一种褐飞虱基因Nl1860及其编码产物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个褐飞虱基因Nl1860及其编码产物与应用，该基因Nl1860具有SEQIDNo.1的DNA序列。该序列由1454个核苷酸碱基组成，包含一个由1386个核苷酸构成的完整的编码框，编码含有461个氨基酸残基的蛋白。研究发现该基因与褐飞虱的取食、存活以及产卵量有关。构建Nl1860的RNAi载体，转入水稻中，在转基因水稻体内表达Nl1860基因的dsRNA，可以达到提高水稻对褐飞虱抗性的目的。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。
【专利说明】—种褐飞虱基因NI1860及其编码产物与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别地，涉及一种褐飞虱基因#77浙O及其编码产物与应用。
【背景技术】
[0002]水稻(Oirza sativa L.)是中国乃至全球最重要的粮食作物之一。在中国，水稻的年种植面积约为3000万hm2，占粮食作物种植面积近1/2，稻谷产量占粮食总产量的45%。近年来，中国水稻种植面积有所下降，但稻谷产量仍然维持在粮食总产量的40%左右，水稻的产量直接关系到中国的粮食安全。但全国每年由于水稻病虫害造成的水稻产量损失巨大，虽经防治仍然造成经济损失400万-500万吨，重灾年份甚至颗粒无收。因此如何通过减少虫害来增加粮食产量，是当今人类必需要面对的迫切问题。
[0003]稻飞風属于半翅目Hemiptera,飞風科Delphacidae,主要包括褐飞風Nilaparvata lugens (Stal)、白背飞風 Soga tel la furcifera (Horvath)、灰飞風Laodelphax s tri a tel Ius Fall6n等,是我国水稻作物上的重要害虫。近些年来,稻飞風主要种类之一的褐飞虱，更是接连大暴发，对我国的水稻粮食产量造成了严重损失。20世纪80年代以来，褐飞虱在我国的年发生面积为1330-2000万hm2，约占水稻种植面积的50%，年损失稻谷达10-15亿Kg。2005年，褐飞虱再次在我国南方稻区爆发，引起水稻大面积干枯倒伏，造成严重损失。据浙江省农业厅调查统计，2005年浙江省第5代褐飞虱发生量每667m2达30万头以上的有66.7万hm2，占水稻总种植面积的86% ;每667m2在100万头以上的有33.3万hm2,占42 % ;最闻田块的发生量达到每667m2 1000万头以上；绝收的面积达5333hm2，造成直接水稻产量损失120万吨。在针对褐飞虱的综合防治体系中，种植抗虫水稻品种是控制虫害最经济有效的方法之一。但褐飞虱致害性因为具有可变性，往往造成抗虫水稻品种使用年限的极大缩短，因此亟需通过褐飞虱致害性变异规律和形成原因的研究，培育出抗褐飞虱不同致害性的水稻新品种，从而最终实现褐飞虱的可持续控制。
[0004]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，目前利用RNAi技术对昆虫基因进行功能研究已有较多的报道，但对于利用RNAi防治害虫还没有好的研究实例。至今，国内外已尝试利用水稻表达相关基因dsRNA的方法来沉默稻飞虱的相应基因，从而达到控制稻飞虱的目的。这些基因，主要有蜕皮激素受体基因(ecdysteroidreceptor,及?./?)、乙酸胆喊酯酶基因(Acetylcholinesterase,、几丁质合成酶基因(chitin synthetase, CS)、鱼尼丁受体基因(ryanodine receptor,办允)、己糖转运蛋白基因(hexose transporter gene, ΛΜΤ7 )、羧妝酶基因(carboxypeptidase gene, A7car)和类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶( rypsin -like serine protease, NI try)等。尽管利用这些转基因水稻品系，可以在一定程度上降低相关基因的转录水平，但对褐飞虱的致死效果并不明显。因此，至今为止，国内外尚没有克隆到褐飞虱的相关靶标基因，可以通过转基因水稻沉默该基因而达到控制褐飞虱的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱基因#776^?及其编码产物与应用。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种褐飞虱基因NI1860，它具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
[0007]一种权利要求1所述基因Λ77浙O的编码蛋白，它包含SEQ ID N0.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID N0.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白质。
[0008]一种权利要求1所述基因NI1860在转基因植物中的应用。
[0009]一种权利要求1所述基因NI1860在作物育种中的应用。
[0010]一种权利要求1所述基因NI1860在转基因动物中的应用。
[0011]本发明的有益效果是，通过对褐飞虱唾液腺转录组分析，并结合褐飞虱基因组数据库(浙江大学)获得了 Λ77浙O基因 全长；然后以N11860基因片段为模板合成相应dsRNA，并利用注射目的片段dsRNA的方法分析#776^?基因在RNAi沉默后，褐飞虱中#776^? mRNA的表达水平及相应死亡率、产卵量；利用转基因技术将褐飞虱基因仰转化入水稻体内，使该转基因水稻表达仰基因的dsRNA片段。利用该转基因技术证实转入仰基因的转基因水稻对褐飞虱均具有极好的抗虫效果。该基因的分离克隆，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将起到重要的促进作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是褐飞虱#77浙0基因⑶S全长电泳图，图中，1-2泳道为褐飞虱PCR电泳结果；M 为 DL2000 Marker ；
图2是褐飞虱注射dsRNA后对其mRNA表达水平的抑制作用柱状图，图中，办#77^仰指注射 20nl N11860 dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；指注射 20nl GFP dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；星号表示dsN11860组与dsGFP组之间存在显著差异(*，P〈 0.05，Student’ s 1-tests),柱形图为平均数±标准误(n=3)；
图3是褐飞虱注射dsRNA后对其蜜露分泌量的影响图，图中，dsN11860指注射20nlN11860 dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；指注射 20nl GFP dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；Ck指未注射dsRNA的褐飞虱。星号表示dsN11860组与dsGFP组之间存在极显著差异(**，P〈 0.01.Student’s ?-tests )，线形图为平均数土标准误(n=20);
图4是褐飞虱注射dsRNA后对其存活率的影响图，图中，dsN11860指注射20nl NI 1860dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；指注射 20nl GFP dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；Ck指未注射dsRNA的褐飞虱。星号表示dsN11860组与dsGFP组之间存在显著差异(*，P〈
0.05; **，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),线形图为平均数土标准误(n=4);
图5是褐飞虱注射dsRNA后对其雌成虫11天内产卵量的影响图，图中，dsN11860指注射 20nl N11860 dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；指注射 20nl GFP dsRNA (10 μ g/μ I)的褐飞虱；Ck指未注射dsRNA的褐飞虱。星号表示dsN11860组与dsGFP组之间存在极显著差异(**，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),线形图为平均数土标准误(n=15);
图6是含#77浙0基因的水稻遗传转化载体质粒结构示意图；
图7是褐飞虱取食转基因水稻对其#776^? mRNA水平抑制作用的柱状图，图中，ASl:取食转基因N11860 dsRNA水稻品系ASl的褐飞虱Λ77浙O mRNA量；AS2:取食转基因N11860dsRNA水稻品系AS2的褐飞虱#77浙0 mRNA量；WT:取食非转基因水稻的褐飞虱#77浙0mRNA量；图中星号表示取食转基因品系(ASl或AS2)与WT之间存在极显著差异(**，P〈
0.01.Student’ s ?-tests )，柱形图为平均数±标准误(n=5)；
图8是褐飞虱取食转基因水稻对其死亡率的影响图，图中，ASl:取食转基因Λ778仰dsRNA水稻品系ASl的褐飞虱；AS2:取食转基因#77浙0 dsRNA水稻品系AS2的褐飞虱；WT:取食非转基因水稻的褐飞虱；图中星号表示取食转基因品系(ASl或AS2)与WT之间存在显著差异(*，P< 0.05; **，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),线形图为平均数土标准误(n=5)；
图9是褐飞虱取食转基因水稻对其雌成虫11天内产卵量的影响图，图中，ASl:取食转基因NI1860 dsRNA水稻品系ASl的褐飞虱；AS2:取食转基因NI1860 dsRNA水稻品系AS2的褐飞虱；WT:取食非转基因水稻的褐飞虱；图中星号表示取食转基因品系(ASl或AS2)与WT之间存在极显著差异(**，P〈 0.01.Student’s ?-tests ),线形图为平均数土标准误(n=5)；
图10是转基因#77浙0 dsRNA水稻品系对褐飞虱的耐害性实验图，图中，AS1，AS2:转基因Λ77浙O dsRNA水稻品系；WT:非转基因水稻。
【具体实施方式】
[0013]本发明通过 构建褐飞虱唾液腺转录组文库进行高通量测序的方法获得转录组数据，在此基础上获得Λ77浙O基因片段。结合褐飞虱基因组数据库(浙江大学)进行比对分析，初步得到CDS全长序列。首先在CDS序列的5’端和3’端非编码区设计一对引物AW^O-CDS-Fl和Λ77浙O-CDS-Rl。再提取褐飞虱mRNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板，以AW^O-CDS-Fl和AW^O-CDS-Rl为引物进行常规PCR反应，获得NI1860 CDS全长序列并连接到PMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(TGl)，摇菌，送菌液测序(南京金斯瑞公司)。测序结果与转录组及基因组获得的CDS全长序列进行比对验证。随后在Λ77浙O CDS序列中选取215bp长度的片段设计合成dsRNA，并用注射法对目的基因进行RNAi，检测其对目的基因mRNA表达水平抑制效果及对褐飞虱蜜露分泌量、死亡率及产卵量的影响。并通过转基因技术获得含#77浙0基因dsRNA的水稻转基因突变体。通过生物测定，证明Λ77浙O基因dsRNA在水稻中具有很好的抗虫效果。对该基因的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻抗褐飞虱育种将起到重要的促进作用。
[0014]实现本发明的具体技术步骤如下:
UNl1860基因的分离和序列分析
利用对褐飞虱唾液腺转录组测序的方法，获得表达基因数据库，并筛选到NI1860基因，分析发现此转录组序列并没有覆盖该基因的完整编码区。为了获得该片段的完整编码区序列，我们比对褐飞虱基因组数据库(浙江大学)初步得到Λ77浙O CDS全长序列。提取褐飞虱唾液腺mRNA并反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以N11860基因5’端和3’端非编码区设计Λ77浙O-⑶S-FI和Λ77浙O-⑶S-Rl为引物，PCR扩增⑶S (图1)全长序列后连接入PMD19-T克隆载体，转化入大肠杆菌感受态细胞(TGl)，挑取6个克隆送南京金斯瑞公司测序,每个分别测通2 次。测序结果,用 NCBI Blast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比对分析。获得仰基因DNA序列，见序列表SEQ ID N0.1表示的序列。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID N0.2所示。
[0015]2、褐飞虱#77浙0 dsRNA合成及其RNAi效果
以I中构建的载体为模板，设计带T7启动子的引物dSA776^-T7-F，AM1860 -T7-R和ds6F/M7-F、ds6F/M7-R，PCR扩增#77浙0基因215bp片段和基因860bp片段，以这两片段为模板合成与纯化Λ778仰dsRNA和dsRNA。分别对褐飞虱注射Λ778仰dsRNA和GFP dsRNA进行RNAi。首先检测褐飞虱注射dsRNA后，对其体内Λ77浙O mRNA表达水平的影响。结果发现:对褐飞虱利用注射dsRNA的方法的确可以诱导靶基因RNAi，使靶基因表达持续被抑制(图2)。我们还测定了注射Λ77浙O dsRNA的褐飞虱在水稻上的蜜露分泌量、存活率及11天内产卵量，结果表明，与注射dsRNA相比，#776^?基因沉默后褐飞虱24h内的蜜露分泌量显著降低(图3)，存活率显著降低(图4)，11天内产卵量也显著降低(图5)。
[0016]3.镇NI1860 dsRNA水稻品系的获得及其对褐飞虱抗性的检测
构建含基因#77浙0 dsRNA水 稻遗传转化载体(图6)，构建的表达载体以电击法转化农杆菌，获得含有表达载体的工程农杆菌，以本实验成熟的农杆菌转基因方法侵染水稻愈伤，愈伤经抗性筛选后获得整合了目的基因的愈伤组织，再经分化培养基和生根培养基中培养，获得含Λ77浙O基因dsRNA的转基因水稻。对水稻植株进行观察未发现植株生理缺陷，能获得正常世代。生物测定试验表明，与对照的非转基因水稻相比，褐飞虱成虫在含Λ77浙O基因dsRNA的水稻上取食，NI1860 mRNA水平显著降低(图7)，褐飞虱存活率明显降低(图8)，单个雌成虫11天产卵量显著降低(图9)。耐虫性实验表明，接褐飞虱为害20天后，作为对照的非转基因水稻基本枯死，而含MJSW基因dsRNA的ASl、AS2转基因水稻品系仅外面的叶片枯黄(图10)。
[0017]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
[0018]实施例UN11860基因的获得和序列分析
1)褐飞虱唾液腺RNA的提取、质量检测及总cDNA第一链合成；
2)从总cDNA第一链中以聚合酶链式反应(PCR)诚N11860⑶S片段 上游引物(SEQ ID N0.3): 5’- TGTAGGAATTGAGCAGCAAG -3’
下游引物(SEQ ID N0.4): 5’- ATAAATTCTTTGGTGCATCC -3’
PCR扩增条件:94°C X3min —(94°C X30sec —55°C X30sec —72°C X lmin30sec)X 30循环一72°C X lOmin，得到特异PCR扩增产物见附图1。
[0019]3) pMD19- N11860克隆载体构建及基因碱基解析
PCR产物通过克隆入Takara公司pMD19_T载体获得PMD19tV77浙O载体，并通过CaCl2法转入TGl大肠杆菌，将含pMD19- NI1860载体的TGl菌液送南京金斯瑞公司测序。用NCBIBlast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比对分析,获得序列表中的序列SEQ ID N0.1。将此cDNA的基因命名为Λ77浙0。
[0020]实施例2、褐飞虱犯7浙0 dsRNA合成及注射法RNAi效果
I)从上述PMD19- Λ778仰克隆载体中以聚合酶链式反应(PCR) iUNI1860中间215bp片段，并继续合成NI1860 dsRNA片段。同时以质粒为模板，PCR获得GFP中间860bp片段，并继续合成GFP dsRNA片段?Μ1860----Υ (SEQ ID N0.5):
【权利要求】
1.一种褐飞虱基因Λ77浙队其特征在于，它具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
2.—种权利要求1所述褐飞虱基因Λ778仰的编码蛋白，其特征在于，它包含SEQ IDN0.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID N0.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID N0.2衍生的蛋白质。
3.一种权利要求1所述褐飞虱基因#776^?在转基因植物中的应用。
4.一种权利要求1所述褐飞虱基因NI1860在作物育种中的应用。
5.一种权利要求1所述褐飞虱`基因NI1860在转基因动物研究中的应用。
【文档编号】C07K14/435GK103820460SQ201410040880
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】娄永根, 纪锐, 陈红丹, 李恒, 叶文丰, 禹海鑫 申请人:浙江大学