棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体提供了棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，其全长编码序列如SEQ?ID?No.1所示。基于该基因序列设计的dsRNA能够显著抑制棉铃虫转铁蛋白基因的表达，并表现出该dsRNA能够影响棉铃虫的生长发育，表现为发育迟缓以及对植物次生性物质2-十三烷酮敏感性升高的现象。
【专利说明】棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf及其应用。【背景技术】
[0002]化学杀虫剂的广泛使用对于有害生物的控制非常有用，但长时间以及大规模的使用化学杀虫剂，对于环境以及高等食肉动物的危害也是不可忽视的，化学杀虫物质的积累导致对这些物质抗性的发展，并且可能在进化梯中高等的物种中，成为诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害的遗传修饰。植物次生物质具有对病虫草害防治效果好、且对人畜安全、不污染环境、无残留对、病虫草害特异性强、源于自然易被降解、害虫和病菌难以产生抗药性等优点。
[0003]植物次生性物质是其在代谢过程中形成的产物，是植物自卫的武器，植物通过次生物质影响昆虫的取食形成忌避效果或影响昆虫的消化来保护自己，植物次生性物质对昆虫的寄主选择、取食及生长发育具有重要的影响。昆虫在进化过程中也形成了特有的解毒排毒机制，弱化 植物次生物质的影响。昆虫从寄主植物获取营养成分后通过代谢作用从而完成生长发育全过程。植物通过自身所含营养成分的质和量，以及种类繁多的次生代谢产物，来影响植食性昆虫对寄主的趋性取食活动，进而影响昆虫的生长发育和繁殖，造成昆虫种群的波动。植物次生物质对昆虫的影响及昆虫对植物次生物质的适应，反映了植物与昆虫的协同进化。利用分子生物学技术对作物进行改良，提高作物自身的抗虫性或将化学防治与植物自身的抗性相结合的研究，将减少化学农药的用量。植物次生性物质作为一种植物的防御性物质能够诱导昆虫中防御性基因的表达，例如植物次生物质能够诱导昆虫的解毒酶基因的表达。利用分子生物学手段干扰昆虫潜在的防御基因，从而提高昆虫对植物次生性物质的敏感性，对制定新的抗药性综合治理策略具有深远的意义。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf,其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所不。
[0005]进一步地，其全长编码序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]本发明还提供了用于扩增前述转铁蛋白基因编码序列的引物对，包括正向引物F:5’ -GCCATGGTATCAAAAATAAAATATAT-3’ 和反向引物 R:5’ -AATAACATCATGGATTTGCTTGAA-3’。
[0007]本发明还提供了所述转铁蛋白基因HaTrf在抑制棉铃虫的生长发育中的应用。
[0008]进一步地，所述应用具体包括以下步骤:
[0009]I)以权利要求1或2所述转铁蛋白基因为模板，利用利用引物Fl:CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物Rl:GTCTAGCTGCCCAGGAACAG，扩增得到棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ ID N0.2所示；
[0010]2)根据步骤I)扩增得到的棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，用于通过体外转录试剂盒合成HaTrf基因的dsRNA，该dsRNA后与棉铃虫人工饲料混合饲喂2龄棉铃虫幼虫。[0011]优选地，所述dsRNA的饲喂以双蒸水为载体，dsRNA的饲喂量为35 μ g/g。
[0012]本发明还提供了所述转铁蛋白基因HaTrf在提高棉铃虫对植物次生物质2_十三烷酮的敏感性中的应用。
[0013]进一步地，所述应用具体包括以下步骤:
[0014]I)以权利要求1或2所述转铁蛋白基因为模板，利用利用引物Fl:CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物Rl:GTCTAGCTGCCCAGGAACAG，扩增得到棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ ID N0.2所示；
[0015]2)根据步骤I)扩增得到的棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，设计HaTrf基因的dsRNA，通过体外转录试剂合成dsRNA后与植物次生物质2-十三烷酮及棉铃虫人工饲料混合词喂2龄棉铃虫幼虫。
[0016]优选地，所述dsRNA的饲喂以双蒸水为载体，dsRNA的饲喂量为35 μ g/g。
[0017]本发明的有益效果在于:
[0018]本发明提供来自棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf的基因全长以及用于合成dsRNA的序列，根据本发明的提供的基因全长及用于合成dsRNA的序列能够用于干扰棉铃虫转铁蛋白基因的表达,使棉铃虫出现生长抑制,并提高了昆虫对植物次生性物质的敏感性。
[0019]dsRNA干扰方法可提高作物抗虫性从而应用于对棉铃虫的防治，对于解决由于化学杀虫剂导致的生态恶 化以及杀虫剂抗性等问题都有积极意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为HaTrf全长电泳图。
[0021]图2为HaTrf与Gene bank中已报道的昆虫转铁蛋白同源性比对结果。
[0022]图3为HaTrf dsRNA抑制棉铃虫中转铁蛋白基因的表达。
[0023]图4为HaTrf dsRNA抑制棉铃虫生长发育的表型。
[0024]图5为HaTrf dsRNA增强棉铃虫对植物次生性物质2_十三烷酮的敏感性。【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026]实施例1棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf全长序列的克隆
[0027]棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf的基因全长编码序列共2052bp编码大小约为76KDa的蛋白，通过信号肽在线预测软件发现该序列前20个氨基酸为信号肽序列(MVSKIKYIYLLVLACVCVQA)。棉铃虫转铁蛋白N端和C端的两个拓扑环形成两个同源性很高的结构域，每个结构域含有三价铁离子结合位点，可逆地结合和释放铁离子。
[0028]提取棉铃虫总RNA，反转录得cDNA，以cDNA为模板，根据家蚕以及斜纹夜蛾转铁蛋白基因序列设计简并引物，扩增得到棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，运用cDNA末端快速克隆技术(RACE)拼接得到棉铃虫转铁蛋白基因的全长，设计全长引物F和R扩增出长度约为2000bp的条带，1%琼脂糖凝胶电泳分析(图1 )，并进行回收。回收片段与PMD18-T载体连接得到重组质粒PMD18-T，并测序。
[0029]表1扩增棉铃虫转铁蛋白基因用到的引物[0030]
【权利要求】
1.棉铃虫转铁蛋白基因HaTrf，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQID N0.3所示ο
2.根据权利要求1所述转铁蛋白基因HaTrf，其特征在于，其全长编码序列如SEQIDN0.1所示。
3.用于扩增权利要求1或2所述转铁蛋白基因编码序列的引物对，其特征在于，包括正向引物F:5，-GCCATGGTATCAAAAATAAAATATAT-3’和反向引物R:5’ -AATAACATCATGGATTTGCTTGAA-3’。
4.权利要求1或2所述转铁蛋白基因HaTrf在抑制棉铃虫的生长发育中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤: 1)以权利要求1或2所述转铁蛋白基因为模板，利用引物Fl:CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物R1: GTCTAGCTGCCCAGGAACAG，扩增得到棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ ID N0.2所示； 2)根据步骤I)扩增得到的棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，用于体外转录试剂盒合成HaTrf基因的dsRNA，该dsRNA后与棉铃虫人工饲料混合饲喂2龄棉铃虫幼虫。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的饲喂以双蒸水为载体，dsRNA的饲喂量为35μ8/^。
7.权利要求1或2所述转铁蛋白基因HaTrf在提高棉铃虫对植物次生物质2-十三烷酮的敏感性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤: O以权利要求1或2所述转铁蛋白基因为模板，利用引物Fl:CAAGCAGACATCGTGCCAGT和引物Rl:GTCTAGCTGCCCAGGAACAG,扩增得到棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，所述部分序列如SEQ ID N0.2所示； 2)根据步骤I)扩增得到的棉铃虫转铁蛋白基因部分序列，用于通过体外转录试剂盒合成HaTrf基因的dsRNA，该dsRNA后与植物次生物质2-十三烷酮及棉铃虫人工饲料混合饲喂2龄棉铃虫幼虫。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的饲喂以双蒸水为载体，dsRNA的饲喂量为35μ8/^。
【文档编号】C07K14/79GK103789320SQ201410028726
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】高希武, 张雷, 尚庆利, 刘晓岚, 路瑶 申请人:中国农业大学