一种多肽、多肽衍生物、多肽的可药用盐及药物组合物的制作方法
【专利摘要】为克服现有技术中促胰岛新生多肽的血浆半衰期较短、活性较低的问题，本发明提供了一种多肽。同时，本发明还公开了上述多肽的衍生物、可药用盐及药物组合物。本发明提供的多肽在血液中的稳定性高，半衰期长。
【专利说明】一种多肽、多肽衍生物、多肽的可药用盐及药物组合物
[0001]本申请基于2013年3月15日提交的在先的PCT国际申请(申请号为PCT/CN2013/072771 )，并要求其优先权，将该在先申请的全部内容通过引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002]本发明主要涉及到医药及制药领域，尤其是一种多肽以及该多肽的衍生物、可药用盐及药物组合物。
【背景技术】
[0003]全世界有3亿多人患有糖尿病(DM)并忍受由此带来的痛苦。主要的糖尿病类型分为一型糖尿病(TlD)和二型糖尿病(T2D)两种。一型糖尿病是由于机体无法产生胰岛素从而病人需要每天给予胰岛素进行治疗；二型糖尿病的发病则是由于胰岛素抵抗，即机体细胞无法恰当的利用胰岛素。目前对于二型糖尿病已经有多种被证实确切有效的非胰岛素治疗方式，然而随着疾病的发展，有相当大比例的晚期二型糖尿病病人胰岛β细胞的功能丧失从而需要给予胰岛素治疗。
[0004]糖尿病的发展与胰腺中胰岛的大量丧失有关。在被诊断出糖尿病之初，一型糖尿病病人90%以上的胰岛、二型糖尿病病人50%左右的胰岛已经丧失。胰岛新生被公认是治疗一型和二型糖尿病的最优方案，人们为寻找刺激胰岛新生的方法也做出了很多尝试和努力。
[0005]目前，研究者发现胰岛新生相关蛋白(INGAP)、人促胰岛肽(HIP)、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、胰岛内分泌血管活性肠肽(VIP)、表皮生长因子和胃泌素等都具有引发非内分泌胰腺母细胞分化成功能完善的胰岛的功能，且已经在多种动物模型中得到证实。在所有的这些化合物中，INGAP蛋白序列中104 - 118区域15个氨基酸的INGAP多肽(INGAP-PP)可诱发胰岛新生，并且已经在逆转STZ诱发的小鼠糖尿病、增加一型糖尿病病人C-肽的释放、改善二型糖尿病病人的血糖控制等多种实验结果中得到证实。除此之外，另外有报道表明INGAP-PP还具有其他一些生物学效应，比如剂量依赖性的刺激胰岛β细胞数目的增加、增加胰岛素的分泌以及β细胞的大小。在人体开展的临床验证研究表明，其具有改善血糖平衡的功效，二型糖尿病病人给药90天HbAlc指标的改善以及一型糖尿病病人C-肽的释放明显增加等均进一步证实了上述INGAP-PP的功效。然而，INGAP-PP的血浆半衰期较短并且需要给予较高的剂量等特点使得该多肽的临床应用受到限制。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中INGAP-PP的血浆半衰期较短的问题，提供一种多肽。
[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
[0008]提供一种多肽，具有如下通式:
[0009]R1-1GLHDPSHGTLPAG(X1)n1-R2 ；
[0010]其中，m为O或I 选自-H或-Ac ；R2选自-OH或-NH2 ；
[0011]当R1 为-H、R2 为-OH且m 为 I 不成立时，X1 选自 Serine (S)、Glutamic acid (E)、Cysteine (C)或 Lysine (K)；
[0012]当R1 为-H、R2 为-OH 且m 为 I 成立时，X1 选自 Glutamic acid (E)、Cysteine (C)或 Lysine (K)。
[0013]同时，本发明还提供了一种多肽，R1-1glhdpshgtlpagsx2-R2；
[0014]其中，X2选自 Lysine (K)或 Cysteine (C)，R1 选自-H 或-Ac，R2 选自-OH 或-NH2。
[0015]同时，本发明还提供了基于上述多肽的多肽衍生物，该多肽衍生物为上述多肽的修饰产物。
[0016]进一步的，本发明还公开了上述多肽或多肽衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
[0017]进一步的，本发明还提供了上述多肽或多肽衍生物的可药用盐，所述可药用盐为醋酸盐和盐酸盐。
[0018]进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物由上述多肽或多肽衍生物与药用载体按配方制造而成。
[0019]进一步的，本发明还提供了一种促进胰岛细胞增殖的方法，包括采用上述多肽或多肽衍生物与胰岛细胞接触。
[0020]进一步的，本发明还提供了一种产生胰岛细胞簇的方法，包括采用上述多肽或多肽衍生物与胰腺导管细胞接触。
[0021]进一步的，本发明还提供了一种促进肝细胞再生的方法，包括采用上述多肽或多肽衍生物与肝细胞接触。
[0022]进一步的，本发明还提供了一种促进神经细胞再生的方法，包括采用上述多肽或多肽衍生物与神经细胞接触。
[0023]将本发明提供的多肽制备成药物后，使用时可有效的改善胰岛功能，并且该多肽的血浆半衰期长，稳定性好，可在血液中长时间发挥作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例2中，肽1、肽12、肽16在细胞培养基中的稳定性对比图；
[0025]图2是本发明实施例2中，肽1、肽12、肽16、肽29和肽31在大鼠血浆中的稳定性对比图；
[0026]图3是本发明实施例2中，肽1、肽12、肽16、肽29在小鼠血浆中的稳定性对比图；
[0027]图4是本发明实施例2中，肽1、肽12、肽16在人血浆中的稳定性对比图；
[0028]图5是本发明实施例2另一组实验中，肽1、肽29和肽31在人血浆中的稳定性对比图；
[0029]图6是本发明实施例3中，肽1、肽12、肽16胰岛素分泌量的对比图；
[0030]图7A是本发明实施例5中，经过肽1、肽12、肽16、肽29或肽31治疗10天后，雌性C57BL/6J小鼠EIC的数量对比图；
[0031]图7B是本发明实施例5中，经过肽1、肽12、肽16、肽29或肽31治疗10天后，雌性C57BL/6J小鼠EIC的总面积对比图；
[0032]图7C是本发明实施例5中，经过肽1、肽12、肽16、肽29或肽31给药后与胰腺导管上皮细胞相关联的EIC代表性免疫组化图；
[0033]图8是本发明实施例6中，经过肽1、肽12或肽31治疗10天后，促进胰岛新生的效果对比图。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]本发明所述化合物，包含具有治疗各种疾病和病症，尤其是与糖尿病有关的疾病和病症的多肽或多肽衍生物。另外本发明的多肽和多肽衍生物可用于以下用途:治疗胰腺功能障碍、代谢性疾病、体外诱导胰岛增殖用于移植、提高体内移植胰岛的存活率、神经保护或促进神经再生、促进肝再生及抗炎等。
[0036]如本文所公开的，本发明提供了具有与原INGAP-PP和HIP肽相比活性和稳定性相当或有所提高的一系列多肽(见表2和表3)。改善了成药性的多肽使得它们更适合于临床开发。本发明还提供了包含本发明中所提到的多肽或多肽衍生物的药学组成成分及使用方法制备的药物，用于治疗代谢性疾病，包含但不限于一型糖尿病(TlD)和二型糖尿病(T2D)。本发明还提供本发明的组合物的合适的配方，包括缓释制剂。
[0037]如前所述，来源于仓鼠的胰岛新生相关蛋白(INGAP)已经被证实具有促进胰岛新生的作用(见美国专利第5834590号)。这里提到的INGAP-PP是INGAP蛋白的15个氨基酸多肽片段， 已经被证实具有逆转小鼠糖尿病模型的作用(Rosenberget al.，Ann.Surg.240:875-884(2004) ;US publicat1n2006/0009516;see alsoUS pub Iicat1n2008/0171704;Kapur et al.，IsIets4:1-9 (2012) ;Chang etal.,Mo 1.Cell.Endocrinol.335:104-109 (2011) ; Borel Ii et al., RegulatoryPeptides 13 1:97-102 (2005) ;Dungan et al., Diabetes/Metabolism Res.Rev.25:558-565(2009);Zha et al., J.Endocrinol.1nvest.35:634-639(2012);ffang etal., J.Cell.Phys1l.224:501-508(2010);Petropavlovskaia et al.,J.Endocrinol.191:65-81(2006);Taylor-Fishwick et al., Pancreas39:64-70(2010);Rosenberg,Diabetologia39:256-262 (1996);Madrid et al., Regulatory Peptidesl57:25-31 (2009);andTaylor-Fishwick et al.，J.Endocrinol.190:729-737 (2006))。 一个被称作人促胰岛肽(HIP)的多肽也同样被证实其功效(Levetan et al.，Endocrin.Pract.14:1075-1083(2008) ;US publicat1n2011/0280833)。本发明提供的 INGAP-PP 和HIP多肽，包括表2和表3中的多肽，不是INGAP-PP或HIP母肽，而是表现出较INGAP-PP或HIP母肽非显而易见的性能提高的多肽。
[0038]如本文所用，术语“肽”是指两个或两个以上的氨基酸的聚合物。可被修饰成其类似物，衍生物，功能模拟物，伪肽等诸如此类包含至少两个氨基酸的聚合物。术语“肽”的含义是被本专业领域的技术人员所熟知的。通常情况下，肽是由两个或多个氨基酸由酰胺键链接，酰胺键则由一个氨基酸的氨基与相邻氨基酸的羧基构成。本文所述的多肽可包含天然存在的氨基酸或者非天然存在的氨基酸。
[0039]如本文所用的术语“衍生物”是指母体分子如多肽的一种变型。例如多肽的衍生物，可以包括相对于多肽而言一个或多个氨基酸被取代的一种变型。还可以包括对于多肽的修饰，包含但不限于非天然存在的氨基酸、D型氨基酸、氨基和/或羧基末端(N-或C-末端)修饰的氨基酸，特别是对于在N-末端的氨基和/或C-末端的羧基的修饰、脂肪酸修饰、肽模拟物和伪肽等本文所公开的诸如此类的修饰物。下面有对于改造修饰示例更详细地描述。
[0040]如本文所用术语“胰腺功能障碍”是指与正常或健康个体胰腺相比功能下降的一种疾病或病症。胰腺功能受损的典型不例包含但不限于，一型糖尿病、二型糖尿病、成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)、空腹血糖受损、糖耐量异常、胰岛素不足、空腹胰岛素血症、胰岛素抵抗或空腹胰岛素水平受损或者以上几种情况的组合。下面有对这些疾病和病症情况更详细地讨论。
[0041]如本文所述，本发明提供了 INGAP-PP和HIP。表1显示了 INGAP-PP和HIP肽，以及多种被用作本文所述实验阴性对照的杂肽的序列，这些杂肽在比较INGAP-PP，HIP与本发明的衍生物的活性研究实验时作为阴性对照。
[0042]表1.1NGAP-PP和HIP肽以及对照杂肽
[0043]
【权利要求】
1.一种多肽，其特征在于，具有如下通式:
R1-1GLHDPSHGTLPAG(X1)n1-R2 ； 其中，m为O或I J1选自-H或-Ac ;R2选自-OH或-NH2 ； 当 R1 为-H、R2 为-OH且m 为 I 不成立时，X1 选自 Serine (S)、Glutamic acid (E)、Cysteine (C)或 Lysine (K)； 当 R1 为-H、R2 为-OH 且 m 为 I 成立时，X1 选自 Glutamic acid(E)、Cysteine(C)或Lysine (K)。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，具有如下序列: H-1GLHDPSHGTLPAGE-OH (序列编号:27)或 H-1GLHDPSHGTLPAGK-OH (序列编号:23)。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，具有如下序列: Ac-1GLHDPSHGTLPAGS-NH2 (序列编号:29)、 h-1glhdpshgtlpags-nh2 (序列编号:41)、
Ac-1GLHDPSHGTLPAGS-OH(序列编号:12)中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，具有如下序列: H-1GLHDPSHGTLPAGC-OH(序列编号:46)、 Ac-1GLHDPSHGTLPAGC-OH(序列编号:47)、 H-1GLHDPSHGTLPAGC-NH2 (序列编号:48)、 Ac-1GLHDPSHGTLPAGC-NH2 (序列编号:49)中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，具有如下序列: H-1GLHDPSHGTLPAG-OH(序列编号:73)、 H-1GLHDPSHGTLPAG-NH2 (序列编号:28)、 Ac-1GLHDPSHGTLPAG-NH2 (序列编号:30)中的一种或多种。
6.一种多肽，其特征在于，具有如下通式:
R1-1glhdpshgtlpagsx2-R2 ； 其中，X2 选自 Lysine (K)或 Cysteine (C)，R1 选自-H 或-Ac, R2 选自-OH 或-NH20
7.根据权利要求6所述的多肽，其特征在于，具有如下序列: H-1GLHDPSHGTLPAGSK-OH(序列编号:9)、 H-1GLHDPSHGTLPAGSC-OH(序列编号:42)、 Ac-1GLHDPSHGTLPAGSC-OH(序列编号:43)、 H-1GLHDPSHGTLPAGSC-NH2 (序列编号:44)、 Ac-1GLHDPSHGTLPAGSC-NH2 (序列编号:45)中的一种或多种。
8.一种多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物为权利要求1-7中任意一项所述的多肽的修饰产物。
9.根据权利要求8所述的多肽衍生物，其特征在于，所述修饰包括烷基化、酰基化、氨基甲酰化、碘化。
10.根据权利要求8所述的多肽衍生物，其特征在于，所述修饰包括N-末端乙酰化、C-末端酰胺化、D型氨基酸非天然氨基酸替换所述多肽中的天然氨基酸、脂肪酸修饰中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的多肽衍生物，其特征在于，所述非天然氨基酸选自2-氨基脂肪酸、3-氨基脂肪酸、β-丙氨酸、β_氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶羧酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4- 二氨基丁酸、锁链素、2，2’ - 二氨基庚二酸、2，3- 二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、异羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、异-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-Ν-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸或鸟氨酸。
12.根据权利要求10所述的多肽衍生物，其特征在于，所述脂肪酸修饰包括C2、C4、C6、C8、C1、C12、C14、C16、C18、C20或更长碳链的脂肪族基团酰化。
13.如权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
14.一种多肽的可药用盐，其特征在于，所述多肽选自权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物，所述的可药用盐为醋酸盐和盐酸盐。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由多肽与药用载体按配方制造而成； 所述多肽选自权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药用载体包括水、缓冲盐溶液、生理盐水、林格氏液、乙二醇、甘油、油脂或可注射的有机酯中的一种或多种。
17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，其特征在于，所述药用载体包括碳水化合物、抗氧剂、螯合剂、二价金属离子、酶抑制剂、低分子量蛋白或稳定剂中的一种或多种。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、纤维素；所述抗氧剂包括抗坏血酸或谷胱甘肽；所述螯合剂包括乙二胺四乙酸；所述二价金属离子包括钙离子或镁离子。
19.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂、增加所述多肽分子选择可能的物质、抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂中的一种或多种。
20.一种促进胰岛细胞增殖的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物与胰岛细胞接触。
21.—种产生胰岛细胞簇的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物与胰腺导管细胞接触。
22.一种促进肝细胞再生的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物与肝细胞接触。
23.一种促进神经细胞再生的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-7中任意一项所述的多肽或者选自权利要求8-12中任意一项所述的多肽衍生物与神经细胞接触。
【文档编号】C07K14/47GK104045698SQ201410096363
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2013年3月15日
【发明者】刘利平, 白茹 申请人:深圳君圣泰生物技术有限公司