Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御的制作方法
【专利摘要】Perforin-2(P2)由成纤维细胞、小胶质细胞以及巨噬细胞表达并发现可负责杀死细菌，例如，耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、沙门氏菌(Salmonellae)、MRSA(耐药性葡萄球菌(Stapholococci))、大肠杆菌(E coli)。由筛选检测鉴定出的化合物，是基于这些化合物对P2的作用进行选择的。本发明还涉及这些化合物在用于治疗感染性疾病，特别是治疗细菌以及抗生素耐受的细菌中的用途。
【专利说明】PERFORIN2对侵袭性且多药耐受的病原体的防御
[0001]对通讨EFS-ffeb提夺的作为f本f件的序列表的引用
[0002] 遵照美国信息交换标准编码（ASCII)，与本说明书一起作为文本文件通过 EFS-Web提交了序列表的正式文本，其文件名为"430333seqlist. txt"，创建于2013年3月 12日，并且大小为2KB。通过EFS-Web提交的所述序列表是本说明书的一部分并且通过整 体引用并入本申请。
[0003]联邦咨助声明
[0004] 本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号CA109094的政府支持下完成的。美国 政府具有本发明的某些权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及抗生素以及药物开发领域。更具体地，其涉及有利于增强机体针对微 生物感染的天然防御能力的方法及化合物。
【背景技术】
[0006] Perforin是在⑶8T细胞及NK细胞颗粒中发现的细胞溶解蛋白。在脱颗粒 时，perforin将其自身插入祀细胞的质膜，形成孔。发明人的实验室对Perforin的克隆 (Lichtenheld, M. G. , et al. , 1988. Nature 335:448-451 ；Lowrey, D. M. , et al. , 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86:247-25 1)and by Shinkai et al(Nature(1988)334:525-527)证 明了补体成分 C9 与 perforin 的假定的同源性（DiScipio, R. G. , et al. , 1984. Proc Natl Acad Sci USA81:7298-7302)。
[0007] Perforin-1与Perforin-2 (P2)两者都是孔形成物，其作为亲水的、水溶性的前体 被合成。两者都能插入脂双层并在其中进行多聚化，以形成大的充水的跨膜孔。充水的孔 由圆柱体蛋白多聚体形成。
[0008] 所述圆柱体内部必然具有亲水性表面，因为它形成了充水的孔；而圆柱体外部需 要呈疏水性，因为它锚定于脂质核心体中。所述核心体结构被认为是由两亲性螺旋体（螺 旋转角螺旋）形成的。正是这部分被称为MAC-Pf(膜攻击复合物/Perforin)结构域的蛋白 结构域，在Perforin与C9及其它形成补体的膜攻击复合物（MAC)的补体蛋白间最保守。
[0009] Spilsbury最先描述了（Blood(1995) 85:1620-1629)在人类和鼠类巨噬细胞（称 之为Mpg 1或Mpeg 1巨噬细胞表达基因）中表达的mRNA，其预测具有MAC/Pf结构域的蛋 白。随后，发现相同的mRNA(命名为MPS-1)在实验朊病毒疾病中上调。利用2D-凝胶电 泳及质谱法，Desjardin的团队分析了从喂有乳胶珠的巨噬细胞中分离的吞噬体膜的蛋白 组分（J Cell Biol 152:165-180,2001)。这些作者发现了与MPS-1蛋白对应的蛋白质点。 Mah等分析了鲍鱼软体动物并在其血液中发现了与Mpegl基因家族同源的mRNA(Bi 〇Chem Biophys Res Commun 316:468-475, 2004)，并提不预测的蛋白具有与 CTL perforin 相似的 功能，不同之处在于它是软体动物先天性免疫系统的一部分。
[0010] 发明概沭
[0011] 本申请描述了涉及调节P2表达或活性的组合物及方法，包括那些对治疗微生物 感染有益的组合物及方法。
[0012] 附图简沭
[0013] 图1A-1C显示了 Perforin-2增强R0S和N0的杀菌作用。用10mM NAC阻断R0S、 用10mM L-NAME阻断N0、或用3种P2特异性的siRNA池阻断P2,都抑制了细胞内的杀伤 作用。如图2A-2F所示开展了庆大霉素保护试验。在转染了 P-2siRNA或杂乱（scramble) siRNA后24h，用（图1A)大肠杆菌、（图1B)鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimuriu)或（图1C) 耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感染了 PEM。在感染前lh加入了抑制剂并在测试期间保持。 于感染后lh和5h裂解了细胞并确定了 CFU。显示的数据代表了重复2次的3个实验；星 号代表基于学生t检验的显著性（p〈0. 05)。
[0014] 图2A-2F显示了 Perforin-2是成孔蛋白。（图2A)P-2结构域的结构；TM，跨膜结 构域；Cyto,胞质结构域。经中性钠磷鹤酸负染的聚合perforin-2膜损伤的电镜照片。（图 2B)膜结合的、聚合perforin-2的概观。需要注意的是，充满染液的孔的内径为9. 2nm。（图 2C)在更高放大倍数下观察到的不完全聚合的复合物（如箭头所示）。（图2D)箭头指向了 较为罕见的、从斜位角度观察的聚-P2复合物斜视图，该成像描述了三维形状。（图2E，2F) 膜相关的聚-P2的两种侧面图。（图2G)用铀酸盐对源自CTL 3的膜结合Perforin-1 (P-1) 进行了染色，用于比较，并且其放大倍数与图2A中的Perforin-2相同；需要注意的是，与 P-2的孔径（9. 2nm)相比，P-1的孔径（16nm)更大。
[0015] 图3A-3I显示了 Perforin-2在巨噬细胞和小胶质细胞内杀死耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌（S.aureus(MRSA))、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium)、鸟分枝杆菌（M.avium)、 耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)、以及大肠杆菌（E.coli)。如方法中所示，感染细胞，将其洗 涤以去除残留的细胞外细菌，并加入庆大霉素。在所示时间裂解细胞并确定菌落形成单位 (CFU)，以测量细胞内存活情况（图3A-3D):在RAW、PEM以及BV-2小胶质细胞中，P-2siRNA 池对P-2的抑制允许本该被杀死的病原性细菌在细胞内存活。（图3E) :P-2抑制，Western blot分析了在P-2siRNA处理后，P-2在RAW细胞内的蛋白表达。（图3F和3G):与载体对 照相比，过量表达P-2-RFP融合蛋白导致对细菌的杀伤作用增强。（图3H):在巨噬细胞内 抑制内源性P-2并用P-2-RFP融合蛋白进行补充，恢复了针对耻垢分枝杆菌（M. smegmatis) 的杀伤活性。（图31):用Western blot法分析了 P-2-补充试验中，RAW细胞内P-2以及 P-2-RFP的表达。显示的图表代表3个或更多的实验，每个实验设3个复孔。星号代表由学 生t检验确定的显著性（p〈0. 05)差异。
[0016] 图4A-4D显示了 Perforin-2-GFP在巨噬细胞中的胞内定位。用P-2-GFP转染了 RAW细胞，并于24h后固定、染色多种细胞器。P-2-GFP与ER(图4A)以及高尔基体膜和反面 高尔基体管网状结构（图4B)共定位，但不与质膜（图4C)或溶酶体（图4D)共定位。图 像中的下图以单独的彩图形式显示了叠加图（左图）中的所示区域。在该叠加图中，共定 位显示为黄色。
[0017] 图5A、5B显示了在RNA以及蛋白水平上对P-2的抑制进行定量。在图5A的RAW细 胞以及图5B的PEM细胞内，将siRNA介导的P2抑制与杂乱siRNA对照进行比较。柱状图 显示了用定量的TAQMAN? RT-PCR确定的在各种细胞内P-2相对的mRNA表达水平。将P-2 的mRNA水平对GAPDH进行了基准化。Western blot分析显示了在处理组的样品中，蛋白水 平与mRNA表达相对应。在转染后24hr收获了细胞，用于分析。
[0018] 图6显示了 R0S以及N0的抑制剂并非直接抑制细菌生长。在存在或不存 在NAC(10mM)或L-NAME(10mM)的条件下，使大肠杆菌（E. coli)、鼠伤寒沙门氏菌 (S. typhimurium)、或耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)于IMDM+10% FBS中生长5小时。在培 养基中加入抑制剂后1小时和4小时，用分光光度计在0D值为600nM的条件下，测量细菌 生长情况。
[0019] 图7显示了 Perforin-2在系统进化过程中的保守性。将来自多物种的预测性蛋 白序列进行了比对（Vector NTI，Invitrogen)。MACPF和P-2的结构域用方框突出，用方框 突出跨膜结构域并以黄色高亮显示。以粉色高亮和灰色高亮分别突出了胞质结构域中保守 的酪氨酸和丝氨酸。红色字体以及黄色高亮表明所有物种间的一致性，蓝色高亮表明在四 个或多个序列间的一致性，绿色表明保守性替换。
[0020] 图8显示了对P-2-GFP的转染及蛋白表达的确认。用Western blot法分析了 转染的P-2-GFP在293细胞内的表达；用针对P-2的胞质结构域制备的多克隆抗血清 (P-2cyto)、市售的肽抗血清（P-2Abcam)、以及抗GFP的抗体，检测P-2-GFP。P-2-GFP迁移 至约110kD预期大小的位置。
[0021] 图9A-9D显示了在巨噬细胞、树突及小胶质细胞和细胞系中，P-2介导细胞内杀 菌活性。在存在GM-CSF的条件下，使BMDM/DC从鼠类骨髓中分化10天，并随后用（图9A) LPS(lmg/ml)以及IFNy(100U/ml)或（图 9B)poly(I:C) (3mg/ml)对所得的 BMDM/DC 进行 48hr的刺激。（图9C)用IFNy(100U/ml)对BV2小胶质细胞进行24hr的刺激。（图9D) 用LPS(lng/ml)以及IFNy(100U/ml)对RAW细胞进行24hr的刺激。于所示的时间点收获 细胞，并用TAQMAN? RT-PCR分析P-2相对于GAPDH的信使表达。
[0022] 图10A-10E显示了对P2的抑制抑制了细胞内杀菌活性。（图10A-10C)在M0I为 10的条件下用耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)、MRSA、以及鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium) 分别感染经P_2siRNA (虚线柱）或杂乱siRNA对照（实心黑柱）处理的RAW细胞。（图10D 和10E)用P2siRNA或杂乱siRNA对照处理PEM以及BMDM/DC，并在M0I为10的条件下用耻 垢分枝杆菌（Msmegmatis)对其感染。于所示时间点，用庆大霉素保护试验确定存活的细 胞内细菌，并用CFU检测进行计数。显示的图表代表每例细胞：细菌组合的至少3次实验。 误差线代表2-3次重复产生的s. e. m.。星号代表利用学生t检验得到的显著性差异。
[0023] 图11A-11F显示了 P-2-RFP的过量表达提升细胞内杀伤活性。如材料与方法中所 述，用包含所述P-2-RFP融合蛋白的载体（黑柱）或对照的空白载体（阴影柱）转染所示 细胞，并在M0I为10的条件下用所示细菌感染所述细胞。于所示时间点对存活的细菌进行 计数。显示的图表代表每例细胞：细菌组合的至少3次实验。误差线代表2-3次的技术重 复产生的s. e. m.。星号代表利用学生t检验得到的显著性差异。
[0024] 图12A，12B显示了 P-2-RFP转染进内源性P-2抑制的细胞内，恢复了细胞内杀菌 活性。如材料与方法中所述，将靶向P-2的3' UTR的siRNA和包含P-2-RFP融合蛋白的载 体或单独的空白载体，共转染入BMDM/DC(图12A)或RAW细胞（图12B)，并用所示细菌感 染该细胞。红线指示了与对照的RFP载体相比，P2RFP对细胞内细菌存活的效应；以及黑线 代表与同实验中的杂乱siRNA对照相比，P2siRNA的处理（仅靶向3'UTR)对细菌存活的效 应。误差线代表3-4次单独实验的s. e. m.，每次实验设2-3个复孔。
[0025] 图13A-13C显示了 P-2未与早期内涵体的标记物或细胞核共定位。（图13A)瞬时 转染入RAW细胞并在其内表达的P2-GFP(左图）和GFP(右图），两者的染色模式具有差异 性。P-2-GFP不与（图13B)早期内涵体（EEA-1，红色）或（图13C)细胞核（Hoechst，红 色）共定位。用Leica SP5倒置共聚焦显微镜，并在40X物镜下，采集了图像。
[0026] 图14A-14J显示了 1型以及2型干扰素上调Perforin-2的mRNA。用100U/ml的干 扰素_ a、干扰素_ 0、以及干扰素-Y对鼠类胚胎成纤维细胞（图14A)、结肠癌细胞系（图 14B)、成肌细胞系（图14C)、以及卵巢细胞系（图14D)处理14小时。用lng/ml LPS，10U/ mlIL-1 a，lng/ml IL-1 P，以及 20ng/mL TNFa 进行处理。用 150U/ml 的 IFN-a，l〇〇U/ml 的IFN-0以及IFN-y处理人类胚胎肾细胞系（图14E)以及宫颈癌细胞系（图14F)。用 100U/ml的鼠类干扰素-Y刺激BV2小胶质细胞系14小时，以上调P-2的mRNA以及蛋白质 水平。用IFN-y处理mEF 14小时（mEF)，或处理完后接着用25mM的MG-132(mEF+MG132) 处理1小时（图14G)。对经所示的重组型人IFN处理过的人类原代角质形成细胞进行蛋 白质表达分析（图14H)。用大肠杆菌（E. coli)或耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)处理mEF。 于所示时间点，收获细胞，并用TAQMAN? PCR法分析P-2的mRNA水平并将其与未感染的对 照组进行比较。（图141)对mEF不刺激，或者经100U/ml的IFN-Y刺激14小时。在刺激 之后，用耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感染mEF，并于所示时间点分析菌落形成单位。
[0027] 图15A-15F显示了在细菌上的聚-perforin-2孔。用鼠源干扰素处理mEF 14小时，并随后用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（S. aureus)(图15A，15B)或耻垢分枝杆菌 (M. smegmatis)(图15D，15E)感染所述mEF。于感染后5小时，用去垢剂裂解mEF，收获完整 的细菌并将其负染以进行透射电子显微镜检查。将过量表达的P-2cDNA的HEK293细胞膜 进行加工，以作为阳性对照使用（图15C)。显示了位于大肠杆菌（E. coli)上的补体孔的 膜攻击复合物（MAC)，用于比较19(图15F)。
[0028] 图16A-16L显示了抑制内源Perforin-2增强了细胞内的细菌生长。用P-2siRNA 池，或P-2-RFP瞬时转染小鼠直肠癌CMT-93细胞。还转染并分析了杂乱siRNA或RFP，以分 别用作P_2siRNA和P-2-RFP的对照。所有转染于感染前24小时进行。在感染前14小时， 将细胞与l〇〇U/ml的物种特异性的IFN-Y孵育。于所示感染后的时间点，裂解细胞并铺板 以进行CFU分析。（图16A-16D)用P-2siRNA转染mEF，并于感染前24小时补充siRNA耐 受的P-2-RFP cDNA。于感染前14小时，加入干扰素Y。用处于后对数期的鼠伤寒沙门氏 菌（S. typhimurium)感染mEF。于所示时间点裂解mEF并进行菌落形成单位分析。于感染 前24小时，用物种特异性的P-2siRNA或杂乱siRNA转染小鼠星形胶质细胞（图16F)、人胰 腺癌（图16G)、人膀胱癌（图16H)、小鼠成肌细胞（图161)、人宫颈癌（图16J)、小鼠卵巢 癌（图16K)、人脐带静脉内皮细胞（图16L)，并于感染前14小时，用物种特异性的IFN-Y 刺激这些细胞。用所示细菌感染细胞，并于所示时间点裂解所述细胞以确定CFU。
[0029] 图17A-17J显示了 P-2提升细胞内细菌对溶酶体的易感性。（图17A-17C)由相 位光学显微镜（放大倍数：50x)拍摄的、在Middlebrook 7H11琼脂板上铺板的耻垢分枝 杆菌（M. smegmatis)微菌落的代表性图像。（图17A)与mEF孵育前铺板的耻垢分枝杆菌 (M. smegmatis)(图17B)对用IFN- Y预活化的mEF感染5小时，在冰上对照（无溶菌酶） 孵育30min然后铺板的耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)。（图17C)对用IFN- Y预活化的mEF 感染5小时，在冰上用溶菌酶孵育30min然后铺板的耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)。（图 17D)溶菌酶对于经耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感染的mEF的效应的定量分析，百分数 来自于在感染5小时之时的各个铺板样品。结果由5次实验组成，每次均进行了技术性重 复。计数了 1000个细菌，并在饱满形态与正常形态间进行区别，并显示饱满形态的细菌的 百分比。（图17E-17G):在感染前24小时，用杂乱siRNA(图17E)、P-2siRNA(图17F)、以 及P-2-RFP (图17G)转染mEF，并用IFN- Y对所述mEF刺激14小时，随后用MRSA感染所述 mEF。于所述时间点，裂解真核细胞以收获细胞内细菌，并将其分为六等份。对这些细菌裂 解物的等份，一半用溶菌酶处理，剩余的给予缓冲液处理。在冰上处理30分钟以允许溶菌 酶发挥活性之后，将细菌铺板以分析溶菌酶的作用。（图17H-17J)将杂乱siRNA(图17H)、 P-2siRNA (图171)、或P-2-RFP (图17J)瞬时转染小鼠直肠癌细胞系CMT-93,并用IFN-y 刺激所述细胞。处理之后，用耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感染这些细胞。于所示时间点， 裂解所述真核细胞并分析溶菌酶介导的杀伤作用。
[0030] 图18A-18I显示了在人体及小鼠组织中，可用1型及2型干扰素诱导产生P-2。（图 18A-18D)经1型及2型干扰素处理后，可在结肠细胞癌（图18A)、黑色素瘤（图18B)、原代 脑膜成纤维细胞（图18C)、原代星形胶质细胞（图18D)中诱导产生鼠类P-2mRNA的转录 子。（图18E-18I)经1型及2型干扰素处理后，在膀胱癌（图18E，18F)、胰腺癌（图18G)、 原代角质形成细胞（图18H)、以及脐带静脉内皮细胞（图181)中诱导产生人P-2mRNA。
[0031] 图19A-19G:显示了用P-2siRNA进行mRNA抑制的效率。在以下条件下，测量了 P-2 转录子：未转染、转染了 P_2siRNA、或转染了杂乱siRNA。用100U/ml的IFN-y对所有细胞 刺激14小时。（图19A-19D)以下的小鼠细胞系为对siRNA处理后的P-2抑制的代表性取 样。这些包括：mEF (图19A)、直肠癌（图19B)、脑膜成纤维细胞（图19C)、以及星形胶质细 胞（图19D)。此外，以下的人细胞系也将作为使用人P-2特异性的siRNA进行P-2转录子 抑制的代表性取样。这些包括HUVEC(E)、胰腺癌（图19F)、以及膀胱癌（图19G)。Y表明 经过qRT-PCR 45个循环后，未检测出P-2转录子。
[0032] 图20A，20B显示了对P-2的抑制使得细菌在细胞内的复制不受阻碍，这导致真核 细胞死亡。用台酚蓝排除法确定经siRNA处理的mEF在被耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感 染后的绝对活细胞计数（图20A)和生存力（图20B)。显示的数据来自4次单独的实验。
[0033] 图21A-21AF显示了对Perforin-2的抑制在多种细胞类型上增强细胞内细菌的生 长。于感染前24小时，用P-2siRNA或杂乱siRNA瞬时转染以下细胞：（图21A-21C)鼠类 C2C12成肌细胞、（图21D-21F)鼠类卵巢M0VAC 5009、（图21G-21I)人HeLa宫颈癌、（图 21J-21L)人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)、（图21M-21P)鼠类卵巢M0VAC5447、（图21Q-21T) CT-26结肠癌、（图21U-21X)鼠类B16F10黑色素瘤、（图21Y-21AB)人MIA-PaCa-2胰腺 癌、（图21AC-21AF)人UM-UC-9膀胱癌。于感染前14小时，将细胞与物种特异性的100U/ ml的IFN-y孵育。于所示感染后的时间点，裂解细胞并铺板以分析CFU。
[0034] 图22A-22C显示了补充P-2恢复了内源P-2被抑制的细胞的杀伤活性。用 P-2siRNA转染、并且用抗siRNA的P-2cDNA共转染的mEF细胞能够恢复针对（图22A)耻垢 分枝杆菌（M. smegmatis)、（图22B)大肠杆菌（E. coli)、以及（图22C)MRSA的杀伤活性。
[0035] 图23A-23C显示了单独的溶菌酶未降低CFU。处理了 MRSA(Figure 23A)、大肠杆菌 (E. coli) (Figure 23B)、以及耻垢分枝杆菌（M. smegmatis) (Figure 23C)，以确定这些细菌 各自对溶菌酶效应的易感性。三个分别的实验在在冰上孵育30分钟之前以及之后、在有或 没有溶菌酶添加的条件下以CFU计数显示。
[0036] 图24A-24L显示了溶菌酶增强Perforin-2的杀菌作用。Perforin-2能够调节溶菌 酶针对之前无应答的细菌的杀菌活性。对于经大肠杆菌（E. coli)感染的mEF(图24A-24C)、 经耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)感染的mEF(图24D-24F)、经大肠杆菌（E. coli)感染的 CMT-93 (图24G-24I)、以及经MRSA感染的CMT-93,溶菌酶呈现出增强的活性。
[0037] 图25A-C显示了缺乏P-2导致致死性的细菌生长失控。（a)每天测量 P-2+/+(0)，P2-/-(0)以及P-2+/-(0)同窝小鼠体重。给予小鼠20mg的链霉素，并于 24h后，经口胃管饲法给予105或102个鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium) RL144。n = 10和 15(分析方法：对每排数据进行多次非配对t检验）。（b)鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium) 自肠向血液、肝脏以及脾脏扩散（分析方法：Kruskal - Wallis检验）。（c)与siRNAP-2抑 制的PEM( □)相比，在P2-/-基因型的PEM( □)中，鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium)的 复制不受控制；如材料与方法中所述，进行了 CFU检测（分析方法：非配对t =检验）。
[0038] 图26A-F显示了 P-2被广泛表达，并且P-2针对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)和鸟分枝杆菌（M. avium)、以及 MRSA具有杀菌作用。（a).对来自人类血液的PMN以及巨噬细胞进行了 Western blot分析， 并对经siRNA处理的、HL60-来源的PMN进行了 western blot分析以及CFU测试。如方法中 所述，用所示细菌感染经P-2特异性的（□)以及杂乱对照的（O)siRNA转染的HL60/PMN 细胞，并于所示时间分析了 CFU。（b)对经IFN □诱导后用所示细菌感染的肠内皮CMT93细 胞进行CFU测试。用P-2特异性的（□)或杂乱对照的（□ ) siRNA，连同P-2-RFP ( □)或 RFP(D)的质粒-cDNA，转染细胞，并于感染前用IFN-y对所述细胞进行过夜刺激。（c) (d) 在原代人脐带内皮细胞（HUVEC)或宫颈上皮细胞（HeLa)内，IFN-Y诱导的P-2杀死了耻垢 分枝杆菌（M. smegmatis)(及其它细菌一未在本申请中显示）。（e)P-2-RFP转染的RAW巨噬 细胞中鸟分枝杆菌（M. avium)的彻底清除。（f)用P-2-RFP补充了 MEF中内源性抑制的P-2。 对经P-2siRNA和P-2-RFP转染并经IFN- Y活化、随后用沙门氏菌（Salmonella)感染的 MEF 进行 CFU 测试以及 western blot 分析；P-2siRNA+RFP( □)，P-2siRNA+P-2-RFP( □)， 以及杂乱siRNA+RFP( ▲)。用t检验进行统计学分析。
[0039] 图27A-E显示了细菌具有阻断P-2的机制。（a)沙门氏菌（Salmonella)阻断了初 始MEF (未经IFN活化）内对P-2mRNA的诱导。在经所示的沙门氏菌（Salmonella)以及大 肠杆菌（E. coli)菌株感染后，P_2mRNA的相对水平。（b)沙眼衣原体（C. trachomatis)阻 断了 HeLa细胞内由IFN- □介导的、对P-2mRNA表达的诱导。经氯霉素（Cm)处理的衣原体 诱导了 P_2mRNA。数据以来自3个重复性样品的均数土标准差给出。（c)肠致病性大肠杆 菌（EPEC)若携带CIF质粒，能阻断P-2介导的杀伤作用。（d)切自未愈的慢性溃疡组织边 缘的真皮及表皮上的P-2的信使水平。按照与慢性皮肤溃疡的距离，将所述皮肤样品一半 分成邻近组，一半分成远距组，并描述了临近组P_2mRNA对远距组P-2mRNA水平的比值。用 t检验进行了统计学分析；n = 10。
[0040] 图28A-D显示了 P-2易位至含有细菌的液泡。（a).蛋白质结构域的结构，预测的 膜囊泡内P-2的跨膜方向，以及胞质结构域在哺乳动物种属间的序列保守性。（b)在经沙门 氏菌（Salmonella)感染后5min，经P-2siRNA和瞬时P-2-GFP (绿色）转染的BV2细胞的代 表性共聚焦图像；DNA经DAPI染色以假色白色显示。显示了代表整个细胞的三个的垂直的 1. 2 ii的切片。（c)在大肠杆菌-GFP (绿色）感染5min的、经P-2siRNA和瞬时P-2-GFP (红 色）转染的并随后固定及成像的BV2小胶质细胞的代表性共聚焦图像。（d)P-2-GFP在未被 感染的细胞内定位于核周；显示了荧光图像以及对应的相位图像。
[0041] 图29A-C显示了 Perforin-2形成的孔。（a) poly-P-2孔在Hek-293细胞膜上的电 子显微镜成像。白色箭头显示了典型的聚合环结构，充满染液的孔的内径为9. 2±0. 5nm。 黑色箭头指向了聚合不完全且不规则的复合物。用中性钠磷钨酸盐进行了负染。（c，d)在 感染了 IFN-y诱导的MEF细胞后，在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis) (c)以及MRSA(d)上的 聚合化P-2膜损伤的电子显微镜图像。如方法中所述，分离了细菌膜，并对其进行负染以进 行透射电子显微镜检测。白色箭头指向由白色窄界围绕的细菌细胞壁上环状黑色的、充满 染液的孔，所述白色窄边推测是在聚合过程中的P-2形成的。黑色箭头指向不规则聚合物。
[0042] 图30 :㈧在直肠上皮癌细胞中的P_2siRNA抑制导致了鼠伤寒沙门氏菌 (S. typhimurium)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，临床分离株）和耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis)的细胞内的复制；P-2-RFP的过量表达升高了对细胞内细菌 的杀伤作用。（B)当内源性P-2被抑制时，转染P-2-RFP恢复了 mEF内的杀伤活性，而转 染RFP无此效应。（C)用western blots法对P-2的抑制以及补充P-RFP进行检测。于感 染前24小时，将特异性针对P-2的3' UTR的P-2-siRNA或杂乱siRNA，连同RFP或缺失内 源性P-23'UTR的P-2-RFP，转染细胞。在-16h时，将细胞与100U/ml的IFN- Y孵育，以诱 导产生P-2-RNA。在Oh时，在Mol为30的条件下将细胞与细菌孵育lh，洗涤细胞以去除外 部的细菌，并与庆大霉素一起再次铺板，以阻止细胞外细菌生长。于所示时间，用NP40裂解 宿主细胞并在所述裂解物中确定CFU。需要注意的是，P-2siRNA对P-2的抑制升高了细胞 内的CFU，表明P-2的阻断准许细菌复制并杀死宿主细胞（如本申请所示，沙门氏菌除外）。 用P-2-RFP(P-2C端与RFP的融合物）而非RFP进行转染升高了对细胞内细菌的杀伤作用 (左侧3图），或者在当P-2被抑制时恢复P-2的活性。
[0043] 图31:在P-2被抑制、并且只有R0S和N0存在（红色圆圈）的条件下，细胞内细菌 的复制。当P_2、R0S以及N0都存在时，具有良好的杀伤作用（绿色球）。在P-2+N0 (黑色实心 三角）或P-2+R0S(菱形）条件下，杀伤作用呈中间水平。P-2抑制的效率（右图）。细胞：经 IFN处理的、由巯基乙酸盐促发的腹膜巨噬细胞，以及鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium)。
[0044] 图32 : (a)P-2-GFP、RASA2以及LC3-RFP共定位于被内吞的细菌上。顶端两图：IFN 活化的BV2细胞经DAPI (DNA)、RASA-2抗体染色，并用P-2-GFP和LC3-RFP转染。所有其它 图：BV2细胞以比例100:1感染鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium) 5min，并随后用 多聚甲醛进行固定。荧光的标记分子如图中所示。需要注意一个细胞外细菌（箭头）以及 若干被杀死的细胞内细菌（星号）如DAPI染色和P-2-GFP所示。RASA2与LC3-RFP共定 位。（b)在对经IFN活化的BV-2细胞感染的5分钟内，P-2-RFP向包含大肠杆菌-GFP的液 泡易位（相位图像中的箭头）。
[0045] 图33 :在转染了 P-2-GFP并用RASA2抗体染色的未被感染的静息RAW细胞内，P-2 与RASA2在核周膜内或核周膜上的共定位。
[0046] 图34 : (a) IFN对mEF的活化升高了 P_2mRNA的表达（左图，Taqman PCR)并增强 了针对分枝杆菌（Mycobacteria)的细胞内杀伤作用（右图，庆大霉素保护试验）。（b)活 的野生型沙门氏菌（Salmonella)抑制了 mEF内的P-2诱导。热灭活的和PhoP突变的沙门 氏菌（Salmonella)，以及大肠杆菌（E. coli)K12,诱导产生P-2。感染mEF并于lh后洗涤并 在庆大霉素中铺板。
[0047] 图35:(a) siRNA对RASA2的抑制作用抑制了 BV2对分枝杆菌（Mycobacteria)的 细胞内杀伤作用，并允许细胞内复制（实心柱）。（b)在转染了 P-2-GFP的RAW细胞中，用 抗GFP对P-2-GFP进行免疫沉淀，并捕获RASA2。
[0048] 图36 :mEF杀死了细胞内MRSA并产生了与真核细胞膜上的poly P-2类似的细胞 壁损伤。左图：于感染后4小时，通过用去垢剂裂解mEF，获得了 MRSA细胞壁；用甲酸双氧铀 进行负染。右图AEK293膜上的poly P-2复合物；用钠磷钨酸盐进行负染。比例尺：40〇A. 需要注意的是，细胞壁/细胞膜具有类似大小的孔径(90A)。
[0049] 图37 :siRNA对Atgl4L或P-2的抑制阻断了杀伤作用并使得细胞内细菌能够在 BV2小胶质细胞内复制。用庆大霉素保护试验确定了对分枝杆菌（mycobacteria)的细胞内 杀伤作用或其存活力。
[0050]图 38 :siRNA 对（a)P-2,（b)Atgl4L，（c)Atgl6L，（d)Atg5 的抑制使得沙门氏菌 (Salmonella)能在mEF内复制。在mEF内，P-2抑制沙门氏菌（Salmonella)在细胞内的复 制，当P-2被抑制时，沙门氏菌（Salmonella)可以复制。据报道，对自噬水平的抑制能产生 同样的效应，这与我们在本申请中公开的数据是一致的。
[0051] 图39 :3-MA抑制了 vps34并允许沙门氏菌（Salmonella)在mEF内产生与P-2抑 制相似（a-c中的红线）的复制（c中的蓝线）。与杂乱siRNA(图a中的蓝色）相似，巴弗 洛霉素（Bafilomycin)(图b中的蓝色）能抑制P-2介导的对沙门氏菌（Salmonella)的抑 菌作用。
[0052] 图40 :Perforin_2作用机制的模型。
[0053] 发明详沭
[0054] 定义
[0055] 在详细描述本发明之前，给出以下定义，以说明并明确用于描述本申请中的发明 的术语的含义及范围：
[0056] 术语"调节"，意味着任何一种提及的活性被升高、增强、激动（作为激动剂发挥作 用）、促进、上调、降低、减少、抑制、阻断、下调、或拮抗（作为拮抗剂发挥作用）。调节作用 可以将活性相对于基线值"升高"或"上调"多于1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调 节作用也可以将活性降低或下调至低于基线值。本申请所使用的"降低"或"下调"意味着 相对于合适的对照，至少降低了 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%。调节作用还可以将活性基准化至基线值。
[0057] 本申请所使用的"药学上可接受的"成分/运载体等，是适合用于人类和/或动物、 且无过度的副作用（例如毒性、刺激、以及过敏反应）并相应具有合理的收益/风险比的 一类成分/运载体等。
[0058] 本申请所使用的术语"安全并有效的量"是指在以本发明所述的方式使用时，能足 以产生所需要的治疗性应答、且无过度的副作用（例如毒性、刺激、或过敏反应）并相应具 有合理的收益/风险比的成分的量。"治疗有效量"是指本发明中能有效产生所需要的治疗 性应答的成分的量。
[0059] 本申请中互换使用术语"患者"或"个体"，所述术语是指治疗的哺乳动物受试者， 优选人类患者。在一些情况下，本发明所述方法用于实验性动物中、兽医应用中（例如在 猫、狗、马、牛、羊、及猪中）、以及在开发疾病的动物模型中（包括，但不限于，啮齿类动物 (包括小鼠、大鼠、以及仓鼠）；以及灵长类动物）。
[0060] "治疗"是一种干预，意图防止疾病的病理或症状发展或改变。据此，"治疗"是指 治疗性处理及预防性或防范性措施。
[0061] "靶分子"包括影响或调节Perforin-2的表达、功能或活性的任意分子。这包括例 如表1中的分子，以及与那些尚待鉴定的分子。
[0062] 依据本发明，在本领域的范围内，可以采用常规的分子生物学、微生物学、重组 DNA、免疫学、细胞生物学以及其它相关技术。可参阅如下文献：如Sambrook et al.，（2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, New York ；Sambrook et al. , (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York ；Ausubel et al.,eds. (2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons, Inc. :Hoboken, NJ ;Bonifacino et al.,eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons, Inc. :Hoboken, NJ ; Coligan et al. , eds. (2005)Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons,Inc. :Hoboken, NJ ;Coico et al. , eds. (2005)Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc. :Hoboken, NJ ；Coligan et al. , eds. (2005) Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc. :Hoboken, NJ ； Enna et al. , eds. (2005)Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons,Inc. :Hoboken, NJ ；Hames et al. , eds. (1999)Protein Expression:A Practical Approach. Oxford University Press:Oxford ；Freshney (2000)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique.4th ed.Wiley-Liss;等等。以上列出的最新实验方 案每年更新数次。
[0063] 治疗性组合物
[0064] 实施方式涉及在体外以及在体内鉴定调节Perforin-2的表达、功能、或活性的化 合物。所采取的途径之一是鉴定调节P2的表达、功能、或活性的分子。基于酵母杂交系统 鉴定了这些分子，这在后面的实施例部分有详细描述。候选治疗剂对Perforin-2的表达、 功能或任何活性的调节将有效地预防或治疗病原性生物感染，尤其是那些对抗生素已经发 展出以及有可能发展出耐药性的生物，例如，细菌。
[0065] 在一个实施方式中，公开了一种在体外或在体内调节Perforin-2 (P2)的功能、活 性、或表达的方法包括：在体外接触细胞或向患者施用有效量的至少一种试剂，所述试剂调 节与P2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子的功能、活性或表达。
[0066] 在另一个实施方式中，公开了鉴定调节Perforin-2的表达、功能或活性的至少一 种试剂的方法，包括：将表达与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个祀分子 的细胞与所述的至少一种试剂接触；测定所述与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的 一个或多个靶分子的表达、功能、或活性；以及将所述一个或多个靶分子的表达、功能、或活 性与对照组比较，其中，与所述至少一种试剂的接触调节所述一个或多个靶分子的表达、功 能、或活性，从而鉴定调节Perforin-2的表达、功能或活性的试剂。
[0067] 在一些实施方式中，所述与P2的功能、活性或表达相关的一个或多个靶分子包 括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gaplm、半乳凝集素3、泛素C(UCHLl)、蛋白酶、 vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、或上述分子的片段或相关分子。与 所述靶分子相关的分子，可以是任何涉及这些靶分子参与的多种通路的细胞内分子，与这 些分子、信号通路相关的分子，以及调节这些靶分子的转录和翻译的分子。
[0068]在其它实施方式中，所述至少一种试剂能上调与Perforin-2的表达、功能、或 活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能、或活性。或者，所述至少一种试剂下调与 Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个祀分子的表达、功能、或活性。
[0069]在一些实施方式中，通过施用所述至少一种试剂，能上调P2的表达、功能、或活 性，所述试剂上调与P2的功能、表达或活性相关的所述一个或多个靶分子的功能、活性、或 表达。
[0070]在一些实施方式中，通过施用所述至少一种试剂，能下调P2的表达、功能、或活 性，所述试剂下调与P2的功能、表达或活性相关的所述一个或多个靶分子的功能、活性、或 表达。
[0071]在一些情况下，可能需要上调一些所述的靶分子并抑制其它靶分子的功能、活性、 或表达或使其保持不变。因此，在一些实施方式中，通过施用至少一种试剂来上调所述P2 的表达、功能、或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少 两种分子的功能、活性、或表达。
[0072]在其它实施方式中，通过施用至少一种试剂，下调所述P2的表达、功能、或活性， 所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功能、活 性、或表达。
[0073]在另一实施方式中，通过施用至少两种试剂的组合，上调所述P2的表达、功能、或 活性，所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功 能、活性、或表达。
[0074]在一些实施方式中，通过施用至少两种试剂的组合，下调所述P2的表达、功能、或 活性，所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功 能、活性、或表达。
[0075]在其它实施方式中，对P2的表达、功能、或活性的调节包括施用能直接调节所述 P2分子的表达、功能、或活性的试剂任选步骤。这样的分子，可以是那些抑制P2的转录或翻 译的分子。例如，参见US专利
【发明者】L·德阿马斯, K·利亚皮切夫, R·麦科马克, E·波达克 申请人:迈阿密大学