制备高纯度胸腺法新的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备高纯度胸腺法新的方法。首先分别制备多肽片段一树脂、多肽片段二树脂、多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂；将多肽片段二、三、四和五树脂进行裂解，得到各粗多肽片段；将得到的粗多肽片段二、三、四和五分别纯化；将纯化后的各多肽片段连接到多肽片段一树脂上；将连接后多肽片段树脂进行乙酰化反应，得到胸腺法新wang树脂；进行裂解，得到胸腺法新粗品；将所得胸腺法新粗品进行两次纯化；收集纯化过程中含胸腺法新的流动相减压蒸干，离心后得到胸腺法新，真空干燥得到胸腺法新成品。利用本发明制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量；制备的胸腺法新纯度达到99%以上。
【专利说明】制备高纯度胸腺法新的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽固相合成【技术领域】，具体涉及一种制备高纯度胸腺法新的方法。【背景技术】
[0002]胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，能促进淋巴细胞转化，增强巨噬细胞吞噬活性，可用于治疗多种免疫缺陷病。
[0003]胸腺法新的化学结构式为: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Gl
u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHo
[0004]单用胸腺法新治疗慢性乙肝中内外有研究表明，单用胸腺法新治疗慢性乙肝，持续应答率在37%左右，与单用干扰素相近，不过没有干扰素的毒副作用。
[0005]在中国台湾应用胸腺法新治疗慢性乙肝的临床研究表明:胸腺法新具有延迟的治疗效应。当胸腺法新治疗结束后，ALT有一过性升高，同时伴有HBeAg的血清转换，HBV DNA消失。HBV DNA转阴率及血清转换优越性的研究结果表明:单用胸腺法新治疗慢性乙肝有长期疗效，而没有明显不良反应。对于晚期肝纤维化患者，高剂量的胸腺法新治疗效果较好。
[0006]目前化学合成胸腺肽主要有固相合成法，该方法虽然比较成熟，但是采用该固相合成法来合成多肽是非常困难的。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是:提供一种高效制备高纯度胸腺法新的方法。利用本发明技术方案制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量。利用本发明技术方案制备的胸腺法新纯度达到99%以上。
[0008]为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为:
本发明提供一种制备高纯度胸腺法新的方法，所述制备方法包括以下步骤:
(I)、多妝片段一 Asn_Glu_Ala_Glu_Glu_Val_Val_Glu_Lys_Lys_Glu 树脂的制备:
a、首先将Fmoc-Asn(Trt) -wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌唳与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Asn(Trt)-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
C、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu (OtBu)-OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Asn (Trt) -wang resin 树脂、Fmoc-Glu(OtBu) -OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2: 4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤C同样方法依次将 Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu (OtBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Glu (OtBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Val-OH 氛基酸、Fmoc-Val-OH 氛基酸、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 氛基酸、Fmoc-Lys(Boc)-OH氨基酸、Fmoc-Lys (Boc)-OH氨基酸和Fmoc-Glu (OtBu)-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多妝片段一 Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu 树脂；
(2)、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-1le 树脂的制备:
a、首先将Fmoc-Lys(Boc)-wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌唳与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Lys(Boc)-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Lys (Boc) -wang resin 树脂、Fmoc-Leu-OH 氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将 Fmoc-Asp (OtBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Lys (Bqc)-OH 氨基酸、Fmoc-Thr (tBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Thr (tBu)-OH氨基酸和Fmoc-1le-ΟΗ氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-1le 树月旨；
(3)、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备:
a、首先将Fmoc-Glu-(OtBu) -wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Glu-(OtBu)-Wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser (tBu)-OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Glu- (OtBu)-wang resin 树脂、Fmoc-Ser(tBu)-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser (tBu)-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；
(4)、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备:
a、首先将Fmoc-Thr (tBu) -wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺；b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Thr (tBu) -wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp (OtBu) -OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Thr (tBu) -wang resin 树脂、Fmoc-Asp(OtBu) -OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2: 4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂；
(5)、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备:
a、首先将Fmoc-Ala-wangresin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Ala-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应容器中，然后加入Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂HATU和催化剂DIPEA，所述Fmoc-Ala-wang resin树脂、Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂和催化剂四者之间加 入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp (OtBu)-OH氨基酸和Fmoc-Ser (tBu)-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多妝片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂；
(6)、多肽片段的裂解:
将上述制备的多肽片段二树脂加入反应容器中，按照Ig多肽片段二树脂:8~12mL裂解液的比例加入裂解液进行裂解，裂解液由三氟乙酸、水和1，2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25°C条件下进行裂解2h，通过裂解将多肽片段二从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液进行减压蒸馏，然后加入乙醚，离心得到粗多肽片段二；
重复步骤(6)依次处理上述制备的多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树月旨，得到粗多肽片段三、粗多肽片段四和粗多肽片段五；
(7)多肽片段的纯化:
将步骤(6)得到的粗多肽片段二、三、四和五用流动相A分别进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相分别进行纯化；
(8)多肽片段的连接:
将步骤(1)得到的多妝片段一 Asn_Glu_Ala_Glu_Glu_Val_Val_Glu_Lys_Lys_Glu 树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液中进行脱保护5~8min，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺二者之间的质量比为1:1，所述多肽片段一树脂与混合液之间的加入量比例为Ig多肽片段一树脂:8~12mL混合液；脱保护后采用二甲基甲酰胺进行洗涤5~8次，将洗涤后的树脂加入反应容器中，并加入步骤(7)纯化后的多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA进行缩合反应，洗涤后的树脂、多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA四者之间加入量的摩尔比例为1:2:2:4,加入后在25°C下进行缩和反应3h,反应结束后过滤,过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次，洗涤后得到多肽片段二连接到多肽片段一树脂上的产物；
重复步骤(8)，依次将步骤(7)纯化后的多肽片段三、四和五连接到多肽片段一树脂，得到连接后的多肽片段树脂；
(9)乙酰化:
将步骤(8)得到的连接后多肽片段树脂加入反应容器中，并加入乙酸酐、催化剂DIPEA和二甲基甲酰胺，所述连接后多肽片段树脂、乙酸酐、催化剂和二甲基甲酰胺四者加入比例为Ig连接后多肽片段树脂=IOmL乙酸酐:20mL催化剂:20mL 二甲基甲酰胺；加入后在室温下搅拌30~40min进行乙酰化反应，通过茚三酮检测反应进程，检测结果为阴性反应结束；反应后进行过滤，所得产物先用二甲基甲酰胺洗涤5~8次，再用无水乙醇洗涤3~5次，洗涤后得到胸腺法新wang树脂；
(10)粗肽的裂解:
将步骤(9)得到的胸腺法新wang树脂加入反应容器中，按照Ig胸腺法新wang树脂:8~12mL裂解液的比例加入裂解液，所述裂解液由三氟乙酸、水和1，2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25°C条件下裂解2h，通过裂解使得多肽片段从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液在真空度0.095MPa、40°C条件下减压蒸干，蒸干后所得产物中加入乙醚进行离心，离心后得到胸腺法新粗品；
(11)胸腺法新粗品的纯化:`
将步骤(10)得到的胸腺法新粗品采用流动相A进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相进行两次纯化；
(12)干燥:
收集步骤(11)含胸腺法新的流动相，在真空度0.095MPa、30°C下减压蒸干，然后加入乙醚进行离心，离心后得到胸腺法新，接着在真空度0.095MPa、30°C下真空干燥24h，得到胸腺法新成品。
[0009]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法,所述Fmoc-Asn (Trt) -wang resin树月旨、Fmoc_Lys (Boc) -wang resin 申对月旨、Fmoc_Glu_ (OtBu) -wang resin 申对月旨、Fmoc_Thr(tBu)-wang resin树脂和Fmoc-Ala-wang resin树脂均由吉尔生化(上海)有限公司提供。
[0010]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，所述缩合剂HATU为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，所述催化剂DIPEA为N，N- 二异丙基乙胺。
[0011]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤(6)中所述所得滤液进行减压蒸馏，即在真空度为0.095MPa、温度为40°C条件下蒸干；所述加入乙醚，其乙醚的加入量为所得滤液质量的1/2。
[0012]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤(7)中纯化时的色谱条件为: 流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱(20 X 250mm),线性梯度为O~60min，10~35%B，流速为14ml/min ;所述乙腈溶液为质量百分浓度为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
[0013]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤(8)中所述反应结束后过滤，所得滤液中含有过量的各多肽片段，通过减压蒸馏回收滤液中的各多肽片段，减压蒸馏即在真空度为0.095MPa、温度为40°C的条件下蒸干。
[0014]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤(10)中所述蒸干后所得产物中加入乙醚进行离心，其乙醚的加入量为所得滤液质量的1/2。
[0015]根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤(11)中纯化时的色谱条件为: 流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18
反向柱(20 X 250mm),线性梯度为O~60min, 10~35%B,流速14ml/min ;所述乙腈溶液为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
[0016]本发明涉及到的氨基酸及其试剂缩写详见表1。
表1木发明涉过沾酸缝LA.缩V的含义
【权利要求】
1.一种制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: (1)、多妝片段一Asn_Glu_Ala_Glu_Glu_Val_Val_Glu_Lys_Lys_Glu 树脂的制备: a、首先将Fmoc-Asn(Trt) -wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺； b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌唳与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Asn(Trt)-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； C、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu (OtBu)-OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Asn (Trt) -wang resin 树脂、Fmoc-Glu(OtBu) -OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2: 4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； 将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将 Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu (OtBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Glu (OtBu)-OH 氨基酸、Fmoc-Val-OH 氛基酸、Fmoc-Val-OH 氛基酸、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 氛基酸、Fmoc-Lys(Boc)-OH氨基酸、Fmoc-Lys (Boc)-O H氨基酸和Fmoc-Glu (OtBu)-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多妝片段一 Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu 树脂； (2)、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-1le 树脂的制备: a、首先将Fmoc-Lys(Boc)-wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺； b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌唳与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Lys(Boc)-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Lys (Boc) -wang resin 树脂、Fmoc-Leu-OH 氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； 然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 氨基酸、Fmoc-Lys (Boc) -OH 氨基酸、Fmoc-Thr (tBu) -OH 氨基酸、Fmoc-Thr (tBu)-OH氨基酸和Fmoc-1le-ΟΗ氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-1le 树月旨； (3)、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备: a、首先将Fmoc-Glu-(OtBu) -wang resin树脂加入容器中,然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺； b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Glu-(OtBu)-Wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser (tBu) -OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Glu- (OtBu)-wang resin 树脂、Fmoc-Ser(tBu)-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； 将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser (tBu) -OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂； (4)、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备: a、首先将Fmoc-Thr(tBu) -wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺； b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Thr (tBu) -wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp (OtBu) -OH氨基酸、缩合剂 HATU 和缩合催化剂 DIPEA,所述 Fmoc-Thr (tBu) -wang resin 树脂、Fmoc-Asp(OtBu) -OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2: 4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所 得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； 将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂； (5)、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备: a、首先将Fmoc-Ala-wangresin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30~60min ;所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为Ig树脂:8~12mL 二甲基甲酰胺； b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1,每克Fmoc-Ala-wang resin树脂加入8~12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； C、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应容器中，然后加入Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂HATU和催化剂DIPEA，所述Fmoc-Ala-wang resin树脂、Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂和催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25°C条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次； 然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp (OtBu) -OH氨基酸和Fmoc-Ser (tBu) -OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多妝片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂； (6)、多肽片段的裂解:将上述制备的多肽片段二树脂加入反应容器中，按照Ig多肽片段二树脂:8~12mL裂解液的比例加入裂解液进行裂解，裂解液由三氟乙酸、水和1，2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25°C条件下进行裂解2h，通过裂解将多肽片段二从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液进行减压蒸馏，然后加入乙醚，离心得到粗多肽片段二； 重复步骤(6)依次处理上述制备的多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树月旨，得到粗多肽片段三、粗多肽片段四和粗多肽片段五； (7)多肽片段的纯化: 将步骤(6)得到的粗多肽片段二、三、四和五用流动相A分别进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相分别进行纯化； (8)多肽片段的连接: 将步骤(1)得到的多妝片段一 Asn_Glu_Ala_Glu_Glu_Val_Val_Glu_Lys_Lys_Glu 树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液中进行脱保护5~8min，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺二者之间的质量比为1:1，所述多肽片段一树脂与混合液之间的加入量比例为Ig多肽片段一树脂:8~12mL混合液；脱保护后采用二甲基甲酰胺进行洗涤5~8次，将洗涤后的树脂加入反应容器中，并加入步骤(7)纯化后的多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA进行缩合反应，洗涤后的树脂、多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA四者之间加入量的摩尔比例为1:2:2:4,加入后在25°C下进行缩和反应3h,反应结束后过滤,过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5~8次，洗涤后得到多肽片段二连接到多肽片段一树脂上的产物； 重复步骤(8)，依次将步骤(7)纯化后的多肽片段三、四和五连接到多肽片段一树脂，得到连接后的多肽 片段树脂； (9)乙酰化: 将步骤(8)得到的连接后多肽片段树脂加入反应容器中，并加入乙酸酐、催化剂DIPEA和二甲基甲酰胺，所述连接后多肽片段树脂、乙酸酐、催化剂和二甲基甲酰胺四者加入比例为Ig连接后多肽片段树脂:10mL乙酸酐:20mL催化剂:20mL 二甲基甲酰胺；加入后在室温下搅拌30~40min进行乙酰化反应，通过茚三酮检测反应进程，检测结果为阴性反应结束；反应后进行过滤，所得产物先用二甲基甲酰胺洗涤5~8次，再用无水乙醇洗涤3~5次，洗涤后得到胸腺法新wang树脂； (10)粗肽的裂解: 将步骤(9)得到的胸腺法新wang树脂加入反应容器中，按照Ig胸腺法新wang树脂:8~12mL裂解液的比例加入裂解液，所述裂解液由三氟乙酸、水和1，2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25°C条件下裂解2h，通过裂解使得多肽片段从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液在真空度0.095MPa、40°C条件下减压蒸干，蒸干后所得产物中加入乙醚进行离心，离心后得到胸腺法新粗品； (11)胸腺法新粗品的纯化: 将步骤(10)得到的胸腺法新粗品采用流动相A进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相进行两次纯化； (12)干燥:收集步骤(11)含胸腺法新的流动相，在真空度0.095MPa、30°C下减压蒸干，然后加入乙醚进行离心，离心后得到胸腺法新，接着在真空度0.095MPa、30°C下真空干燥24h，得到胸腺法新成品。
2.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于:所述Fmoc-Asn(Trt) -wang resin 申对月旨、Fmoc_Lys (Boc) -wang resin 申对月旨、Fmoc_Glu_ (OtBu) -wangresin 树脂、Fmoc-Thr (tBu) -wang resin 树脂和 Fmoc-Ala-wang resin 树脂均由吉尔生化(上海)有限公司提供。
3.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于:所述缩合剂HATU为2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，所述催化剂DIPEA为N，N- 二异丙基乙胺。
4.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(6)中所述所得滤液进行减压蒸馏，即在真空度为0.095MPa、温度为40°C条件下蒸干；所述加入乙醚，其乙醚的加入量为所得滤液质量的1/2。
5.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(7)中纯化时的色谱条件为: 流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱(20 X 250mm),线性梯度为O~60min，10~35%B，流速为14ml/min ;所述乙腈溶液为质量百分浓度为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
6.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(8)中所述反应结束后过滤，所得滤液中含有过量的各多肽片段，通过减压蒸馏回收滤液中的各多肽片段，减压蒸馏即在真空度为0.095MPa、温度为40°C的条件下蒸干。
7.根据权利要求1所述的制备高`纯度胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(10)中所述蒸干后所得产物中加入乙醚进行离心，其乙醚的加入量为所得滤液质量的1/2。
8.根据权利要求1所述的制备高纯度胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(11)中纯化时的色谱条件为: 流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱(20 X 250mm),线性梯度为O~60min, 10~35%B,流速14ml/min ;所述乙腈溶液为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
【文档编号】C07K1/06GK103880945SQ201310735479
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月28日 优先权日:2013年12月28日
【发明者】张宝国, 李沁沁, 王艳侨, 翟腾, 朱赞梅, 张亚惠, 苗海敏, 王娜 申请人:郑州大明药物科技有限公司