专利名称：编码巨核细胞增强因子的基因的制作方法
技术领域：
本发明是关于基因的、更具体地说是关于在有干扰白细胞素(IL-3)等的巨核细胞集群刺激因子(Megakaryocyte Colony-Stimulating Factor简记为Meg-CSF)活性的物质存在下，作用于从多能性血液干细胞分化的巨核细胞集群形成细胞(Megakaryocyte Colony-Forming Vnit)编码具有促进巨核细胞成熟的来源于人的巨核细胞增强因子[Megakaryocyte Potentiator(以下缩写为Meg-POT)]活性多肽的基因，含有该基因的重组媒介物，由该媒介物产生的性状转变体，以及利用该基因的巨核细胞增强因子的制造方法。
本发明的基因，在体外在IL-3存在下，将具有用量依赖于增强巨核细胞集群作用的巨核细胞增强因子编码。将本发明的基因插入适当的媒介物后，通过性状转变常用的宿主细胞可以制造大量均匀的巨核细胞增强因子。因此，本发明有可能提供期待在临床上有用的，例如对随着血小板减少或血小板功能降低而引起的疾病的治疗剂。
血小板是对于生物机体的止血和形成血栓有重要意义的血液有形成分之一。血小板从骨髓中的造血干细胞经过巨核细胞系前体细胞成为巨核芽细胞，进而从成熟了的巨核细胞释放到血液中。
通常认为，为了从骨髓细胞形成巨核细胞集群，有必要具有二种不同作用的因子(Williams，N，et al.，「J.Cell Physiol.」110，101，(1982)。亦即，在只用加入这种因子形成巨核细胞集群的Meg-CSF时，仅这样则没有形成巨核细胞集群的活性，但是与加入Meg-CSF的同时增加巨核细胞集群数，则显示促进其成熟作用Meg-POT。
作为人体中具有Meg-CSF活性的因子，IL-3(Teramura，M. et al.，「Exp.Hematol.」16，843(1988))和粒性白细胞·巨噬细胞集群刺激因子(Teramura，M等，「Exp.Hematol.」17，1011(1989))等是已知的。另外，作为人体中具有Meg-POT活性的因子，干扰白细胞素6(Taramura，M和Mizoguchi，H「Int.J.Cell Cloning」8，245(1990))、干扰白细胞素11(Teramura，M等，「Blood」79，327(1992))、促红细胞生成素(Bruno，E等人，「Blood」73，671(1989))等是已知的。
但是，已知这些因子在巨核细胞·血小板系中不是特异的因子、而是对其他血球系及血球系以外的细胞也有作用。因此，当把它们作为药品、期望对巨核细胞·血小板系起作用而投药时，担心同时也有其他作用。因而，目前仍期待着对于巨核细胞·血小板系有特异作用的、作为药品用高生理活性的物质。
于是，找出对巨核细胞·血小板系起作用的新的巨核细胞增强因子的同时，为了将这种巨核细胞增强因子用于药品用途，需要大量地得到这种因子。在从产生细胞的培养上清液离析出巨核细胞增强因子的方法中，存在由于培养上清液中的巨核细胞增强因子浓度低、为得到均匀的巨核细胞增强因子，需要复杂的提纯工序，而且只能得到微量等难点。因此，为了满足上述的使用目的，利用了重组DNA技术，可期望能大量制造作用于巨核细胞·血小板系的新颖巨核细胞增强因子。
在这种情况下，本发明者在来自人体胰腺癌细胞的株化细胞「HPC-Y5」的培养上清液中发现了巨核细胞增强活性，从该培养上清液中精制出以巨核细胞增强活性为指标目的的新颖的巨核细胞增强因子、并且弄清了其性质(特願平3-361522号和特願平4-122518号)。
进而，以氨基酸序列的信息为基础合成寡核苷酸引物，从由「HPC-Y5」制造的mRNA制备成cDNA库，从该库用上述合成的引物，通过聚合酶链反应(以下简记为PCR)、得到编码巨核细胞增强因子的DNA片段。接着，以该DNA片段作为探针，经过cDNA库筛选，成功地离析出作为目的的新颖的编码巨核细胞增强因子的基因，并且弄清楚了它的整个碱基序列。
而且，也已清楚，将该基因插入适当的媒介物体之后，用这种表达媒介物培养性状转变的性状转变体，然后通过分离·提纯产生的目的蛋白质，能够大量地制造新颖的巨核细胞增强因子。
因而，本发明提供编码具有人的巨核细胞增强因子活性的多肽的基因。
本发明还提供了含有编码具有人的巨核细胞增强因子活性的多肽的基因的重组媒介物。
另外，本发明通过含有编码具有人的巨核细胞增强因子活性的多肽的基因的重组媒介物，提供性状转变的原核或者真核宿主细胞。
本发明还通过含有编码人巨核细胞增强因子活性的多肽的基因的重组媒介物进行性状转变而培养性状转变株，提供具有以分离产生的目的蛋白质为特征的人巨核细胞增强因子活性的蛋白质的制造方法。
图1表示实施例3中的阶梯-7的反相HPLC(Ⅲ)的结果。
图2表示质粒pKPO27的结构。
图3表示质粒pRVHKPO27的结构。
图4表示质粒pRVHKPO27f的结构。
图5表示质粒pCITE·KPO27的结构。
图6表示质粒pMBPKPO27的结构。
图7表示质粒pEFDKPOf的结构。
以下对本发明进行详细说明。
巨核细胞增强因子的基因，例如由产生巨核细胞增强因子的细胞等制成mRNA之后，利用已知方法转换为双链cDNA而得到。成为这种mRNA的供给源的细胞，在本发明中使用来自人胰腺癌肿瘤细胞的株化细胞「HPC-Y5」(Nozomi Yamaguchi等人，CANCER RESEARCH 50，7008，1990)[根据布达佩斯条约，于1991年12月27日在工业技术院微生物工业技术研究所，以微工研条寄第3703号(FERM BP-3703)进行了国际保藏]，但是并不限于肿瘤细胞株，也可以是从哺乳动物能够分离的细胞，或者是建立的其他细胞株。
另外，mRNA的制备，在本发明中是经过胍基硫氰酸盐处理后，进行氯化钯密度梯度离心(Chirgwin等人，Biochemistrg18，5294，1979)而得到全RNA。但是已经可以使用将其他生理活性蛋白的基因克隆化时使用的方法，例如，在钒复合物等的核糖核酸酶抑制剂存在下，进行表面活性剂处理、苯酚处理的方法(Berger & Birkenmeier，Biochemistry，18，5143，1979)。
从全RNA制备多(A)+RNA可以借助使用结合低聚(dT)的载体，例如琼脂糖和纤维素等的亲和柱色谱法或分批法进行。另外，也可以通过蔗糖密度梯度离心法等进一步精制多(A)+RNA。此外，也有不制备RNA而直接制得多(A)+RNA的方法。
如上所述，为了从所得的mRNA得到cDNA，例如以mRNA为模板，以在3′端的多A-链上互补的低聚(dT)或无规引物或者相应于巨核细胞增强因子的氨基酸序列的一部分的合成寡核苷酸作为引物，用逆转录酶处理来合成与mRNA互补的DNA(cDNA)。
将mRNA用碱处理而进行分解·除去之后，以得到的单链cDNA为模板、经逆转录酶或DNA聚合酶(例如Klenow片段等)处理后，再用S1核酸酶等处理或直接用RNase H及DNA聚合酶等处理可得到双链cDNA(Maniatis等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory 1982及Gubler & Hoffman，Gene 25，263，1983)。
为了离析编码巨核细胞增强因子的cDNA，可以用例如将巨核细胞增强活性作为指标或用抗体直接表达克隆等的方法进行。巨核细胞增强活性的测定，可以在IL-3存在下用骨髓细胞的软琼脂培养法进行。
亦即，将0.2ml马血清(56℃、处理30分钟、Biocell公司制)、0.1ml小鼠(C57BL/6N系雄性、6～12周龄)大腿骨骨髓细胞悬浮液(2×106有核细胞)、0.2ml含有重组体小鼠IL-3(5ng/ml)的Iscove′s Modified Dulbecco′s培养液(IMDM)、0.4ml含有0.75%琼脂的改性McCog′s5A培养液及0.1ml被检检样(用含10%马血清的IMDM稀释了的检样)进行混合，然后放入直径35mm的组织培养塑料盘中凝结后，在37℃、5%二氧化碳/95%空气、湿度100%的条件下进行培养。
在培养的第六天连带琼脂层取出、放在玻璃片上使之干燥，将作成的膜状标本用5%的戊二醛固定，按照Nakeff等人的方法(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.151，587，1976)，用乙酰胆碱酯酶染色，进行巨核细胞集群数的计算。这时，把含4个以上乙酰胆碱酯酶染色阳性细胞的集块作为巨核细胞集群。检查镜的放大倍数为40。还有，Meg-POT活性，把加入被检检样产生的巨核细胞集群数与不加入被检检样(只添加含10%马血清的IMDM)单独用重组体IL-3产生的巨核细胞集群数之差作为指标。
本发明人，从产生巨核细胞增强因子的株化细胞的培养上清液中离析精制出巨核细胞增强因子，以其氨基酸序列的信息为基础合成引物，用PCR，把编码具有来自人的巨核细胞增强活性的多肽的基因片段克隆。以其DNA作探针，通过已知方法从cDNA库中筛选出含有编码作为目的的新的巨核细胞增强因子的完全长cDNA的克隆。
再有，将这些cDNA作为含有在pBlue script SK(-)的EcoRI，Xho I切断部位之间插入的pKPO27的大肠杆菌(E.coli)JM109株，和含有pKPO21的大肠杆菌(E.coli)JM109株，按照布达佩斯条约在工业技术院微生物工业技术研究所进行了国际保藏，其寄存日分别为平成4年10月12日和平成4年11月10日，其寄存号分别为微工研条寄第4029号(FERM BP-4029)和微工研条寄第4071号(FERM BP-4071)。
另外，在本发明中反复进行使用PCR也可以得到完全长的cDNA。而且，不利用PCR而从氨基酸序列的信息合成探针，直接筛选cDNA库，也可以得到作为目的物的cDNA。
这样，通过把编码克隆化的巨核细胞增强因子的基因编入适当的媒介物DNA中，也可以使其他原核细胞或真核细胞的宿主细胞性状转变。
进而，通过将适当的启动子和有关性状表达的序列引入这些媒介物中，能够在各自的宿主细胞中表达基因。另外，将编码其他多肽的基因连续在作为目的基因中，表达为融合蛋白质，既容易纯化，又能提高表达量，在纯化过程中通过施行适当的处理，也能将作为目的蛋白质切开取出。另外，使用其他生理活性因子的基因，使连结的基因像融合蛋白质那样可尝试增强巨核细胞增强活性。
通常，真核生物的基因，像在人的干扰素基因等中已知的那样，被认为显示有多形现象(例如，Nishi等，J.Biochem.97，153，1985)，由于这种多形现象，如有一个或一个以上的氨基酸被置换时，也有即使碱基序列有变化，氨基酸也完全不变的情况。
另外，序列号10的氨基酸序列中是缺少或附加一个或一个以上的氨基酸的多肽或者氨基酸在一个或一个以上的氨基酸中是被置换的多肽都具有巨核细胞增强活性。例如，将相当于人的干扰白细胞素2(IL-2)基因的半胱氨酸的碱基序列置换为相当于丝氨酸的序列而得到的多肽保持有IL-2活性是公知的(Wang等，Science，224，1431，1984)。
另外，以真核细胞表达的情况，虽然多数是附加糖链，但在通过变换1个至更多个氨基酸能够调节糖链附加的情况下，也具有巨核细胞增强活性。因此，利用本发明中的人工改变的巨核细胞增强因子的基因所得到的多肽只要具有巨核细胞增强活性，编码它们的多肽的基因全都包括在本发明中。
而且，得到的多肽具有巨核细胞增强活性，与在序列号10中表示的基因进行杂交的基因也包括在本发明中。另外，杂交条件也可以应用通常进行探针杂交的条件(例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)。
本发明的表达媒介物包括复制起源、选择标记、位于要表达的基因之前的启动子、RNA镶接部位、聚腺苷化信号等。
作为哺乳动物细胞中的基因表达的启动子，可以使用来自逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等的病毒启动子和人体多肽链延伸因子-la(HEF-la)等细胞的启动子。例如，使用SV40的启动子时，如果按照Mulligan等的方法(Nature 277，108(1979)就能够容易实施。
作为复制起源可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等病毒，作为选择标记可以使用磷酸转移酶APH(3′)Ⅱ或Ⅰ(neo)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因等。
另外，原核宿主细胞，例如大肠杆菌，利用是以其作为宿主的媒介物pBR322可进行性状转变(Boliver等Gone 2，95(1975))。pBR322含有耐氨必西林和四环素的基因，通过利用某种耐性可以鉴定性状转变细胞。作为在原核生物宿主的基因表达中必要的启动子可以举出β-内酰胺酶基因的启动子(Chang等Nature 275，615(1978))、乳糖启动子(Goeddel等Natnre 281，544(1979))及色氨酸启动子(Goeddel等Nucleic Acid Res.8，4057(1980))，tac启动子等，哪种启动子都可以用于本发明的人的巨核细胞增强因子的表达。
在本发明表达系中使用的宿主中作为原核生物宿主细胞，例如可举出大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热杆菌(Bacillus thermophilus)等。并且在真核生物中，作为真核微生物的宿主细胞，例如可举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，作为来自哺乳动物的宿主细胞，例如可举出COS细胞、中国大田鼠卵巢(CHO)细胞、C127细胞、3T3细胞、Hela细胞、BHK细胞、ナバルバ细胞等。再有，本发明性状转变体的培养，可以在宿主细胞中适当选择适宜的条件进行培养。
如上所述，用编码作为目的巨核细胞增强因子的基因培养性状转变的性状转变体，所产生的巨核细胞增强因子可以从细胞内或细胞外分离直到均匀纯化。
另外，作为本发明目的蛋白质的人的巨核细胞增强因子的分离·纯化，可以使用通常蛋白质的分离·纯化方法，没有什么限制。例如，适当选择各种色谱法、超滤、盐析、透析等并组合，就可以分离·纯化人的巨核细胞增强因子。
有关得到编码本发明码巨核细胞增强因子的基因的方法、具有该基因的重组媒介物、含有该媒介物的性状转变体、培养这种性状转变体而获得的目的蛋白质以及各自的制造方法，虽然通过以下实施例进行详细说明，但并不是通过这些实施例来限制本发明。
实施例1 Meg-POT产生细胞株HPV-Y5的建立把由胰腺癌患者的淋巴结得到的肿瘤用含10%牛胎儿血清(FBS)的RPMI1640培养基，通过在二氧化碳恒温器(二氧化碳浓度5%、湿度100%)中培养而建立。使这种细胞株在含有1%FBS的Ham′s F10培养基中也能够驯化至增殖。此细胞株在塑料盘上进行单层状增殖、倍增化时间约为33小时(Nozomi Yamaguchi等，CANCER RESEARCH 50，7008，1990)。将这种细胞株称为HPC-Y5细胞。
实施例2 HPC-Y5的传代培养和通过摇瓶进行大量培养实施例1中描述的HPC-Y5细胞的传代培养如下所述进行。使用塑料培养烧瓶(150cm2，Corning公司制)，在含有10-8mol亚硒酸钠、100U/ml G青霉素钾和1.00μg/ml硫酸卡那霉素的Hanis营养混合物F12培养基(50ml)中培养HPC-Y5细胞，每四天更换培养液。
在细胞传代时除去培养液，加入预先加温至37℃的0.125%胰蛋白酶(GIBCO公司制)、含0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)(和光纯药公司制)的，不含钙、镁的Dulbeco′s磷酸盐缓冲含盐(PBS)溶液，在37℃加温5分钟。通过ピペツティンゲ操作剥离细胞，把细胞移入15ml容量的塑料制离心管中，以1500转/分的转速、离心5分钟回收细胞。将细胞悬浮于上述培养基中，在4～5个新烧瓶中传代。静置一夜后、将培养液和非附着性细胞一起除去，重新加入上述培养液继续培养。以后每四天更换培养液。另外，为了供给实施例3中所述的纯化Meg-POT用的HPC-Y5细胞，实施如下的摇瓶大量培养。
如上所述已传代的HPC-Y5细胞从完全密增殖的150cm2的塑料培养烧瓶中利用上述的胰蛋白酶-EDTA回收细胞，然后将其悬浮在含有0.2%牛胎儿血清(Hyclone公司制)的250ml上述培养基中，随后转移到1700cm2的塑料制摇瓶(Corning公司制)中，以0.5转/分的速度进行转动培养。7日后将培养液更换为不含血清的上述培养基，以后通过每四天更换上述无血清的培养基回收纯化用无血清的培养上清液。
实施例3 来自HPC-Y5株培养上清液中的Meg-POT的纯化在按照实施例2所述方法得到的HPC-Y5细胞的培养上清液(27.3升)中加入Tween20，使其最终浓度为0.01%，然后用人工肾pAN1200(旭メディカ)浓缩约200倍。将浓缩液相对于含0.01%Tween 20的10mmol乙酸缓冲液(pH5.0)，在4℃透析一夜。对透析内液进行离心操作(1000×g，60分)，除去不溶物，将上清液用于下述的纯化。
(步骤1)S-琼脂糖离子交换色谱法将上述离心上清液加入用含0.01%Tween20的20mmol乙酸缓冲液(pH5.0)平衡的S-琼脂糖快速流动(Pharmacia公司制)柱(5×10cm)中。用同样的缓冲液将柱洗净后，依次将同样缓冲液中的NaCl浓度增加为0.15mol，0.5mol和1.0mol洗脱出吸附的蛋白质。根据上述方法测定未加工部分、洗净部分和在各盐浓度中洗脱部分的活性的结果，认为在0.15mol NaCl的洗脱部分中有Meg-POT活性。
(步骤2)DEAE-琼脂糖离子交换色谱法把步骤1得到的活性部分，相对于含0.01%Tween20的10mmol Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)在4℃透析一夜。将透析内液加入用同样的缓冲液平衡化的DEAE-琼脂糖快速流动(Pharmacia 公司制)柱(2.2×13cm)中，用同样的缓冲液将柱洗净。依次将同样缓冲液中的NaCl浓度增加为0.15mol、0.5mol和1.0mol洗脱出吸附的蛋白质。根据上述方法测定未加工部分、洗净部分和在各盐浓度中的洗脱部分的活性的结果，认为在0.15mol NaCl的洗脱部分中有Meg-POT活性。
(步骤3)逆相HPLC(Ⅰ)在步骤2得到的活性部分中，加入5%三氟乙酸(TFA)，调整pH值约为2，以1.0ml/分的流速加到用含0.1%TFA的5%乙腈平衡化的逆相HPLC柱(ProteinC4，10×250mm，Vydac公司制)中。按照乙腈的直线浓度梯度(5%→65%、120分、0.5%乙腈/分)，以1ml/分流速洗脱出吸附的蛋白质。通过跟踪在220nm和280nm处的吸光度进行测定洗脱的蛋白质，每1ml为一部分。对各部分进行活性测定的结果，认为在乙腈浓度40～45%的部分中有Meg-POT活性。
(步骤4)逆相HPLC(Ⅱ)用0.1%TFA将步骤3中得到的活性部分稀释2倍、以1.0ml/分的流速加到用含0.1%TFA的35%乙腈平衡化的逆相HPLC柱(Protein C4，4.6×250mm，Vydac公司制)中。按乙腈的直线浓度梯度(35%→50%、75分、0.2%乙腈/分)，以1ml/分的流速洗脱出吸附的蛋白质。通过跟踪在220nm和280nm处的吸光度进行测定洗脱的蛋白质，每1ml为一部分。对各部分进行活性测定的结果，认为在乙腈浓度40～45%的部分中有Meg-POT活性。
(步骤5)DEAE·离子交换HPLC将步骤4得到的活性部分冷冻干燥后，溶于含0.01%Tween20的10mmol Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中，以0.7ml/分的流速加到用同样缓冲液平衡化的蛋白质Pak G-DEAE柱(Waters公司制，8.2×75mm)中。按NaCl的直线浓度梯度(0.0mol→0.2mol、40分、5mmol NaCl/分)，以0.7ml/分的流速洗脱出吸附的蛋白质。洗脱蛋白质在20nm进行测定，每0.7ml为一部分。对各部分进行活性测定的结果，认为在NaCl浓度75mmol以下部分中有Meg-POT活性。
(步骤6)TSK凝胶G3000SW凝胶过滤将步骤5得到的活性部分，以3ml/分的流速流经用含0.01%Tween20和0.15mol NaCl的50ml Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化的TSK凝胶G3000SW柱(东ソ-公司制21.5×600nm、ガ-ド柱21.5×75nm)，在220nm检测洗脱的蛋白质。每3ml为一个部分，对各部分测定的结果，认为在洗脱时间为49～54分的部分中有Meg-POT活性，并回收了该部分。
(步骤7)逆相HPLC(Ⅲ)向步骤6得到的活性部分加入5%TFA，将pH调节为约2、在与步骤4的逆相HPLC(Ⅱ)相同条件下进行色谱法。对各部分活性测定的结果，认为在主峰(乙腈浓度为40～45%)有Meg-POT活性。其结果在图1中示出。把在图1中用横杠表示的部分作为纯化的Meg-POT回收。
实施例4 巨核细胞增强因子(Meg-POT)的氨基酸序列(ⅰ)N末端氨基酸序列的确定将实施例3得到的纯化Meg-POT试样用气相式蛋白质序列-470A型分析仪(Applied Biosystems公司制)进行爱德曼(Edman)降解，把得到的苯基海硫因(PTH)-氨基酸用PTH分析器120型(Applied Biosystems公司制)进行鉴定。其结果，确认N末端附近的氨基酸序列(序列1～3)有以下表示的三种。序列-1(序列号1)
序列-2(序列号2)
序列-3(序列号3)
(序列下面所示的数字是爱德曼降解时的循环数)在上述序列1～序列3中的氨基酸序列中，确认了下述的氨基酸序列是共同的。
Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu(序列号4)(ⅱ)内蛋白酶Glu-C消化将试样溶解于0.1mol碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)中，加入尿素和二硫苏糖醇(DTT)至各自最终浓度为7.8mol和50mmol，在37℃培育2小时。向其中加入0.5μg Endo Glu-C(Boehvinger-Mannheim公司制)、在37℃反应2小时之后，再加入等量的酶，再次在37℃反应18小时。将10%三氟乙酸(TFA)加入反应液至pH为2，然后加到用0.1%TFA平衡化的C18柱(4.6×25cm，Vydac公司制)上。
肽的洗脱是用在0.1%TFA中乙腈浓度在128分钟内从0上升到64%，其后在16分钟内再直线地上升到80%而进行的。用220nm和280nm二种波长对肽进行检测。有关得到的部分消化肽片段，依次用气相式蛋白质序列-473A型分析仪(Applied Biosystems公司制)分析氨基酸序列。
其结果表明，在部分消化片段中有一个具有以下所述序列Leu-Ala-Val-Ala-Leu-Ala-Gln-Lys-Asn-Val-Lys-Leu-Ser-Thr-Glu-Gln-Leu-Arg-Xaa-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ser-Glu-Pro-Pro-Glu-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Pro-(序列号5)(另外Xaa表示未鉴定的氨基酸。下同)。
实施例5 从HPC-Y5细胞制备多(A)+RNA按照Chirgwin等(Biochemistry，18，5294(1979))所述的方法，从HPC-Y5细胞制成了全RNA。亦即，将约1×109个HPC-Y5细胞在49ml含有31.25mmol柠檬酸钠及0.625%月桂基肌氨酸钠的5mol胍基硫氰酸(Fulka公司制)溶液中完全搅均。使匀浆在离心管中的含0.1mol EDTA的5.3mol氯化铯的溶液层上重层，然后将其用SW40旋转器(Beckman公司制)以31，000转/分的转速在20℃离心分离17小时，借此使RNA沉淀。
将RNA沉淀物在80%乙醇中洗净，然后溶解于含1mmolEDTA和0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)的2.4ml的10mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中，加入链霉蛋白酶(Boehringer Mannheim公司制)使其浓度为0.5mg/ml，然后，在37℃保温20分钟。RNA溶液通过苯酚处理而除去蛋白质。溶液中残留的苯酚用氯仿提取后，用乙醇使RNA沉淀。
用由低聚(dT)纤维素旋制柱组成的mRNA分离器(Clontech laboratories公司制)从全RNA纯化多(A)+RNA。按照装置所附带的处理方法，通过反复二次纯化提高纯度。
进行二次上述操作，分别得到37μg和190μg多(A)+RNA。
实施例6 PCR用于cDNA库的构筑以10μg上述多(A)+RNA作为材料，使用cDNA合成装置c-CLONE(clontech laboralories公司制)合成双链cDNA，在末端附着有EcoRI接头。游离的Eco RI接头用琼脂糖凝胶电泳分离后，通过使用Geneluter(Invitrogen公司制)的电洗脱回收具有600碱基对以上长度的cDNA。把这种接头附加双链cDNA和预先经EcoRI及碱磷酸酶(宝酒造公司制)处理过的λZAPⅡ媒介物(Stratagene公司制)在含有7mmol氯化镁、1mmol DTT、1mmolATP及2单位的T4DNA连接酶(宝酒造公司制)的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、在4℃保温24小时进行连接。
用Gigapack GoldⅡ packaging extract (Stratagene公司制)将其包装，构筑成HPC-Y5细胞的cDNA库。进而将该库分为7个库(A-G)，进行放大，在含有5.8g/l氯化钠、2g/l硫酸镁·7H2O和0.01%明胶的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中回收。
实施例7 利用PCR的克隆化作为编为λXAPⅡ的EcoRI部位附近的T7启动子序列的引物T7、T3启动子附近序列的引物T3-2和本因子的末端附近的部分氨基酸序列Gly-Glu-The-Gly-Gln-Glu-Ala的基因，用381A DNA合成装置(Applied Biosystems公司制)合成含有可能有的全部密码的混合引物N1。
而且，如实施例4(ⅱ)中所述那样，由于在本因子的内Glu-C片段(序列号5)中发现Ala-Gln-Lys-Asn-Val-Lys-Leu-Ser-Thr-Glu-Gln-Leu-Arg-Xaa-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ser-Glu-Pro-Pro-Glu-Asp-Leu-Asp-Ala这个比较的密码usage低的序列(有下线的部分)，因此，以这种氨基酸序列为基础作为编码这些低序列的基因，同样合成含有可能有的全部碱基序列的混合引物K4及K4-2A。这些引物的碱基序列如以下所示T75′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′T3-25′-CATGATTACGCCAAGCTCGAA-3′N15′-GG(GATC)GA(GA)AC(GATC)GG(GATC)CA(GA)GA(GA)GC-3′(有义)K4S5′-GC(GATC)CA(AG)AA(AG)AA(TC)(GT(GATC)AA(AG)(TC)T-3′(有义)K4-2A5′-GC(GA)TC[(GATC)AG或(TC)AA](AG)TC(TC)TC(GATC)GG(GATC)GG(TC)TC-3′(无义)将链霉蛋白酶、EDTA和SDS加入增强的cDNA库的7个库的噬菌体悬浮液中，加至使最终浓度分别为0.5mg/ml、20mmol、0.5%，在37℃保温1小时。该溶液用苯酚处理除去蛋白质，接着用氯仿提取苯酚，然后用乙醇使DNA沉淀。将这样纯化的DNA作为模板，使用热循环控制装置(Perkin Elmer Cetus公司制)进行第一阶段的PCR。
将500ng库存DNA在含有10mmol tris盐酸缓冲液(pH8.3)、50mmol氯化钾、1.5mmol氯化镁、0.01%明胶、100μmol脱氧核苷三磷酸(dNTP)及引物T7和N1各1μmol的50μl的PCR反应溶液中增强。先在95℃进行7分钟变性后、冷却到85℃，加入1.25单位的Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus公司制)。然后在94℃变性1分钟，在60℃韧化1分钟，进行延伸72℃2分钟的40个循环的PCR。再相对于这些PCR反应液量的1/20，利用引物K4S和K4-2A，在与上述相同的条件下进行第二阶段的PCR。
用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析第二阶段的PCR反应液，切出含有增强的84bp的DNA片段的凝胶部分，在含有0.1%SDS、10mmol乙酸镁、0.1mmolEDTA的500mmol乙酸钠中进行破碎，在37℃保温16小时，提取出DNA。把用乙醇沉淀的DNA溶解于含有1mmol精脒、0.1mmolEDTA的20mmol tris盐酸缓冲液(pH9.5)中，在90℃加热2分钟之后，进行急冷，在加入含有100mmol2-巯基乙醇、100mmol氯化镁的10μl的500mmol、tris盐酸缓冲液(pH9.5)以及13μl的10mmolATP和20单位的多核苷酸激酶(东洋纺公司制)之后，使之在37℃反应1小时使5′端磷酸化。
通过用苯酚处理DNA溶液除去蛋白质。用氯仿提取出溶液中残留的苯酚之后，用乙醇使DNA沉淀。把用限制性酶Sma I(宝酒造公司制)和碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)处理过的媒介物pSP73(Promega公司制)和这种DNA试样在含有7mmol氯化镁、1mmolDTT、1mmolATP和2单位的T4DNA连接酶(宝酒造公司制)的20μl的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、在16℃保温16小时进行连接。
接着，将上述连接混合物中的10μl加入到100μl大肠杆菌JM109的感受态细胞中，在冰上静置30分钟，在42℃静置1分钟，然后再在冰上静置1分钟。然后加入400μl的SOC培养基(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，在37℃保温30分钟后，使这种大肠杆菌在含50μg/ml的氨必西林的LB琼脂培养基(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)上扩展，在37℃保温16小时得到大肠杆菌性状转变体。
将已发现的性状转变体体中的5种克隆分别在含50μg/ml氨必西林的5ml的LB培养基中、在37℃培养16小时，从其培养物中用碱法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)制取质粒DNA。用Sequenase Vcrsion 2.0(United States Biochemical公司制)通过双脱氧序列(ジデオキシ.シ-グンシング)法确定各自的插入碱基序列，如在序列号6中所示，已经清楚引物K4S和K4-2A中插入的40个碱基对排列顺序。
以这种碱基序列为基础合成了有义的引物7D-1S5′-CTCTCAACAGAGCAGCTGCG-3′及7D-3S5′-CTGGCTCACCGGCTCTCTGA-3′和无义引物7D-1A5′-AGAGCCGGTGAGCCAGACAG-3′及7D-2A5′-GCGCAGCTGCTCTGTTGAGA-3′。用上述同样的条件以库存DNA为模板用T7和7D-1S以及T3-2和7D-1A的组合进行第一阶段的PCR。而且，分别用引物T7和7D-3S以及T3-2和7D-2A的组合进行第二阶段的PCR。
用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，切出含有已增强的DNA片段的凝胶部分，用Sephaglas Bsnd Prep Kit(Pharmacia公司制)提取DNA。对这些DNA用fmol DNA序列化系统(Promega公司制)确定直接碱基序列，如在序列号7和8中所示，已证实编码本因子的基因的一部分。
以这种碱基序列为基础合成有义引物3AS15′-AACTCCTTGGCTTCCCGTGTG-3′和无义引物7SAl5′-CGCATCTGGGTTGAGGAATAG-3′，用上述条件对于库D进行PCR时，证实有197碱基对(序列号9)的DNA片段的增强，该DNA片段编码的氨基酸序列与在实施例3中使用所得的纯化Meg-POT确定的氨基酸序列是一致的。该DNA片段(Q197A)在以下的筛选中作为探针使用。
实施例8 利用cDNA库的探针Q197A的筛选以实施例5得到的5μg多(A)+RNA作为材料、利用ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT(Stratagene公司制)合成双链cDNA，然后连接到λZApⅡ媒介物(Stratagene公司制)的臂上。用Gigapack Gold Ⅱ packaging extract(Stratagene公司制)将其包装，构筑成新的HPC-Y5细胞的cDNA库。
从丙烯酰胺凝胶电泳后的凝胶中回收以实施例7中的PCR增强的197bp的DNA，使用无规引物DNA标记装置(宝酒造公司制)，用32P标记这种DNA片段Q197A。但是，用400nmol浓度的引物3AS1和7SA1代替附带的无规引物来进行标记。游离的dNTP通过装载在NICK柱(Pharmacia公司制)上而被除去。接着，按照Benton和Davis的方法(Science 196，180，1977)进行噬菌斑杂交。
将Hybond-N+过滤膜(Amersham公司制)放在噬菌斑生长的琼脂培养基上移动噬菌体，以下述顺序处理过滤膜。在含1.5mol NaCl的0.5N NaOH水溶液中使DNA进行5分钟变性，在含1.5mol NaCl的0.1N NaOH水溶液中继续1分钟，然后用含1.5mol NaCl的0.5mol tris盐酸缓冲液(pH7.4)1分钟2次处理，最后用2×SSCP(240mmol NaCl，30mmol柠檬酸钠、26mmol KH2PO4、2mmol EDTA)进行1分钟处理。
接着，将过滤膜干燥，用0.4N NaOH水溶液处理20分钟，用5×SSPE(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)1分钟处理2次。在含有50%甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt′s溶液(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)、0.1% SDS及0.1mg/ml变性DNA(鲑鱼精巢DNA，Boehringer Mannheim公司制)的预杂交(プレハィプリダィゼ-シヨン)溶液中，在42℃保温4小时。
像上述那样在含有标记的Q197A探针的杂交溶液(50%甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt′s Solution、0.1mg/ml变性DNA(鲑鱼精巢DNA)、0.1%SDS)中，在42℃进行16小时杂交。过滤膜在室温下用含0.05%SDS的2×SSC进行1小时2次洗涤，接着，在68℃用含0.1%SDS的1×SSC进行1小时2次洗涤，进而在68℃用含0.1%SDS的0.2×SSC洗涤1小时之后，用放射自显影法进行检测。
其结果，得到23个阳性噬菌体克隆。在得到的噬菌体克隆中对认为含有完全长cDNA的克隆，使用协助者噬菌体R408，按照ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT(stratagene公司制)所附的处理方法进行质粒的切出。使用Sequenase Version 2.0(United States Biochemical公司制)，按照双脱氧顺序法，对得到的质粒pKPO27(图2)检测，克隆化DNA的碱基序列得到在序列号10中所示的碱基序列。并且对其他质粒pKPO21用同样的方法检测。克隆化DNA的碱基序列，在序列号10中所示的碱基序列中，第1873号的G(鸟嘌呤)变化为A(腺嘌呤)(因而，第593号的VaI(缬氨酸)变化为Met(蛋氨酸)，序列的其他部分与pKPO27的其他部分是一样的。利用Gen Bank Re 1.71检查这些碱基序列和用这些碱基序列编码的氨基酸序列，已证实这些碱基序列和氨基酸序列都是新颖的。
另外，含有上述质粒pKPO27的大肠杆菌作为Escherichia coli JM109(pKPO27)，以及含有质粒pKPO21的大肠杆菌作为Escherichia coli JM109(pKPO21)，根据布达佩斯条约，已分别于平成4年10月12日和平成4年11月10日在工业技术院微生物工业技术研究所(茨城县つくぽ市东1丁目1番3号)进行国际保藏，保藏号分别为微工研条寄第4029号(FERM BP-4029)和微工研条寄第4071号(FERM BP-4071)。
实施例9 pRVHKPO27媒介物的构筑(动物细胞用)将实施例8得到的pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol NaCl的20mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶EcoRI(宝酒造公司制)处理2小时，作为乙醇沉淀回收DNA，进而在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol KCl的20mmol tris盐酸缓冲液(pH8.5)中，于37℃用限制性酶BamHI(宝酒造公司制)处理2小时之后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收1.8Kbp的DNA片段。
将媒介物HEF-12h-gγ1与上述同样地用限制性酶EcoRI和BamHI处理后、加入碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)，通过在65℃保温2小时，脱磷酸之后进行琼脂糖凝胶电泳，把回收的8.7Kbp DNA与先前得到的1.8Kbp的DNA片段混合后，在含有6.6mmol MgCl2、5mmol DTT、1mmolATP的66mmoltris盐酸缓冲液(pH7.5)中，于16℃使之与T4 DNA连接酶反应一夜，将其导入大肠杆菌JM109株中，得到pRVHKPO27(图3)。
如图3所示，这种质粒含有EF1α启动子、人的免疫球蛋白H链定常区域基因、SV40加强启动子、来自pBR322的复制开始区域和β-乳胺酶基因(amp′)，在EF1α启动子和人免疫球蛋白H链定常区域基因之间连接有人的Meg-POT cDNA的一部分。
另外，上述媒介物HEF-12h-gγ1的构成要素的2.5Kb的HEF-1α启动子加强区域，它是由连接在该基因的5′-末端的约1.5Kp的DNA、第一エクソン中的33bp、第一内含子中的943bp、及第二エクソン的最初的部分的10bp组成。把这种2.5Kb的HindⅢ-EcoRI片段从质粒pEF321-CAT(D.W.Kim等，Gene 91，217(1990);及T.Uetsuki等，J.Biol.Chem.264，5791(1989))中切出，然后在pdKCR媒介物(M.Tsuchiya等，Embo J.6，611(1987)，K.O′Hara等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78，1527(1981))，R.Fukunaga等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81，5086(1984)上进行克隆，与含有SV40前期启动子加强的约300bp的HindⅢ-EcoRI片段置换而得到pTEF-1。
用EcoRI消化pTEF-1，用Klenow聚合酶进行填平，然后连接到HindⅢ接头。接着，从已修饰的pTEF-1媒介物DNA上切出约1.6Kb 的HindⅢ-SmaⅠ片段。用EcoRI将HCMV-12h-gγl(Maede等，Human Antibodies and Hybridomas 2，124(1991);C.A.Kettleborough等，Protein Engeneering 4，773(1991))部分消化，用Klenow聚合酶进行填平，然后通过自身连结，从HCMV-12h-gγl制成质粒HCMV-12h-gγl(△E2)。
用EcoRI消化质粒HCMV-12h-gγl(△E2)，用Klenow聚合酶进行填平，然后用HindⅢ消化。把含有编码人的α-IC区域的DNA序列的约7Kb的片段连接到含有HEF-1α启动子加强的上述1.6Kb HindⅢ-SmaⅠ片段上，得到HEF-12h-gγl。这种媒介物中的HEF-1α启动子加强区域，除了连接5′-区域的380bp的DNA之外，与pTEF-1中区域的相同。
实施例10 COS细胞中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)基因的表达Ⅰ将COS细胞按1×107个/ml悬浮在PBS中，在0.8ml这种细胞悬浮液中加入10μg pRVHKPO27。在1900V、25μF、0.4毫秒的条件下、用GenePulsar(BioRad公司制)通过电穿孔法(electroporation)将质粒导入COS细胞。在室温经10分钟的恢复时间之后，把电穿孔的细胞加入25ml含1%牛胎儿血清的Dulbecco′s Minimum Essential Medium(DMEM)(GIBCO公司制)中。经72小时培养后，收集培养上清液。
将如此得到的一部分COS细胞培养上清液用セントリ プレツプ-10(Amicon公司制)浓缩约10倍，用SDS/PAGE分析。作为对照，用同样的未处理的COS细胞以及只导入媒介物的COS细胞的培养上清液也同样分别浓缩约10倍，也对其比较而进行泳动。凝胶浓度为12%，按照Laemmli的方法(Natave，227，680(1970))进行泳动，有一个用2D-银染色试剂·Ⅱ「第一」(第一化学药品制)对蛋白质染了色。
分子量标示剂使用バィオラツド公司制的低分子量标示剂[磷酸化酶B(92.5Kd)、牛血清清蛋白(66.2Kd)、卵清蛋白(45.0Kd)、碳酸酐酶(31.0Kd)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5Kd)、溶菌酶(14.4Kd)]。
根据Western印迹法已检出又一个巨核细胞增强因子。
这时的分子量标示剂使用バィオラツド公司プレスティンド分子量标示剂[磷酸化酶B(130.0Kd)、牛血清清蛋白(75.0Kd)、卵清蛋白(50.0Kd)、碳酸酐酶(39.0Kd)、大豆胰蛋白酶抑制剂(27.0Kd)、溶菌酶(17.0Kd)]。一次抗体使用以从来自HPC-Y5的培养上清液纯化的巨核细胞增强因子的N末端序列分析得到的序列为基础合成的18残基的肽作抗原，对家兔免疫而得到的多克隆抗体。
其结果，将用银染色法染色的带在三者间进行比较，对于分子量约33，000中能见带、只有在导入巨核细胞增强因子的基因的COS细胞的培养上清液中看到。而且就连用Western印迹法也只有这种分子量33，000的带，有强的显色，因此这种带被认为是重组型巨核细胞增强因子。
实施例11 COS细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)的活性测定Ⅰ按照前述方法测定在实施例10中得到的COS细胞的培养上清液的巨核细胞增强因子活性。但是，由于基因导入对COS细胞的刺激，已知在其培养上清液中IL-6被诱导，所以测定是在添加对于小鼠IL-6受体的抗体的体系中进行的。
其结果，如表2所示，虽然没有导入基因的无处理的COS细胞的培养上清液和导入不含Meg-POT的cDNA的媒介物的对照COS细胞的培养上清液都未显示出巨核细胞增强因子活性，但是导入含有Meg-POT的cDNA的媒介物的COS细胞的培养上清液明显地显示出巨核细胞增强因子活性。
表2COS细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子活性COS细胞巨核细胞增强因子活性a)培养上清液浓度(%) 50 0.5 0.005无处理的COS 1.53 NDb)对照的COS 0 2.5 ND导入Meg-POT cDNA的COS 8.5 7 3.5a)从形成的集群数扣除以IL-3单独形成的集群数(26.5个)之后的值b)未测定实施例12 来自COS细胞的培养上清液的重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)的纯化Ⅰ在实施例10中得到的350ml COS细胞的培养上清液中加入Tween20，使其最终浓度为0.01%，通过使用Amicon PM-10(Amicon公司制)的超滤方法约浓缩10倍。从该浓缩液按以下顺序纯化重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)。
(ⅰ)相对10L含0.01%Tween 20的10mmol tris盐酸缓冲液(pH8.4)，将上述浓缩液在4℃透析一夜之后，加入到用同样缓冲液平衡化的DEAE-琼脂糖快速流动柱(2.2×18cm，Pharmacia公司制)中。用同样的缓冲液将柱洗净后，在同样的缓冲液中分级将NaCl浓度提高为0、0.1、0.15、0.2、0.5mol洗脱出吸附在柱中的蛋白质。用SDS/PAGE对得到的部分进行分析的结果表明，在实施例10中看到的分子量约33，000的带，只有在NaCl浓度为0.1mol的部分的前半部分被检测出。收集该部分，用下述逆相HPLC进行纯化。
(ⅱ)在上述部分中加入10%TFA，使pH值为3以下，然后加入到用含0.1%TFA的24%乙腈平衡化的Vydac C4柱(4.6×250mm)中，用同样的洗提液将柱洗净后，使0.1%TFA中的乙腈浓度在80分钟直线地由24%增至64%，进而再在10分钟上升至80%，洗脱出吸附在柱上的蛋白质。以流速约为1ml/min，用220nm和280nm二种波长进行蛋白质检测。对所得到的峰用SDS/PAGE进行分析的结果表明，在乙腈浓度约为41%时，得到分子量约33，000的带。将该部分用0.1%TFA稀释后，再用相同条件进行逆相HPLC，收回主峰部分。
实施例13 重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)的氨基酸序列分析对实施例12得到的重组型Meg-POT，用气相蛋白质序列-473A型分析仪(Applied Biosystems公司制)进行N末端氨基酸序列分析。其结果证明，以下所示的(a)～(c)3种的N末端氨基酸序列在实施例10中已看到，其中所看到的分子量约33，000的带是重组型巨核细胞增强因子。
(a)Ser-Arg-The-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-……(序列号11)
(b)Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val-Leu-Ala-Asn Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xaa-Leu-Xaa-Pro-Arg-……(c)Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xaa-Len-Xaa-Pro-Arg-Gln-Leu-……其中(b)和(c)分别对应于实施例4(ⅰ)中的来自HPC-Y5细胞的培养上清液的多肽的序列-1(序列号1)和序列-3(序列号3)。
另外，在重组型Meg-POT中加入含有10mg/ml的溴化氰的70%甲酸溶液100μl，在室温经24小时溴化氰分解后，用离心浓缩机除去过量的试剂。将余渣溶解于1ml的0.1%TFA中，加入到用0.1%TFA平衡化的Vydac C4柱(4.6×250mm)中，在0.1%TFA中使乙腈浓度在40分钟直线地增至80%，洗脱出吸附在柱上的溴化氰片段。对所得到的片段中的C末端的片段用气相式蛋白质序列-473A型分析仪进行氨基酸序列分析，得到以下所示的序列。这种序列与将从HPC-Y5的培养上清液得到的巨核细胞增强因子(Meg-POT)同样进行溴化氰分解得到的溴化氰片段的部分序列，如下所示是一致的。
表3
上表中的「cDNA」表记的氨基酸序列是从编码Meg-POT的cDNA的碱基序列演变的氨基酸序列，而且「COS」表记的氨基酸序列是在COS细胞中使编码Meg-POT的cDNA表达的蛋白质的部分序列，该蛋白质是在氨基酸序列分析中得到的，而且「HPC-Y5」表记的氨基酸序列是从来自人胰腺癌细胞的株化细胞「HPC-Y5」的培养上清液得到的Meg-POT的氨基酸序列分析中得到的部分序列。
实施例14 pRVHKPO27f媒介物的构筑(动物细胞用)将实施例8得到的pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT和100mmol NaCl的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶XhoI(东洋纺公司制)处理2小时，作为乙醇沉淀回收DNA。接着，在含有5mmol MgCl2、10mmol DTT、1mmol的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的20mmol tris盐酸缓冲液(pH7.4)中、于10℃用DNA聚合酶的Klenow片段处理1小时，将末端平滑化。回收作为乙醇沉淀的DNA，接着在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol NaCl的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶Sal I(东洋纺公司制)处理2小时、进行琼脂糖凝胶电泳，回收到1.3Kbp的DNA片段。
将实施例9得到的pRVHKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol KCl的20mmol tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶BamHI(宝酒造公司制)处理2小时之后，回收作为乙醇沉淀的DNA。接着，在含有5mmol MgCl2、10mmolDTT、1mmol的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的20mmol tris盐酸缓冲液(pH7.4)中、于10℃用DNA聚合酶的Klenow片段处理1小时，使末端平滑化。
作为乙醇沉淀回收这种DNA，接着在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol NaCl的50mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶Sal I(东洋纺公司制)处理2小时，加入碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)，通过在65℃保温2小时脱去磷酸，然后进行琼脂糖凝胶电泳，回收到8.5Kbp的DNA片段。将该8.5Kbp的DNA片段与先前得到的1.3Kbp的DNA片段混合后，在含有6.6mmol MgCl2、5mmol DTT、1mmolATP的66mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于16℃使T4DNA连接酶反应一夜，将其导入大肠杆菌JM109株中得到pRVHKPO27f(图4)。
另外，pRVHKPO27f如图4所示，含有EF1α启动子、人的免疫球蛋白H链定常区域基因、SV40加强启动子、来自pBR322的复制开始区域和β-乳胺酶基因(amp′)，人的Meg-POTcDNA连接在EF1α启动子和人免疫球蛋白H链定常区域基因之间。
实施例15 COS细胞中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)基因的表达Ⅱ将COS细胞以1×107个/ml悬浮在PBS中，在0.8ml的该细胞悬浮液中加入10μg pRVHKPO27。在1900V、25uFD、0.4毫秒的条件下，使用GenePulsar(BioRad公司制)，通过电穿孔法(electroporation)将质粒导入COS细胞。在室温经10分钟的恢复时间之后，把电穿孔的细胞加入到25ml含1%牛胎儿血清的Dulbecco′s Minimum Essential Medium(DMEM)(GIBCO公司制)中。经72小时培养后，收集培养上清液。
将这样得到的COS细胞的培养上清液的一部分，用セントリプレップ-10(Amicon公司制)浓缩约10倍，用SDS/PAGE进行分析。作为对照只有媒介物导入的COS细胞的培养上清液也同样地分别浓缩约10倍，对其进行比较而泳动。凝胶浓度为12%，利用Laemmli方法(Nature，227，680(1970))进行电泳，一个用2D-银染色试剂·Ⅱ「第1」(第1化学药品制)将蛋白质染色。
另外，分子量标示记使用了バィオラッド公司制的低分子量标示剂[磷酸化酶B(92.5Kd)、牛血清清蛋白(66.2Kd)、卵清蛋白(45.0Kd)、磷酸酐酶(31.0Kd)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5Kd)、溶菌酶(14.4Kd)]。
用Western印迹法检测出又一种巨核细胞增强因子。
这时的分子量标示剂使用バィオラッド公司制プレスティンド分子量标示剂[磷酸化酶B(130.0Kd)、牛血清清蛋白(75.0Kd)、卵清蛋白(50.0Kd)、碳酸酐酶(39.0Kd)、大豆胰蛋白酶抑制剂(27.0Kd)、溶菌酶(17.0Kd)]。一次抗体使用以从来自HPC-Y5的培养上清液纯化的巨核细胞增强因子的N末端序列分析得到的序列为基础合成的18残基的肽作抗原，对家兔免疫而得到的多克隆抗体。
其结果，在二者间比较银染色法染色的带，在分子量约33，000中能见的带，只有在巨核细胞增强因子的基因导入COS细胞的培养上清液中可看到。而且就连用Western印迹法也只有这种分子量33，000的带有强的显色，因此，这种带被认为是重组型巨核细胞增强因子。
实施例16 COS细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)活性的测定Ⅱ按照前述方法测定了在实施例15得到的COS细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子活性。但是，由于基因导入对COS细胞的刺激、已知在其培养上清液中IL-6被诱导，因此，测定是在添加对于小鼠IL-6受体的抗体系统中进行的。
其结果，如表4所示，虽然没有导入基因的无处理的COS细胞的培养上清液和导入不含Meg-POT的cDNA的媒介物的对照COS细胞的培养上清液都不显示巨核细胞增强因子活性，但是导入含有Meg-POT的cDNA的媒介物的COS细胞的培养上清液明显地显示出巨核细胞增强因子活性。
表4COS细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子活性COS细胞巨核细胞增强因子活性a)培养上清液浓度(%) 2 0.2 0.02 0.002无处理的COS 0 NDb)ND ND对照的COS 2 ND ND ND导入Meg-POT cDNA的COS 7 4 7 1a)从形成的集群数扣除IL-3单独形成的集群数(10个)之后的值b)未测定。
实施例17 来自COS细胞的培养上清液的重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)的纯化Ⅱ在350ml实施例15得到的COS细胞的培养上清液中加入Tween20使其最终浓度为0.01%，通过使用Amicon PM-10(Amieon公司制)的超滤方法浓缩约10倍。从该浓缩液按下述顺序纯化重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)。
(ⅰ)相对10L含0.01%Tween 20的10mmol tris盐酸缓冲液(pH8.4)，将上述浓缩液在4℃透析一夜之后，加入到用同样缓冲液平衡化的DEAE-琼脂糖快速流动柱(2.2×18cm，Pharmacia公司制)中。用同样的缓冲液将柱洗涤后，在同样的缓冲液中分级使NaCl浓度上升为0、0.1、0.15、0.2、0.5mol，洗脱出吸附在柱中的蛋白质。用SDS/PAGE对得到的部分进行分析的结果表明，在实施例15中认定的分子量约33，000的带，在NaCl浓度为0.1mol的部分中检测出在实施例15中看到的分子量约33000的带，将该部分用下述逆相HPLC进行纯化。
(ⅱ)在上述部分中加入10%TFA，使pH值为3以下，然后加入到用含0.1%TFA的24%乙腈平衡化的Vydac C4柱(4.6×250mm)中，用同样的洗提液将柱洗净后，使0.1%TFA中的乙腈浓度在80分钟直线地由24%增至64%，进而再在10分钟增至80%，洗脱出吸附在柱上的蛋白质。流速约为1ml/min，蛋白质的检测是用220nm和280nm二种波长进行的。对所得到的峰用SDS/PAGE进行分析的结果表明，在乙腈浓度约为41%时，看到分子量约33，000的带。将该部分用0.1%TFA稀释后，再用相同条件进行逆相HPLC，回收主峰部分。
实施例18 纯化重组型Meg-POT中的巨核细胞增强因子活性测定将实施例17纯化的重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)用含有10%马血清的Iscove′s Modified Dulbecco′s培养液(IMDM)稀释成规定浓度(50.1、3.1、0.2ng/ml)的被检检样0.1ml，与马血清(56℃，30分钟处理，Biocell公司制)0.2ml、小鼠(C57BL/6N系雄性，6～12周龄)大腿骨骨髓细胞悬浮液0.1ml(2×105有核细胞)、含有重组型小鼠IL-3(5ng/ml)的IMDM 0.2ml，以及含0.75%琼脂的改性的McCoy′s 5A培养液0.4ml进行混合。接着将其放入直径35mm的组织培养塑料盘中使之凝结后，在37℃、5%二氧化碳/95%空气、100%湿度的条件下进行培养。
在培养的第6天、连带琼脂取出，放在玻璃片上使之干燥、将作成的膜状标本者用5%的戊二醛固定，按照Nakeff等人的方法(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.151，587(1976))，用乙酰胆碱酯酶染色，进行巨核细胞集群数的计算。这时，把含4个以上乙酰胆碱酯酶染色阳性细胞的集块作为巨核细胞集群(集群的显微镜检查是用40倍的放大倍数进行的)。
另外，巨核细胞增强因子活性，是以加入重组型Meg-POT而产生的巨核细胞集群数与不加入重组型Meg-POT(只添加含10%马血清的IMDM)单独用重组体IL-3产生的巨核细胞集群数之差作为指标。
其结果，如表5中所示，纯化重组型Meg-POT显示出巨核细胞增强因子活性。
表5纯化重组型Meg-POT的巨核细胞增强因子活性Meg-POT浓度(ng/ml)a)巨核细胞增强因子活性b)50.1 9.53.1 8.50.2 3a)由氨基酸分析法测定b)由形成的集群数减去以IL-3单独形成的集群数(19.5)之后的值。
实施例19 编码巨核细胞增强因子(Meg-POT)的基因在试管内转录翻译将实施例8得到的pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol KCl的20mmol tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Xho I(东洋纺公司制)处理2小时，接着进行琼脂糖凝胶电泳，回收到1.9Kbp的DNA片段。将媒介物pCIFE-2C(Novagen公司制)在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol KCl的20mmol tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Xho I(东洋纺公司制)处理2小时后，加入碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)，通过在65℃2小时保温进行脱磷酸，将得到的DNA通过苯酚处理而纯化。将其与先前得到的1.9Kbp的DNA片段混合后，在含有6.6mmol MgCl2、5mmol DTT、1mmol ATF的66mmol tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于16℃使T4DNA连接酶反应一夜，导入大肠杆菌JM109株中得到了pCITE·KPO27(图5)。
将pCITE·KPO27在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT的10mmol Tris-HCl(pH7.5)中、于37℃用限制性酶Nae I(东洋纺公司制)处理2小时后，通过进行苯酚处理纯化DNA。这种模板DNA在含有2mmol亚精胺、6mmol MgCl2、10mmol NaCl、1单位/μl RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega公司制)、0.5mmol的ATP、GTP、CTP、UTP的40mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃使T7RNA聚合酶反应而进行转录。通过将其进行苯酚处理而纯化，作为乙醇沉淀回收RNA。接着用Red Nova Lysate(Novagen公司制)作为含35S-甲硫氨酸的标识体使RNA翻译。该反应物经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影法，看到约70，000分子量的带。
实施例20 pMBPKPO27媒介物的构筑(大肠杆菌用)将实施例8得到的pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol KCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Xho I(东洋纺公司制)处理2小时，作为乙醇沉淀回收DNA，在含有5mmol MgCl2、10mmol DTT、1mmol dATP、dCTP、dGTP、dTTP的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.4)中、于10℃用DNA聚合酶的Klenow片段处理1小时，使末端光滑化。接着进行琼脂糖凝胶电泳，回收到1.9Kbp的DNA片段。
媒介物pMAL-c(New England Biolabs公司制)在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、50mmol NaCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶Stu I处理2小时后，加入碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)，通过在65℃2小时保温脱去磷酸。通过进行苯酚处理除去蛋白，作为乙醇沉淀回收DNA。
将其与先前得到的1.9Kbp的DNA片段混合后，在含有6.6mmol MgCl2、5mmol DTT、1mmol ATP的66mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于16℃使T4DNA连接酶反应一夜，将其导入大肠杆菌JM109株中得到pMBPKPO27(图6)。如图6所示，这种质粒作为表达单位在tac启动子的下游，麦芽糖结合蛋白质(MBP)基因(mal E△2-26)、Factor Xa的识别序列以及Meg-POT的第34的氨基酸Ser以后的cDNA被连接着以便构架一致。
实施例21 大肠杆菌JM109株中的融合蛋白质的表达将在实施例20中用pMBPKPO27性状转变的大肠杆菌在含有50μg/ml的必氨西林和0.2%葡萄糖的LB培养基中、于37℃培养16小时，将4ml该培养液加入含有50μg/ml的必氨西林和0.2%葡萄糖的400ml LB培养基中。在37℃培养约2小时后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使形成0.3mmol，继续培养3小时。将该培养菌体像实施例10那样进行SDS聚丙烯酰胺电泳、用上述抗Meg-POT肽血清或抗MBP血清进行Western印迹时，已证明MBP和Meg-POT的融合蛋白质的表达。
实施例22 pEFDKPOf媒介物的构筑(动物细胞用)将pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmolKCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Eco EI、BamHI(宝酒造公司制)处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收到1.8Kbp的DNA片段。
将媒介物DHFR-△E-RVh用EcoRI、BamHI进行同样的处理后，通过用碱性磷酸酯酶(宝酒造公司制)在60℃处理2小时脱去磷酸之后，进行琼脂糖凝胶电泳，将回收的7Kbp DNA与先前得到的1.8Kbp的DNA片段连接而得到pEFDKPO5′。
将其在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol KCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶BamHI处理后，在含有6.7mmol MgCl2、16.6mmol(NH4)2SO4、10mmol 2-巯基乙醇、6.7mmol EDTA、330mmol dNTP的67mmol Tris缓冲液中、于37℃用T4DNA聚合酶处理5分钟，使末端平滑化。进而与Kpn I接头(Amersham公司制)连接而得到pEFDKPO5′K。重新将pKPO27在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol KCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Xho I切断后，在含有6.7MgCl2、16.6mmol(NH4)2SO4、10mmol 2-巯基乙醇、6.7mmol EDTA、330mmol dNTP的67mmol Tris缓冲液中、于37℃用T4DNA聚合酶处理5分钟，使末端平滑化。将其再在含10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol NaCl的50mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶SalI处理，进行琼脂糖凝胶电泳，回收到1.3Kbp的DNA片段。将媒介物pCDM8(Invitrogen公司制)在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol KCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Xho I处理后，再在含有10mmol MgCl2、1mmolDTT、100mmol KCl的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Hpa I切断后，进行琼脂糖凝胶电泳，将回收的3.3Kbp的DNA与先前得到的1.3Kbp的DNA片段连接，得到pCDMKPO3′。将pEFDKPO5′K和pCDMKPO 3′在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT的10mmol Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中、于37℃用限制性酶Kpn I处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收10Kbp、0.9Kbp的片段，将它们相连接得到pEFDKPO f(图7)。如图所示，这种质粒含有二氢叶酸还原酶基因(dhfr)，在EF1α启动子和SV40多A信号之间连接着人的Meg-POT cDNA。
另外，上述媒介物DHFR-△E-RVh使用在国际公开WO92/19759号公报中记载的DHFR-△E-RMh-gγ1及RVh-PM1f-4如下述进行制作。
将DHFR-△E-RMh-gγ1和RVh-PM1f-4在含有10mmol MgCl2、1mmol DTT、100mmol KCl、0.01%BSA的20mmol Tris盐酸缓冲液(pH8.5)中、于37℃用限制性酶Pvu I、BamHI(宝酒造公司制)处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳、回收4Kbp、3Kbp的片段，通过将它们连接而制成DHFR-△E-RVh。
实施例23 CHO细胞中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)基因的表达将CHO细胞DXB-11按1×107个/ml悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中，将10μg pEFDKPOf加入0.8ml的这种细胞悬浮液中。在1900V、25μF条件下用GenePulsar(BioRad公司制)，通过电穿孔法将质粒导入CHO细胞。在室温经10分钟的恢复时间后，将电穿孔的细胞加入含有10%牛胎儿血清的25ml的α-MEM培养基(GIBCO公司制)中。在37℃培养24小时后，将用胰蛋白酶处理而回收的细胞稀释至100倍，添加10%牛胎儿血清的用不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的α-MEM培养基(GIBCO公司制)培养三周。这时每3～4天更换一次培养基。集群成长到用肉眼可以确认时，挑选已成长的克隆，对每克隆继续培养。然后，在先前的培养基中加入氨甲蝶呤(methotrexate，即MTX)(Sigma公司制)，继续进行选择培养。初次选择时的MTX浓度为10nmol，对于得到的抗性克隆用MTX浓度50nmol的培养基进行二次选择。将最终得到的克隆在含有50nmol MTX及2%FCS的IMDM培养基(GIBCO公司制)中大量培养，将其培养上清液提供于纯化。
实施例24 来自HCO细胞的培养上清液的重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)的纯化在实施例23制得的CHO细胞的上清液10L中加入Tween20，使其最终浓度为0.01%，通过5μm的膜滤器(富士フィルム公司制)除去不溶物。由该培养上清液通过下述顺序纯化重组型巨核细胞增强因子。
(ⅰ)将上述培养上清液加入用含有0.01%Tween 20和0.2mmol NaCl的50mmol Tris盐酸缓冲液(pH8)平衡化的Blue-Sepharose快速流动柱(5.0×20cm、Pharmacia公司制)中。用同样的缓冲液将柱洗净后，用含有0.01%Tween 20和2mmolKCl的50mmol Tris盐酸缓冲液(pH9)将吸附的蛋白洗脱出。收集该部分，用ミェタン(millipore公司制)浓缩，加入含0.01%Tween 20的20mmol乙酸缓冲液(pH5)，重复进行稀释操作而脱盐后，通过离心操作(100000转/分×30分钟)将生成的不溶物除去。将上清液用下面的阳离子交换色谱法进行纯化。
(ⅱ)将上述部分添加到用含0.01%Tween 20的20mmol乙酸缓冲液(pH5)平衡化的S-琼脂糖快速流动(S-Sepharose fast flow)柱(5.0×12cm)上，在同样的缓冲液中，使NaCl浓度分别提高到0.1、0.2、0.3、0.5mol，洗脱出吸附在柱上的蛋白质。
(ⅲ)将含有重组型Meg-POT的0.1mol NaCl的部分添加到预先用含0.1%TFA的24%乙腈平衡化的Vydac C4柱(10×250mm)中，用同样的洗脱液将柱洗净后，使在0.1%TFA中的乙腈浓度在48分钟由24%直线上升至48%，洗脱出吸附在柱上的蛋白质。流速为1ml/min，蛋白质的检测是用220nm和280nm二种波长进行的。收集含有乙腈浓度40～45%的重组型Meg-POT的部分，进行如下的凝胶渗透色谱法。
(ⅳ)将含有重组型Meg-POT的部分添加到用含0.01%TFA的40%乙腈平衡化的TSKgel G3000SW柱(21.5×60cm)中。以流速是3ml/min、用280nm波长进行蛋白质的检测。收集在37～44分钟洗脱出的主要峰值部分，用0.1%TFA稀释后，用与(ⅲ)同样的条件进行逆相HPLC回收主要峰值部分。
用SDS/PAGE分析这样得到的重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)。以凝胶浓度为12%，按照Laemmli的方法[Nature，227，680(1970)]泳动、用2D-银染色试剂·「第一」(第一化学药品制)进行蛋白质染色。另外，分子量标示剂使用バィオラツド公司制低分子量标示剂[磷酸化酶B(92.5Kd)、牛血清清蛋白(66.2Kd)、卵清蛋白(45.0Kd)、磷酸酐酶(31.0Kd)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5Kd)、溶菌酶(14.4Kd)]。
其结果，纯化的重组型Meg-POT在分子量约33，000中给出单一带。
实施例25 重组型巨核细胞增强因子(Meg-POT)的N末端及C末端氨基酸序列分析(ⅰ)对于实施例24得到的重组体Meg-POT，用气相式蛋白质序列-476A型分析仪(Applied Biosystems公司制)进行了N末端氨基酸序列分析。其结果，确定了以下(a)～(c)的3种N末端氨基酸序列。
(a)Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-……(b)Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-……(c)Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-Gly-Val-……这些序列对应于实施例13中的序列(a)～(c)。
(ⅱ)进行重组型Meg-POT的C末端氨基酸序列分析。
在重组型Meg-POT中加入含有10mg/ml的溴化氰的70%甲酸溶液100μl，在室温经24小时溴化氰分解后，用离心浓缩机除去过剩的试剂。将残渣溶解于0.1%TFA中，加到用0.1%TFA平衡化的Vydac C4柱(4.6×250mm)中，使在0.1%TFA中的乙腈浓度在40分钟直线地增至80%，洗脱出吸附在柱上的溴化氰片段。在得到的2个峰之中，对于C末肽片段进一步进行Endo Asp-N消化。将C末肽溶解于50mmol磷酸缓冲液(pH8.0)中，添加Endo Asp-N，在室温进行16小时酶消化。将10%TFA加入反应液使pH为3之后，添加到用0.1%TFA平衡化的VydacC18柱中，使乙腈浓度在48分钟直线地由0增至48%，洗脱出吸附在柱上的肽。将得到的片段用气相式蛋白质序列-476A型分析仪进行分析，结果表明C末片段的氨基酸序列为如下所示。
Asp-Pro-Ser-Trp-Arg-Gln-Pro-Glu-Arg实施例26 CHO细胞的培养上清液中的巨核细胞增强因子(Meg-POT)活性的测定按照上述方法测定实施例23得到的CHO细胞的上清液和实施例24纯化的重组型巨核细胞增强因子的巨核细胞增强因子活性。
其结果如表6所示那样，导入含有巨核细胞增强因子cDNA的媒介物的CHO细胞培养上清液明显地显示出巨核细胞增强因子活性，由此纯化的重组型巨核细胞增强因子也显示出巨核细胞增强因子活性。
还有，纯化品的蛋白量根据氨基酸分析法作为Ala＝28计算出。
表6CHO细胞的培养上清液中以及纯化重组型Meg-POT的巨核细胞增强因子活性被检检样最终浓度 巨核细胞集群数CHO细胞培养上清液0%0.08% 4a)0.31% 11a)1.25% 10.5a)5% 12a)纯化品 0ng/ml0.01ng/ml 0b)0.1ng/ml 6b)1ng/ml 8b)10ng/ml 11b)a)从形成的集群数减去以由IL-3单独形成的集群数(25个)之后的值。
b)从形成的集群数减去以由IL-3单独形成的集群数(20.5个)之后的值。
序列表序列号1序列的长度16序列的类型氨基酸拓扑学线性序列的种类肽序列
序列号2序列的长度16序列的类型氨基酸拓扑学线性序列的种类肽序列
序列号3序列的长度16序列的类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽序列
序列号4序列长度14序列类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽序列Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu1 5 10序列号5序列长度35序列类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽序列
序列号6序列长度40序列类型核酸链数双链拓扑学线性序列种类DNA序列CTCAACAGAG CAGCTGCGCT GTCTGGCTCA CCGGCTCTCT序列号7序列长度69序列类型核酸链数双链拓扑学线性序列种类cDNA序列
序列号8序列长度75
序列类型核酸链数双链拓扑学线性序列种类cDNA序列
序列号9序列长度197序列类型核酸链数双链拓扑学线性序列种类cDNA来源生物名人特征来源于从人胰腺癌患者的淋巴结得到的培养细胞、编码具有人巨核细胞增强因子活性的多肽的一部分的cDNA。
序列
序列号10序列长度2129序列类型核酸链数双链拓扑学线性序列种类cDNA来源生物名人直接来源质粒pKPO27特征来源于从人胰腺癌患者的淋巴结得到的培养细胞、编码具有人巨核细胞增强因子活性的多肽的一部分的cDNA。
序列
序列号11序列的长度17序列的类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽序列
权利要求
1.编码具有人巨核细胞增强因子活性的多肽的基因。
2.按照权利要求1所述的基因，其特征在于，该基因由在序列号10中表示的碱基序列或是将其一部分置换、去除或附加的碱基序列，或在它们中杂交的DNA构成。
3.按照权利要求1所述的基团，其特征在于，该基因是用具有序列号9所示的来自人胰腺癌细胞(HPC-Y5株)的cDNA的碱基序列的DNA探针通过筛选而得到。
4.按照权利要求1所述的基团，其特征在于，该基因插入质粒pKPO27(微工研条寄第4029FERM BP-4029)中。
5.按照权利要求1所述的基因，其特征在于，该基因插入质粒pKPO21(微工研条寄4071FERM BP-4071)中。
6.含有权利要求1～5中任一项权利要求所述的基因的重组媒介物。
7.由权利要求6中所述的重组媒介物而产生的性状转变原核或直核宿主细胞。
8.一种制造具有人巨核细胞增强因子活性的蛋白质的方法，其特征在于，培养权利要求7中所述的宿主细胞，分离所产生的具有人巨核细胞增强因子活性的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种编码巨核细胞增强因子的基团及制备方法。
文档编号C07K14/475GK1092466SQ93120248
公开日1994年9月21日 申请日期1993年10月23日 优先权日1992年10月23日
发明者山口希, 小哲郎, 大枝匡义, 服部有宏 申请人:中外制药株式会社