专利名称：制备9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及通式(Ⅰ)表示的新的9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸衍生物，
这里M代表氢、C1-4烷基或药学上可接受的阳离子，以及含有这些化合物的药物组合物。
本发明还涉及通过β-谷甾醇或来源于植物的含β-谷甾醇的甾醇的微生物降解，如果需要的话，接着进行成盐或酯化反应，制备通式(Ⅰ)的化合物的方法，和制备含有通式(Ⅰ)的化合物的药物组合物的方法。
在通式(Ⅰ)表示的化合物的药学上可接受的盐包括那些与无机阳离子或有机阳离子所生成的盐，这些离子如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铵离子、亚乙二铵离子、甲基三羟甲基铵离子或四甲基铵离子。
本发明通式(Ⅰ)表示的化合物(这里M如前所述)是新的，并且具有价值的药理性质;这些化合物也作为制备药学上重要的甾族衍生物的起始原料。
已经知道，利用甾醇作为碳源时细菌降解甾族化合物的骨架和侧链。C.J.Sih及其合作者已经阐明了甾醇侧链的降解机理〔J.Am.Chem.Soc.89，1957(1967);同上，104，4718(1982);同上，104，4720(1982)〕。胆甾醇的侧链降解始于侧链末端的羟基化。26位碳原子上羟基的氧化导致形成羧酸，后者通过脂肪酸特有的β-氧化机理降解，其结果是逐步缩短侧链。在24位碳原子上有一个乙基的β-谷甾醇的侧链降解与胆甾醇的侧链降解不同。在降解中，细菌降解侧链在连结24位碳原子的28位碳原子上引入羧基，然后通过β-氧化机理使24位和28位碳原子之间的键断裂。
侧链降解的同时，酶催化转换影响甾族化合物的骨架，导致骨架的分裂，接着就是环系统的完全降解。骨架分裂以下述方式发生从甾醇形成具有9α-羟基-1，4-二烯-3-酮结构的甾族衍生物，接着自发重排生成毫无治疗价值的断甾族化合物，断甾族化合物中的骨架B环上9位和10位碳原子之间的键是断裂的。〔R.M.Dodson和R.D.MuirJ.Am.Chem.Soc.83，4627(1961);K.Schubert及合作者Z.Naturforsch 156，584(1960)〕。
廿世纪七十年代，通过导致遗传突变的处理，从应用甾醇的细菌制得了改变了遗传性质的菌株。这些菌株没有催化引发甾族类化合物骨架降解的反应的活性酶。
人们也已知道，当形成原生质体〔J.Tomcsik和S.Guex-HolzerSchweiz.Z.Allg.Path.Bact.15，517(1952);C.WeibullJ.Bacteriol.66，688(1953)〕或原生质球状体〔H.Sato和其合作者Canad.J.Microbiol，11，807(1965)〕时，在等渗条件下通过酶催化水解，能够全部或部分地分解细菌的细胞壁;细菌的细胞壁能够再生。原生质体或球状原生质体的聚乙二醇诱导熔合涉及遗传重组，产生了带有新的遗传信息的细胞〔K.Fodor和L.AlfoldiProc.Natl.Acad.Sci.USA73，2147(1976);P.Schaeffer及其合作者Proc.Natl.Acad.Sci.USA73，2151(1976);N.Rastogi及其合作者J.Gen.Microbiol，129，1227(1983);同上，137a，135(1986)〕。
我们使用G.E.Peterson及其合作者的方法〔J.Lipid Research 3，275(1962)〕，从各种土壤样品中分离出了降解谷甾醇的微生物。从使用甾醇的微生物菌株中，我们挑选了分枝杆菌菌株;通过使用UV辐射的遗传致变处理，我们从分枝杆菌菌株制得了突变菌株，这一菌株不再降解甾族化合物骨架。通过使用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的遗传致变处理，我们从这种菌种株培养出能进行遗传标记的突变菌株，比如那些需要各种培养基(腺嘌呤、吡咯氨酸、缬氨酸)的菌株或那些抗各种抗生素(例如链酶素)的菌株。通过体内遗传重组，该遗传重组使用了带有这些遗传标记突变菌株的原生质球状融熔体，我们培养出了重组分枝杆菌菌株，该菌株部分地降解甾醇侧链。标记名称BCS394下这种类型的分枝杆菌菌株生产出新的尚未发表的谷甾醇降解产物，该产物为主要产物，比如9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸(Ⅰ，这里M代表氢)和9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸甲酯(Ⅰ，这里M是甲基)。上述产物寄存在国家农业和工业微生物收藏中心(布达佩斯)，寄存号是NCAIM B(P)001038。
寄存号是NCAIM B(P)001038的分枝杆菌菌株的分类学性质如下微生物菌落呈灰白色;在45℃下繁殖，在50℃和无氧情况下不能繁殖。该菌株能有效地利用氯化铵、硝酸钙、硝酸钠和磷酸氢铵作为唯一的氮源，以及葡萄糖、丙三醇、果糖、麦芽糖、木糖、琥珀酸钠、丙酮酸钠和醋酸钠作为唯一的碳源;它不能利用蔗糖、淀粉和阿拉伯糖。该菌株不能降解酪氨酸，并且缺乏色素形成作用。
我们进一步出乎预料地发现，通式(Ⅰ)表示的新化合物(这里M代表的意义如前述)是哺乳动物体内胆固醇生物合成的强抑制剂，并能有效地降低血浆中胆固醇含量。
廿世八十年代，流行病学研究揭示出这样的事实血浆中高的胆甾醇含量是冠状动脉粥样硬化发病率高的主要危险因素。胆甾醇生物合成的主要器官是肝脏;合成的起始原料是乙酸，胆甾醇合成路线以具有萜烯结构的甲瓦龙酸和角鲨烯为中间体〔K.BlockArgew.Chem.77，944(1965);F.LynenAngew.Chem.77，929(1965)〕。
在抑制胆甾醇生物合成的物质中，8(14)-脱氢-15-氧代甾醇的微生物最为重要，其中最有效的试剂是3β-羟基-5α-胆甾基-8(14)-烯-15-酮(Colestolone)，其显著的降低血浆胆甾醇效果已在几种动物体、也在人体内得到了证明〔G.J.schroepfer jr.及其合作者J.Biol.Chem.263、4110(1988);G.F.Schroepfer jr.及其合作者Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，3042(1982)〕。
以9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸(Ⅰ，这里M代表氢)为例说明化合物的抑制胆甾醇生物合成效果。将该化合物的抑制效果与A.Erdo及其合作者〔Eur.J.Biochem.77，31(1977);Biochim.Biophys.Acta.486，71(1977)方法中3β-羟基-5α-胆甾基-8(14)-烯-15-酮(Colestolone)的抑制效果进行对比，A.Endo等研究了在大鼠肝脏均浆中将放射标记的乙酸引入胆甾醇的情况。
实验中使用了重50-60g的Hannover wistar雄性大鼠。实验前，在颠倒白天黑夜的环境(白天从下午四点到早晨四点，黑夜从早晨四点到下午四点)中，以富集有5%胆甾醇胺(cholestyramine)的咀嚼饲料喂养大鼠一星期;大鼠可以无限制地得到饲料和饮水。
实验当天将大鼠去头，肝脏浸入冰冷的Krebs/Ringer碳酸氢盐缓冲液中，并切成碎片。使用组织均质化器并缓缓操作，我们制得天然的肝脏均浆。称取100mg湿润的肝脏均浆置于玻璃塞试管中。上述操作都在稳定的冷却下进行。培育混合物包括肝脏均浆、Krebs/Ringer碳酸氢盐缓冲溶液、(1-14C)乙酸钠(IZINTA提供;比活性14.86MBq/mg)和油酸(3H)胆甾醇酯(Du Pont提供;比活性3067GBq/mmole)。象G.J.Schroepfer及其合作者描述的那样，在含有白蛋白的醇溶液中，将抑制胆甾醇生物合成的甾族化合物加入培育混合物中〔J.Biol.Chem.24，8975(1977)。最后培育混合物体积达2.0ml。在37℃水浴中培育2小时，再向上述混合物中加入2ml含15%(w/v)KoH的乙醇，然后于70-75℃下放置2小时。用石油醚将类脂化合物从碱性混合物中萃取出来。用氮气流将溶剂挥发完后，干燥的剩余物溶解在丙酮和乙醇混合溶剂中，然后用毛地黄皂苷溶液将胆固醇沉淀出来。沉淀物经离心分离后溶于闪烁鸡尾酒中，用Hitachi闪光分光仪上测其活性5分钟，得到结果列于表Ⅰ。
表Ⅰ化合物 浓度μM 抑制量%3β-羟基-5α-胆甾基-8(14)- 2.5 16.6烯-15-酮(参照) 10.0 55.09α-羟基-3-氧代-4，24(25)- 2.5 65.3豆甾二烯-26-羧酸 10.0 86.3表Ⅰ数据表明，在大鼠肝脏均浆实验中，本发明化合物的胆甾醇生物合成抑制效果显著超过了已知化合物3β-羟基-5α-胆甾基-8(14)-烯-15-酮(Colestolone)的抑制效果。
另一方面，本发明涉及制备通式(Ⅰ)表示的新的9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸衍生物的方法，通式(Ⅰ)中M代表氢、C1-4烷基或药学上可接受的阳离子。该方法利用寄存号为NCAIM B(P)001038的微生物菌株分枝杆菌BCS-394或其突变物，与带有β-谷甾醇或来源于植物含有β-谷甾醇的甾醇混合物，在含有可利用的碳源和氮源及天然盐的培养基中浸入的需氧发酵。并且，如果需要的话，可将通式(Ⅰ)的化合物，这里M代表氢和/或甲基，从发酵培养液中分离出来;如果需要还可以将通式(Ⅰ)的化合物，这里M代表氢，转化为通式(Ⅰ)代表的化合物，此时M代表药学上可接受的阳离子或C1-4烷基。
根据本发明的优选方案，寄存号为NCAIM B(P)001038的分枝杆菌菌株BCS-394是在含有可被利用的碳源、氮源以及天然盐的培养基中培养的，并且该培养基适于迅速生长分枝杆菌的培养。
碳源中的葡萄糖和甘油，有机氮源中的大豆粉、尿素和酵母提取液，无机氮源中的氯化铵要优先使用。将转化的甾醇以使用Tween-80和聚丙二醇制得的悬浮液形式与培养基混合是有利的。纯的β-谷甾醇或含有β-谷甾醇的甾醇混合物，例如从大豆油获得的天然谷甾醇，即β-谷甾醇和菜油甾醇的混合物，作为微生物转化的基质。
微生物培养和甾醇转化在28℃和37℃之间的温度下进行，最好在32℃下进行。
甾醇转化产物的大部分吸附在分枝杆菌细胞上，小部分溶解在培养基液体中。使用与水可混溶的有机溶剂，最好是甲醇，将甾族化合物从细胞上解吸下来;同时，发酵培养基滤液中的甾醇转化产物最好通过乙酸乙酯或氯代烃如二氯甲烷萃取来分离。溶剂蒸发后得到的粗产物中，除了主要产物9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸及其甲酯，还含有少量的几种甾醇降解产物。最好使用柱色谱和/或薄层色谱分离甾醇转化产物。产物的结构通过UV、IR、1H-NMR、13C-NMR以及质谱证明。
从本发明方法制备的具有通式(Ⅰ)的化合物，可以合成能应用于治疗的盐，通式(Ⅰ)中的M代表氢。从通式(Ⅰ)的化合物，这里M代表氢，可以使用本质上已知的方法制备这些盐，碱提供合适的阳离子。
本发明的酯衍生物也可以使用本质上已知的方法从通式(Ⅰ)的化合物，这里M代表氢，和合适的C1-4醇来制备。然而，本发明有代表性的化合物通式(Ⅰ)中的M是甲基，则可直接从发酵培养液中分离出来。
本发明通式(Ⅰ)的化合物，这里M代表氢、C1-4烷基或药学上可接受的阳离子，作为治疗比如人类的动脉粥样化或高脂肪血症的抗血胆甾醇过多的药物组合物的活性物质非常有用。这些药物可经口腔或非肠道给药，剂型可采用片剂、胶囊或注射剂。通常最好采用口腔给药。服药量自然受一些因素的影响，比如被治疗人员的年龄、体重、病情的严重程度以及其他一些因素，但成年人每天的服药量通常在大约100到3000mg的范围内，最好在300至1000mg范围内;但是，如果必要的话，更高的剂量也是合适的。
为应用于治疗，将本发明的活性化合物与无毒、惰性、固体或液体载体和/或添加剂混合配制成通常用作肠道内或非肠道给药的适当的药物组合物。
根据本发明，适于口腔给药的药物组合物固体剂型可从通式(Ⅰ)表示的9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸的衍生物，这里M表示的意义同前，通过下述方法制备研磨成平均粒径为0.05-1.0mm的活性物质与近似粒径的添加剂混合，用于制备片剂和胶囊。上述混合物可以直接添入硬质胶囊中或压成片剂，也可以在干燥或润湿后造粒。
用于制备片剂和胶囊的赋形剂作为添加剂使用，最好是淀粉、三碱价磷酸钙、磷酸氢钙、乳糖、葡萄糖、纤维素、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇或它们的混合物;吸附剂最好是胶体二氧化硅(商品名称Aerosil、Gesilite、Cab-O-Sil、Syloid、Neosyl);辅剂(excipients)最好是明胶、阿拉伯胶、纤维素醚(甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、果胶、藻酸钠、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的混合物;崩解剂最好是淀粉、羧甲基淀粉钠、超支链淀粉、藻酸和藻酸盐、甲醛明胶、甲醛酪蛋白、果胶、膨润土、微晶纤维素或它们的混合物;助流剂、润滑剂和抗粘材料(最好是金属皂、硬酯酸镁和硬酯酸钙)、甘油单硬酯酸酯、十八烷醇、十六烷醇、聚乙二醇、滑石或它们的混合物。
通过下列实施例对本发明做详细地说明。
实施例1制备9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸及其甲酯从在土豆-葡萄糖琼脂斜面培养基上生长5天的分枝杆菌SP.BCS-394(NCAIM B(P)001038)的培养物里取10ml无菌水制得细胞悬浮液。在3000ml Erlenmeyer烧瓶中，用5ml上述悬浮液为800ml无菌MI接种培养基接种。
MI培养基具有下列成分葡萄糖 8.0g大豆粉 1.6g尿素 0.4g酵母抽提物 0.8g氯化铵 2.4g磷酸二氢钾 0.4g7水硫酸镁 0.4g6水氯化铁 0.4gTween-80 0.4g加入800ml自来水中。
消毒前上述培养基的PH值调到7.0，该混合物于121℃下消毒45分钟。
该烧瓶置于旋转振动器(250转/分，直径2.5cm)上在32℃下培养2天。在装有4.2l121℃下消毒60分钟的MF培养基的101实验发酵器中，用烧瓶中的内容物接种。
MF培养基按下述方法制备50g葡萄糖、10g大豆粉、2.5g尿素、15g氯化铵和2.5g磷酸二氢钾放入1.5l自来水中加热至沸腾，这样制得的基本培养基补加15g碳酸钙后，在不断搅拌下加到100ml β-谷甾醇、40g聚丙二醇、10g TWeen-80和800ml自来水组成的融熔混合物中，121℃下消毒1小时，然后上述混合物的体积用沸腾自来水稀释至4l。这样制得的培养基在121℃下消毒1小时。
接种培养物在32℃以750转/分的转速摇动24小时，同时将100l/h的空气气流引入发酵器中。在300l/h气流通过以750转/分摇动的培养物的情况下，发酵持续进行6天。发酵终止后，淄醇转化产物通过下述方法分离。
取1l培养液的细胞进行过滤，该培养基最初含有20g β-谷甾醇。然后用200ml甲醇洗涤粘附的甾醇转化产物和未转化的β-谷甾醇三次。用200ml乙酸乙酯萃取培养基滤液。
减压蒸发合并的甲醇和乙酸乙酯萃取物后得到22g粗产物。该粗产物放到400g硅酸制得的柱子上进行色谱分离。用乙酸乙酯/正庚烷混合溶剂洗脱，混合溶剂中乙酸乙酯的比例逐步增加。蒸发用含10%乙酸乙酯的乙酸乙酯正庚烷混合溶剂洗脱的洗脱液，剩余物用甲醇重结晶后得到0.15g4-豆甾二烯-3-酮，m.p.89-90℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax 243nm(ε＝14090);
IR光谱(在KBr中)νc＝o1678，νc＝c1616cm-1;
1H-NMR光谱(在CDCl3中，δ)0.56S(H-4)，1.16S(3H-19)，0.68S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)412特征离子(m/z)412，229，135，124，109，95，55，43。
用正庚烷中含20%乙酸乙酯的混合溶剂从柱子上洗脱下1.05g未转化的β-谷甾醇。
减压蒸发用正庚烷中含30%乙酸乙酯的洗脱混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用甲醇重结晶后得到1.8g9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸甲酯，m.p.187-189℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax 239nm(ε＝21530);
IR光谱(在KBr中)νOH3600-3400，νmax3487(9α-羟基)，νC＝o1717(共轭酯)，1678(3位酮)，νC＝C1615cm-1;
1H-NMR光谱(在C6D6中，δ)5.92S(H-4)，3.46(3H，OCH3)，2.58q(2H-28)，1.96S(3H-27)，1.22t(3H-29)，0.95d(3H-21)，0.83(3H-19)，0.55S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)470;
特征离子470，438，410，137，136，134。
(m/z)减压蒸发用正庚烷中含35%乙酸乙酯的洗脱混合溶剂洗脱的洗脱液，剩余物用甲醇重结晶后得到0.15g9α-羟基-27-降-4-胆甾烯-3，24-二酮，m.p.208-211℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax241(ε＝14800);
IR光谱(在KBr中)νOH3555，νc＝o1705(24位酮)，1660(3位酮)，νc＝c1614cm-11H-NMR光谱(在CDCl3中，δ)5.86S(H-4)，1.32S(3H-19)，1.05t(3H-26)，0.90d(3H-21)，0.72s(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)400;
特征离子(m/z)400，151，137，136，124，122，109，57。
蒸发用正庚烷中含40%乙酸乙酯的洗脱混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用丙酮重结晶后得到0.2g9α-羟基-3-氧代-23，24-二降-4-胆烯-22-羧酸甲酯，m.p.212-216℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax242nm(ε＝15860);
IR光谱(在KBr中)νOH3395，νc＝o1730(酯)，1650(3位酮)，νc＝c1615cm-11H-NMR光谱(在CDCl3中，δ)5.8S(H-4)，3.6S(OCH3)，1.3S(3H-19)，1.2d(3H-21)，0.7S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)374;
特征离子(m/z)374，180，151，137，136，124，109，81。
蒸发用正庚烷中含42%乙酸乙酯的洗脱混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用甲醇重结晶得到0.25g3-氧代-4-豆甾二烯-26-羧酸，m.p.164-168℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax242nm(ε＝14010);
IR光谱(在KBr中)νc＝o1736，1650(26位羧酸和3位氧基)，νc＝c1616cm-1;
1H-NMR光谱(在CDCl3中，δ)5.73S(H-4)，1.19S(3H-19)，0.7S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)442;
特征离子(m/z)442，424，229，147，124，123，95，55。
减压蒸发用含45%乙酸乙酯的乙酸乙酯一正庚烷混合溶剂洗脱的洗脱物。如此得到的2.5g剩余物溶于10ml甲醇中，向该甲醇溶液中加入10ml在甲醇中含10%(W/V)盐酸的混合物和50ml乙酸乙酯。得到的溶液用30ml蒸馏水洗涤两次，再减压蒸发。剩余物用甲醇重结晶后得到2.2g9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸，m.p.242-248℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax239nm(ε＝21230);
IR光谱(在KBr中)νOH3650-3350，νmax3483(9α-羟基)，3200-2200(26位羧酸)，νc＝o1676(3位酮和26位羧酸)，νc＝c1616cm-1;
1H-NMR光谱(在C5D5N中，δ)6.15d(H-4)，2.83q(2H-28)，2.28S(3H-27)，1.39S(3H-19)，1.39t(3H-29)，1.14d(3H-21)，0.89S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)456;
特征离子(m/z)456，438，410，137，136，124，123，110。
实施例2制备9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸及其甲酯从在土豆-葡萄糖琼酯斜面培养基上生长4至5天的分枝杆菌SP.BCS-394的培养物里取10ml无菌水制得细胞悬浮液。在十个500ml Erlenmeyer烧瓶中分别放入100ml无菌MY-5培养基，每份培养基都分别用1ml上述细胞悬浮液接种。
MY-5培养基按下述方法制得10g甘油，1g大豆粉，0.5g尿素，1g氯化铵，0.5g磷酸氢二钾酯，0.5g7水硫酸镁，1g柠檬酸钠和0.05g6水氯化铁放入300ml自来水中，加热至沸腾。这样制得的基本培养基在搅拌下加到由30g粗谷甾醇(β-谷甾醇与菜油甾醇2∶1的混合物)、8g聚丙二醇、2g TWeen-80和150ml自来水组成的融熔混合物中，在121℃下消毒，再用沸腾的自来水将该混合物体积稀释至1l。
烧瓶于32℃在一个水平摇动器(250转/分，直径2.5cm)上摇动7天，然后用离心法将细胞从培养液中分离出来。每次用200ml甲醇，共洗涤三次，将甾醇转化产物和未转化的粗谷甾醇从细胞上洗涤下来。减压蒸发甲醇溶液。发酵培养基上层清液用200ml乙酸乙酯萃取，萃取液在减压下蒸发。合并萃取剩余物得粗产物32g。该粗产物置于500g硅酸制成的柱子上进行色谱分离。用乙酸乙酯正庚烷混合溶剂洗脱，混合溶剂中乙酸乙酯的比例逐步增加。用正庚烷中含25%乙酸乙酯的洗脱混合溶剂将2.5g未转化的起始原料(β-谷甾醇与菜油甾醇2∶1的混合物)从柱子上洗脱下来。
减压蒸发用正庚烷中含30%乙酸乙酯混合溶剂洗脱的洗脱物，剩余物用甲醇重结晶得到3.4g9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸甲酯，m.p.187-189℃。
上述产物的光谱特性与实施例1中的相同。
减压蒸发用正庚烷中含35%乙酸乙酯的混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用甲醇重结晶后得到0.43g9α-羟基-27-降-4-胆甾烯-3，24-二酮，m.p.208-211℃。
产物的光谱特性与实施例1中的相同。
蒸发用正庚烷中含37%乙酸乙酯的混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用丙酮重结晶得到0.49g9α-羟基-3-氧代-23，24-二降-4-胆烯-22-羧酸甲酯，m.p.212-216℃。
该产物的光谱特性与实施例1中的相同。
蒸发用正庚烷中含40%乙酸乙酯混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用甲醇重结晶后得到0.25g9α-羟基-26，27-二降-4-胆甾烯-3，24-二酮，m.p.201-204℃。
UV光谱(在乙醇中)λmax241nm(ε＝14200);
IR光谱(在KBr中)νOH3550，νc＝o1705(24位酮)，1660(3位酮)，νc＝c1610cm-1;
1H-NMR光谱(在CDCl3中，δ)5.85S(H-4)，2.12S(3H-25)，1.3S(3H-19)，0.90d(3H-21)，0.7S(3H-18)ppm;
质谱分子离子(m/z)386;
特征离子(m/z)386，151，137，136，124，109，43。
减压蒸发用正庚烷中含45%乙酸乙酯混合溶剂洗脱的洗脱液。剩余物用制备薄层色谱纯化，纯化时使用下列展开溶剂比例4∶6的乙酸乙酯/正庚烷。这样得到的4g产物溶于10ml甲醇中，该溶液用10ml10%甲醇的盐酸酸化，再用50ml乙酸乙酯稀释。得到的溶液用蒸馏水洗涤两次，每次用蒸馏水30ml。然后减压蒸发，剩余物用甲纯重结晶后得到3.5g9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸，m.p.242-248℃。
该产物的光谱特性与实施例1中的相同。
实施例39α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸的钠盐向含有100mg9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸的25ml乙醇溶液中加入2.2ml0.1N氢氧化钠。该溶液在室温放置30分钟后进行真空蒸发。得到的油状剩余物溶于10ml乙醇中，该溶液再进行蒸发。向剩余物中加入5ml丙酮，过滤便得到9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸的钠盐。
IR光谱(在KBr中)νOH3495，νc＝o1660(3位氧基)，νcoo-1572cm-1快原子轰击(FAB)质谱〔M+Na〕+＝501。
权利要求
1.制备式(Ⅰ)表示的9α-羟基-3-氧代-4，24(25)-豆甾二烯-26-羧酸衍生物的方法，
这里，M代表氢、C1-4烷基或药学上可接受的阳离子，包括通过含有可被利用的碳源、氮原以及天然盐培养基里的寄存号为NCAIMB(P)001038的分枝杆菌SP.BCS-394或其突变物的浸入需氧培养，发酵β-谷甾醇或含有来源于植物的β-谷甾醇的甾醇混合物，如果需要的话，可将通式(Ⅰ)表示的化合物，这里M代表氢和/或甲基，从培养基中分离出来，如果需要，还可以将通式(Ⅰ)表示的化合物，这里M代表氢，转化为通式(Ⅰ)表示的化合物，这里M代表C1-4烷基或药学上可接受的阳离子。
2.制备主要用于抗胆甾醇过多的药物组合物的方法，包括使用已知的制药方法将通式(Ⅰ)表示的化合物，这里M的定义同权利要求1，配制成药物组合物。
全文摘要
本发明涉及通式(I)表示的新的9α-羟基-3-氧代-4，24，(25)-豆甾二烯-26-羧酸衍生物，本发明还涉及制备这些化合物的方法。通式(I)表示的新化合物显示出抗血胆甾醇过多的作用。
文档编号C07J1/00GK1048857SQ9010438
公开日1991年1月30日 申请日期1990年5月11日 优先权日1989年5月11日
发明者加伯·安布拉斯, 安德烈亚·梅德斯帕克, 安东尼亚·杰科·尼·博卡, 安扎斯·加沃, 埃娃·伊尔凯, 吉奥吉·哈杰斯, 拉兹洛·西伯尼, 约兹塞夫·纳吉加拉·霍宛彻, 艾姆尔·莫拉维克斯克 申请人:格德昂·理查德化学工厂股份公司