专利名称：一种负急性期镍棕蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域，特别是一种负急性期镍棕蛋白的制备方法。
肿瘤生物治疗研究涉及细胞水平、分子水平和基因水平三方面工作，目前均处于萌芽状态，尚未成熟，不能与手术、放射治疗、化疗三大抗肿瘤常规疗法相提并论。美国在开发新的血浆蛋白制品研究中，已分离和纯化出40多种蛋白成分，其中大部分制品的生物学功能与疾病的相关性仍然不太清楚或不确定。到目前为止，还没有一种生物治疗制剂在肿瘤治疗中疗效是很显著的。
本发明的目的是提供一种利用人的组织液(腹水、血清或Ⅳ组份)，经硫酸铵盐析、二乙氨基乙基(DEAE32)、纤维素层析、金属镍离子螯合亲和层析、抗体亲和层析等方法制备而得的负急性期镍棕蛋白，它在一些疾病如细菌感染、胶原生疾病、癌症、白血病等血清中含量较正常人显著低，拟用补充该蛋白的方法达到治疗上述疾病，使之病情缓解，乃至痊愈。
本发明的具体技术方案是1．从癌症病人腹水中提取收集腹水10000ml，加硫酸铵使其成65％饱和度，去沉淀后其上清液加硫酸铵使其成90％饱和度，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，此溶液于流动自来水中透析过夜，然后于PH4.0、0.02mol/L的醋酸缓冲液中透析，装已经用缓冲液平衡的二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，将上述透析过的液体流经纤维素柱，收集未吸附部分，经PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)透析，再上二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，其吸附部分用PH7.4、0.01mol/L磷酸缓冲液(PB)内含氯化钠0.025mol/L洗脱之，并收集备用，备用液体经制备好的二价镍离子与琼脂糖4B螯合层析柱，收集吸附部分溶液，吸附部分溶液通过抗白蛋白抗体亲和层析柱得到镍棕蛋白；2．从正常人血清提取收集正常人血清1000ml，调PH到8.55，按1∶1(V/V)加2.3％雷凡诺，静置2小时将白蛋白沉淀并去之，加硫酸铵使成65％饱和度，去沉淀后其上清液再加硫酸铵使成90％饱和度，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，上述溶液于流动自来水中透析过夜，然后于PH4.0、0.02mol/L的醋酸缓冲液中透析，装已经用缓冲液平衡的二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，将上述透析过的液体流经纤维素柱，收集未吸附部分，经PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)透析，然后上二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，其吸附部分用PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)内含氯化钠0.025mol/L洗脱之，并收集备用，备用液体经制备好的二价镍离子与琼脂糖4B螯合层析柱，收集吸附部分溶液，吸附部分溶液经蒸馏水透析得镍棕蛋白；3．Ⅳ组份中的提取取5～10Kg重的Ⅳ组份，加5～10倍量的蒸馏水，离心沉淀，去沉淀，调PH到8.55，按1∶1(V/V)加2.3％雷凡诺，静置2小时将白蛋白沉淀并去之，加硫酸铵使成40～65％饱和度，去沉淀后加0.01～0.1％的活性炭使溶液澄清，澄清溶液为镍棕蛋白。
经本发明得到的蛋白所产生的效果1．体外试验用细胞增殖法测定活细胞数，结果该蛋白浓度760mg/ml以上时有明显抑制L1210细胞生长作用。正急性期蛋白α1一酸性糖蛋白则无抑制L1210细胞作用；2．动物试验裸小鼠体内实验，腹腔注射大于58.4mg/kg体重本蛋白时，能抑制L1210细胞生长，并延长裸小鼠的存活期。
权利要求
1．一种负急性期镍棕蛋白的制备方法，其特征在于a．从癌症病人腹水中提取收集腹水10000ml，加硫酸铵使其成65％饱和度，去沉淀后其上清液加硫酸铵使其成90％饱和度，收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，此溶液于流动自来水中透析过夜，然后于PH4.0、0.02mol/L的醋酸缓冲液中透析，装已经用缓冲液平衡的二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，将上述透析过的液体流经纤维素柱，收集未吸附部分，经PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)透析，再上二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，其吸附部分用PH7.4、0.01mol/L磷酸缓冲液(PB)内含氯化钠0.025mol/L洗脱之，并收集备用，备用液体经制备好的二价镍离子与琼脂糖4B螯合层析亲和柱，收集吸附部分溶液，吸附部分溶液通过抗白蛋白抗体亲和层析柱得镍棕蛋白；b．从正常人血清提取收集正常人血清1000ml，调PH到8.55，按1∶1(V/V)加2.3％雷凡诺，静置2小时将白蛋白沉淀并去之，加硫酸铵使成65％饱和度，去沉淀后其上清液再加硫酸铵使成90％饱和度，收集沉淀，将沉淀浴于蒸馏水，上述溶液于流动自来水中透析过夜，然后于PH4.0、0.02mol/L的醋酸缓冲液中透析，装已经用缓冲液平衡的二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，将上述透析过的液体流经纤维素柱，收集未吸附部分，经PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)透析，然后上二乙氨基乙基(DEAE32)纤维素柱，其吸附部分用PH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PB)内含氯化钠0.025mol/L洗脱之，并收集备用，备用液体经制备好的二价镍离子与琼脂糖4B螯合层析柱，收集吸附部分溶液，吸附部分溶液经蒸馏水透析得镍棕蛋白；c．Ⅳ组份中的提取取5～10Kg重的Ⅳ组份，加5～10倍量的蒸馏水，离心沉淀，去沉淀，调PH到8.55，按1∶1(V/V)加2.3％雷凡诺，静置2小时将白蛋白沉淀并去之，加硫酸铵使成40～65％饱和度，去沉淀后加0.01～0.1％的活性炭使溶液澄清，澄清溶液为镍棕蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种负急性期镍棕蛋白的制备方法,它是利用人的组织液,经硫酸铵盐析、二乙氨基乙基(DEAE
文档编号C07K1/00GK1303860SQ9912491
公开日2001年7月18日 申请日期1999年11月30日 优先权日1999年11月30日
发明者胡树滋 申请人:胡树滋