具有吡啶基取代的c13侧链的紫杉烷衍生物、其制备方法及其作为抗肿瘤剂的用途的制作方法

专利名称：具有吡啶基取代的c13侧链的紫杉烷衍生物、其制备方法及其作为抗肿瘤剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够影响微管蛋白聚合与解聚的药物活性化合物。
一系列天然有丝分裂毒素被用作抗肿瘤剂，或者用于临床实验中。这些有丝分裂毒素分为不同的类别，它们或者通过抑制纺锤体中微管的聚合产生细胞毒性(例如长春花属生物碱、秋水仙素)，或者通过GTP-非依赖性增加微管蛋白聚合并且通过防止微管解聚产生细胞毒性(例如紫杉酚(taxol)、taxoters)。由于其迄今尚未确定的理化性质，并且由于肿瘤细胞的特性，有丝分裂毒素对肿瘤细胞具有一定的选择性，但是对于非转移细胞它们仍然保留着并非是无足轻重的细胞毒性。在找寻更具选择性、更易于制造，并且-象紫杉烷类物质一样-能够抑制微管解聚的化合物时，出人意料地发现了冰片酯类物质，如在P4416374.6和19513040.5中所述。对这类化合物进行结构改性显示出使微管作用最佳化的相当大的可能性。尤其是，通过用Sk-H类型的酸将那些冰片在形式上酯化取得了显著的结果。通过合成本文所述的紫杉酚衍生物(其中紫杉酚的异丝氨酸链被Sk置换)，将研究该类物质与紫杉酚相比是否还可以改善微管的稳定作用。
目前出人意料地发现，本发明的式Ⅰ化合物与紫杉酚相比，具有有利的变化的活性模式。除了明显改善微管的稳定作用之外，还证明了式Ⅰ化合物可影响微管蛋白的聚合作用。
本发明的紫杉烷类(taxanes)化合物可用通式Ⅰ表征
其中Sk可以是
R1可以是氢或C1-C10酰基，R2可以是α-OH或β-OH，R3可以是C1-C10烷基、X-取代的苯基、C1-C10烷氧基，X可以是氢、卤素、-N3或-CN，并且Ⅰ中的游离羟基可以进一步通过醚化或酯化进行官能改性，还包括其α-、β-和γ-环糊精笼形物，和用脂质体包封的通式Ⅰ化合物。
表示烷基的R3可以是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、庚基、己基和癸基。优选具有1-4个碳原子的烷基。通式Ⅰ的R1和R3中分别包括的酰基和烷氧基含有1-10个碳原子，分别优选的是甲酰基、乙酰基、丙酰基和异丙酰基，以及甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。
X定义中的卤素是氟、氯、溴或碘。
优选的通式Ⅰ化合物是3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚，3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，以及3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚。
本发明还涉及式Ⅰ冰片衍生物的制备方法，该方法的特征在于，将通式Ⅱ的醇与通式Ⅲa、Ⅲb或Ⅲc化合物反应，
其中R1和R2如上所定义，并且Ⅱ中所包括的羟基是任选地被保护的，
其中R3如上所定义，并且X′可以是羟基、O-烷基或卤素，并且其中游离羟基通过醚化或酯化作用进行保护，以形成通式Ⅰ化合物，其中游离羟基可以通过醚化或酯化作用进行进一步的官能改性。
为了将Ⅱ中的醇官能团酯化，用碱例如金属氢化物(如氢化钠)、碱金属醇盐(如甲醇钠、叔丁醇钾)、碱金属六甲基二硅氮烷(如六甲基二硅氮烷钠)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、三乙胺、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)或1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)进行脱质子反应，并与通式Ⅲ的羧酸衍生物在惰性溶剂(例如二氯甲烷、乙醚或四氢呋喃)中、在-70℃至+50℃的温度下反应。优选的反应是用氢化钠作为碱，用环酰胺作羧酸衍生物，用四氢呋喃作溶剂，并且反应温度为-10℃至+25℃。
式Ⅰ中的游离羟基可以按照本领域专业人员已知的方法进行进一步的官能改性，例如通过醚化或酯化。例如，游离羟基可以用生理耐受的酸转化为吡啶鎓盐，用生理耐受的碱转化为磷酸酯或其盐、或者转化为其酯，用生理耐受的碱转化为硫酸酯或其盐、或者转化为其酯，或者用水溶性聚合物转化为酯和醚。还可以制备其本身具有肿瘤抑制作用的这些化合物的酯和醚。
新的紫杉酚衍生物的生物作用及应用领域
新的式Ⅰ化合物是有价值的药物。它们通过影响微管蛋白的聚合作用并使所形成的微管稳定与微管蛋白相互作用，因而能够以阶段特异的方式影响细胞分裂。由此，特别是影响其生长基本不受细胞内调节机制影响的迅速生长的肿瘤细胞。此类活性成分主要适用于治疗对细胞分裂的影响可以产生治疗作用的疾病。
可以提及的是例如治疗恶性肿瘤、疟疾、治疗格兰氏阴性菌引起的疾病，以及治疗以促毒性(excitotoxic)机制为基础的中枢和外周神经系统疾病，例如治疗急性神经变性症状如因中风和脑外伤引起的疾病，治疗慢性神经变性症状包括阿尔茨海默症，以及治疗肌萎缩性侧索硬化。对于恶性肿瘤而言，可以提及的是，例如治疗卵巢癌、胃癌、结肠癌、腺癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、恶性黑素瘤和急性淋巴细胞和髓细胞性白血病。本发明化合物通常可以单独使用，或者与其他活性成分和可用于所述治疗领域的各类物质联合使用、以产生附加或协同作用。对于肿瘤治疗来说，可以提及的是例如与下列物质联合治疗●铂配合物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，●间介物质，例如蒽环类物质如阿霉素，或者蒽吡唑类物质例如C1-941。●与微管蛋白相互作用的物质，例如长春花属生物碱如长春新碱和长春碱，或者在P4416374.6和19513040.5中所述的一类新的冰片酯，或者大环内酯类物质例如根霉素(rhizoxin)，或者其他物质例如秋水仙素、combretastatin A-4和epothilon A和B，●DNA局部异构酶(topoisomerase)抑制剂，例如喜树碱、依托泊甙、topotecan和替尼泊甙，●叶酸(folate)或嘧啶抗代谢物质，例如lometrexol和gemcitubin,●DNA烷基化化合物，例如adozelesin和dystamycin A，●生长因子抑制剂(例如PDGF、EGF、TGFb、EGF抑制剂)，例如生长激素释放抑制因子、苏拉明、蛙皮素拮抗剂，●酪氨酸蛋白激酶或蛋白激酶A和C抑制剂，例如erbstatin、金雀异黄素、staurosporine、ilmofosin和8-Cl-cAMP，●抗促孕激素类抗激素物质例如mifepristone、onapristone，或者抗雌激素类物质例如三苯氧胺，或者抗雄激素类物质例如环丙氯地孕酮，●转移抑制化合物，例如二十烷酸类物质(eicosanoids)，如PGI2、PGE1、6-氧代-PGE1及其稳定的衍生物(例如iloprost、cicaprost、beraprost)，●透膜Ca2+流入抑制剂，例如戊脉安、galopamil、氟苯桂嗪、硫氮卓酮、硝苯吡啶和硝苯吡酯，●精神抑制药，例如氯丙嗪、三氟拉嗪、甲硫哒嗪和奋乃静，●局部麻醉药，例如苯胺基甲酸-Ca7、地布卡因、苯胺基甲酸-Ca3、articaine、苯胺基甲酸、利多卡因，●血管生成抑制物质，例如抗-VEGF抗体、endostatin B、干扰素a、AGM1470，以及●牛皮癣、卡波济肉瘤和成神经细胞瘤中的细胞增殖抑制剂。
本发明还涉及以可药用(即所用剂量的所述化合物是无毒的)通式Ⅰ化合物为基础的药物，任选地该药物含有常规的赋形剂、载体和添加剂。
本发明化合物可以按照本身已知的盖仑制药方法制成肠道、经皮、非肠道或局部给药的药物制剂。它们可以以片剂、锭剂、明胶胶囊、颗粒剂、栓剂、植入物、可注射的无菌水溶液或油溶液、悬浮液或乳液、油膏、乳膏和凝胶形式给药。因此，本发明还涉及本发明化合物在制备药物中的应用。
可以将一种或多种活性成分与盖仑制药常用的赋形剂混合，这些赋形剂是例如阿拉伯胶、滑石、淀粉、甘露醇、甲基纤维素、乳糖、表面活性剂如吐温或Myrj、硬脂酸镁、水或非水载体、石蜡衍生物、润湿剂、分散剂、乳化剂和防腐剂、以及调味用的矫味剂(例如精油)。
因此，本发明还涉及药物组合物和药物，其中含有至少一种本发明的化合物作为活性成分。一个单位剂量含有约0.1-100毫克一种或多种活性成分。本发明化合物的人用剂量约为0.1-1000毫克/天。


图1示出了随着时间和温度的吸收变化过程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，应用实施例2)。
图2示出了随着时间和温度的吸收变化过程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚，应用实施例3)。
图3示出了随着时间和温度的吸收变化过程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，应用实施例4)。
图4示出了随着时间和温度的吸收变化过程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚，应用实施例5)。
下列实施例用于进一步说明本发明化合物的制备，而非将本发明限制在实施例上。实施例13′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚在3℃和干燥的氩气氛下，向3.1毫克(2.9微摩尔)实施例1a制备的化合物在0.5毫升无水四氢呋喃中的溶液中加入8.6微升1M氟化四丁铵的四氢呋喃溶液，并搅拌反应混合物30分钟。将该混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，并用二氯甲烷萃取，将有机提取液浓缩，残余物经半分析薄层板色谱纯化。用乙酸乙酯作流动相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脱剂。分离得到0.4毫克(0.5微摩尔，17％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=1.16(3H),1.25(3H),1.70(3H),1.75(1H),1.84(3H),1.90(1H),2.26(3H),2.25-2.38(2H),2.38(3H),2.48(1H),2.56(1H),3.62(3H),3.81(1H),4.19(1H),4.31(1H),4.40(1H),4.71(1H),4.95(1H),5.37(1H),5.66(1H),5.69(1H),6.28(1H),6.31(1H),7.40(2H),7.51(2H),7.61(1H),8.11(2H),8.66(2H)ppm.实施例1a2′-三异丙基甲硅烷基-3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-紫杉酚在3℃和干燥的氩气氛下，向4.2毫克(6.0微摩尔)和11.4毫克实施例1b和1c制备的化合物在0.1毫升无水四氢呋喃中的溶液中加入12毫克约60％氢化钠分散液，并将该混合物加热至30℃，并搅拌30分钟。将该混合物再冷却至3℃，加入30％乙酸水溶液，并用乙醚萃取数次。合并的有机提取液用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸镁干燥。过滤并除去溶剂后，残余物经2个分析薄层板色谱纯化。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流动相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脱剂。分离得到3.7毫克(3.4微摩尔，57％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.60(6H),0.80-1.02(30H),1.25(6H),1.70(3H),1.91(1H),2.03(3H),2.14(1H),2.20(3H),2.36(1H),2.49(3H),2.53(1H),3.54(3H),3.84(1H),4.18(1H),4.30(1H),4.49(1H),4.85(1H),4.93(1H),5.30(1H),5.60(1H),5.70(1H),6.32(1H),6.47(1H),7.28(2H),7.49(2H),7.59(1H),8.13(2H),8.64(2H)ppm.实施例1b7-三乙基甲硅烷基-浆果赤霉素Ⅱ′在3℃和干燥的氩气氛下，向3.7毫克(6.3微摩尔)色谱纯化的浆果赤霉素Ⅲ(Calbiochem Corp.)在0.3毫升无水二甲基甲酰胺中的溶液中加入21微升三乙基氯硅烷和10.3毫克咪唑，并搅拌反应混合物1小时。将该混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙醚萃取数次，然后用饱和氯化钠溶液洗涤，浓缩合并的有机提取液。过滤并除去溶剂后得到的残余物经半个分析薄层板色谱纯化。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流动相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脱剂。分离得到3.0毫克(5.6微摩尔，88％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.59(6H),0.92(9H),1.06(3H),1.20(3H),1.62(1H),1.69(3H),1.88(1H),2.04(1H),2.19(6H),2.28(2H),2.29(3H),2.53(1H),3.88(1H),4.14(1H),4.31(1H),4.50(1H),4.83(1H),4.98(1H),5.63(1H),6.47(1H),7.49(2H),7.61(1H),8.11(2H)ppm.实施例1c(3R,4S)-1-(甲氧羰基)-3-三异丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮杂环丁酮在3℃和干燥的氩气氛下，向250毫克(0.78毫摩尔)实施例1d制备的化合物在10毫升无水二氯甲烷中的溶液中加入573毫克4-二甲氨基吡啶和193微升氯甲酸甲酯，将反应混合物加热至23℃，并搅拌16小时。将该混合物倒入饱和氯化铵溶液中，用乙醚萃取数次，然后用饱和氯化钠溶液洗涤，浓缩合并的有机提取液。过滤并除去溶剂后得到的残余物在约150毫升细硅胶上经色谱纯化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流动相。分离得到251毫克(0.66毫摩尔，85％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.82-1.07(21H),3.82(3H),5.11(1H),5.26(1H),7.23(2H),8.61(2H)ppm.实施例1d(3R,4S)-3-三异丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮杂环丁酮在3℃和氩气氛下，向17.2克(40.3毫摩尔)实施例1e制备的化合物在384毫升乙腈中的溶液中加入67.3克硝酸高铈铵在700毫升水中的溶液，搅拌反应混合物30分钟。将该混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙醚萃取数次，合并的有机提取液用1％氢氧化钠溶液洗涤，并用硫酸镁干燥。过滤并除去溶剂后得到的残余物在约800毫升细硅胶上经色谱纯化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流动相。分离得到7.89克(24.6毫摩尔，61％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.78-1.07(21H),4.81(1H),5.23(1H),6.39(1H),7.28(2H),8.59(2H)ppm.实施例1e(3R,4S)-1-(4-甲氧基苯基)-3-三异丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮杂环丁酮在干燥氩气氛下，将12.6毫升新蒸的二异丙基胺在70毫升无水四氢呋喃中的溶液冷却至-30℃，加入37.6毫升2.4M正丁基锂的正己烷溶液，并将该混合物加热至0℃。30分钟后，将该混合物冷却至-78℃，向其中滴加按照四面体(Tetrahedron)第48期，No.34,6985-7012页等(1992)所述类似的方法制备的22.1克(56.6毫摩尔)(1R,2S)-2-苯基-1-环己基-三异丙基甲硅烷氧基乙酸酯在70毫升无水四氢呋喃中的溶液，并搅拌该混合物3小时。然后加入15.6克(73.5毫摩尔)实施例1f制备的醛亚胺在150毫升无水四氢呋喃中的溶液，并用16小时将该混合物加热至23℃。将该混合物倒入饱和氯化铵溶液中，用乙酸乙酯萃取数次，然后用饱和氯化钠溶液洗涤，浓缩合并的有机提取液。过滤并除去溶剂后得到的残余物在约1.8升细硅胶上经色谱纯化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流动相。分离得到17.2克(40.3毫摩尔，71％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.82-1.12(21H),3.76(3H),5.12(1H),5.29(1H),6.80(2H),7.19-7.30(4H),8.60(2H)ppm.实施例1fN-(4-甲氧基苯基)-(4-吡啶基)醛亚胺在干燥氩气氛下，向10克(81.1毫摩尔)4-茴香胺在120毫升无水二氯甲烷中的溶液中加入7.8毫升吡啶-4-醛和8.4克硫酸镁，并在23℃搅拌该混合物4小时。过滤并除去溶剂后得到的残余物从正己烷中重结晶。分离得到15.9克(74.9毫摩尔，92％)标题化合物。1H-NMR(CDCl33):d=3.83(3H),6.95(2H),7.29(2H),7.73(2H),8.47(1H),8.73(2H)ppm.实施例23′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚(A)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(B)在3℃和干燥的氩气氛下，向15毫克(13.9微摩尔)实施例1a制备的化合物在0.5毫升无水四氢呋喃中的溶液中加入42微升1M氟化四丁铵的四氢呋喃溶液，并在3℃搅拌该混合物30分钟，加热至23℃，并再搅拌30分钟。将该混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取，将有机提取液浓缩，残余物经2个分析薄层板色谱纯化。用乙酸乙酯和甲醇的混合物作流动相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脱剂。分离得到3.8毫克(4.7微摩尔，34％)标题化合物A，2.4毫克(3.4微摩尔，25％)标题化合物B以及1.2毫克(1.5微摩尔，11％)实施例1所述的化合物。1H-NMR(CDCl3)of A:d=1.18(3H),1.23(3H),1.68(3H),1.71(1H),1.80(1H),1.83(3H),2.15-2.48(4H),2.21(3H),2.49(3H),3.56(3H),3.71(1H),3.92(1H),4.37(2H),4.63(1H),4.71(1H),4.91(1H),5.37(1H),5.67(1H),5.76(1H),6.34(1H),6.81(1H),7.33(2H),7.51(2H),7.61(1H),8.16(2H),8.63(2H)ppm.实施例33′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚在氩气氛下，向9.0毫克(10.2微摩尔)实施例3a制备的化合物A在0.8毫升乙醇和0.2毫升四氢呋喃中的溶液中加入20.4微升4N盐酸，在23℃搅拌反应混合物1小时。重复两次加入盐酸，每次在搅拌1小时后添加，加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取，将有机提取液浓缩，残余物经2个分析薄层板色谱纯化。用乙酸乙酯和乙醇的混合物作流动相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脱剂。分离得到6.5毫克(8.5微摩尔，83％)标题化合物。1H-NMR(CDCl3):d=1.13(3H),1.24(3H),1.78(3H),1.83(3H),1.73-1.96(3H),2.25(2H),2.37(3H),2.60(1H),3.62(3H),3.92(1H),4.14-4.28(2H),4.20(1H),4.32(1H),4.69(1H),4.94(1H),5.21(1H),5.36(1H),5.68(1H),5.83(1H),6.30(1H),7.34(2H),7.50(2H),7.62(1H),8.10(2H),8.61(2H)ppm.实施例3a3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚(A)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚(B)在-10℃，按照与实施例1所述类似的方法，将25毫克(23微摩尔)实施例3b制备的粗产物进行反应，经处理和纯化后，分离得到9.0毫克(10.2微摩尔，44％)标题化合物A,2.5毫克(3.2微摩尔，14％)标题化合物B以及2.2毫克(2.9微摩尔，12％)实施例3的标题化合物。1H-NMR(CDCl3)of A:d=0.43-0.67(6H),0.94(9H),1.13(3H),1.24(3H),1.70(1H),1.76(3H),1.87(3H),1.93(1H),2.24(2H),2.36(3H),2.48(1H),3.62(3H),3.87(1H),4.18(1H),4.29(1H),4.34(1H),4.68(1H),4.91(1H),5.12(1H),5.36(1H), 5.63(1H),5.77(1H),6.29(1H), 7.33(2H),7.49(2H),7.60(1H),8.10(2H),8.60(2H)ppm.1H-NMR(CDCl3)of B:d=0.45-0.64(6H),0.94(9H),1.02(3H),1.25(4H),1.67(1H),1.72(3H),1.82(3H),1.88-2.12(2H),2.18(4H),2.47(1H),3.50(1H),3.67(1H),3.70(3H),3.90(lH),4.26(1H),4.30(1H),4.59(1H),4.61(1H),4.66(1H),4.91(1H),5.03(1H),5.27(1H),5.65(1H),6.25(1H),7.32(2H),8.62(2H)ppm.实施例3b2′-三异丙基甲硅烷基-3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚在氩气氛下，向25毫克(23.2微摩尔)实施例1a制备的化合物在1.2毫升乙醇中的溶液中加入0.23毫升氢氧化，并在23℃搅拌该混合物24小时。将该混合物倒入饱和氯化钠溶液中，用乙酸乙酯萃取数次，并用硫酸镁干燥。过滤并除去溶剂后得到的残余物无需纯化即进行下一步反应。分离得到22毫克(最多21微摩尔，91％)标题化合物，其中仍然含有少量原料。
下列应用实施例用于证明本发明化合物的生物活性，而非将其应用限制在那些实施例上。应用实施例1分离和纯化微管蛋白从新开颅的牛头中分离牛脑(各330克)，并将其置于冰冷却的PM4-M缓冲液中。除去每个脑的脑膜和血栓，并在冷室中用足量的PM4-M缓冲液打成均浆。将2个牛脑的均浆物质用总量500毫升的缓冲液配制成1.0升总体积，并进行首次离心(GSA转子，15分钟，4℃,6500g)。除去上清液表面的脂肪皮肤，经4层薄muslin过滤，转入反向平衡的离心管(420毫升)中，并再次离心(Ti45转子，96000g,75分钟，4℃)。用移液管从沉淀中移去上清液，并经6层薄muslin过滤，加入在0.01M碳酸氢盐/PBS中的50mM GTP溶液，使最终浓度达到1mM。在温热至37℃的水浴中、在反向平衡的离心管中进行首次聚合45分钟。离心(Ti45转子，27℃,96000g,60分钟)除去所形成的微管，用移液管小心地除去上清液，并用刮铲从管壁上分离非常软的乳色沉淀。然后向沉淀中加入40毫升冷的PM缓冲液，用小的玻璃乳钵将其研磨成匀浆，并在冰上、在冷室中、在反向平衡的离心管中培养过夜(12-16小时)。在Ti60转子(4℃；96000g,60分钟)中离心除去解聚的产物，并用PM8-M缓冲液将上清液稀释至1∶1，在37℃于计数器平衡的离心管中培养45分钟，并再次离心(Ti45转子，27℃,96000g,60分钟)。用移液管小心地除去上清液，并将非常软的乳色沉淀吸收在20毫升冷的PM缓冲液中，用小的玻璃乳钵将其小心地研磨成匀浆，并在冰上培养30分钟。再次离心(Ti60转子，4℃,96000g,60分钟)得到微管蛋白，按照Pearce方法或者采用在280nm进行的光度测定法测量所述微管蛋白中的蛋白含量。在蛋白测定中，所用的分离物质与PM缓冲液的稀释比例为1∶10、1∶20和1∶40。PM缓冲液本身是消光的，将该消光值作为零值从测定的蛋白含量中扣除。将分离的物质用PM缓冲液稀释至所需的蛋白浓度(2毫克/毫升)。应用实施例23′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚对微管蛋白的生物作用采用光度测定法测量微管蛋白的聚合和微管的解聚。在测量之前，将按照应用实施例1制备的微管蛋白熔融，并脱气15分钟。将光度计设置在350nm。用移液管将3微升溶剂/样品、6微升GTP(0-25微摩尔/升终浓度)和291微升微管蛋白移入干燥清洁的培养皿(10毫米)中。小心地搅拌样品(不产生气泡)，立即置于培养皿架上，并在37℃开始测量。一旦达到最大聚合值(20分钟后，溶剂对照与紫杉酚1E-5摩尔/升)，则通过降温至15℃开始解聚。解聚结束时停止测量操作，吸收的变化过程以对时间和温度函数的图表示(参见图1)。
该图清楚地表明，与对照相比，紫杉酚加速微管蛋白的聚合，并抑制解聚，而本发明化合物3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚抑制聚合并比紫杉酚明显更好地使形成的微管稳定。应用实施例33′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚对微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚更显著地促进微管蛋白聚合以及与紫杉酚相比好得多地使微管稳定。结果示于图2中。应用实施例43′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚对微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚更显著地促进微管蛋白聚合以及比紫杉酚更好地使所形成的微管稳定。结果示于图3中。应用实施例53′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚对微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚对于微管蛋白的聚合与紫杉酚没有区别，但是它可以比紫杉酚明显更好地使所形成的微管稳定。结果示于图4中。应用实施例63′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(1),3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚(2),3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(3)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚(4)对肿瘤细胞系的抗增殖作用将MDA MB435乳房癌细胞置于微滴板中(5000细胞/孔)(第0天，RPMI培养基，1％非必需氨基酸、1％丙酮酸盐，10％胎牛血清)。在第1天加入几种不同浓度的添加物质。在第3天，采用MTT方法测定抗增殖作用。测定其IC50值。结果示于表1中。
表1

3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚与紫杉酚的活性相似，而3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚比紫杉酚具有显著改善的抑制活性。
权利要求
1．通式Ⅰ的紫杉烷
其中Sk可以是
R1可以是氢或C1-C10酰基，R2可以是α-OH或β-OH，R3可以是C1-C10烷基、X-取代的苯基、C1-C10烷氧基，X可以是氢、卤素、-N3或-CN，并且Ⅰ中的游离羟基可以进一步通过醚化或酯化进行官能改性，还包括其α-、β-和γ-环糊精笼形物，和用脂质体包封的通式Ⅰ化合物。
2．权利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚。
3．权利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚。
4．权利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚。
5．权利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚。
6．权利要求1-5的通式Ⅰ紫杉烷衍生物的制备方法，其特征在于将通式Ⅱ的醇与通式Ⅲa、Ⅲb或Ⅲc化合物反应，
其中R1和R2如上所定义，并且Ⅱ中所包括的羟基是任选地被保护的，
其中R3如上所定义，并且X′可以是羟基、O-烷基或卤素，其中游离羟基通过醚化或酯化作用进行保护，以形成通式Ⅰ化合物，其中游离羟基可以通过醚化或酯化作用进行官能改性。
7．含有权利要求1-5的一种或多种通式Ⅰ化合物的药物。
8．权利要求7的药物，其中含有常规的赋形剂、载体和添加剂。
9．权利要求1-5的通式Ⅰ化合物在制备药物中的应用。
全文摘要
本发明描述了通式(Ⅰ)的紫杉烷,其中Sk可以是(i),R
文档编号C07D405/12GK1210535SQ97192006
公开日1999年3月10日 申请日期1997年1月31日 优先权日1996年1月31日
发明者U·克拉尔, G·尼夫, H·格拉夫 申请人:舍林股份公司