996 ;5，697，902 ；5，328, 679 ;5，128，119 ;5，101,827 ;和4，735，210号美国专利，其均通过引用结合入本文。其他方法请参见1999年6月22日提交的序号为09/337，756的美国专利申请和2001年4月3日提交的序号为09/823，746的美国专利申请。此成像可通过直接标记所述稳定拴结结构或者通过预祀向成像方法执行，请参见Goldenberg等,“Antibody Pretargeting AdvancesCancer Radioimmunodetection and Radiotherapy”(抗体预祀向改善了癌症的放射免疫检测和放射治疗)，(发行中，J.Clin.0ncol.)，另请参见第20050002945，20040018557，20030148409和20050014207号美国专利公布，其均通过引用结合入本文。已公开了使用免疫轭合物治疗癌症的其他实例和其他治疗形式，尤其是在下列美国专利中:4，331，647、4，348，376、4，361，544、4，468，457、4，444，744、4，460，459、4，460，5614，624，846,4, 818，709,4, 046，722,4, 671，958,4, 046，784,5, 332，567、5，443，953,5, 541，297,5, 601, 825,5, 635，603,5, 637，288,5, 677，427,5, 686，578、5，698，178,5, 789，554,5, 922，302,6, 187，287 和 6，319，500。这些方法还可通过用本发明的稳定拴结结构代替工程抗体和前述方法的抗体，而用于本文所公开的方法。

在某些实施方案中，本发明公开和要求保护的稳定拴结结构可用于放射性核素治疗或放射免疫治疗方法(例如，请参见Govindan等,2005, Technology in CancerResearch&Treatment,4:375-91 ；Sharkey 和 Goldenberg,2005，J.Nucl.Med.46:115S-127S ;Goldenberg 等(发行中，J.Clin.0ncol.) ,“Antibody Pretargeting AdvancesCancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy”(抗体预祀向改善了癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗)，其均通过引用结合入本文)。在另一实施方案中，放射增敏剂可与裸露或轭合的稳定拴结结构、抗体或抗体片段组合使用。例如，所述放射增敏剂可与放射标记的稳定拴结结构组合使用。与单独使用放射标记的稳定拴结结构进行治疗相比，加入放射增敏剂可增强效力。放射增敏剂请参见D.EGoldenberg编，CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES (使用放射标记抗体治疗癌症)，CRC Press (1995)，其通过引用整体结合入本文。用于要求保护的任何方法的稳定拴结结构均可连接抗菌剂或者与其一起施用。用于要求保护的任何方法的稳定拴结结构均可缔合细胞因子和免疫调节剂或者与其一起施用。这些细胞因子和免疫调节剂至少包括α、β和Y干扰素以及集落刺激因子。本发明公开的方法还可使用稳定拴结结构以刺激患者的免疫反应。在一个实施方案中，所述稳定拴结结构可包含抗独特型抗体的抗原结合位点(ABS)。此类稳定拴结结构可模拟肿瘤相关抗原的表位，以增强机体的免疫反应。所述稳定拴结结构可用于许多目前使用抗体的免疫程序。这些程序包括使用抗独特型抗体和表位轭合抗体，以激发免疫系统。请参见第5，798，100 ;6，090，381和6，132，718号美国专利。抗独特型抗体还用作抗癌症和传染性疾病的疫苗。请参见第6，440，416和6，472，511号美国专利。此外，多特异性三聚或六聚结合结构可结合多药运输蛋白并克服细胞和病原体的多药抗性表型。这些方法中的抗体可替换为本发明公开的稳定拴结结构。不同的实施方案涉及治疗自身免疫疾病症状的方法。在所述方法中，稳定拴结结构施用至患有自身免疫疾病的患者，其在施用前可与药学可接受载体混合。此方法中的稳定拴结结构应包含至少一个能特异性结合B细胞或T细胞抗原表位的ABS。所述B细胞抗原可为⑶22，且所述表位可为⑶22和其他抗原的A表位、B表位、C表位、D表位和E表位。所述B细胞相关抗原也可是另一细胞抗原，如⑶19、⑶20、HLA-DR和⑶74。所述T细胞抗原可包括CD25。在某些实施方案中，可选择用于治疗自身免疫疾病的稳定拴结结构与IL-17
彡口口 所述ABS可包含类人灵长类动物、鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人来源的序列。例如，所述ABS可来源于人源化LL2(抗CD22)、人源化LLl (抗CD74)或人源化A20(抗⑶20)单克隆抗体。所述施用方式可
本发明要求保护的方法可用于治疗包括人在内的任何动物。优选地，所述动物为哺乳动物，如人类、灵长类、马科、犬科和猫科。所述稳定拴结结构可用于治疗抵抗或耐受全身化疗的疾病。这些疾病包括各种病毒、真菌、细菌和原生动物感染，以及特定的寄生虫感染。病毒感染包括由流感病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒、狂犬病毒(Rhabdoviridae)、乳头瘤病毒和乳多空病毒引起的感染，所有这些感染均难以通过全身施用抗生素/细胞毒剂进行治疗。使用多价结合结构可提供更高的靶病毒亲和力，进而显著提高治疗指数。使用放射性同位素(并包括可用热中子激活的硼附加物)标记的稳定拴结结构的轭合物进行靶向放射免疫治疗，提供了抗病毒治疗的新方法。可用本发明所述方法进行治疗的原生动物包括，例如疟原虫(特别是疟疾寄生物恶性疟原虫)、刚地弓形虫(弓形体病的传染剂)、利什曼原虫(利什曼病的传染剂)和溶组织内大肠杆菌(Escherichia histolytica)。使用所述稳定栓结结构可显著增强对各个阶段的疟疾的检测和治疗。与子孢子抗原结合的单克隆抗体(mAb)为已知。但是，由于血液期的寄生虫不具有子孢子抗原，因此使用此类针对子孢子抗原的mAb进行定位只能局限于刚刚注射完毕并且在宿主肝细胞中发展之前，所述子孢子自由存在于循环中的相对较短的时间。因此，优选使用可以祀向原生动物(如P.falciparum)多于一个的寄生时期的mAb,这可通过使用具有多特异性的一个或多于一个的稳定拴结结构实现。使用轭合物可提供进一步的好处，如使用99mTc进行成像，或者如使用211At或抗疟药(如乙胺嘧啶)进行治疗。弓形体病也不能使用全身化疗。尚不清楚特异性结合T.gondii的mAb或天然的宿主抗体能否在对弓形体病的免疫反应中发挥作用，但是对于疟原虫而言，合适定位的稳定拴结结构可成为递送治疗剂的有效介质。广泛流行的蠕虫感染病血吸虫病是由一些淡水螺类携带的自由游动的尾蝴(cercariae)引起的。对于疟疾而言，其传染过程涉及不同阶段的尾蝴。能结合多个阶段的尾蝴、任选地结合一个或多个阶段的尾蝴上的多个表位、并且优选为多特异性组合物形式的稳定拴结结构，可轭合至显像剂或治疗剂，以进行有效的定位和增强治疗效力。可制备结合克氏锥虫(即查格斯病的病原体)的一个或多个形式的稳定拴结结构，并将其用于此微生物传染病的检测和治疗。与此锥体虫不同分化阶段的细胞表面糖蛋白或其他表面抗原反应的稳定拴结结构适合用于将显像剂和治疗剂定位至机体内的寄生渗透部位。现有药物非常难以治疗的另一传染性生物体为麻风杆菌(Mycobacteriumleprae)。可制备特异性结合M.leprae表面的多个表位的稳定栓结结构，并且其可单独或组合用于将显像剂和/或抗生素/细胞毒剂靶向至该细菌。螺虫寄生传染病(如类圆线虫病(Strongyloidosis)和旋毛虫病(Trichinosis))本身难以用化疗剂控制，是稳定拴结结构的合适靶标。可使用特异性结合所述寄生虫的一个或优选地多个表位的合适的稳定拴结结构或轭合物对其进行诊断和治疗。特异性结合引起人类大多数传染病的大多数微生物和寄生虫的抗体已有市售，或可容易地制得。其中有许多抗体之前已用于体外诊断目的，并可作为抗体轭合物的组分包含在稳定拴结结构内，以将诊断剂和治疗剂靶向至传染部位。人和哺乳动物的微生物病原体和无脊椎寄生虫是具有复杂生命周期的生物，其在不同阶段表达多种抗原。因此，当制备识别不同形式生物体的抗 原决定簇的稳定拴结结构并将其作为混合物或多特异性轭合物(与合适的治疗剂连接)组合使用时，靶向治疗可能最为有效。同样的原理也适用于通过连接显像剂(例如放射性核素和/或MRI增强剂)，使用包含稳定拴结结构的试剂检测感染部位的情况。其他实施方案涉及通过施用有效量的稳定拴结结构和可靶向构建体来手术定位病组织的方法，其中所述稳定拴结结构包含至少一个特异性结合靶组织的抗原结合位点，并且另外至少有一个抗原结合位点特异性结合所述可靶向构建体；并且，其中所述至少一个抗原结合位点能够与靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者其产生或与其相关的分子上的互补结合部分特异性结合。其他实施方案涉及通过施用有效量的稳定拴结结构和施用可靶向构建体，来使用内窥镜确定受治疗者的病组织的方法。所述稳定拴结结构包含至少一个特异性结合靶组织的抗原结合位点和至少一个特异性结合所述可靶向构建体的抗原结合位点；并且其中所述至少一个抗原结合位点显示与祀细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者其产生或与其相关的分子上的互补结合部分特异性结合。可用的替代检测方法为无线胶囊内镜，该方法使用食入性胶囊摄像机/检测器类型，例如可购自Given Imaging(Norcross GA)。某些实施方案包括通过施用有效量的稳定拴结结构和施用可靶向构建体，来使用内窥镜确定受治疗者的病组织的方法。在此实施方案中，所述稳定拴结结构包含至少一个特异性结合靶组织的抗原结合位点和至少一个特异性结合所述可靶向构建体的抗原结合位点；并且其中所述至少一个抗原结合位点显示与靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者其产生或与其相关的分子上的互补结合部分特异性结合。替代实施方案涉及通过施用有效量的稳定拴结结构和可靶向构建体，来确定受治疗者血管内的病组织的方法。所述稳定拴结结构包含至少一个特异性结合靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者其产生或与其相关的分子上的互补结合部分的抗原结合位点(ABS)，和至少一个特异性结合可靶向构建体的ABS。所述靶组织可为正常组织，如甲状腺、肝脏、心脏、卵巢、胸腺、甲状旁腺、子宫内膜、骨髓、淋巴结或脾。一些实施方案涉及可实施本发明要求保护的方法的试剂盒。该试剂盒可包括可靶向构建体。所述可靶向构建体可使用试剂标记，所述试剂可为适合于上文所述可靶向构建体的任何试剂 。此外，所述可靶向构建体可不进行标记，但是所述试剂盒可包含标记该可靶向构建体的标记试剂。所述标记试剂(如果包括)可包含该标记和交联剂。所述试剂盒还可包含稳定拴结结构，该稳定拴结结构包含至少一个特异性结合所述可靶向构建体的ABS和至少一个特异性结合可靶向组织的ABS。所述试剂盒可任选包含清除组合物，以从循环中清除稳定栓结结构。稳定拴结结构的靶标有关稳定拴结结构靶标的其他公开内容，请参见2004年12月9日提交的序号为60/634，076 的美国临时专利申请，“Methods and Compositions for Immunotherapy andDetection of Inflammatory and Immune-dysregulatory Disease,Infectious Disease,Pathologic Angiogenesis and Cancer”(用于对炎症和免疫失调疾病、传染性疾病、病理性血管生成和癌症进行免疫治疗和检测的方法和组合物)(Goldenberg等)，其完整内容通过引用结合入本文。在一些实施方案中，本发明要求保护的稳定拴结结构与两个不同靶标发生特异性反应。所述不同靶标可包括但不限于，先天免疫系统的促炎效应物，凝血因子，补体因子和补体调节蛋白，与炎症和免疫失调疾病、与传染原、或与病理性血管生成和癌症特异性相关的靶标；其中此后一类靶标不是免疫系统的促炎效应物或凝血因子。因此，在某些实施方案中，所述稳定拴结结构包含至少一种与疾病细胞、病理性血管生成或癌症，或者传染性疾病相关的结合特异性，和至少一种对免疫系统组分的特异性，所述免疫系统组分如B细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞和树突状细胞的受体或抗原，凝血调节剂(如凝血酶或组织因子)，或者促炎细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-10、HMGB-1和MIF)。所述稳定拴结结构可为裸的，但也可轭合至诊断显像剂(例如，同位素、放射造影剂)或轭合至治疗剂，所述治疗剂包括放射性核素、硼化合物、免疫调节剂、肽、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒剂、血管生成抑制剂和其组合。所述稳定拴结结构与靶标的结合可下调或以其他方式影响免疫细胞的功能，但是所述稳定拴结结构也可与不直接影响免疫细胞功能的其他靶标结合。例如，抗粒细胞(如抗CD66或CEACAM6)抗体(例如NCA90或NCA95)不但可用于靶向感染组织中的粒细胞，而且还可用于靶向表达CEACAM6的癌症。在一个实施方案中，所述治疗剂为寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可为反义寡核苷酸或双链干扰RNA(RNAi)分子。所述寡核苷酸可针对致癌基因，如bcl-2或p53。第5，734，033号美国专利中描述了抑制bcl-2表达的反义分子。它可轭合至稳定栓结结构的治疗剂部分，或形成该治疗剂部分。替代地，所述寡核苷酸可与所述稳定拴结结构同时或在其后施用。在另一实施方案中，所述治疗剂为硼附加物，并且在定位所述治疗剂之后，必须通过热或超热中子照射进行治疗。所述治疗剂还可为光敏治疗剂，尤其是显色剂或染料。在优选实施方案中，所述治疗剂为细胞毒剂，如药物或毒素。还优选的是，所述药物选自由以下组成的组:氮芥类、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、吉西他滨、三氮烯类、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷类、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、酶抑制剂、表鬼白毒素、钼配合物、长春碱类、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑制素、紫杉醇、SN38、喜树碱、阿霉素及其类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-1l及其组合。在另一优选实施方案中，所述治疗剂为从选自包含动物、植物和微生物的组的来源获得的毒素。优选毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、肥皂草蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶1、金葡菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素和绿脓杆菌内毒素。所述治疗剂可为免疫调节剂，如细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素和其组合，所述淋巴毒素为肿瘤坏死因子(TNF)。所述造血因子可为白介素(IL)，所述集落刺激因子可为粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，所述干扰素可为干扰素-α、β或Y，所述干细胞生长因子可为SI因子。替代地，所述免疫调节剂可包含 IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素-Y、TNF-α，或其组合。 优选的治疗放射性核素包括keV范围为80_500keV的β、α和俄歇辐射源。治
疗放射性同位素的示例包括 32P、33P、47Sc、1251、1311、86Y、9°Y、186Re、188Re、189Re、64CU、67CU、67Ga、111In,111Ag^142Pr,153Sm,161Tb,166Dy^166Ho,177Lu,198Au,211At,212Pb,212Bi,213Bi,223Ra 225Ac 和其组合。光敏治疗剂示例选自包含显色剂和染料的组。还优选地，所述治疗剂为选自包含苹果酸脱氢酶、金黄色葡萄球菌核酸酶、δ -V-留体异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α -甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、糖化酶和乙酰胆碱酯酶的组的酶。治疗剂肽的各种实例在本领域为已知，并且任何此类已知试剂均可使用。示例性治疗肽包括但不限于，激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、结合肽、封闭肽、毒素、血管生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、药物肽、酶、激动剂、拮抗剂、造血剂(如促红细胞生成素)和许多其他临床有用化合物。所述稳定拴结结构可与至少一个促炎效应细胞因子、促炎效应趋化因子或促炎效应受体特异性结合。可与所述稳定拴结结构结合的促炎效应细胞因子包括但不限于，MIF、HMGB-U TNF-α (中瘤坏死因子 α )、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 和IL-18。促炎效应趋化因子包括但不限于，CCL19、CCL21、IL_8、MCP-1 (单核细胞趋化蛋白I)、RANTES、MIP-1A(巨噬细胞炎性蛋白ΙΑ) ,MIP-1B (巨噬细胞炎性蛋白IB)、ENA_78(上皮中性粒细胞激活肽78)、IP-10、GROB (GRO β )和Eotaxin (嗜酸粒细胞趋化因子)。促炎效应受体包括但不限于，IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R和IL-18R。所述稳定拴结结构还可与至少一个凝血因子(如组织因子或凝血酶)特异反应。所述淋巴因子/细胞因子与其在免疫细胞上的受体反应，以实现激活，而抗体可通过中和该淋巴因子/细胞因子来阻止激活。替代地，抗体可与所述淋巴因子/细胞因子受体反应以阻止激活。与所述稳定拴结结构特异性结合的不同靶标可来自相同或不同类别的效应物和凝血因子。例如，与所述稳定拴结结构特异性结合的两个或多个不同靶标可选自相同类别的效应物或凝血因子，如两个或多个不同的促炎效应细胞因子、两个或多个不同的促炎效应趋化因子、两个或多个不同的促炎效应受体或者两个或多个不同的凝血因子。替代地，所述两个或多个不同靶标可选自不同类别的效应物和凝血因子。例如，一个靶标可为先天免疫系统的促炎效应物，而另一个靶标可为凝血因子。或者所述稳定拴结结构可与两个不同类别的促炎效应物特异反应，如至少一个促炎效应细胞因子和至少一个促炎效应趋化因子，至少一个促炎效应细胞因子和至少一个促炎效应受体或者至少一个促炎效应趋化因子和至少一个促炎效应受体。还可以是如下情况:与所述稳定拴结结构特异反应的两个不同靶标为先天免疫系统中同一促炎效应物的多于一个的表位，或者同一凝血因子的多于一个的表位。因此，“两个不同靶标”可指两个不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。可对同一抗原使用多个抗体，进而增加价位。例如，当靶向MIF或HMGB-1，尤其是用于治疗脓毒症、某些癌症和动脉粥样硬化斑块时，稳定拴结结构可包含两个结合靶标上两个相同表位的抗体和具有一个或多个对不同抗原的结合臂的另一抗体，所述不同抗原如II类HLA恒定链抗原，如⑶74。所述抗体可选择为与两个不同抗原结合，如MIF和⑶74的抗体和CD74的抗体。当靶向促炎效 应受体时，在优选实施方案中，实际的靶标可为该促炎效应受体的胞外结构域。在替代实施方案中，所述稳定拴结结构可包含至少一个可与促炎效应受体反应的分子。该分子可为所述促炎效应受体的天然拮抗剂，或者与所述受体特异性相互作用的此拮抗剂的片段或突变体。在优选实施方案中，所述天然拮抗剂为天然的IL-1受体拮抗齐U，或者此拮抗剂的片段或突变体。在一个实施方案中，靶标可为获得性免疫系统的抗原或受体。在其他实施方案中，所述稳定拴结结构的靶标可位于先天性免疫系统的细胞，如粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。其他靶标包括血小板和内皮细胞。另一组靶标为由C5a、LPS、IFNY和B7组成的组。另一组合适靶标包括⑶2、⑶3、⑶4、⑶14、⑶18、⑶I la、⑶20、⑶22、⑶23、⑶25、⑶29、⑶38、CD40L、⑶52、⑶64、⑶83、CD 147和⑶154。这些CD是免疫细胞上的靶标，可封闭它们以阻止免疫细胞反应。CD83作为活化树突状细胞的标记特别有效(Cao等，Biochem J.，2004 年 8 月 23 日(印刷前的电子出版物);Zinser 等，J.Exp Med.200(3):345-51(2004))。某些靶标非常值得关注，如MIF、HMGB-l、TNF-a、补体因子和补体调节蛋白以及凝血因子。MIF是先天性免疫系统的关键细胞因子，并且在控制炎症反应中发挥重要作用。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)蛋白最初被描述为抑制巨噬细胞随机迁移的、由T淋巴细胞产生的因子，其在近30年的时间内被视为神秘的细胞因子。近年来，MIF为垂体前叶产物的发现以及生物活性重组MIF蛋白的克隆和表达使人们清楚了其在体内的重要生物作用。MIF具有从糖皮质激素刺激的巨噬细胞和T淋巴细胞释放的独特特性。释放之后，MIF在体外抵消糖皮质激素对TNF- α、IL-1 β、IL-6和IL_8 (由LPS刺激的单核细胞产生)的抑制作用，并且在体内抑制留体对致死内毒素血症的保护作用。通过恢复几-2和0^-^的产生，MIF还在体外拮抗糖皮质激素对T细胞增殖的抑制作用。MIF是确定可反向调节糖皮质激素的抑制作用的第一个调节体，因而在炎症和免疫的宿主控制中发挥关键作用。MIF在治疗癌症、病理性血管生成和脓毒症或感染性休克方面特别有效。HMGB-1 (DNA结合的核和胞质蛋白)是由IL-1 β、TNF或LPS激活的单核细胞和巨噬细胞释放的促炎细胞因子。其通过其B盒结构域诱导DC的表型成熟。它还造成促炎细胞因子IL-1 α、IL-6、IL-8, IL-12, TNF-α和RANTES分泌增加。坏死细胞释放的HMGB-1可能是组织或细胞受损的信号，当此信号被DC感知时，其诱发和/或增强免疫反应。Palumbo等报道了 HMBGl诱导中间成血管细胞(Mesoangioblast)迁移和增殖(J Cell Biol, 164:441-449(2004))。HMGB-1是内毒素诱导的致死的晚期调节体，与TNF和IL-1 β相比，其表现出显著延迟的动力学。靶向特异性早期炎症调节体(如TNF和IL-1 β)的实验性治疗剂(Experimental therapeutics)单独未能证明临床有效性,但是同时祀向早期和晚期炎症调节体的稳定栓结结构可改善响应。靶向HMBG-1的稳定拴结结构在治疗关节炎，尤其是胶原诱导的关节炎方面特别有效。包含HMBG-1的稳定拴结结构还可用于治疗脓毒症和/或感染性休克。Yang等，PNASUSAlOl =296-301 (2004) ；Kokkola 等，Arthritis Rheum, 48:2052-8 (2003) ；Czura 等，JInfect Dis,187Suppl2:S391-6 (2003) ;Treutiger 等，J Intern Med，254:375-85 (2003)。TNF-α是参与全身炎症反应和急性期反应的重要细胞因子。TNF_ a由受激的单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞释放。巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞、粒细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、软骨细胞、成骨`细胞、肥大细胞、胶质细胞和角质形成细胞也可在受激后产生TNF-a。其释放是由几种其他调节体(如白介素-1和细菌内毒素)在损伤过程(如感染造成的损伤)中刺激的。其对各种器官系统具有多种作用，通常为与白介素-1和-6一起。TNF-a的一个作用是抑制食欲；因此，治疗恶病质的稳定拴结结构优选靶向TNF-a。TNF-a还刺激肝脏的急性期反应，导致C反应蛋白和多种其他调节体的增加。它还是治疗脓毒症或感染性休克的有效靶标。补体系统是包括血浆糖蛋白的蛋白酶切(通常由细胞受体激活)的复杂级联。“补体级联”是组成型且非特异性的，但是它必须被激活以发挥功能。补体激活造成单向序列的酶和生物化学反应。在此级联中，特异的补体蛋白C5形成两个具有高度活性的炎性副产物C5a和C5b，C5a和C5b可联合激活白细胞。这进而激发许多其他炎性副产物，包括有害细胞因子、炎性酶和细胞粘附分子。这些副产物一起可导致许多炎性疾病中见到的组织的破坏。此级联最终导致诱发炎症反应、巨噬细胞趋化作用和调理作用，以及细胞裂解。补体系统可通过两个不同途径激活，即经典途径和替代途径。大多数补体组分都进行了编号(例如，C1、C2、C3等)，但是一些则称为“因子”。一些组分必须经过酶切才能激活它们的功能；其他组分则只需组合形成活性复合体。经典途径的活性组分包括Clq、Clr、Cls、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。替代途径的活性组分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和Properdin(备解素)。每条途径的最后一步是相同的，并包括组分组装为膜攻击复合体。所述膜攻击复合体的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。虽然稳定拴结结构可靶向补体系统的任何组分，但是其中某些补体组分为优选。C3a、C4a和C5a导致肥大细胞释放吸引巨噬细胞、抗体和补体等的趋化因子(如组胺和5-羟色胺)。这些补体组分构成一组优选靶标。另一组优选靶标包括C3b、C4b和C5b，它们增强外源细胞的吞噬作用。另一组优选靶标为前两组的前驱物组分，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9诱导外源细胞的裂解(膜攻击复合体)，并构成另一组优选祀标。像C3a —样，补体C5a为过敏毒素。它介导炎症反应，并且是诱导嗜中性粒细胞释放抗菌蛋白酶和氧自由基的趋化引诱剂。因此，C5a和其前驱物C5是特别优选的靶标。靶向C5不仅影响C5a，还影响启动膜攻击复合体组装的C5b。因此，C5是另一优选靶标。C3b及其前驱物C3也是优选靶标，原因在于经典和替代补体途径均依赖于C3b。三个蛋白(Cl抑制剂、蛋白H和因子I)影响此因子的水平，因此它们也是本发明的优选靶标。补体调节蛋白(如CD46、CD55和CD59)可为所述稳定拴结结构的结合靶标。凝血因子，特别是组织因子(TF)和凝血酶，也是优选靶标。TF还称作组织凝血活酶、CD142、凝血因子III或因子III。TF是膜内在受体糖蛋白和细胞因子受体超家族的成员。TF的配体结合胞外结构域由两个结构化模块组成，依据这些模块的特征，TF归为2型细胞因子受体成员。TF参与凝血蛋白酶级联，并通过在TF的胞外结构域和循环血凝血因子、丝氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之间形成高亲和力复合体，启动外部和内部凝血级联。然后这些具有酶活性的复合体激活因子IX和因子X，导致产生凝血酶，并进而形成凝血。

TF表达于各种细胞类型，包括单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞，并受IL-1、TNF-α或细菌脂多糖的诱导。蛋白激酶C参与内皮细胞TF表达的细胞因子激活过程。内毒素和细胞因子诱导的TF表达是革兰氏阴性脓毒症患者中引发播散性血管内凝血的重要机制。TF还参与多种非止血功能，包括炎症、癌症、脑功能、免疫反应和肿瘤相关性血管生成。因此，依据本发明，靶向TF的稳定拴结结构不仅可有效治疗凝血病，而且可有效治疗脓毒症、癌症、病理性血管生成，以及其他免疫和炎性失调疾病。多种细胞因子影响TF在多种细胞中的表达的能力，以及配体与所述受体结合的作用表明，凝血途径和细胞因子网络之间存在复杂的相互作用。已报道配体结合(因子Vila)产生胞内钙信号，进而表明TF是真正的受体。凝血酶是凝血因子II (凝血酶原)的活性形式；它将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶是巨噬细胞的有效趋化物，并可改变其细胞因子和花生四烯酸代谢物的产生。它在脓毒症伴生的凝血病中具有重要作用。已有多项研究证实，脓毒症患者体内或施用LPS的动物模型内激活了凝血系统。虽然已研究了 30多年，但是人们对LPS诱导肝脏毒性的机制仍知之甚少。现在人们清楚它们包括细胞和体液调节体之间一系列复杂的顺序性相互作用。在同一时段内，革兰氏阴性全身性脓毒症和其后遗症(sequelae)成为主要的健康问题，使用针对LPS或各种炎症调节体的单克隆抗体的尝试治疗未能成功。同时靶向凝血酶和至少一个其他靶标的稳定拴结结构解决了脓毒症临床治疗失败的问题。在其他实施方案中，所述稳定拴结结构与I类MHC、II类MHC或辅助分子(如CD40、CD54、CD80或CD86)结合。所述稳定拴结结构还可与T细胞激活细胞因子或细胞因子调节体(如NF-K B)结合。在某些实施方案中，所述两个不同靶标之一可为癌症细胞受体或癌症相关抗原，尤其是选自由以下组成的组的抗原=B细胞系抗原(⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、⑶23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PlGF)、生腱蛋白、HER-2/neu、EGP-U EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD 138、NCA66、CEACAM6 (癌胚抗原相关的细胞粘附分子 6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、结肠特异性抗原-P(CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、la、EL-2、胰岛素样生长因子(ILGF)和ILGF受体、KS-1、Le (y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Prl、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、S100、TlOU TAC、TAG72、TRAIL受体和碳酸酐酶IX。与脓毒症和免疫失调以及其他免疫疾病相关的靶标包括MIF、IL-1、IL_6、IL_8、⑶74、⑶83和C5aR。已发现针对C5aR的抗体和抑制剂改善了患脓毒症的啮齿动物(Huber-Lang 等，FASEB J2002 ；16:1567-1574 ；Riedemann 等，J Clin Invest2002 ；110:101-108)以及患感染性休克和成人呼吸窘迫综合征的猴(Hangen等，JSurgResl989 ；46:195-199 ;Stevens 等，J Clin Investl986 ；77:1812-1816)的存活率。因此，对于脓毒症而言，所述两个不同靶标之一优选为感染相关靶标，如LPS/C5a。其他优选靶标包括HMGB-1、TF、CD14、VEGF和IL-6，其均与败血病或感染性休克相关。优选的稳定拴结结构靶向HMGB-1、TF和MIF中的两个或多个靶标，如MIF/TF和HMGB-1/TF。在其他实施方案中，所述两个不同靶标之一可为与移植物抗宿主病或移植排斥反应相关的祀标，如 MIF (Lo 等，Bone Marrow Transplant, 30 (6):375-80 (2002))。所述两个不同靶标之一还可为与急性呼吸窘迫综合征相关的抗原，如IL-8 (Bouros等，PMC PulmMed、4(l):6 (2004),与动脉粥样硬化或再狭窄相关的抗原，如MIF (Chen等，ArteriosclerThromb Vasc Biol, 24 (4):709-14 (2004);与哮喘相关的抗原，如 IL-18 (Hata 等，Int Immunol，2004年10月11日，出版前的电子出版物)；与肉芽肿病相关的抗原，如TNF- a (Ulbricht 等，Arthritis Rheum, 50 (8):2717-8 (2004);与神经病变相关的抗原，如氨甲酰EPO (促红细胞生成素)(Leist等，Science305 (5681) =164-5(2004);或与恶病质相关的抗原，如IL-6和TNF- α。其他靶标包括C5a、LPS、IFN- y、B7 ;CD2、CD4、CDlla、CDllb、CDllc、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、 CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。CD18、CDllb 或 CDllc 的抗体可在一定程度上抑制某些微生物抗原(包括LPS)对单核细胞的活化，从而牵涉β2-整合素(Cuzzola 等，J Tmmunol 2000 ； 164:5871-5876 ；Medvedev 等，J TmMino11998 ； 160:4535-4542)。已发现⑶83在巨细胞动脉炎(GCA)中起作用，该病为影响中型和大型动脉(主要是主动脉弓的颅外分枝和主动脉本身的颅外分枝)的系统性血管炎，该病造成血管狭窄和并发的组织缺血以及严重的失明、脑卒中和主动脉弓综合征并发症(Weyand和 Goronzy, N Engl J Med2003 ；349: 160-169 ；Hunder 和 Valente,来源！InflammatoryDiseases of Blood Vessels (血管炎症疾病)，G.S.Hoffman 和 C.M.Weyand 编，MarcelDekker，New York, 2002:255-265)。还发现CD83的抗体可消除人GCA的SCID小鼠模型的血管炎(Ma-Krupa等，J Exp Med2004 ；199:173-183)，这暗示研究人员，在激活时表达CD83的树突状细胞是GCA中重要的抗原加工细胞。在这些研究中，他们使用了小鼠抗CD83Mab (来自Research Diagnostics的IgGl克隆HB15e)。TNF家族成员CD 154表达于CD4阳性T淋巴细胞的表面，并且已报道⑶154的人源化单克隆抗体对活动期系统性红斑狼疮(SLE)患者有显著的临床受益(Grammar等，J Clin Invest2003 ;112:1506-1520)。此外，还有报道表明此抗体可用于其他自身免疫疾病(Kelsoe, J Clin Invest2003 ;112:1480-1482)。事实上，还报道此抗体对难治性特发性血小板减少性紫癜患者有效(Kuwana等，Blood2004 ；103:1229-1236)。已表明重组白介素-1受体拮抗剂、IL-1Ra或阿那白滞素(Kineret )对类风湿性关节炎有效果(Cohen 等，Ann Rheum Dis2004 ；63: 1062-8 ；Cohen, Rheum Dis Clin NorthAm2004 ；30:365-80)。对这些受治疗者(迄今尚需要进行甲氨蝶呤联合治疗)的治疗改进是将阿那白滞素与一个或多个所述抗促炎效应细胞因子或抗促炎效应趋化因子(如上所举)组合使用。实际上，在对类风湿性关节炎的抗体治疗的综述中，Taylor(Curr OpinPharmaco12003 ；3 =323-328)提出，除了 TNF之外，也可使用针对此类细胞因子(如IL-UIL-6、IL-8、IL-15、IL-17 和 IL-18)的其他抗体。一些更优选的靶标组合如下所示。此表列出了优选组合的实例，但并非旨在是穷尽性的。
权利要求
1.一种具有六聚稳定拴结结构的六聚复合体，其包含与两个AD2(SEQ ID NO:4)部分轭合的IgG抗体和四个相同或不同IgG的抗体片段，其中每个片段均与DDD2 (SEQ ID NO:2)部分轭合；所述AD2部分与所述DDD2部分结合，其中所述复合体通过AD2部分与DDD2部分之间的二硫键被稳定，其中所述抗体片段是Fab片段并且所述AD2部分与所述IgG抗体的C末端轭合，所述DDD2部分与所述Fab片段的C-末端轭合。
2.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述Fab片段与IgG抗体结合相同的抗原表位。
3.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述Fab片段与IgG抗体结合不同的抗原表位。
4.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述抗体或抗体片段为人、人源化或嵌合的抗体或抗体片段。
5.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述Fab片段选自由hMN-14、L19、hA20、hLL2、hL243、hCC49、7E3、hLL 1、hPAM4、hRS7、L49、抗 CD 14、抗 CD 111、阿达木单抗、英利昔单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗和hMN-15的Fab片段组成的组。
6.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体和/或抗体片段与选自由以下组成的组的抗原结合:碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba733、BrE3抗原、CA125、CDU CDla, CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原 p (CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-U EGP-2、Ep-CAM, Flt-U Flt_3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、缺氧诱导因子(HIF-1)、la、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE,MUC1、MUC2、MUC3、MUC4 、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4 抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA, RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED_B纤连蛋白、17-1A抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物或致癌基因产物。
7.如权利要求1所述的六聚复合体，其进一步包含通过共价或非共价连接与所述结构轭合的一个或多个效应物或载体。
8.如权利要求7所述的六聚复合体，其中所述效应物为诊断剂、治疗剂、化疗剂、放射性同位素、显像剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、激素、可光检测的标记、染料、肽、毒素、造影剂、顺磁标记、超声标记、促凋亡剂、脂质体、纳米粒子或其组合。
9.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体和抗体片段具有对靶分子、复合物、聚集体、细胞、抗原或组织的结合亲和力。
10.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体具有对靶分子、复合物、聚集体、细胞、抗原或组织的结合亲和力，并且至少一个抗体片段具有半抗原的结合位点。
11.如权利要求10所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体具有对以下物质的结合亲和力:细胞表面受体、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素、尿激酶、CA 19-9、CEA、CEACAM6、CD 19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-B 纤连蛋白、EGFR、GD2、G250 抗原、HER2/neu、hTR、II 类 HLA、HMW/MAA、HN/NDV、IGF1R、IL_2R/Tac、IL_17、MUC1、PSMA, M13 外壳蛋白、GpIIb/IIIa、CD74、EGP-K CD25/Tac、LeY、间皮素、Erb_B2、Erb_B3、EpCAM、GP240、GPIIb/IIIa、p97、CD3、IL-4R、IL-4、IL-13、VEGFR-2、CD14、CDlll/ 连接素-1、叶酸受体 a、gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-l、β -胰蛋白酶、CD105/ 内皮糖蛋白、TNFa ,RSV F 蛋白、CEA 的 AlBl、CEA 的 N 结构域、PfMSP-1、TAG-72、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR 或 VEGRF3/Flt_4。
12.如权利要求11所述的六聚复合体，其中至少一个抗体片段具有对IL-17、组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)、铟-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/卩1卜4、0)3、0)16、0)64、0)89、0)2、腺病毒纤突结^13外壳蛋白、6 1113/111&、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素或尿激酶的结合亲和力。
13.如权利要求10所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体具有对选自由CEA、ED-B纤连蛋白、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGF1R、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt_4、HER2/neu、CD30、CD33、PfMSP-l、HN/NDV、EpCAM/17-lA、hTR、IL-2R/Tac、CA19-9、MUCUII 类 HLA、Gd2, G250、TAG-72、PSMA, CEACAM6、HMWMAA, CD40、M13 外壳蛋白和 GPIIb/IIIa 组成的组的细胞表面抗原的结合亲和力，并且其中至少一个抗体片段具有对选自由组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)和铟-DTPA组成的组的半抗原或者选自由CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGRl/Flt-1、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt_4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2 和腺病毒纤突结组成的组的细胞表面抗原的结合亲和力。
14.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体具有对选自由M13外壳蛋白和GpIIb/IIIa组成的组的细胞表面抗原或者选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶组成的组的生物分子的结合亲和力，并且其中至少一个抗体片段具有对选自由M13外壳蛋白和GpIIb/IIIa组成的组的细胞表面抗原或者选自由碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶组成的组的生物分子的结合亲和力。
15.如权利要求1所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体和所述抗体片段与相同抗原结合，所述抗原选自由CD14·、CDl 11/连接素-1、叶酸受体a、gpl20、IL-6、IL-5、IL_8、CD154、IgE、LFA-l、β-胰蛋白酶、CD105/ 内皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、TNF a、RSV F 蛋白、CEA 的 AlBl和CEA的N结构域组成的组。
16.如权利要求3所述的六聚复合体，其中所述IgG抗体和所述抗体片段与下述抗原组合结合:CD20/CD22 ;CD20/CD74 ;CD20/HLA_DR ;CD22/CD74 ;CD22/HLA_DR ;CD74/HLA_DR ；CD74/CEA 或 HLA-DR/CEA。
17.如权利要求1所述的六聚复合体在制备用于治疗或预防受治疗者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症为癌症或自身免疫疾病。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述疾病或病症为癌症，并且所述IgG抗体和/或至少一个所述抗体片段具有对选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原的结合亲和力:碳酸酐酶 IX、甲胎蛋白、A3、A33 抗体特异性抗原、Ba733、BrE3 抗原、CA125、CDl、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原 p(CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-K EGP-2、Ep-CAM、Flt-U Flt-3、叶酸受体、G250抗原、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、缺氧诱导因子(HIF-1)、la、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4抗原、KS-1 抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUCK MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA,RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL 受体、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物和致癌基因产物。
19.如权利要求18所述的用途，其中至少一个所述抗体片段具有对半抗原的结合亲和力。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述半抗原连接至选自由抗血管生成剂、化疗剂、细胞因子、药物、前体药物、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、抗生素、抗病毒齐U、抗真菌剂、激素、结合分子、脂质、聚合物、胶束、脂质体、纳米粒子或其组合所组成的组的试剂。
21.如权利要求17所述的用途，其中所述疾病或病症为自身免疫疾病。
22.如权利要求17所述的用途，其中所述结构包含选自由以下组成的组的IgG抗体和抗体片段的组合:抗⑶74X抗⑶20、抗⑶74X抗⑶22、抗⑶22X抗⑶20、抗⑶20X抗HLA-DR、抗 CD19X 抗 CD20、抗 CD20X 抗 CD80、抗 CD2X 抗 CD25、抗 CD8X 抗 CD25、抗 CD2X 抗 CD147、抗CEACAM5X 抗 CD3、抗 CEACAM6X 抗 CD3、抗 EGFRX 抗 CD3、抗 HER2/neu X 抗 CD3、抗 CD20X 抗CD3、抗 CD74X 抗 CD3 和抗 CD22X 抗 CD3。
23.如权利要求18所述的用途，其中所述癌症选自由上皮癌、间充质癌、血液系统肿瘤、神经肿瘤、恶瘤、黑色素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤和骨髓瘤组成 的组。
全文摘要
本发明涉及确定组分的稳定拴结结构的方法和组合物，所述稳定拴结结构可能具有多种功能和/或结合特异性。优选实施方案涉及包含一个或多个IgG抗体片段的六聚稳定拴结结构，并且该结构可以是单特异性或双特异性。所公开的方法和组合物提供了容易、通用的获得具有基本上任何功能和/或结合特异性的稳定拴结结构的途径。所述稳定拴结结构可以被施用至受治疗者用于诊断和/或治疗用途，例如用于治疗癌症或自身免疫疾病。所述稳定拴结结构可以与多种已知的效应物结合和/或轭合，所述效应物如药物、酶、放射性核素、治疗剂和/或诊断剂。
文档编号C07K16/46GK103242451SQ20131008703
公开日2013年8月14日 申请日期2006年12月5日 优先权日2005年12月16日
发明者张健行, 大卫·高德宝, 爱得盟·罗希 申请人:Ibc医药公司