还原响应多糖pei纳米凝胶、制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种还原响应多糖PEI纳米凝胶及其制备方法，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶由多糖与PEI静电作用形成凝胶后再加入二硫交联剂进行交联形成，还原响应多糖PEI纳米凝胶中各组分的重量份数为：多糖1-100；PEI1-100；二硫交联剂10-2000。本发明的还原响应多糖PEI纳米凝胶具有低毒性的优点，还能很好的包裹基因或蛋白质，保护所包裹的物质不受到溶菌酶的降解，被免疫细胞摄取，进入细胞后对还原性的条件响应，使所包裹物质的释放速度加快，可作为纳米凝胶载体负载蛋白质、多肽或核酸，本发明的纳米凝胶还有免疫佐剂的作用，其制备全过程均在水溶液中进行，环保无污染。
【专利说明】还原响应多糖PEI纳米凝胶、制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型的纳米凝胶，具体涉及一种具有还原响应的纳米凝胶。
【背景技术】
[0002]纳米载体是指可以负载基因或蛋白质等目标物质且具有纳米尺度的系统。纳米载体将DNA、RNA或蛋白质等分子包裹在纳米颗粒的内部或吸附在其表面，在细胞摄粒作用下将目标物质引入细胞内，从而实现安全有效的治疗或其他作用。纳米载体在介导基因或蛋白转移方面具有一定的优势，首先纳米材料一般具有生物相容性和可生物降解性，因此基本无毒性和免疫原性，不会引起机体的免疫反应，不会导致细胞转化与死亡。而且纳米粒子有特殊的结构和表面电荷，具有较高的基因或蛋白的转移效率。纳米载体还可以介导外源基因在细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因长期稳定的表达。另外，纳米载体可保护基因或蛋白，降低机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏。
[0003]很多纳米载体不仅能作为基因或蛋白的载体，同时具有免疫佐剂的效应。作为免疫佐剂的纳米载体需要带有比较强的正电荷，吸附带负电荷的DNA或蛋白质，作为免疫佐剂的纳米载体有阳离子脂质体、聚合物纳米颗粒、纳米凝胶等几种类型。
[0004]纳米凝胶由物理或者化学交联的聚合物网络组成的水凝胶颗粒，是一种纳米尺度的水分散体，由交联的共价键或非共价键形成三维网络结构。纳米凝胶作为基因或蛋白质的载体具有优势，纳米凝胶负载能力强，稳定性高，对离子强度、PH和温度等环境条件敏感，因此，纳米凝胶作为载体具有优势。
[0005]多糖具有良好的生物相容性，低毒性，生物可降解性，被广泛用于医药、化妆品、食品等领域，尤其是海藻酸钠，其分子上具有大量的羟基和羧基官能团，便于对其进行化学修饰，为理想的纳米载体合成材料。现有技术中用海藻酸钠作为基质材料制备纳米系统作为载体的方法主要有以下:第一种现有技术为用海藻酸钠与多价阳离子结合，进行离子交联，如中国专利CN1793209A ;第二种现有技术为利用海藻酸钠带大量负电荷的性质，与带大量正电荷的阳离子聚合物形成复合物；第三种现有技术为对海藻酸钠进行疏水修饰，疏水修饰后的海藻酸钠为两性分子，可进行自组装形成纳米粒子。第一种现有技术和第二种现有技术主要是基于正负电荷的静电作用形成的纳米粒子，粒径较大，且不能负载疏水性的物质；第三种现有技术对细胞内外环境的差异不敏感。
[0006]人体细胞内部含有大量的谷胱甘肽，浓度远高于细胞外部浓度，形成了细胞内外氧化还原电位差，利用这种差设计出一种对细胞内环境敏感的纳米载体，实现基因或蛋白质物质在细胞内的快速释放成为一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007]为解决上述技术问题之一，本发明提供了一种还原响应多糖PEI纳米凝胶，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶由海藻酸钠与PEI静电作用形成凝胶，再加入二硫交联剂进行交联；所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶组分的重量份数为:[0008]海藻酸钠1-100 ；
[0009]PEI1-100 ；
[0010]二硫交联剂 10-2000。
[0011]优选地，所述的PEI为分枝状，分子量为200-8000。
[0012]优选地，所述的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3丨-二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
[0013]本发明还提供了一种还原响应多糖PEI纳米凝胶载体，所述的载体为还原响应多糖PEI纳米凝胶，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶由海藻酸钠与PEI静电作用形成凝胶，再加入二硫交联剂进行交联；所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶组分的重量份数为:
[0014]海藻酸钠1-100 ；
[0015]PEI1-100 ；
[0016]二硫交联剂 10-2000。
[0017]优选地，所述的PEI为分枝状，分子量为200-8000。
[0018]优选地，所述的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3' - 二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
[0019]本发明还提供了还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0020](I)海藻酸钠与PEI的静电作用形成凝胶
[0021]将海藻酸钠溶液加入到PEI溶液中，同时进行搅拌，于室温放置进行反应，得到第一反应液；将第一反应液过滤后进行透析，得到第一纳米凝胶；
[0022](2) 二硫交联
[0023]将步骤⑴中得到的第一纳米凝胶与二硫交联剂混合、搅拌，在室温下反应，得到第二反应液；将第二反应液过滤后透析，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶。
[0024]优选地，所述的二硫交联剂与所述的第一纳米凝胶的质量比为5: 1-10: I。
[0025]本发明还提供了一种还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂为还原响应多糖PEI纳米凝胶作为载体包裹抗原，其组分的重量份数为:
[0026]还原响应多糖PEI纳米凝胶1-100 ；
[0027]抗原1-20。
[0028]优选地，所述的抗原为各类蛋白质、多肽、多糖、DNA或RNA。
[0029]优选地，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的粒径为70_100nm。
[0030]本发明另外提供了还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的制备方法，其特征在于，将抗原加入到权利要求1所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶中，充分混合进行反应，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂。
[0031]优选地，所述的抗原为各类蛋白质、多肽、多糖、DNA或RNA。
[0032]本发明的有益效果在于:第一，本发明所用的材料为低毒性的多糖与PEI，所制备的纳米凝胶具有低毒性的优点；第二，本发明通过多糖与PEI的静电作用形成凝胶，再用二硫交联剂进行交联，形成的纳米凝胶能很好的包裹抗原，保护所包裹的物质不受到溶菌酶的降解，被免疫细胞摄取；第三，本发明用二硫交联剂在纳米凝胶表面引入了二硫键，二硫键在正常人体体温，pH,氧化作用下稳定，进入细胞后对还原性的条件响应，二硫键变为巯基，纳米凝胶系统破坏，使所包裹物质的释放速度加快；第四，本发明的纳米凝胶可通过在制备过程中调节各原料的使用比例来控制粒径。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1是还原响应多糖PEI纳米凝胶形成及其包裹抗原示意图。
[0034]图2是还原响应多糖PEI纳米凝胶扫描电镜示意图。
[0035]图3是经不同浓度还原响应多糖PEI纳米凝胶作用的小鼠脾细胞活力变化图。
[0036]图4是小鼠单核巨噬细胞摄取还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂中的抗原结果图。
[0037]图5是还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂在小鼠树突状细胞中释放抗原结果图。
[0038]图6是注射还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的小鼠体内特异性抗体水平结果图。
【具体实施方式】
[0039]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041]图1为还原响应多糖PEI纳米凝胶及其包裹抗原的示意图。
[0042]本发明提供了 一种还原响应多糖PEI纳米凝胶，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶由海藻酸钠与PEI静电作用形成凝胶，再加入二硫交联剂进行交联，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶组分的重量份数为:
[0043]海藻酸钠1-100 ；
[0044]PEI1-100 ；
[0045]二硫交联剂 10-2000。
[0046]本发明的还原响应多糖PEI纳米凝胶可以作为载体，包裹抗原，形成还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂,所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂组分的重量份数为:
[0047]还原响应多糖PEI纳米凝胶1-100 ；
[0048]抗原1-20。
[0049]本发明的实施例中使用的PEI为分枝状，分子量为2000。
[0050]本发明的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3 ' - 二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
[0051]本发明中还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0052](I)海藻酸钠与PEI的静电作用形成凝胶
[0053]将海藻酸钠溶液加入到PEI溶液中，同时进行搅拌，于室温放置进行反应，得到第一反应液；将第一反应液过滤后进行透析，得到第一纳米凝胶；
[0054](2) 二硫交联
[0055]将步骤⑴中得到的第一纳米凝胶与二硫交联剂混合、搅拌，在室温下反应，得到第二反应液；将第二反应液过滤后透析，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶。
[0056]本发明的实施例中使用的PEI为分枝状，分子量为2000。
[0057]本发明的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3 ' - 二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
[0058]实施例1
[0059]还原性多糖PEI纳米凝胶:
[0060]溶液配置:
[0061]PEI溶液的配制:将PEI溶于2-(N_吗啉基)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液)中-使PEI的最终浓度为lmg/ml ；
[0062]海藻酸钠溶液的配制:将海藻酸钠溶于2- (N-吗啉基)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液)中使海藻酸钠的最终浓度为lmg/ml。
[0063]还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备,步骤如下:
[0064]1、海藻酸钠与PEI静电作用形成胶体:将配制好的PEI溶液置于圆底烧瓶中，再与所加入PEI溶液体积相同的海藻酸钠溶液缓慢滴入PEI溶液中混合，同时用磁力搅拌器进行搅拌，于室温下反应24h ;将反应后的溶液用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，将过滤后所得溶液放入截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋放入超纯水中透析3天，期间每6小时更换一次超纯水；
[0065]2、多糖PEI纳米凝胶的交联:将3，3’ - 二硫代二丙酸与步骤I中所得的普通多糖纳米凝胶按照质量比5: I进行混合交联，用磁力搅拌器搅拌，在室温下反应24h，将反应后的溶液放入到截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋放入超纯水中透析3天，期间每6小时更换一次超纯水，将透析后所得溶液用孔径为0.2 μ m的滤膜过滤，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶(简称为AP-SS)，置于4°C保存。
[0066]对比例1:`
[0067]海藻酸钠与PEI静电作用形成纳米凝胶:将配制好的PEI溶液置于圆底烧瓶中，再与所加入PEI溶液体积相同的海藻酸钠溶液缓慢滴入PEI溶液中混合，同时用磁力搅拌器进行搅拌，于室温下反应24h ;将反应后的溶液用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，将过滤后所得溶液放入截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋放入超纯水中透析3天，期间每6小时更换一次超纯水，得到普通多糖PEI纳米凝胶(简称为AP-CC);普通多糖纳米凝胶主要靠多糖与PEI静电作用形成。
[0068]还原响应多糖PEI纳米凝胶对小鼠细胞的毒性检测
[0069]分别检测了对比例I中的普通多糖PEI纳米凝胶和实施例1中的还原响应的多糖PEI纳米凝胶对小鼠脾细胞的毒性，具体步骤如下:
[0070]1、溶液配置:
[0071]分别将普通多糖PEI纳米凝胶和还原响应多糖PEI纳米凝胶按照以下的浓度梯度配置:20、40、60、120、160、200μ g/ml ；
[0072]从小鼠的脾脏中分离小鼠脾细胞，配置浓度4X IO6个/ml的小鼠脾细胞溶液；
[0073]2、小鼠脾细胞与不同的多糖PEI纳米凝胶共培养
[0074]本实验设置有4个组:
[0075]第一组:将50 μ L小鼠脾细胞溶液接种到U型底96孔板中，同时按照上述浓度梯度加入对比例I中的普通多糖PEI纳米凝胶50 μ L，每个孔中溶液的总体积为100 μ L，每个孔小鼠脾细胞的密度为2Χ IO5个/孔，孔中普通多糖PEI纳米凝胶的浓度梯度为10、20、30、60、80、100 μ g/ml ；
[0076]第二组:将50 μ L小鼠脾细胞溶液接种到U型底96孔板中，同时按照上述浓度梯度加入实施例1中的还原响应多糖PEI纳米凝胶50 μ L，每个孔中溶液的总体积为100 μ L，每个孔小鼠脾细胞的密度为2 X IO5个/孔，孔中还原响应多糖PEI纳米凝胶的浓度梯度为
10、20、30、60、80、100 μ g/ml ；
[0077]最大释放组:将50 μ L小鼠脾细胞溶液接种到U型底96孔板中，同时加入50 μ L无菌超纯水；
[0078]自然释放组:将50μ L小鼠脾细胞溶液接种到U型底96孔板中，同时加入50 μ L无菌超纯水；
[0079]将第一组、第二组、最大释放组和自然释放组的U型底96孔板置于37°C，5% CO2的环境中培养24h ;培养后将最大释放组加入细胞裂解液，使细胞充分裂解45min ；
[0080]3、用 CytoTox 96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 试剂盒(Promega 公司，USA)检测小鼠脾细胞乳酸脱氢酶(LDH)的活性
[0081]将以上4组的U型底96孔板200rcf离心5min，每孔取50 μ L细胞培养上清液加入到新的U型底96孔板中，每孔中再加入50 μ L乳酸脱氢酶底物避光反应30min，反应后每孔再加入50 μ L终止液终止反应，然后检测0D490值(490nm下的吸光值)，其中乳酸脱氢酶底物和终止液均为CytoTox 96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒中直接提供的试剂；
[0082]活细胞不会释放 LDH，只有细胞死亡后，细胞裂解，LDH才会从细胞中释放出来，本实验用小鼠脾细胞LDH的活性表征死亡细胞的数量；
[0083]细胞毒性百分比计算公式:细胞毒性=(实验组LDH的活性-自然释放LDH活性)/ (最大释放LDH活性-自然释放LDH活性)；
[0084]细胞活力=1-细胞毒性；
[0085]将第一组、第二组、最大释放组和自然释放组中所得LDH活性代入到上述公式中计算细胞活力，以加入的还原响应多糖PEI纳米凝胶的浓度或普通多糖PEI纳米凝胶的浓度为横坐标，细胞活力值为纵坐标绘制细胞活力变化曲线。
[0086]实验结果如图3所示，普通多糖PEI纳米凝胶细胞活力曲线显示，随着所加入的普通多糖PEI纳米凝胶浓度的增加，细胞活力有所下降，但是下降的幅度较小；还原响应多糖PEI纳米凝胶细胞活力曲线显示，还原响应多糖PEI纳米凝胶也有同样的变化趋势，说明普通多糖PEI纳米凝胶和还原响应多糖PEI纳米凝胶对小鼠脾细胞的毒性小。
[0087]实施例2
[0088]还原性多糖PEI纳米凝胶，二硫交联剂的使用量与实施例1不同。
[0089]溶液配置:
[0090]PEI溶液的配制:将PEI溶于2-(N_吗啉基)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液)中-使PEI的最终浓度为lmg/ml ；
[0091]海藻酸钠溶液的配制:将海藻酸钠溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液)中使海藻酸钠的最终浓度为lmg/ml。
[0092]还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备,步骤如下:
[0093]1、海藻酸钠与PEI静电作用形成胶体:将配制好的PEI溶液置于圆底烧瓶中，再与所加入PEI溶液体积相同的海藻酸钠溶液缓慢滴入PEI溶液中混合，同时用磁力搅拌器进行搅拌，于室温下反应24h ;将反应后的溶液用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，将过滤后所得溶液放入截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋放入超纯水中透析3天，期间每6小时更换一次超纯水；
[0094]2、多糖PEI纳米凝胶的交联:将3，3 ' -二硫代二丙酸与步骤I中所得的普通多糖纳米凝胶按照质量比10: I进行混合交联，用磁力搅拌器搅拌，在室温下反应24h，将反应后的溶液放入到截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋放入超纯水中透析3天，期间每6小时更换一次超纯水，将透析后所得溶液用孔径为0.2 μ m的滤膜过滤，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶(简称为AP-SS)，置于4°C保存。
[0095]图2为本实施例中的还原响应多糖PEI纳米凝胶扫描电镜示意图。
[0096]实施例3
[0097]还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂制备:将实施例2中制备的还原响应多糖PEI纳米凝胶与荧光标记的卵清蛋白(OVA-FITC)以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载OVA-FITC的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，配置成浓度为30 μ g/ml的溶液。
[0098]通过扫描电镜观察，本实施例中所得的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的粒径最小的为70nm,最大的为lOOnm。
[0099]对比例2
[0100]普通多糖PEI纳米凝胶制剂制备:将对比例I中制备的普通多糖纳米凝胶与荧光标记的卵清蛋白(OVA-FITC)以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载OVA-FITC的普通多糖纳米凝胶，配置成浓度为30 μ g/mi的溶液；
[0101]小鼠单核巨噬细胞对抗原的摄取情况
[0102]AP-CC组:在6孔玻底培养板中加入密度为6X IO6个/ml的小鼠单核巨噬细胞Iml,同时加入30 μ g/ml的对比例2中的负载OVA-FITC的普通多糖PEI纳米凝胶制剂Iml ；
[0103]AP-SS组:在6孔玻底培养板中加入密度为6X IO6个/ml的小鼠单核巨噬细胞Iml,同时加入30 μ g/ml的实施例3中的负载OVA-FITC的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂Iml ；
[0104]对照组:在6孔玻底培养板加入密度为6 X IO6个/ml的小鼠单核巨噬细胞1ml，同时加入5 μ g/ml的OVA-FITC溶液Iml ；
[0105]以上三组中小鼠单核巨噬细胞的浓度为3X IO6个/ml，两种负载OVA-FITC的纳米凝胶制剂的浓度为15 μ g/ml，三组中OVA-FITC的浓度为2.5 μ g/ml ；
[0106]将上述3组的6孔玻底培养板置于37°C，5% CO2的环境中培养lh，培养后，将上清液去除，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，再将细胞重新悬浮于2ml的FACS缓冲液中，在光谱激光扫描共聚焦显微镜下观察，计算出发出绿色荧光的阳性细胞比例，结果如图4所示，细胞发出绿色荧光是由于摄取了 0VA-FITC，对照组发出绿色荧光的细胞比例很小，不到10%，而AP-CC和AP-SS组发出绿色荧光的细胞比例均超过70%，说明普通多糖PEI纳米凝胶和还原响应多糖PEI纳米凝胶增加了小鼠单核巨噬细胞对抗原OVA-FITC的摄取，普通多糖PEI纳米凝胶和还原响应多糖PEI纳米凝胶均可以很好的包裹抗原，保护其不被溶菌酶降解，能够很好的被免疫细胞摄取。[0107]实施例4
[0108]还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂制备:将实施例2中制备的还原响应多糖PEI纳米凝胶与DQ-OVA以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min,得到负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，配置成浓度为30 μ g/ml的溶液。
[0109]对比例3
[0110]普通多糖PEI纳米凝胶制剂:将对比例I中制备的普通多糖纳米凝胶与DQ-OVA以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载DQ-OVA的普通多糖纳米凝胶制剂，配置成浓度为30 μ g/ml的溶液。
[0111]抗原在小鼠树突状细胞中的释放情况
[0112]AP-CC组:在6孔玻底培养板中加入多赖氨酸，再加入密度为2 X IO6个/ml的小鼠树突状细胞(DC) 1ml，培养24h，然后加入30 μ g/ml的对比例3中的负载DQ-OVA的普通多糖PEI纳米凝胶制剂溶液Iml ；
[0113]AP-SS组:在6孔玻底培养板中加入多赖氨酸，再加入密度为2 X IO6个/ml的小鼠树突状细胞(DC) Iml,同时加入30 μ g/ml的实施例4中的负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂溶液Iml ；
[0114]对照组:在6孔玻底培养板中加入密度为2 X IO6个/mI的小鼠树突状细胞(DC) Iml,同时加入 5 μ g/ml 的 DQ-OVA 溶液 Iml ；
[0115]将上述3组6孔玻底培养板置于37°C ,5% CO2的环境中培养，在培养时间为0.5h，lh, 1.5h时对3组样品各取样一次，`去除上清液，用PBS缓冲液冲洗3次，用光谱激光扫描共聚焦显微镜取图，每个孔中的样品随机选择300-400个细胞，测量细胞荧光强度，最后用Image-Pro Plus计算每个细胞的平均荧光强度。
[0116]其中，DQ-OVA是一种荧光自淬灭蛋白，本身不会发出荧光，但是被蛋白酶水解后，DQ-OVA的结构被破坏，自淬灭作用被解除，发出绿色的荧光，也就是说，只有进入小鼠树突状细胞，并且从载体中释放出来的DQ-OVA才会被蛋白酶水解发出绿色荧光，因此，荧光强度越强表示被蛋白酶水解的DQ-OVA越多，即从载体中释放的DQ-OVA越多，实验结果如图5所示，没有使用普通多糖PEI纳米凝胶或还原响应多糖PEI纳米凝胶包裹DQ-OVA的对照组荧光强度值最低，结合小鼠单核巨噬细胞对抗原的摄取情况的实验结果，主要是因为小鼠树突状细胞直接摄取DQ-OVA的能力较差，大部分DQ-OVA没有进入小鼠树突状细胞；AP_SS组使用了还原响应多糖PEI纳米凝胶作为载体，AP-CC组使用了普通多糖PEI纳米凝胶作为载体，随着细胞培养时间的延长，AP-SS组荧光强度显著高于AP-CC组荧光强度，结合实施例6中的结果，小鼠树突状细胞对负载DQ-OVA的普通多糖PEI纳米凝胶制剂和负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的摄取能力是相当的，也就是说，进入小鼠树突状细胞的负载DQ-OVA的普通多糖PEI纳米凝胶制剂和负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的数量是相当的，即进入小鼠树突状细胞的DQ-OVA的量是相当的，荧光强度的差异主要来自于DQ-OVA从载体中的释放量，还原响应多糖PEI纳米凝胶中抗原蛋白DQ-OVA的释放速度显著高于普通多糖PEI纳米凝胶中的DQ-OVA的释放速度，还原响应多糖PEI纳米凝胶作为载体可提高抗原蛋白的释放速度。
[0117]实施例5[0118]低凝胶含量还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂(还原性纳米疫苗I):将实施例2中制备的还原性响应多糖PEI纳米凝胶与DQ-OVA以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，配置成浓度为600 μ g/ml的溶液。
[0119]实施例6
[0120]高凝胶含量还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂(还原性纳米疫苗2):将实施例2中制备的还原响应多糖PEI纳米凝胶与DQ-OVA以质量比7.5:1混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载DQ-OVA的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，配置成浓度为850 μ g/ml的溶液。
[0121]对比例4 [0122]低凝胶含量普通多糖PEI纳米凝胶制剂(普通纳米疫苗I):将对比例I中制备的普通多糖纳米凝胶与卵清蛋白(OVA)以质量比5: I混合，于涡旋振荡器上震荡lOmin，在4°C环境中孵育30min，得到负载DQ-OVA的普通多糖纳米凝胶制剂，配置成浓度为600 μ g/ml的溶液。
[0123]对比例5
[0124]高凝胶含量普通多糖PEI纳米凝胶制剂(普通纳米疫苗2):将对比例I中制备的普通多糖纳米凝胶与卵清蛋白(OVA)以质量比7.5: I混合，于涡旋振荡器上震荡IOmin,在4°C环境中孵育30min，得到负载DQ-OVA的普通多糖纳米凝胶制剂，配置成浓度为850 μ g/ml的溶液。
[0125]注射还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的小鼠体内特异性抗体水平变化情况
[0126]实验对象为6-8周的C57BL/6雌性小鼠，随机分为5组，每组5只，注射方式为腹
腔注射；
[0127]小鼠抗体水平实验分组:共分为5组，第一组为对照组:注射100 μ g/ml的OVA溶液200 μ L，第二、三、四、五组分别注射对比例4中的普通纳米疫苗1、对比例5中的普通纳米疫苗2、实施例5中的还原性纳米疫苗1、实施例6中的还原性纳米疫苗2，注射量均为200 μ L ；
[0128]小鼠OVA抗体的ELISA检测
[0129]腹腔注射疫苗21天后处死小鼠，采集血清样本，对血清中的OVA抗体(OVA-1gG)含量用ELISA法进行检测，结果如图6所示，直接注射OVA的对照组小鼠血清中OVA-1gG的含量最少，注射普通纳米疫苗I和普通纳米疫苗2的小鼠血清中OVA-1gG的含量相当，纳米疫苗中普通多糖PEI凝胶含量的增加没有导致OVA-1gG水平的增加，普通多糖PEI凝胶作为免疫佐剂的效果不明显，注射还原性纳米疫苗2的小鼠比注射还原性纳米疫苗I的小鼠血清中OVA-1gG含量显著增加，也就是说，还原响应多糖PEI凝胶在纳米疫苗中含量的增加导致了 OVA-1gG含量显著增加，还原响应多糖PEI凝胶具有免疫佐剂的作用。
[0130]本发明的还原响应多糖PEI凝胶具有低毒性，能够被免疫细胞摄取，能够增加所包裹的抗原等物质在细胞中的释放速度，同时具有免疫佐剂的作用。
[0131]可以理解的是，尽管本发明在凝胶上引入二硫键使用的二硫交联剂为3，3丨-二硫代二丙酸，然而，本领域技术人员应理解，本发明中使用的二硫交联剂还可以为磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯。所述的二硫交联剂的选用对本发明不产生实质影响。尽管本发明中使用的PEI分子量为2000，然而，本领域技术人员应理解，本发明中使用的PEI分子量不限于2000，可以是200-8000。所述的PEI分子的分子量对本发明不产生实质影响。
[0132]以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、 等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【权利要求】
1.一种还原响应多糖PEI纳米凝胶,其特征在于,所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶组分的重量份数为: 海藻酸钠1-100 ；
PEI1-100 ； 二硫交联剂10-2000。
2.根据权利要求1所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶，其特征在于，所述的PEI为分枝状，分子量为200-8000。
3.根据权利要求1所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶，其特征在于，所述的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3' - 二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
4.一种还原响应多糖PEI纳米凝胶载体，其特征在于，所述的载体为权利要求1中所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶,所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶组分的重量份数为: 海藻酸钠1-100 ；
PEI 1-100 ； 二硫交联剂10-2000。
5.根据权利要求4所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶载体，其特征在于，所述的PEI为分枝状，分子量为200-8000。
6.根据权利要求4所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶载体，其特征在于，所述的二硫交联剂选自磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯、磺酸琥珀酰亚氨基丙酸钠、3，3' - 二硫代二丙酸、胱胺双丙烯酰胺、L-半胱氨酸双丙烯酰胺或N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种。
7.还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)海藻酸钠与PEI的静电作用形成凝胶 将海藻酸钠溶液加入到PEI溶液中，同时进行搅拌，于室温放置进行反应，得到第一反应液；将第一反应液过滤后进行透析，得到第一纳米凝胶； (2)二硫交联 将步骤(1)中得到的第一纳米凝胶与二硫交联剂混合、搅拌，在室温下反应，得到第二反应液；将第二反应液过滤后透析，得到还原响应多糖PEI纳米凝胶。
8.根据权利要求7所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述的二硫交联剂与所述的第一纳米凝胶的质量比为5: 1-10: I。
9.一种还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂,其特征在于,所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂为权利要求1所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶作为载体包裹抗原，其组分的重量份数为: 还原响应多糖PEI纳米凝胶1-100 ； 抗原1-20。
10.根据权利要求9所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，其特征在于，所述的抗原为各类蛋白质、多肽、多糖、DNA或RNA。
11.根据权利要求9所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂，其特征在于，所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的粒径为70-100nm。
12.还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的制备方法，其特征在于，将抗原加入到权利要求I所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶中，充分混合进行反应,得到还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂。
13.根据权利要求12所述的还原响应多糖PEI纳米凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述的抗原为各类蛋白质、多肽、多糖、DNA或RNA。
【文档编号】C08L5/04GK103588998SQ201210292707
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2012年8月16日
【发明者】马轶凡, 李萍, 刘朋, 蔡林涛 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院