的抗原模拟表位am-1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及黄曲霉素B1的抗原模拟表位，其氨基酸序列为WPLYYYPWSDGA。本发明黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的黄曲霉素B1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于黄曲霉素B1的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然黄曲霉素B1分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了黄曲霉素B1对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。
【专利说明】黄曲霉毒素Bi的抗原模拟表位AM-1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及黄曲霉毒素抗原模拟表位AM-ι及其应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素Bjaflatoxin B1； AFB^是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中。AFBi对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，1993年被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物。因此，食品中AFBi的检测对于人类健康意义重大。
[0003]目前，检测食品中AFBi的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法，免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在AFBi的检测中得到了广泛的应用。然而，AFBi全抗原的化学合成方法目前仍然存在着诸多弊端:1)作为全抗原的合成原料，AFBi标准品不仅具有极强的致癌毒性，而且价格昂贵，使得AFBi全抗原的制备成本高昂，限制了 AFBi免疫学检测体系的规模化应用；2)AFBi全抗原的化学合成制备过程繁杂，中间副产物多、从而造成全抗原的生产批次误差大、质量不均一，成为影响免疫学检测方法准确性的重要技术瓶颈；3)AFBi全抗原的化学合成过程中，使用的有机试齐U、中间产物及废水、废渣易对操作人员产生毒害并严重污染周边环境。鉴于此，开展AFBi全抗原的无害化替代性制备研究，将其应用于免疫学检测体系，解决化学合成制备AFBi全抗原过程中所面临的强毒性、高成本、高污染、批间误差大等关键问题，不仅具有重要的理论价值，也有显著的应用前景。
[0004]本发明通过用噬菌体展示肽库技术，从肽库中筛选出能与靶分子(抗AFBi单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然AFBi分子相似的免疫反应特性，通过获得的AFBi抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的AFBi标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFBi的免疫学检测。
【发明内容】
[0005]本发明以抗AFBi单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示十二肽库，分别进行亲和性竞争洗脱淘选，获得了能与抗AFB1抗体特异性结合的AFBi的抗原模拟表位，命名为AM-1，其氨基酸序列如下:
从噬菌体随机十二肽库中筛选的AFB i抗原模拟表位AM-1，其氨基酸序列为:WPLYYYPWSDGA
上述抗原模拟表位AM-1结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即W代表色氨酸残基，P代表脯氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，S代表丝氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，G代表甘氨酸残基，A代表丙氨酸残基。
[0006]本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，其序列为: GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
[0007]发明提及的AFBi抗原模拟表位AM-1可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFBi抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFBi抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行AFBi抗原模拟表位的大量制备。
[0008]本发明还涉及所述黄曲霉素抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0009]本发明黄曲霉素抗原模拟表位(WPLYYYPWSDGA)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有AFBi抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将AFBi抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替AFBi标准品来进行免疫学检测分析。
[0010]还涉及黄曲霉素抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
[0011]还涉及黄曲霉素抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
[0012]前述黄曲霉素抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFBi标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFBi的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然AFBi分子相似的免疫反应特性，效果非常好。
[0013]本发明的有益效果是:本发明黄曲霉素&抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFBi标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFBi的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然AFBi分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了 AFBi对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1以AFB1抗原模拟表位AM-1建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围0.1-10 ng/mL, IC50 为 1.0 ng/mL。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
l)AFBi抗原模拟表位的亲和性竞争淘选:具体方法为:用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗AFBi单克隆抗体，并以终浓度100 μ g/mL包被96孔酶标板,4°C孵育过夜。第二天用PBST (10mM PBS pH 7.4 包含 0.1% Tween-20 (ν/ν))洗涤 3 次后，加入 300 μ 1 封闭液(3% BSA-PBS)37°C孵育1小时。1小时后弃封闭液，用PBST洗涤5次，每孔加入100 μ?噬菌体肽库(噬菌体展示十二肽库，购自ΝΕΒ公司，用PBS 10倍稀释噬菌体原液，约1.0 X 1011pfu)，37°C振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，结合上的噬菌体用500ng溶于10%的AFBi标准品进行竞争洗脱。取10 μ 1洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20 mL生长至对数前期的疋coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。
[0016]2)在第二、第三、第四轮的淘选过程中，包被的抗么?81单克隆抗体浓度分别为75μ g/mL、50 μ g/mL、50 μ g/mL,所用的 PBST 浓度为 0.25%、0.25%、0.5%，封闭液为 3% 的OVA-PBS、BSA-PBS、0VA-PBS,其余步骤同上。
[0017]3)阳性噬菌体克隆的鉴定:从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个曬菌体斑，进行曬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay, 1-ELISA)进行阳性曬菌体克隆的鉴定,具体方法为:首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗AFBi单克隆抗体，2 Pg/mL包被96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (ν/ν))洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育1小时；投入100 μ?噬菌体斑扩增液(1.0 X 1011 pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37 °C孵育0.5小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μ?,37 °C孵育0.5小时；加入ΙΟΟμ? ΤΜΒ底物液，避光显色5min，酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)读取450 nm处的吸收值。选取0D45(I大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
[0018]3) AFBi抗原模拟表位AM-ι的鉴定:采用间接竞争ELISA的方法进行AFBi抗原模拟表位的鉴定，具体方法为:用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗AFBi单克隆抗体，2 Pg/mL包被酶标板，4°C孵育过夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (ν/ν))洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育0.5小时；投入50 μ?经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0Χ1011 pfu)和50 μ? AFBi标准品(浓度范围为0-100 ng/ml)，37°C孵育0.5小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μ?，37°C孵育0.5小时；加入lOOPL ΤΜΒ底物液，避光显色5min，读取0D450，能结合抗AFBi单克隆抗体，且能被AFBi标准品所阻断的噬菌体，鉴定为AFBi的抗原模拟表位。
[0019]实施例2.AFBi抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争ELISA鉴定展示有AFBi抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下:进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800 μ?含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μ? PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100 μ?碘化物缓冲液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA, 4 M Nal)，加入 250 μΙΤΕ 缓冲液(lOmM Tria-Hcl (pH8.0),1 mM EDTA)，加入等体积的无水乙醇，_20°C冰冻2小时，离心后再用70%乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20 PL灭菌水，取2 μ?进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5 PL噬菌体模板进行DNA测序，其-96 gill测序引物为:5’-H°CCC TCATAG TTA GCG TAA CG_3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得AFBi抗原模拟表位的氨基酸序列。
[0020]实施例3.AFBi抗原模拟表位AM-1作为竞争抗原在ELISA中的应用 (1)样品提取
称取5g样品(谷物及其相关食品)，加入25 mL80 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡4分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1 mL滤液加入4毫升PBS (磷酸盐缓冲液，pH=7.2)
混匀后，即为样品提取液，待用。
[0021](2)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗AFBi单克隆抗体，2 l^g/mL包被酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 °C孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
[0022]( 3 )标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ?展示有AFBi抗原模拟表位的噬菌体(1.0X1011 pfu)和一系列不同浓度的50 μ? AFBi标准品，37°C孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取0D45(i。以AFBi浓度对数为横坐标，结合率(加入AFBi的孔的0D45(I/未加入AFBi的孔的OD450X 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围 0.1-10 ng/mL, IC50 为 1.0 ng/mL (图 1)。
[0023](4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ?展示有AFBi抗原模拟表位的噬菌体(1.0X 1011 pfu)和待测样品提取液，37°C孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取0D45(I，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中AFBi的含量。
[0024]实施例4.AFBi抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用 (1)样品提取
称取5g样品(谷物及其相关食品)，加入25 mL 80 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡4分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1 mL滤液加入4毫升PBS(磷酸盐缓冲液，pH=7.4)
混匀后，即为样品提取液，待用。
[0025](2)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4)稀释展示有AFBi抗原模拟表位的噬菌体(2.0X 1011 pfu),100 μ L包被于酶标板，4°C孵育过夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (ν/ν))洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 °C孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
[0026](3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 PL抗AFBi单克隆抗体(0.5 ng/ml)和一系列不同浓度的50 μ?ΑΡ?,标准品，37°C孵育0.5小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD45(l。以AFBi浓度对数为横坐标，结合率(加入AFBi的孔的0D45(i/未加入AFBi的孔的OD45(lX 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
[0027](4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 PL抗AFBi单克隆抗体(0.5 ng/ml)和一系列不同浓度的50 μ? AFBi标准品，37°C孵育0.5小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD45(l。以AFBi浓度对数为横坐标，结合率(加入AFBi的孔的OD45(i/未加入AFBi的孔的OD45(lX 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线
实施例5.AFBi抗原模拟表位AM-1作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用
(1)样品提取称取5g样品(谷物及其相关食品)，加入25 mL 80 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡4分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1 mL滤液加入4毫升PBS(磷酸盐缓冲液，pH=7.2)
混匀后，即为样品提取液，待用。
[0028](2)噬菌体及控制线的点阵
用10 mM PBS (pH 7.4)稀释展示有AFBi抗原模拟表位的噬菌体(2.0X 1011 pfu)，用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上(孔径0.2-0.45微米)，作为检测线；将0.5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上(位于检测线的上方，距离大于5毫米)，作为控制线。
[0029](3 )胶体金标记AFBi抗体
将AFBi抗体逐滴加入胶体金溶液(PH=8.2)中，边滴边搅拌，30分钟后，取1% PEG加入上述溶液中，继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的10% BSA溶液，搅拌15分钟后，静置30分钟，离心后去上清，得到胶体金标记的AFBi抗体溶液。
[0030](4)胶体金检测卡的组装
将胶体金标记的AFBi抗体点喷于胶金垫上(1.0 mg/L)，将样品垫、胶金垫，点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装，切成试纸条，装入检测卡中待用。
[0031](5)样品的检测
将样品提取液加入样品垫中，静置lOmin，若样品中含有AFBi且超过胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域不显色，而控制线区域显色；若样品中不含有AFBi且低于胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域显色，控制线区域也显色。若控制线区域不显色，表明试纸条失效。
[0032]实施例5 AFBi抗原模拟表位AM_1的大量制备
(1)以曬菌体扩增的方式
将展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体加入至20 mL接种有ER 2738的培养物中，37°C 220 rpm振荡培养4.5 h。将培养物转入另一离心管中，4 V 8000 rpm离心10 min，将上清的上部80 %转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4 °C下静置3小时。4°C 10000rpm离心PEG/NaCL静置溶液15 min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入lmL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
[0033](2)以AFBi抗原模拟表位_融合蛋白的方式进行制备 A.PCR扩增AFB1抗原模拟表位的外源编码基因
PCR反应体系:(50 μ?
10X PCR Buffer5 μ?
dNTP Mixture (each for 2.5 mM)4 M-L
M13KE insert extens1n primer (10 mM)1 M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)1 M-L
噬菌体DNA模板1 μ?
Pyrobest DNA Polymerase0.5 M-L
灭菌 ddH2037.5 μ?
PCR反应条件:
94°C 5 min,
以下 30 cycles: 94°C 30 sec,55°C 30 sec,72°C 30sec, 72°C 10 min。
[0034]采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。AFB1抗原模拟表位 AM-1 的编码基因序列为:GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
[0035]B.外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII，NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。
[0036]C.酶切后产物的连接及转化
将质粒pMal-PIII和目的片段以1: 10 (摩尔比)混匀，于16 °C水浴连接12 h,取10 μ L连接产物加至100 μ L感受态细胞DH5 α中，充分混匀。冰浴30 min后，42 V水浴热激90 s，立即冰浴5 min后补加800 μ L LB液体培养液，37 V，200 rpm培养1 h，8000 rpm离心5 min，吸去上清留取约300 μ L，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37 °〇过夜培养，得到亚克隆阳性克隆。
[0037]D.克隆转化
将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒，取10yL至100 μ L感受态细胞ΤΒ1中，充分混匀。冰浴30 min后，42 V水浴热激90 s，立即冰浴5 min后补加800μ L LB液体培养液，37 °C, 200 rpm培养45min，8000rpm离心5 min，吸去上清留取约300μ L，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37 1:过夜培养，得到阳性克隆阳性克隆。
[0038]E.AFBi抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1 %接种量(ν/ν)接种于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37°C，220 r/min振荡培养，当培养物细菌浓度0D600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L,220 r/min振荡培养，将诱导物(IPEG溶液)于4 °C,4000 g，离心20 min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g细胞湿重)，加入EDTA至1 mM，室温下震荡5-10min,8000 g,4°C,离心20 min,弃上清，沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgS04,冰上震荡10min,8000 g,4°C,离心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4,获得AFBI抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
【权利要求】
1.黄曲霉素B1的抗原模拟表位AM-1，其特征在于其氨基酸序列为WPLYYYPWSDGA。
2.编码权利要求1所述抗原模拟表位AM-1氨基酸序列的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸，序列为:
GGCCTCTGTATTATTATCCTTGGTCTGATGGTCTGAT。
4.根据权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有黄曲霉素B1抗原模拟表位的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有黄曲霉素B1抗原模拟表位的噬菌体粒子；所述化学合成指依据模拟表位模拟表位氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行黄曲霉素B1抗原模拟表位的大量制备。
5.权利要求1所述抗原模拟表位AM-1在免疫学检测分析中的应用。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于黄曲霉素B1抗原模拟表位AM-1以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
7.根据如权利要求4所述应用，其特征在于黄曲霉素B1抗原模拟表位AM-1作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
【文档编号】C07K7/08GK104311634SQ201410526092
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】何庆华, 许杨, 陈静 申请人:南昌大学