本专利申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请61/783,874的优先权的权益，其通过引用并入本文。
技术背景
气温上升和淡水供应减少是环境胁迫的两种形式，也称为非生物胁迫(abiotic stress)，其降低了由农业生产的食品的量。非生物胁迫耐受性的一个关键调节剂是植物激素脱落酸(ABA)，其由植物响应各种非生物胁迫而合成并编排增强植物生存的适应性应答(Cutler,S.et al.,Annual Review of Plant Biology(2010)；Nambara,E.et al.,Annual Review of Plant Biology 56:165-185(2005))。进行工程改造以具有增加的ABA敏感性的农作物植物显示了在干旱条件下提高的产量(Wang,Y.et al.,Plant J43:413-424(2005))。此外，向田野中的植物直接应用ABA或ABA类似物已经显示出提高的水利用效率(Hawkins,A.F.et al.,Plant Growth Regulators for Agricultural and Amenity Use(用于农业和城市美化用途的植物生长调节剂)(British Crop Protection Council)(1987)；Kreeb,K.H.et al.,Structural and Functional Responses to Environmental Stresses(对于环境胁迫的结构和功能反应)(Balogh Scientific Books)(1989))；然而，由于ABA复杂的生产工艺路线和高成本，其尚未成功商业化用于这种用途。
有趣的是，许多杀真菌剂和杀虫剂已显示未知机制的胁迫耐受性(stress-tolerance)“副作用”，并已被商业化用于胁迫耐受性用途，这表明对于控制胁迫耐受性的化学方法的强烈关注和公认需求(USA,Monsanto Technology)(2003)；Beckers,G.J.M.et al.,Current Opinion in Plant Biology(植物生物学的当前观点)10:425-431(2007)；Schulz,A.et al.,In US 2007/0124839 A1(USA,Bayer Crop Sciences)(2006))。这种关注的重要驱动力已促成以下事实，即近100年获得的玉米产量的剧增可以在很大程度上归因于新的高产玉米品种的非生物胁迫耐受性的提高(Duvick,D.N.et al.,Crop Science 39:1622-1630(1999)；Tollenaar,M.et al.,Field Crops Research 75:161-169(2002)；Tollenaar,M.et al.,Crop Sci39:1597-1604(1999))。由于ABA被公认为是植物逆境生理学的关键植物激素调节剂，因此在调节农作物中ABA途径方面有强烈兴趣。控制ABA信号途径的一个可能的要点是受体蛋白，其在原则上允许ABA信号和胁迫耐受性的化学调节和基因调节两者。
最近，一个ABA受体的新家族，Pyrabactin抗性/PYR样(“PYR/PYL”)家族，被确定为ABA信号的调制剂(Park,S.Y.et al.,Science324:1068-1071(2009))。ABA受体PYL5的超表达赋予拟南芥(Arabidopsis)植物耐旱性(Santiago,J.et al.,The Plant Journal60(4):575-578(2009))，确认这个新受体家族作为控制植物胁迫耐受性的一个主要指标。但是，基因的超表达可具有不良产量的后果，这被称为“产量拖累(yield drag)”。产量拖累被认为由于胁迫耐受性途径的未经调节激活而发生，其与减缓生长相关并在正常条件下发生(即不存在干旱或其它胁迫源)。参见，D.W.,J Exp Bot 64(1):83-108(2013)。获得ABA信号传导的调节控制的一种方式是开发激活ABA受体的化学试剂(即激动剂)。这些可以在一旦干旱或其他胁迫条件发生时应用于植物，其允许在不利条件下进行选择性保护。这允许实现胁迫耐受性而在不理想的生长条件不降低产量的好处。
原则上，ABA可用作激动剂来实现这些优点。然而，它是一种天然产品，制造成本昂贵，并且通过UV光异构化和代谢失活两者会迅速降解。它还具有哺乳动物中的生理效果，可料想这会影响其作为农药的适用性(Guri,A.J.et al.,Clin Nutr.(2010))。
发明概述
双炔酰菌胺(mandipropamid)
本申请提供了包含异源表达盒的植物或细胞，所述表达盒包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当双炔酰菌胺与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被双炔酰菌胺激动(agonized)。本申请还提供了编码这种突变的PYR/PYL多肽的分离的核酸，以及包含可操作连接到编码这种突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置K59的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置89、108、122和/或159的氨基酸处还包含至少一个额外的突变，其中所述突变选自A89W、F108L、F108S、F108C、F108Q、F108I、F108T、F108N、F108V、F108A、F108E、F108G、S122G、F159L、F159I、F159C、F159T、F159V、F159A、F159M或它们的组合。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置S122的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是甘氨酸残基，对应于SEQ ID NO:1的位置F108的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置58、81、83、87、159、160和/或164的氨基酸处还包含至少一个额外的突变，其中所述突变选自Y58H、V81C、V81I、V81T、V83L、L87A、F159L、F159M、F159V、A160V、V164I或它们的组合。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置58、108和122的氨基酸处包含突变，其中所述突变是Y58H、F108A和S122G。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置81和/或83的氨基酸处还包含至少一个额外的突变，其中所述突变选自V81I、V83L或它们的组合。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置159和/或160的氨基酸处包含至少一个额外的突变，其中所述突变选自A160V、V164I、F159L或它们的组合。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置81、108、122和160的氨基酸处包含突变，其中所述突变是V81I、F108A、S122G和A160V。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置58、81、108、122和159的氨基酸处包含突变，其中所述突变是Y58H、V81I、F108A、S122G和F159L。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在对应于PYR1(SEQ ID NO:1)中位置58、81、108、122和164的氨基酸处包含突变，其中所述突变是Y58H、V81I、F108A、S122G和V164I。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在包含PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基处包含至少一个突变。
在一些实施方案中，相比于缺乏表达盒的植物，当与双炔酰菌胺接触时，所述植物具有提高的非生物胁迫耐受性。
在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
在一些实施方案中，提供了来自本文描述的植物的种子、花、叶、果实、加工食品或食物成分。
还提供了通过使植物与双炔酰菌胺接触来改善本文所述植物中非生物胁迫的方法。
还提供了通过使植物与双炔酰菌胺接触来抑制本文所述植物的种子萌发的方法。
还提供了制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当双炔酰菌胺与所述突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被双炔酰菌胺激动，其中当双炔酰菌胺与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，双炔酰菌胺不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽，所述方法包括
(a)诱变野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与双炔酰菌胺接触；和
(c)确定双炔酰菌胺是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中激活确定一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽被过双炔酰菌胺激动。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选双炔酰菌胺，以确定在将一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与双炔酰菌胺接触之前，双炔酰菌胺是否结合野生型PYR/PYL受体多肽。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当双炔酰菌胺与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被双炔酰菌胺激动。还提供了包含所述表达盒的表达载体。
还提供了一种分离的核酸，其包含编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，其中当双炔酰菌胺与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被双炔酰菌胺激动。还提供了包含所述核酸的表达载体。
敌草腈(Dichlobenil)
本申请提供了包含异源表达盒的植物或细胞，其，所述表达盒包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当敌草腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被敌草腈激动。还提供了编码这种突变的PYR/PYL多肽的分离的核酸，以及包含可操作连接到编码这种突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置K59的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包括对应(相对于SEQID NO:1)于下列的至少一个额外的突变：V83L、L87P、E94D、F108E、I110M、H115N、E141F、E141L、E141Y、E141H、E141Q、M158L、M158S、M158C、M158I、M158T、M158V、M158A、M158G、F159L、F159I、F159V、A160C、A160S、A160Y、A160I、A160T、A160N、A160V、T162L、T162Y、T162W、T162K、V164F、V164L、V164S、V164Y、V164C、V164H、V164Q、V164T、V164T、V164N、V164K、V164A、V164E、V164G、V164M、N167S、N167C、N167Q、N167T、N167A、N167D、N167G、V81I、V83L、A89C、L117C、E141Y、E141K、F159T、F159C、F159A、F159M或A160G或其组合。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置A89的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是半胱氨酸残基，且还包含对应于A141Y、A160G、V164K或L117C或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置L117的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是半胱氨酸残基，且还包含对应于V164K的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置E141的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是酪氨酸残基，且还包含对应于A160G的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置A160的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是甘氨酸残基，且还包含对应于L117C或V164K或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在包含PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基处包含至少一个突变。
在一些实施方案中，相比于缺乏所述表达盒的植物，当与敌草腈接触时，所述植物具有提高的非生物胁迫耐受性。
在一些实施方案中，细胞是植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
在一些实施方案中，提供了来自本文描述的植物的种子、花、叶、果实、加工食品或食物成分。
还提供了通过使植物与敌草腈接触来改善本文所描述的植物中非生物胁迫的方法。
还提供了通过使植物与敌草腈接触来抑制本文所述植物的种子萌芽的方法。
还提供了制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当敌草腈与所述突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被敌草腈激动，其中当敌草腈与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，敌草腈不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽，所述方法包括：
(a)诱变野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与敌草腈接触；和
(c)确定敌草腈是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中激活确定一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽被敌草腈激动。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选敌草腈以确定在将一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与敌草腈接触之前敌草腈是否结合到野生型PYR/PYL受体多肽。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当敌草腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被敌草腈激动。还提供了包含所述表达盒的表达载体。
还提供了一种分离的核酸，其包含编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，其中当敌草腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被敌草腈激动。还提供了包含所述核酸的表达载体。
苯并噻二唑(Benzothiadiazole)
本申请提供了包含异源表达盒的植物或细胞，所述表达盒包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当苯并噻二唑与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被苯并噻二唑激动。还提供了编码这种突变的PYR/PYL多肽的分离的核酸，以及包含可操作连接到编码这种突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置K59的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，酪氨酸，天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包括对应(相对于SEQID NO:1)于下列的至少一个额外的突变：V81I、V83L、A89C、L117C、E141Y、E141K、M158I、M158T、M158C、M158V、F159L、F159T、F159C、F159I、F159V、F159A、F159M、A160G、T162Y、T162W、T162K、V164Y和V164K或其组合。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置A89的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是半胱氨酸残基，且还包含对应于A141Y、A160G、V164K或L117C或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置L117的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是半胱氨酸残基，且还包含对应于V164K的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置E141的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是酪氨酸残基，且还包含对应于A160G的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置A160的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是甘氨酸残基，且还包含对应于L117C的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在包含PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基处包含至少一个突变。
在一些实施方案中，相比于缺乏表达盒的植物，当与苯并噻二唑接触时，植物具有提高的非生物胁迫耐受性。
在一些实施方案中，细胞是植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
在一些实施方案中，提供了来自本文述植物的种子、花、叶、果实、加工食品或食物成分。
还提供了通过使植物与苯并噻二唑接触来改善本文所述植物中非生物胁迫的方法。
还提供了通过使植物与苯并噻二唑接触来抑制本文所述植物的种子萌发的方法。
还提供了制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当苯并噻二唑与所述突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被苯并噻二唑激动，其中当苯并噻二唑与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，苯并噻二唑不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽，所述方法包括：
(a)诱变野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与苯并噻二唑接触；和
(c)确定苯并噻二唑是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中，激活确定一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽被苯并噻二唑激动。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选苯并噻二唑以确定在将一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与苯并噻二唑接触之前苯并噻二唑是否结合到野生型PYR/PYL受体多肽。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当苯并噻二唑与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被苯并噻二唑激动。还提供了包含所述表达盒的表达载体。
还提供了一种分离的核酸，其包含编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，其中当苯并噻二唑与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被苯并噻二唑激动。还提供了包含所述核酸的表达载体。
解草嗪(Benoxacor)
本申请提供了包含异源表达盒的植物或细胞，所述表达盒包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当解草嗪与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激动。还提供了编码这种突变的PYR/PYL多肽的分离的核酸，以及包含可操作连接到编码这种突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置K59的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，酪氨酸，天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包括对应(相对于SEQID NO:1)于下列的至少一个额外的突变：L87F、A89I、A89W、S92I、S92W、M158C、M158V、M158T、F159V和T162W或其组合。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置A89的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是异亮氨酸残基，且还包含对应于S92I或S92W或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在包含PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基处包含至少一个突变。
在一些实施方案中，相比于缺乏表达盒的植物，当与解草嗪接触时，所述植物具有提高的非生物胁迫耐受性。
在一些实施方案中，细胞是植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
在一些实施方案中，提供了来自于本文述植物的种子、花、叶、果实、加工食品或食物成分。
还提供了通过使植物与解草嗪接触来改善本文所述植物中非生物胁迫的方法。
还提供了通过使植物与解草嗪接触来抑制本文所述植物的种子萌发的方法。
还提供了制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当解草嗪与所述突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激动的，其中当解草嗪与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，解草嗪不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽，所述方法包括
(a)诱变野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触；和
(c)确定解草嗪是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中，激活确定一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激动。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选解草嗪以确定在将一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与解草嗪接触之前解草嗪是否结合到野生型PYR/PYL受体多肽。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当解草嗪与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激动。还提供了包含所述表达盒的表达载体。
还提供了一种分离的核酸,其包含编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸,其中当解草嗪与突变的PYR/PYL受体多肽接触时,所述突变的PYR/PYL受体多肽被解草嗪激动。还提供了包含所述核酸的表达载体。
咯菌腈(Fludioxonil)
本申请提供了包含异源表达盒的植物或细胞，所述表达盒包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当咯菌腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被咯菌腈激动。还提供了编码这种突变的PYR/PYL多肽的分离的核酸，以及包含可操作连接到编码这种突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置K59的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是X，其中X是丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，酪氨酸，天冬酰胺或色氨酸。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包括对应(相对于SEQID NO:1)于下列的至少一个额外的突变：V81Y、V81I、V83L、L87F、L87P、S92F、E94A、E94S、E94D、F108L、Y120F、Y120A、Y120G、Y120M、E141Y、M158C、M158V、M158I、M158T、F159T、F159V、F159A、A160C、T162W、V164K、N167C、N167H和N167V或其组合。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置E94的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是丙氨酸残基，且还包含对应于Y120A或N167C或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的位置Y120的突变的PYR/PYL受体多肽的氨基酸是丙氨酸残基，且还包含对应于N167C或E141Y或其组合的至少一个额外的突变。
在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽在包含PYR/PYL受体多肽的配体结合口袋的氨基酸残基处包含至少一个突变。
在一些实施方案中，相比于缺乏表达盒的植物，当与咯菌腈接触时，植物具有提高的非生物胁迫耐受性。
在一些实施方案中，细胞是植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或真菌细胞。
在一些实施方案中，提供了来自于本文描述的植物的种子、花、叶、果实、加工食品或食物成分。
还提供了通过使植物与咯菌腈接触来改善本文所述植物中非生物胁迫的方法。
还提供了通过使植物与咯菌腈接触来抑制本文所述植物的种子萌发的方法。
还提供了制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法，当咯菌腈与所述突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被咯菌腈激动，其中当咯菌腈与野生型PYR/PYL受体多肽接触时，咯菌腈不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽，所述方法包括：
(a)诱变野生型PYR/PYL受体多肽；
(b)使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与咯菌腈接触；和
(c)确定咯菌腈是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中，激活确定一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽被咯菌腈激动。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，筛选咯菌腈以确定在将一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与咯菌腈接触之前咯菌腈是否结合到野生型PYR/PYL受体多肽。
还提供了一种表达盒，其包含可操作连接到编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的启动子，其中当咯菌腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被咯菌腈激动。还提供了包含所述表达盒的表达载体。
还提供了一种分离的核酸，其包含编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，其中当咯菌腈与突变的PYR/PYL受体多肽接触时，所述突变的PYR/PYL受体多肽被咯菌腈激动。还提供了包含所述核酸的表达载体。
附图说明
图1A总结了通过双炔酰菌胺对HAB1和ABI2 PP2C活性进行饱和抑制的数据。图1B显示了来自测定HAB1、ABI1和ABI2的双炔酰菌胺介导的抑制的IC50值的试验的数据的图。
图2显示了在实施例中进一步讨论的蛋白表达数据的图。
图3显示了PYR1MANDI(PYR1双炔酰菌胺)转基因植物的双炔酰菌胺处理的热像结果。
图4总结了对于PYR1MANDI转基因植物的水耗对于时间的数据。
图5显示了持续至少6天的双炔酰菌胺对PYR1MANDI转基因植物的效果。
图6显示了渐进性水耗对对照和PYR1MANDI转基因植物的效果。
图7A显示了种子萌发试验的结果。图7B显示了响应双炔酰菌胺的种子萌发的剂量应答的总结。图7C显示了指示PYR1 PYR1MANDI蛋白水平的蛋白印记。
图8显示了根生长抑制试验的结果。
图9显示了响应35S::PYR1MANDI转基因植物中ABA的基因的基因表达水平的结果。
图10A显示了双炔酰菌胺对野生型拟南芥(Arabidopsis)植物中基因表达的效果。图10B显示了双炔酰菌胺对于PYR1MANDI转基因的拟南芥植物中基因表达的效果。
图11显示了对于模拟物处理或用双炔酰菌胺处理的植物的标准成像(前两行)和热像(后两行)结果。
图12显示了模拟物处理或用双炔酰菌胺处理的各种基因型植物禁水(water deprivation)后的代表性植物。
图13A显示了PYR1MANDI转基因西红柿植物的蛋白表达水平。图13B显示了模拟物处理或用双炔酰菌胺处理的各种西红柿植物的热像。
定义
术语“PYR/PYL受体多肽”指的是其特征部分在于存在聚酮化合物环化酶结构域2(PF10604)、聚酮环化酶结构域1(PF03364)以及Bet V I结构域(PF03364)中的一个或多个或所有的蛋白，其野生型形式介导脱落酸(ABA)信号传导和ABA类似物信号传导。本领域已知多种多样的PYR/PYL受体多肽序列。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽包含与拟南芥PYR1(SEQ ID NO:1),PYL1(SEQ ID NO:2),PYL2(SEQ ID NO:3),PYL3(SEQ ID NO:4),PYL4(SEQ ID NO:5),PYL5(SEQ ID NO:6),PYL6(SEQ ID NO:7),PYL7(SEQ ID NO:8),PYL8(SEQ ID NO:9),PYL9(SEQ ID NO:10),PYL10(SEQ ID NO:11),PYL11(SEQ ID NO:12),PYL12(SEQ ID NO:13)或PYL13(SEQ ID NO:14)，或SEQ ID NOS:15-89中的任一个基本相同的多肽。
“野生型PYR/PYL受体多肽”是指介导脱落酸(ABA)信号传导和ABA类似物信号传导的天然存在的PYR/PYL受体多肽。
“突变的PYR/PYL受体多肽”或“修饰的PYR/PYL受体多肽”是指，为来自于天然存在的(即野生型)PYR/PYL受体多肽的变体的PYR/PYL受体多肽。如本文所使用的，突变的或修饰的PYR/PYL受体多肽相对于相应的野生型PYR/PYL受体多肽包含一个或多个氨基酸取代。在本文中，“突变的”多肽或“修饰的”多肽可以通过产生非野生型核苷酸序列的任何方法来产生。突变的PYR/PYL受体多肽可以介导或可以不介导脱落酸(ABA)信号传导和ABA类似物信号传导。
“对应于[特定序列]的位置[X]”的氨基酸是指与指定序列的等同氨基酸对齐的目标多肽中的氨基酸。通常，如本文所述，对应于PYR/PYL受体多肽的一个位置上的氨基酸可以使用比对算法例如BLAST来确定。在典型的实施方案中，氨基酸位置的“对应”通过与包含SEQ ID NO:1的PYR/PYL受体多肽的区域对齐来确定，如本文所进一步讨论的。当PYR/PYL受体多肽序列与SEQ ID NO:1不同时(例如，通过氨基酸的变化或氨基酸的添加或缺失)，其可以是，与通过不激动野生型PYR/PYL的化学物质的激动相关联的特定的突变不会存在于与其在SEQ ID NO:1中的相同的位置编号中。例如，PYL1(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置K86与SEQ ID NO:1中的氨基酸位置K59对齐，这可通过两条序列的比对容易地说明。在此实例中，SEQ ID NO:2中氨基酸位置86处的突变对应于SEQ ID NO:1中的位置59。
如果当按如下所述针对最大一致性比对两条核酸序列或多肽时，所述两条序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别是相同的，则所述两条核酸序列或多肽可以说成是“相同的”。在两条或更多条核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指，当通过比较窗口比较和针对最大一致性比对时，如使用下列一个序列比较算法或通过手动比对和目测测量，两条或更多条序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。当序列同一性的百分比用于指蛋白或肽时，应当认识到，不相同残基位置的区别往往在于保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变该分子的功能性质。如果序列的不同在于保守取代，则可以向上调整百分比序列同一性以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常，这涉及将保守取代评价为部分错配而非完全错配，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，如果给予完全相同的氨基酸的分数为1，且给予非保守取代的分数为零分，则给予保守取代的分数介于0-1之间。根据例如Meyers&Miller算法,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)，例如在程序PC/GENE中实施(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)来计算保守取代的评分。
在两条核酸或多肽的上下文中使用的短语“基本上相同”，是指一条序列与参考序列具有至少60％的序列同一性。作为选择，百分比同一性可以是从60％至100％的任何整数。使用本文所述程序，优选使用标准参数的BLAST，如下所述，相比于参考序列，一些实施方案包括至少：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。本发明的实施方案提供了编码与SEQ ID NO:1-89中的任一个基本上相同并具有本文所述的至少一个氨基酸突变的多肽的核酸。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，则指定序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定替代参数。然后相对于参考序列，序列比较算法基于程序参数计算测试序列的序列同一性百分比。
如本文所使用的“比较窗”包括提到选自20-600、通常约50至约200、更通常约100至约150的连续位置的数字中任何一个的区段，在将两条序列进行最佳比对后，可在其中将序列与连续位置相同数字的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方式进行，例如Smith&Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))的局部同源性算法，Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同源性比对算法，Pearson&Lipman(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))的相似性方法研究，这些算法(威斯康星(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化执行，或手工比对和视觉检查。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)网站可获得用于进行BLAST分析的软件。该算法首先包括通过识别查询序列中短字长W来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库中相同的字长比对时，所述序列对匹配或满足一些正值的阈值分数T。T称为指邻近字得分阈值(neightborhood word score threshold,Altschul et al，同上)。这些初始邻近字命中(word hit)作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSP。然后字命中在沿每条序列的两个方向上延伸，直至累积比对分数可被增加。对于核苷酸序列，累积分数使用参数M(对匹配残基对的奖励分数；总是>0)和N(对错配残基对的惩罚分数；总是<0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵被用于计算累计分数。当：累积比对分数从其最大获得值下降了数量X时；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积分数达到0或者0以下时；或达到任一序列的末端时，字命中在每个方向上的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)28、期望值(E)10、M＝1、N＝-2以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。一种由BLAST算法提供的相似性测量是最小总和可能性(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配可能偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和可能性小于约0.01，更优选小于约10-5，和最优选小于约10-20，则该核酸被认为与参考序列类似。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或如果所述核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中通过密码子指定为丙氨酸的每个位置，该密码子可变成任何描述的相应密码子而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异中的一种。在本文中，编码多肽的每一核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应当认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密码子)可以被修饰为产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。
至于氨基酸序列，技术人员应当认识到，在核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变单个氨基酸或编码序列中的小百分比氨基酸的个别取代，是一种“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是公知的现有技术。
以下六组各自含有对于彼此为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
可以预期的是，在突变的PYR/PYL受体多肽中的取代突变不仅包括在本说明书中，例如在实施例部分中或在说明书的任何附图或表中提到的那些具体的氨基酸取代，而且还包括对那些具体氨基酸而言是保守取代的氨基酸，只要所述保守取代的氨基酸不是野生型氨基酸即可。作为非限制性的例子，当突变的PYR/PYL受体多肽包含丝氨酸至苏氨酸取代时，可以预期的是突变的PYR/PYL受体多肽可以作为选择地包括丝氨酸至丙氨酸取代，因为苏氨酸和丙氨酸对于彼此是保守取代；但是突变的PYR/PYL受体多肽不会包括丝氨酸至丝氨酸取代，因为丝氨酸是存在于野生型PYR/PYL多肽中的氨基酸。
如本文所用的，术语“激动剂(agonist)”或“激动剂(agonists)”是指如本文别处所述的使用用于所述的靶蛋白活性的体外和体内试验识别的分子。激动剂是指例如诱导或激活所述靶蛋白的表达，或结合、刺激、增加、打开、激活、促进、增强激活、敏化或上调所述靶蛋白的活性(或编码多核苷酸)的试剂。激动剂包括天然存在的和合成的分子。在一些实施方案中，激动剂是例如杀菌剂、除草剂、杀虫剂和/或肥料的农用化学制品。用于测定激动剂是否“激动”或“不激动”目标蛋白质的试验包括例如，使推定的激动剂接触纯化的靶蛋白，然后如上所述确定对于所述靶蛋白活性的功能效果，或使推定的激动剂接触表达靶蛋白的细胞，然后如上所述确定对于所述靶蛋白活性的功能效果。本领域技术人员应当能够确定一个试验是否适合用于确定激动剂是否激动或不激动靶蛋白。包含所述用推定的激动剂处理的靶蛋白的样品或分析试样与未用激动剂的对照样品进行比较，以检查效果的程度。对照样品(未用激动剂处理)被分配为100％的相对活性值。当相对于对照的活性值是110％，任选150％，任选200％、300％、400％、500％或1000-3000％或更高时，则实现所述靶蛋白的激动作用。
如本文所用的术语“正交受体”指的是已被修饰而选择性地识别新配体(“正交配体”)的受体。如本文所用的术语“正交配体”是指激动突变的或修饰的PYR/PYL受体多肽但不激动(或不实质上激动)野生型PYR/PYL受体多肽的试剂。
术语“植物”包括整株植物(whole plant)、枝营养器官和/或结构(shoot vegetative organ and/or structure)(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵子和中央细胞)、种子(包括合子、胚、胚乳和种皮)、果实(例如成熟子房)、幼苗、植物组织(例如维管组织、基本组织等)，细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)以及同一植株的子代。可以在本发明的方法中使用的植物的种类通常是宽至适于转化技术的更高和更低植物的种类，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物，蕨类植物和多细胞藻类。其包括多种倍性水平包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子的植物。
如本文所用的术语“启动子”，是指能够驱动细胞中编码序列转录的多核苷酸序列。因此，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式作用转录控制元件和参与调节或调控基因转录的时机(timing)和/或速率的调节序列。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括参与转录调控增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3'非翻译区或内含子序列。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子相互作用以执行(打开/闭合、调节、调控等)基因转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子。“组成型启动子”是指能够在几乎所有的组织类型中起始转录的启动子，而“组织特异性启动子”仅在一个或几个特定的组织类型中起始转录。
多核苷酸序列如果源自外来物种，则其对于生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”，或者如果源自相同物种，则由其原始形式改性。例如，当启动子被说成是可操作地连接至异源编码序列，这意味着该编码序列源自一个物种而启动子序列源自另一个不同物种；或者，如果两者都源自相同物种，则编码序列不与启动子天然相关联(例如编码序列是基因工程的编码序列，例如来自相同物种的不同基因在或来自不同基因型或品种的等位基因)。
“表达盒”是指一种核酸构建体，当导入宿主细胞时，其分别导致转录和/或RNA或多肽的转录。没有或不能被翻译的反义或有义构建体明确地包括在该定义中。在转基因的表达和内源基因的抑制(例如通过反义或有义抑制)两种情况中，技术人员将认识到所插入的多核苷酸序列不必是相同的，也可以是对于源自其的基因序列仅基本相同。如本文所解释的，这些基本相同的变体参照特定的核酸序列被具体覆盖。
如本文所用，术语“非生物胁迫”、“胁迫”或“胁迫条件”指的是植物、植物细胞等对于对植物的代谢、生长、发育、繁殖或生存(统称为“生长”)有不利影响的非生命(“非生物”)的物理或化学试剂的暴露。胁迫可由于例如环境因素如水(例如洪水、干旱或脱水)、厌氧条件(例如低水平氧气或高水平CO2)、异常渗透条件、盐度或温度(例如炎热/热、寒冷、冰冻或霜)、营养物不足或暴露于污染物，或通过激素、第二信使或其它分子而被施加到植物。厌氧胁迫例如是由于氧含量下降(低氧或缺氧)而足以产生胁迫应答。溢流胁迫可以归因于植物、植物部分、组织或分离的细胞在季风、雨季、山洪暴发或植物的过度灌溉等的过程中出现的液体介质中长时间或短暂浸泡。冷胁迫或热胁迫可以由于从对特定植物物种的最佳生长温度范围在温度上分别降低或提高而出现。这种最佳生长温度范围容易为本领域技术人员所确定或熟知。脱水胁迫可以由细胞、组织、器官或整株植物的水损失、降低的膨压或降低的含水量引起。干旱胁迫可以由禁水或降低供给至细胞、组织、器官或生物体的水引起或与其相关。盐度引起的胁迫(盐胁迫)可以与细胞的细胞内或细胞外环境的渗透势中的干扰相关联或由其引起。如本文所用的术语“非生物胁迫耐受性”或“胁迫耐受性”是指相比于正常条件下的植物，植物对于非生物胁迫的增加的抗性或耐受性，以及当在非生物胁迫的条件下时以相对优异的方式执行的能力。如本文所用，术语“干旱抗性”和“干旱耐受性”被用于指相比于正常环境，植物对于由水供应量的减少而引起的胁迫的增加的抗性或耐受性，以及该植物在低水环境中发挥功能和生存，并以相对优异的方式执行的能力。
发明详述
I、引言
出人意料的是，属于脱落酸(ABA)受体家族即PYR/PYL受体家族的蛋白，可以突变而结合并响应敌草腈、苯并噻二唑、解草嗪、双炔酰菌胺和咯菌腈。
因此，可以改变PYR/PYL受体多肽，使得上述所列化合物中的一种可以用于选择性地激活它们。而且，因为突变的PYR/PYL受体(正交受体)可以通过应用正交配体被选择性地激活(例如，作为部分程序以改善植物对于水分亏缺的应答)，能够避免“产量拖累(yield drag)”的问题。产量拖累通常与受体超表达相关，其中在正常或最佳的生长条件过程中(即在没有干旱或其它胁迫源下)的基因过度表达与减缓生长相关。这不与所公开的突变受体同时出现，因为它们具有废除ABA反应性的K59R突变。
II、突变的PYR/PYL受体多肽
提供被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学物质(敌草腈、苯并噻二唑、解草嗪和/或双炔酰菌胺)激动的突变的PYR/PYL受体多肽，以及编码被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学物质激动的突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，包含编码被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学物质激动的突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸的表达盒和表达载体，包含被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学物质激动的突变的PYR/PYL受体多肽的植物，制备包含被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学物质激动的突变的PYR/PYL受体多肽的植物的方法，以及制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法。
多种野生型(天然存在的)PYR/PYL多肽序列是现有技术中已知的。虽然PYR1最初被鉴定为拟南芥中的脱落酸(ABA)受体，实际上PYR1是拟南芥中相同蛋白家族中一组也介导ABA信号传导的至少14种蛋白(PYR/PYL蛋白)中的一员。该蛋白家族也存在于其他植物中(参见例如序列表)，其部分特征在于存在聚酮化合物环化酶结构域2(PF10604)、聚酮化合物环化酶结构域1(PF03364)和Bet V I域(PF03364)中的一个或多个或全部。START/Bet v 1超家族域描述于例如，Radauer,BMC Evol.Biol.8:286(2008)。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽包含SEQ ID NO:1-89中的任一个。在一些实施方案中，野生型PYR/PYL受体多肽与SEQ ID No:1-89中的任一个基本相同(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)。
突变的PYR/PYL受体多肽是来自(即当相比于)天然存在的(即野生型)PYR/PYL受体多肽的变体。变体可以包括例如保留活性的融合蛋白、缺失、插入或突变。在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或89中的任一个基本相同(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)，并相对于相应的野生型PYR/PYL受体多肽包含1、2、3、4、5、6或更多个如本文所述的突变。此外，在一些实施方案中，突变的PYR/PYL受体多肽还包含具有异源氨基酸序列的氨基和/或羧基末端融合物。
在希望将一个或多个本文所描述的突变插入上述序列的另外变体或直系同源物的情况下，其可被用于产生序列比对来识别保守氨基酸或基序(即其中序列中的改变可以改变蛋白质功能)和在序列比对中发生变异的区域(即其中序列的变化不太可能显著影响蛋白活性)。用于识别PYR/PYL多肽的一些有用的共有序列包括例如，EXLXXXDXXXXXXXXXXXGGXHXL(SEQ ID NO:90)、CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:91)、GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQ ID NO:92)和/或GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:93)。另外，更具体的共有序列可通过比对拟南芥PYR/PYL蛋白的14个成员的子集来表示，但据信这些共有序列是更广泛地适用于其它植物直系同源序列。这种共有序列的实例包括例如：
PYR1至PYL12
CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:94)
GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQ ID NO:95)
GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:93)
ESxxVDxPxGxxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:96)
PYL1-12共有序列
CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxKxFxxxC(SEQ ID NO:97)
GxxRxVxxxSxLPAxxSxExLxxxD(SEQ ID NO:98)
GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:93)
ESxxVDxPxGNxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:99)
PYL1-6共有序列
HxxxxxxxxCxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxYKxFxxxC(SEQ ID NO:100)
VGxxRxVxVxSGLPAxxSxExLxxxDxxxxxxxFxxxGGxHRLxNYxSVT(SEQ ID NO:101)
VxESYxVDxPxGNxxxxTxxFxDxxxxxNLQxL(SEQ ID NO:102)
PYL7-10共有序列
HxHxxxxxQCxSxLVKxIxAPxHxVWSxVRRFDxPQKYKPFxSRCxVxGx(SEQ ID NO:103)
ExGxxREVxxKSGLPATxSTExLExLDDxEHILxIxIxGGDHRLKNYSSxxxxHxExIxGx(SEQ ID NO:104)
xGTxxxESFVVDVPxGNTKxxTCxFVExLIxCNLxSLAxxxERL(SEQ ID NO:105)
PYL11-13共有序列
CxSxxVxTIxAPLxLVWSILRxFDxPxxxxxFVKxCxxxSGxGG(SEQ ID NO:106)
GSVRxVTxVSxxPAxFSxERLxELDDESHVMxxSIIGGxHRLVNYxSKT(SEQ ID NO:107)
KKTVVVESYVVDVPEGxxEExTxxFxDxIxxxNLxSLAKL(SEQ ID NO:108)。
因此，在一些实施方案中，本文所描述的突变的PYR/PYL多肽包含一条或多条上述共有序列或其保守变体，尽管有至少一种或多种的本文所指出的对于同源化学反应性的氨基酸变化。
本发明人发现了许多影响对化学物质的应答的突变。在变得响应本文所述的非ABA化学物质的过程中，所述的突变的PYR/PYL多肽可以受到触发本文，产生ABA样诱导应答，所述应答类似于在接触外源ABA的野生型植物中观察到的应答。例如，表达本文所述的突变的PYR/PYL多肽并与适当的化学物质(敌草腈、苯并噻二唑、解草酮、咯菌腈和双炔酰菌胺)接触的植物，将表现出改善的胁迫(例如冷、热、盐度、干旱或其他应力)耐受性、提高的芽休眠、提高的种子休眠(受抑制的种子萌发)和/或成熟、叶和果实的脱落。
关于双炔酰菌胺，发明人已经发现了可以被引入到PYR/PYL蛋白以赋予对双炔酰菌胺的体外和体内反应性的一系列突变。已经发现，对应于SEQ ID NO:1中K59R的突变和A89W、F108L、F108S、F108C、F108Q、F108I、F108T、F108N、F108V、F108A、F108E、F108G、S122G、F159L、F159I、F159C、F159T、F159V、F159A、F159M中的任一个的组合导致PYR/PYL多肽对于双炔酰菌胺的反应性。K59突变破坏了修饰的PYR/PYL受体蛋白的ABA反应性。尽管实施例使用了对应于K59R的突变，但基于其它K59突变的先前结果(例如在美国专利公开号2011/0271408中所述)，据信，任何K59X(其中X是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸)可用于本文针对双炔酰菌胺(以及本文描述的其他化学物质)所描述的突变组合。还已发现，下面更详细描述的额外突变进一步提高了响应双炔酰菌胺的灵敏度。因此，在一些情况下，修饰后的PYR/PYL受体蛋白质含有两个、三个、四个、五个、六个或更多个突变，以使蛋白被化学激动剂激动。
同样，还提供了对于其他化学物质(例如敌草腈、苯并噻二唑、咯菌腈和解草酮)激动的突变的PYR/PYL多肽。
本文描述的任何突变可以在SEQ ID NO:1-89中任一个的多肽中形成，或者在与SEQ ID NO:1-89中任一个基本相同的多肽中形成。可替代地，任何上述突变可以在包含如本文所述的识别PYR/PYL蛋白的共有序列的任一个的多肽中形成。
实施方案在方法和组合物(例如表达盒、植物等)中提供上述多肽和/或编码这种多肽的核酸序列的用途。编码植物野生型PYR/PYL受体(例如来自其中PYR/PYL序列尚未被鉴定的植物)的多核苷酸序列的分离可通过许多技术来实现。例如，基于此处公开的PYR/PYL编码序列(例如在序列表中列出)的寡核苷酸探针可以用来鉴别在cDNA或基因组DNA文库中所需的野生型PYR/PYL基因。为了构建基因组文库，基因组DNA的大片段通过随机片段化，例如用限制性内切酶生成，并与载体DNA连接以形成可被包装到适当载体的连环体。为了制备cDNA文库，从期望的组织如来自特定植物物种的叶中分离mRNA，并且由mRNA制备含有目的基因转录物的cDNA文库。可替代地，cDNA可以由提取自表达PYR/PYL基因的其他组织的mRNA制备。
该cDNA或基因组文库随后可以使用基于此处公开的PYR/PYL基因的序列的探针进行筛选。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以在相同或不同的植物物种中分离同源基因。作为选择，针对多肽产生的抗体可用于筛选mRNA表达文库。
或者，编码PYR/PYL的核酸可使用扩增技术由核酸样品扩增。例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用于直接从基因组DNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库扩增PYR/PYL的编码序列。PCR和其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达的PYR/PYL的多核苷酸序列，以使核酸作为探针用于检测样品中所需mRNA的存在，以用于核酸测序或用于其他目的。对于PCR的概述见PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR规程：方法和应用指南)，Innis,M.,Gelfand,D.,Sninsky,J.and White,T.,eds.(编辑),Academic Press,San Diego(1990)。用于从植物组织识别序列的合适的引物和探针通过本文提供的序列与其它相关基因的比较产生。
在一些实施例中，许多植物的部分或整个基因组已被测序，并被开放阅读框识别。通过BLAST搜索，可以识别各种植物中野生型PYR/PYL的编码序列。
III、化学激动剂和激动剂制剂
本发明的实施方案提供了配制用于接触突变的PYR/PYL受体多肽的农用化学制剂和/或包含突变的PYR/PYL受体多肽的植物，其中该制剂包含本发明的突变的PYR/PYL多肽的激动剂。农用化学制品通常以酯或盐制备并施用于植物，其可以改善摄取和功效。普遍存在的细胞酯酶的作用可以将酯(或同源化合物，如阿拉酸式苯(acibenzolar)的S-甲基衍生物)转换成生物活性形式的游离酸或醇。
双炔酰菌胺
已发现，使对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸突变，以及在PYR/PYL受体多肽中引入选自A89W、F108L、F108S、F108C、F108Q、F108I、F108T、F108N、F108V、F108A、F108E、F108G、S122G、F159L、F159I、F159C、F159T、F159V、F159A和F159M中的至少一个或多个氨基酸突变(对应于SEQ ID NO:1的指定位置)，导致所述修饰的受体被双炔酰菌胺激活。导致修饰的PYR/PYL受体被双炔酰菌胺激动的突变的示例性组合的非限制性列表包括：
在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含上述突变的组合之一，并与SEQ ID NO:1-89中的任一个基本相同。在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，或表达这种多肽的植物。
敌草腈
已发现，使对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸突变，以及在PYR/PYL受体多肽中引入选自V83L、L87P、E94D、F108E、I110M、H115N、E141F、E141L、E141Y、E141H、E141Q、M158L、M158S、M158C、M158I、M158T、M158V、M158A、M158G、F159L、F159I、F159V、A160C、A160S、A160Y、A160I、A160T、A160N、A160V、T162L、T162Y、T162W、T162K、V164F、V164L、V164S、V164Y、V164C、V164H、V164Q、V164T、V164T、V164N、V164K、V164A、V164E、V164G、V164M、N167S、N167C、N167Q、N167T、N167A、N167D、N167G、V81I、V83L、A89C、L117C、E141Y、E141K、F159T、F159C、F159A、F159M和A160G中的至少一个或多个氨基酸突变(对应于SEQ ID NO:1的指定位置)，导致所述修饰的受体被敌草腈激活。导致修饰的PYR/PYL受体被敌草腈激动的突变的示例性组合的非限制性列表包括：
在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含上述突变的组合之一，并与SEQ ID NOS:1-89中的任一个基本相同。在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，或表达这种多肽的植物。
苯并噻二唑
已发现，使对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸突变，以及在PYR/PYL受体多肽中引入选自V81I、V83L、A89C、L117C、E141Y、E141K、M158I、M158T、M158C、M158V、F159L、F159T、F159C、F159I、F159V、F159A、F159M、A160G、T162Y、T162W、T162K、V164Y和V164K的至少一个或多个氨基酸突变(对应于SEQ ID NO:1的指定位置)，导致苯并噻二唑激活修饰的受体。导致修饰的PYR/PYL受体被苯并噻二唑激动的突变(在底部的三个突变体对于苯并噻二唑具有进一步增加的灵敏度)的示例性组合的非限制性列表包括：
在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含上述突变的组合之一，并与SEQ ID NOS:1-89中的任一个基本相同。在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，或表达这种多肽的植物。
解草嗪
已发现，使对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸突变，以及在PYR/PYL受体多肽中引入选自L87F、A89I、A89W、S92I、S92W、M158C、M158V、M158T、F159V和T162W中的至少一个或多个氨基酸突变(对应于SEQ ID NO:1的指定位置)，导致所述修饰的受体被解草嗪激活。导致修饰的PYR/PYL受体被解草嗪激动的突变(在底部的三个突变体对于解草嗪具有进一步增加的灵敏度)的示例性组合的非限制性列表包括：
在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含上述突变的组合之一，并与SEQ ID NOS:1-89中的任一个基本相同。在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，或表达这种多肽的植物。
咯菌腈
已发现，使对应于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸突变，以及在PYR/PYL受体多肽中引入选自V81Y、V81I、V83L、L87F、L87P、S92F、E94A、E94S、E94D、F108L、Y120F、Y120A、Y120G、Y120M、E141Y、M158C、M158V、M158I、M158T、F159T、F159V、F159A、A160C、T162W、V164K、N167C、N167H和N167V中的至少一个或多个氨基酸突变(对应于SEQ ID NO:1的指定位置)，导致所述修饰的受体被咯菌腈激活。导致修饰的PYR/PYL受体被咯菌腈激动的突变(在底部的三个突变体对于咯菌腈具有进一步增加的灵敏度)的示例性组合的非限制性列表包括：
在一些实施方案中，修饰的PYR/PYL受体蛋白包含上述突变的组合之一，并与SEQ ID NOS:1-89中的任一个基本相同。在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种所述修饰的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸，或表达这种多肽的植物。
化学激动剂可通过本领域技术人员已知的各种方法制备，例如，所述方法描述于Comprehensive Organic Transformations,2nd ed.(综合有机转化，第二版)，Richard C.Larock,1999。对于上述方法的起始原料是市售可得的(Sigma-Aldrich),或可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
在一些实施方案中，配制预期的农用化学制剂用于接触植物。按照本发明，例如在载体中，该制剂可以适用于处理植物或植物繁殖材料,如种子。合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、包衣剂、多糖和研磨剂。示例性载体包括水、水溶液、浆液、固体和干粉剂(例如泥炭、小麦、麦麸、蛭石、粘土、巴氏杀菌的土壤、许多形式的碳酸钙、白云石、各种等级的石膏、膨润土和其他粘土矿物、岩磷酸盐和其他含磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石、藻酸盐和活性炭)。本领域技术人员已知的任何农业上适用的载体都是可接受的，并预期用于本发明。任选地，该制剂还可以包括至少一种表面活性剂、除草剂、杀真菌剂、农药或肥料。
使农用化学品制剂与突变的PYR/PYL受体多肽接触可以在体外(例如，其中所述突变的PYR/PYL受体多肽以纯化形式存在或在酵母细胞中表达)或体内(例如，其中突变的PYR/PYL受体多肽由植物表达)进行。使农用化学品制剂与突变的PYR/PYL受体多肽在体外接触可以使用各种已知的方法来进行，例如将制剂应用于蛋白质结合测定法、哺乳动物或酵母双杂交测定法、竞争测定法或使用其他生物体的基于细胞的测定法。
使农用化学品制剂与突变的PYR/PYL受体多肽在体内接触(例如对于植物)可以使用各种已知的方法进行，例如通过繁殖材料喷雾、雾化、撒粉或散射组合物，或通过植物刷涂或浇注或以其他方式接触组合物，或在种子的情况下，通过涂布、包封或以其他方式处理的种子。对于种植前直接处理植物或种子的替代方案，也可以将本发明的制剂引入到土壤中或将植入种子的其他介质中。在一些实施方案中，载体也用于本实施方案。载体可以是固体或液体，如上所述。在一些实施方案中，泥炭悬浮在水中作为化学激动剂的载体，并将该混合物喷入土壤或种植介质和/或种植时的种子上。
IV、制备突变的PYR/PYL受体多肽的方法
本发明的实施方案提供了制备被不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学激动剂激动的突变的PYR/PYL受体多肽的方法。在一些实施方案中，该方法包括诱变野生型PYR/PYL受体多肽，使一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽与推定的化学激动剂接触，以及确定该化学品是否激活一种或多种突变的PYR/PYL受体多肽，其中，激活确定一个或多个突变的PYR/PYL受体多肽被该化学品激动。
突变的PYR/PYL受体多肽可通过如使用通常被称为定点诱变的技术，使编码相应的野生型PYR/PYL受体多肽(例如，SEQ ID NO:1-89中任一个的野生型PYR/PYL多肽，或衍生本发明的突变体PYR/PYL受体多肽的相应变体)的DNA序列突变来构建。编码野生型PYR/PYL受体多肽的核酸分子可以通过本领域普通技术人员公知的多种聚合酶链式反应(PCR)技术来进行突变。(参见例如PCR Strategies(PCR策略)(M.A.Innis,D.H.Gelfand,and J.J.Sninsky eds.,1995,Academic Press,San Diego,CA)at Chapter 14(第14章)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR规程：方法和应用指南)(M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,and T.J.White eds.,Academic Press,NY,1990)。
通过非限制性示例的方式，诱变可以通过易错PCR扩增(EPCR)的方式完成，其改良了PCR反应条件(例如，使用易错聚合酶，改变镁或锰的浓度，或提供不平衡的dNTP比值)以促进DNA复制中错误率增加。用于ePCR诱变的试剂盒可商购获得，如诱变试剂盒(Stratagene)和随机诱变试剂盒(Clontech)。简言之，将不平衡比例的DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、盐(例如MgCl2、MgSO4或MnSO4)、dNTPs，反应缓冲液和DNA模板混合并根据制造商的说明进行标准的PCR扩增。ePCR扩增后，将反应产物克隆到合适的载体中构建诱变文库，其然后可被转化到合适的细胞(例如酵母细胞)中，用于后续的筛选(例如通过双杂交筛选)，如下所述。
可替代地，诱变可以通过重组来完成。简言之，突变文库通过使用体外同源重组，由母体DNA随机片段化，随后使用PCR重组生成，产生随机引入点突变。执行基于DNA重组的诱变的方法是本领域已知的(参见例如，Stebel,S.C.et al.,Methods Mol Biol 352:167-190(2007))。
任选地，可以进行多轮诱变以提高突变蛋白质分离的效率。因此，在一些实施方案中，PYR/PYL突变体从ePCR分离，随后的筛选可合并并用作后轮诱变的模板。
V、筛选突变的PYR/PYL受体多肽的激动
本发明的实施方案还提供筛选推定的化学激动剂以确定当推定的激动剂接触到PYR/PYL受体多肽时，推定的激动剂是否激动突变的PYR/PYL受体多肽，但不显著激动野生型PYR/PYL受体多肽的方法。如本文中所使用的，如果试剂的存在导致受体活性的激活或上调，例如增加PYR/PYL受体的下游信号传导，则试剂“激动”PYR/PYL受体蛋白。对于本发明，如果当试剂以不超过200μM的浓度存在，使试剂接触PYR/PYL受体导致PYR/PYL受体活性的激活或上调，则试剂激动PYR/PYL受体。如果如果当试剂以不超过200μM的浓度存在时，试剂不引起PYR/PYL受体蛋白活性的激活或上调，则该试剂不显著激动PYR/PYL受体。如本文所用，“激活”需要由试剂引入的活性的最小阈值。确定此活性的最小阈值是否已经得到满足可以例如通过使用设置了必须被引入的酶活性水平的最小值的酶磷酸酶测定法，或在比色检测试剂(例如对硝基苯基磷酸酯)存在下通过使用酶促磷酸酶测定法实现，其中如果观察到颜色变化，则活性最小阈值已经得到满足。
可用许多不同的筛选方案识别激动突变的PYR/PYL受体多肽但不激动野生型PYR/PYL受体多肽的化学试剂。筛选可使用分离的、纯化的或部分纯化的试剂进行。在一些实施方案中，可以使用纯化的或部分纯化的PYR/PYL多肽。
可替代地，可以使用基于细胞的或基于植物的筛选方法。例如，可以使用天然表达野生型PYR/PYL受体多肽的细胞或重组表达野生型或突变的PYR/PYL受体多肽的细胞。在一些实施方案中，所用的细胞是植物细胞、动物细胞、细菌细胞、真菌细胞，包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。一般来说，筛选方法涉及筛选一种或多种化学试剂以鉴定激动突变的PYR/PYL受体多肽活性(例如，激活突变的PYR/PYL受体多肽或增加突变的PYR/PYL受体多肽的表达或编码突变的PYR/PYL受体多肽的转录物的表达)但不激动野生型PYR/PYL受体多肽活性的试剂。任选地，该筛选方法可以包括两个筛选过程：首先，筛选多个推定的激动剂，以确定与野生型PYR/PYL受体多肽(“弱配体”)弱相互作用的化合物，然后筛选那些针对野生型PYR/PYL受体多肽和多个诱变的PYR/PYL受体多肽的弱配体，以确定哪些突变的PYR/PYL受体多肽被弱配体激动和哪些弱配体仅选择性激动突变的PYR/PYL受体多肽而非野生型PYR/PYL受体多肽。
结合测定(Binding assays)
任选地，初步筛选可以通过筛选能够结合野生型PYR/PRL受体多肽的试剂来进行。弱结合配体的预选提高了分离被试剂激动的突变的PYR/PRL受体多肽的频率，这大概是因为实现分子识别需要配体结合位点的较少改变。
结合测定可包括使野生型PYR/PYL受体多肽与一种或多种化学试剂接触，并允许足够时间以便蛋白质和化学试剂形成结合复合物。可以使用许多已建立的分析技术中的任一个来检测所形成的结合复合体。蛋白质结合测定包括但不限于，测量非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的共沉淀或共迁移的方法，以及对蛋白质印迹上的共迁移(参见例如Bennet,J.P.and Yamamura,H.I.(1985)"Neurotransmitter,Hormone or Drug Receptor Binding Methods(神经递质、激素或药物受体结合方法)",in Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura,H.I.,et al.,eds.),pp.61-89)。其它结合测定包括使用质谱法或NMR技术，以确定结合到PYR/PYL多肽的分子或标记的底物(例如标记的农用化学品)的位移。在此类测定法中使用的PYR/PYL多肽蛋白可被天然表达、克隆或合成。
激动剂测定(Agonist assays)
激动剂测定可包括筛选推定的化学激动剂(其可能已被预先选择作为弱结合配体，或可能未被预先选择作为弱结合配体)，以确定哪些推定的激动剂激动至少一个突变的PYR/PYL受体多肽，但不激动野生型PYR/PYL受体多肽，和/或用推定的化学激动剂(其可能已被预先选择作为弱结合配体，或可能未被预先选择作为弱结合配体)筛选诱变的PYR/PYL受体多肽，以确定哪些诱变的PYR/PYL受体多肽通过推定的激动剂激动。
许多测定法可用于筛选突变的PYR/PYL受体多肽的激动剂。一种活性测定涉及测试推定的激动剂能否以激动剂特异性方式诱导突变的PYR/PYL蛋白与2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽结合。哺乳动物或酵母双杂交方法(参见例如Bartel,P.L.et.al.Methods Enzymol,254:241(1995))可用于鉴定在细胞中一起表达时相互作用或结合的多肽或其它分子。在一些实施方案中，激动突变的PYR/PYL受体多肽但不激动野生型PYR/PYL受体多肽的试剂，在PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽之间的双杂交测定法中鉴定，其中激动剂被鉴定为激活或允许PYR/PYL多肽和PP2C多肽结合的试剂。因此，这两个多肽在试剂存在而非不存在下结合。任选地，可以在双杂交测定中应用正向和负向选择方案。例如，酵母双杂交测定可应用URA3报告菌株进行正向和负向选择；在没有外源性提供的尿嘧啶情况下URA菌株的增长允许针对提高激动剂反应性(即激动剂促进的蛋白-蛋白相互作用)的突变体进行阳性选择，而FOA(5-氟-乳清酸，由URA3代谢为有毒的代谢产物)的增长允许针对促进激动剂应答的突变体进行选择(例如删除导致组成的即未配体的(unliganded)相互作用的突变体)。
还提供了对于增加突变的PYR/PYL受体多肽表达而非野生型PYR/PYL受体多肽表达的化合物进行筛选。筛选方法通常包括进行基于细胞或基于植物的测定，其中使测试化合物与一种或多种表达PYR/PYL多肽的细胞接触，然后检测PYR/PYL表达(转录物或翻译产物)的增加。测定可以用天然表达野生型PYR/PYL的细胞进行或在重组改造以表达突变的或野生型PYR/PYL的细胞中进行。可以进行各种控制以确保观察到的活性是可信的，包括用缺少报道构建(reporter construct)的细胞或通过不使携带报道构建的细胞与所述测试化合物接触，来运行平行反应。
可以进一步测试由任何前述筛选方法最初鉴定的试剂和突变的PYR/PYL受体多肽，以验证表观活性和/或确定所述试剂和/或突变的PYR/PYL受体多肽的其他生物学效应。在一些情况下，测试鉴定的试剂和/或突变的PYR/PYL受体多肽影响植物胁迫(例如，干旱耐受性)、种子萌发或受ABA影响另一种表型的能力。许多这样的测定和表型是本领域已知的，并且可以根据本发明的方法进行采用。
VI、重组表达载体
一旦获得编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列，它也可以用于制备用于在转基因植物中通过异源启动子指导表达突变的PYR/PYL受体多肽的表达盒。突变的PYR/PYL多核苷酸表达增加可用于例如产生将能够响应不激动内源PYR/PYL受体蛋白的化学激动剂的植物，从而提高非生物胁迫抗性。
可以使用本领域中公知的许多方法中的任一个来驱动植物中突变的PYR/PYL的活性或表达。任何器官都可以被靶向，例如枝营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实。可选地，突变的PYR/PYL多核苷酸可被组成性地表达(例如，使用CaMV 35S启动子)。
为了在上述技术中使用突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸序列，制备适于转化植物细胞的重组DNA载体。用于转化多种高等植物物种的技术是公知的，并描述于科技文献中。参见例如Weising et al.Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。优选将编码突变的PYR/PYL受体多肽的DNA序列与指导基因的序列在转基因植物的目标组织中的转录的转录起始调节序列和翻译起始调节序列相组合。
例如，可以采用植物启动子片段来指导突变的PYR/PYL多核苷酸在再生植物的所有组织中表达。这样的启动子在本文中称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下活跃。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，衍生自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1'-或2'-启动子，和来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。
可替换地，植物启动子可以指导突变的PYR/PYL受体蛋白在特定组织(组织特异性启动子)中表达，或者可以另外处于更精确的环境控制(诱导型启动子)下。发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在某些组织例如叶或保卫细胞中启动转录的启动子(包括但不限于描述于下列文献的内容：WO/2005/085449；U.S.Patent No.6,653,535；Li et al.,Sci China C Life Sci.2005Apr；48(2):181-6；Husebye,et al.,Plant Physiol,April 2002,Vol.128,pp.1180-1188；and Plesch,et al.,Gene,Volume 249,Number 1,16May 2000,pp.83-89(7))。可能通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度或光的存在。
如果期望适当的蛋白表达，应当包括在编码区3'-端的聚腺苷酸化区。该聚腺苷酸化区可以源自天然存在的PYR/PYL基因，源自多种其他植物基因，或源自T-DNA。
包含序列(例如启动子或PYR/PYL编码区)的载体通常会包括赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。例如，标记可以编码杀生物剂抗性，特别是抗生素抗性如对于卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或除草剂抗性如对于chlorosluforon或Basta的抗性。
在一些实施方案中，在植物细胞中重组表达突变的PYR/PYL核酸序列。可制备各种不同的表达构建体，如适于转化植物细胞的表达盒和载体。用于转化多种高等植物的技术是公知的，并描述于科技文献中。参见例如，Weising et al.Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。编码PYR/PYL蛋白的DNA序列可以与顺式作用(启动子)和反式作用(增强子)转录调节序列组合，以在转化的植物的目标组织中指示转录的时机、组织类型和水平。也可使用翻译控制元件。
本发明的实施方案还提供了可操作地连接到启动子的突变的PYR/PYL核酸，在一些实施方案中，该启动子能够驱动植物中PYR/PYL编码序列的转录。所述启动子可以例如源自植物或病毒。所述启动子可以是例如组成型活性的、诱导型的或组织特异性的。在本发明的重组表达盒、载体、转基因的构建中，可以选择并采用不同的启动子以区别指导例如在植物或动物的一些或全部组织中的基因表达。
组成型启动子
可以使用启动子片段以指导突变的PYR/PYL核酸在所有例如再生植物的转化细胞或组织中表达。术语“组成型调节元件(constitutive regulatory element)”是赋予可操作连接的核酸分子某种表达水平的调节元件，所述核酸分子相对独立于表达所述组成型调节元件的细胞或组织类型。在植物中被表达的组成型调节元件通常在大量细胞和组织类型中广泛表达。在生理条件下连续驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下活跃。
用于在转基因植物中异位表达的各种组成型调控元件是公知的现有技术。例如，花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子，是在所有植物组织中产生高表达水平的充分表征的组成型调节元件(Odell et al.,Nature313:810-812(1985))。由于其在许多不同植物物种中的活性，CaMV 35S启动子可能特别有用(Benfey and Chua,Science 250:959-966(1990)；Futterer et al.,Physiol.Plant 79:154(1990)；Odell et al.,supra,1985)。其中固有的启动子元件已被复制的串联35S启动子相比于未修饰的35S启动子赋予更高的表达水平(Kay et al.,Science 236:1299(1987))。其他有用的组成型调节元件包括例如，花椰菜花叶病毒19S启动子；玄参花叶病毒启动子；和胭脂碱合酶(NOS)基因启动子(Singer et al.,Plant Mol.Biol.14:433(1990)；An,Plant Physiol.81:86(1986))。
附加的其他组成型调节元件，包括在单子叶植物中有效表达的那些也是本领域已知的，例如pEmu启动子和基于水稻肌动蛋白15'区域的启动子(Last et al.,Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；Mcelroy et al.,Mol.Gen.Genet.231:150(1991)；Mcelroy et al.,Plant Cell 2:163(1990))。结合来自不同基因的元件的嵌合调控元件也可用于异位表达编码突变的PYR/PYL受体蛋白的核酸分子(Comai et al.,Plant Mol.Biol.15:373(1990))。
组成型启动子的其他实例包括源自根癌农杆菌的T-DNA的1'-或2'-启动子(参见例如Mengiste(1997)supra；O'Grady(1995)Plant Mol.Biol.29:99-108)；肌动蛋白启动子，如拟南芥肌动蛋白基因启动子(参见例如Huang(1997)Plant Mol.Biol.199733:125-139)；乙醇脱氢酶(ADH)基因启动子(参见例如Millar(1996)Plant Mol.Biol.31:897-904)；来自拟南芥的ACT11(Huang et al.Plant Mol.Biol.33:125-139(1996))，来自拟南芥的Cat3(GenBank No.U43147,Zhong et al.,Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996))，编码来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No.X74782,Solocombe et al.Plant Physiol.104:1167-1176(1994))，来自玉米的GPc1(GenBank No.X15596,Martinez et al.J.Mol.Biol 208:551-565(1989))，来自玉米的Gpc2(GenBank No.U45855,Manjunath et al.,Plant Mol.Biol.33:97-112(1997))，来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。又见Holtorf Plant Mol.Biol.29:637-646(1995)。
诱导型启动子
作为选择，植物启动子可在改变环境条件或发育条件的影响下指导突变的PYR/PYL多核苷酸的表达。可由诱导型启动子实现转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度、干旱或存在光。这样的启动子在本文中称为“诱导型”启动子。例如，本发明可以并入干旱特异性启动子，如玉米的干旱诱导型启动子(例如，玉米rab17干旱诱导型启动子(Vilardell et al.(1991)Plant Mol.Biol.17:985-993；Vilardell et al.(1994)Plant Mol.Biol.24:561-569))；或者作为选择的来自马铃薯的寒冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch(1997)Plant Mol.Biol.33:897-909)。
作为选择，基于暴露于植物激素如植物生长素所诱导的植物启动子用于表达突变的PYR/PYL多核苷酸。例如，本发明可以使用大豆(Glycine max L.)中的植物生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)Plant Physiol.115:397-407)；对植物生长素应答的拟南芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢应答)(Chen(1996)Plant J.10:955-966)；来自烟草的植物生长素诱导的parC启动子(Sakai(1996)Plant Cell Physiol.37:906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10:933-937)；以及对应激激素脱落酸应答的启动子(Sheen(1996)Science 274:1900-1902)。
基于暴露于可施用于植物的化学试剂如除草剂或抗生素可诱导的植物启动子也可用于表达突变的PYR/PYL多核苷酸。例如，可以使用由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38:568-577)；不同除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和茎端分生组织中的表达。PYR/PYL编码序列也可以受例如四环素诱导型启动子的控制下，例如如含有燕麦(Avena sativa L.)(燕麦(oat))精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物(Masgrau(1997)Plant J.11:465-473)；或者水杨酸应答元件(Stange(1997)Plant J.11:1315-1324；Uknes et al.,Plant Cell 5:159-169(1993)；Bi et al.,Plant J.8:235-245(1995))所描述的。
有用的诱导型调控元件的实例包括铜诱导型调节元件(Mett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4567-4571(1993)；Furst et al.,Cell 55:705-717(1988))；四环素和氯-四环素诱导型调节元件(Gatz et al.,Plant J.2:397-404(1992)； et al.,Mol.Gen.Genet.243:32-38(1994)；Gatz,Meth.Cell Biol.50:411-424(1995))；蜕皮激素诱导型调节元件(Christopherson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318(1992)；Kreutzweiser et al.,Ecotoxicol.Environ.Safety 28:14-24(1994))；热休克诱导型调节元件(Takahashi et al.,Plant Physiol.99:383-390(1992)；Yabe et al.,Plant Cell Physiol.35:1207-1219(1994)；Ueda et al.,Mol.Gen.Genet.250:533-539(1996))；和乳糖(lac)操纵子元件，其与组成性表达的lac阻遏物组合使用以赋予例如IPTG诱导型表达(Wilde et al.,EMBO J.11:1251-1259(1992))。可用于本发明转基因植物的诱导型调控元件也可以是例如，源自菠菜亚硝酸还原酶基因的硝酸盐诱导型启动子(Back et al.,Plant Mol.Biol.17:9(1991))或光诱导型启动子，如与RuBP羧化酶或LHCP基因家族的小亚基相关的启动子(Feinbaum et al.,Mol.Gen.Genet.226:449(1991)；Lam and Chua,Science 248:471(1990))。
组织特异性启动子
作为选择，植物启动子可以指导突变的PYR/PYL多核苷酸在特定组织(组织特异性启动子)中表达。组织特异性启动子是在植物发育过程中的特定时间的特定细胞或组织中，如在营养组织或生殖组织中为唯一活性的转录控制元件。
受发育控制的组织特异性启动子的实例包括仅(或仅主要)在特定组织如营养组织，例如根或叶，或生殖组织，如果实、胚珠、种子、花粉、手枪(pistol)、花，或任何胚胎组织，或表皮或叶肉中启动转录的启动子。生殖组织特异性启动子可以是例如胚珠特异性的、胚芽特异性的、胚乳特异性的、珠被特异性的、种子和种皮特异性的、花粉特异性的、花瓣特异性的、萼片特异性的或它们的一些组合。在一些实施方案中，启动子是细胞类型特异性的，例如保卫细胞特异性的。
其他组织特异性启动子包括种子启动子。合适的种子特异性启动子源自于下列基因：来自玉米的MAC1(Sheridan(1996)Genetics142:1009-1020)；来自玉米的Cat3(基因库编号L05934,Abler(1993)Plant Mol.Biol.22:10131-1038)；来自拟南芥的vivparous-1(基因库编号U93215)；来自拟南芥的atmyc1(Urao(1996)Plant Mol.Biol.32:571-57；Conceicao(1994)Plant 5:493-505)；来自甘蓝型油菜的napA(基因库编号J02798，Josefsson(1987)JBC 26:12196-1301)；和来自甘蓝型油菜的油菜籽蛋白基因家族(Sjodahl(1995)Planta 197:264-271)。
也可以使用在营养组织如叶、茎、根和块茎中特别活跃的各种启动子来表达编码突变的PYR/PYL受体多肽的多核苷酸。例如，可以使用控制马铃薯糖蛋白的启动子，铃薯糖蛋白是马铃薯块茎的主要贮藏蛋白，参见例如，Kim(1994)Plant Mol.Biol.26:603-615；Martin(1997)Plant J.11:53-62。也可以使用来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的在根部中表现出高活性的ORF13启动子(Hansen(1997)Mol.Gen.Genet.254:337-343)。其他有用的营养组织特异性启动子包括：编码来自芋(major taro)(Colocasia esculenta(L.)Schott)球茎蛋白家族的球蛋白的基因的塔林(tarin)启动子，塔林(Bezerra(1995)Plant Mol.Biol.28:137-144)；在芋球茎发育过程中活跃的仙茅蛋白(curculin)启动子(de Castro(1992)Plant Cell 4:1549-1559)和用于烟草根特异性基因TobRB7的启动子，其表达定位于根分生组织和未成熟中心圆柱区(central cylinder region)(Yamamoto(1991)Plant Cell 3:371-382)。
可以使用叶特异性启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子。例如，番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因在叶和光生长的苗中表达，仅RBCS1和RBCS2在发育的番茄果实中表达(Meier(1997)FEBS Lett.415:91-95)。可以使用由Matsuoka(1994)Plant J.6:311-319描述的几乎只在叶片和叶鞘的叶肉细胞中高水平表达的核酮糖二磷酸羧化酶启动子。另一个叶特异性启动子是光收获叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，参见例如Shiina(1997)Plant Physiol.115:477-483；Casal(1998)Plant Physiol.116:1533-1538。由Li(1996)FEBS Lett.379:117-121描述的拟南芥myb-相关的基因启动子(Atmyb5)是叶特异性的。该Atmyb5启动子在幼莲座(young rosette)和茎生叶的边缘上发育的叶毛状体、托叶和表皮细胞中表达，并在未成熟的种子中表达。Atmyb5 mRNA在受精和胚胎发育的16细胞期之间出现，并持续超过心形期。还可以使用由Busk(1997)Plant J.11:1285-1295在玉米中识别的启动子。
另一类有用的营养组织特异性启动子是分生组织(根尖和茎尖)启动子。例如，可以使用由Di Laurenzio(1996)Cell 86:423-433；和Long(1996)Nature 379:66-69描述的在发育的枝条或根端分生组织中为活性的“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”启动子。另一种有用的启动子是控制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因表达的启动子，其表达仅限于分生组织和花(分泌的柱头区、成熟花粉粒、雌蕊脉管组织和受精胚珠)组织(参见例如Enjuto(1995)Plant Cell.7:517-527)。还有用的是来自玉米和显示分生组织特异性表达的其他物种的kn1-相关基因，参见例如Granger(1996)Plant Mol.Biol.31:373-378；Kerstetter(1994)Plant Cell 6:1877-1887；Hake(1995)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350:45-51。例如，可以使用拟南芥KNAT1启动子(参见例如Lincoln(1994)Plant Cell 6:1859-1876)。
本领域技术人员应认识到，组织特异性启动子可以驱动可操作连接的序列在不同于目标组织的组织中表达。因此，如本文中所使用的组织特异性启动子是优先在目标组织中驱动表达，但其也可能导致在其它组织中的一些表达的启动子。
在另一个实施方案中，突变的PYR/PYL多核苷酸通过转座元件表达。这允许组成型活性多肽的组成型的、但定期和偶发的表达。本发明还提供源自病毒的组织特异性启动子的用途，包括例如烟草花叶病毒次基因组启动子(Kumagai(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1679-1683)；水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)，其中仅在感染的水稻植物的韧皮部细胞中用其驱动强韧皮部特异性报告基因表达的启动子进行复制；木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子，在脉管元件、在叶肉细胞和在根尖中具有最高的活性(Verdaguer(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-1139)。
VII、转基因植物的产生
如本文详述，本发明的实施方案提供了转基因植物，其包含用于在植物中表达本文所述的突变的PYR/PYL受体蛋白的重组表达盒。在一些实施方案中，产生的转基因植物含有源自不同于该转基因植物物种的物种的多核苷酸的全部或部分序列。应当认识到，转基因植物包含引入了表达盒的植物或植物细胞，以及包含该表达盒的这种植物或植物细胞的后代，包括在染色体稳定整合了所述表达盒的后代。
包含由异源启动子驱动的PYR/PYL编码序列的重组表达载体可以通过多种常规技术引入所需植物宿主的基因组。例如，该DNA构建体可以使用诸如电穿孔和植物细胞原生质体的微注射的技术直接引入植物细胞的基因组DNA中，或该DNA构建体的技术可以使用用弹道方法如DNA粒子轰击直接引入到植物组织中。作为选择，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并引入到常规的根癌农杆菌宿主载体中。当植物细胞感染了根癌农杆菌时，根癌农杆菌宿主的毒力功能将指导构建体和邻近的标记物插入至植物细胞DNA中。尽管突变的PYR/PYL的瞬时表达包含在本发明中，本发明构建体的表达通常会来自将表达盒插入植物基因组中，例如，使得至少一些植物的后代也含有整合的表达盒。
微注射技术也可用于这一目的。这些技术是本领域众所周知的技术，并在文献中充分说明。用聚乙二醇沉淀引入DNA构建体，描述于Paszkowski et al.EMBO J.3:2717-2722(1984)。电穿孔技术描述于Fromm et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)。弹道转化技术描述于Klein et al.Nature 327:70-73(1987)。
根癌农杆菌介导的转化技术，包括解除和使用二元载体，充分描述于科学文献中。参见例如，Horsch et al.Science 233:496-498(1984)和Fraley et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。
可以培养源自上述任何一种上述转化技术的转化的植物细胞，以再生整株植物，其具有转化的基因型，并因此具有所需的表型，如增强的非生物胁迫抗性。这样的再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操纵某些植物激素，通常依赖于已与所需的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。由培养的原生质体再生植物，描述于Evans et al.,Protoplast Isolation and Culture(原生质体分离和培养),Handbook of Plant Cell Culture(植物细胞培养手册),pp.124-176,MacMillilan Publishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration of Plants“(植物、植物原生质体的结合、再生),Plant Protoplasts(植物原生质体),pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。也可以由植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这样的再生技术普遍描述于Klee et al.Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486(1987)。
本领域技术人员将认识到，表达盒在转基因植物中稳定地并入并证实是可操作的之后，其可通过有性杂交被引入到其它植物中。取决于待杂交的物种，可以使用许多标准育种技术中的任一个。
本发明的表达盒可用于对基本上任何植物赋予非生物胁迫抗性。因此，本发明可作用于宽范围内的植物，包括来自下列属的种类：天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、马郁兰属(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannesetum)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、胡芦属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)。在一些实施方案中，植物选自水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜、草坪草、苜蓿。在一些实施方案中，所述植物是观赏植物。在一些实施方案中，植物是产蔬菜或水果的植物。
本领域的技术人员应认识到，许多植物物种可用作预测在其他植物中转基因表达的表型效应的模型。例如，众所周知，烟草(烟草属(Nicotiana))和拟南芥植物都是特别在其他双子叶植物中转基因表达的有用模型。
在一些实施方案中，相比于除了突变的PYR/PYL受体多肽的表达外其他方面相同的植物，所述植物对于某些化学激动剂具有增强的敏感性。对于激动ABA受体的PYR/PYL家族的激动剂的敏感性可通过观察或测量由ABA介导的任何表型进行检测。本领域技术人员应认识到，ABA是经充分研究的植物激素且ABA介导许多特征变化，可以监测这些特征中的任一个以确定ABA敏感性是否已被调节。在一些实施方案中，调节的ABA敏感性通过改变的种子萌发时机或改变的胁迫(例如干旱)耐受性来表现。
非生物胁迫抗性可根据许多公知技术中的任一个进行检测。例如，对于干旱耐受性，可以使植物在其中少于最佳的水被提供给植物的条件下生长。抗旱性可以通过多个标准措施包括膨压、生长、产量等中的任一个来确定。
作为进一步的注释，除植物细胞以外的细胞可包含编码如本文所述的突变的PYR/PYL多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，细胞包含异源表达盒，其包含可操作连接到细胞中启动子功能的编码多核苷酸。非植物细胞可以是例如动物(例如哺乳动物)细胞、真菌细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，细胞响应本文所述的化学物质，例如在Liang et al.,Sci Signal.2011 Mar 15；4(164)中所提议的化学物质。
实施例
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
植物激素脱落酸(ABA)调节许多生理过程，并在非生物胁迫应答和水分亏缺(即干旱)耐受性中起着主要作用。ABA生物合成通过土壤含水量的降低来受到刺激，其导致升高的激素水平，并依次刺激转录丰度的大规模变化，保卫细胞封闭，增加产生保护渗透剂和许多其他生理变化(Cutler et al.,2010)。陆生植物的特定信号传导途径由受体、磷酸酶和激酶组成，其介导ABA应答(Cutler et al.,2010)。在此途径中，三个密切相关的ABA调节的SnRK2蛋白激酶的磷酸化状态依赖于环境胁迫。当被激活时，通过邻近其ATP结合位点的关键激活环上的磷酸化作用，这些激酶磷酸化下游转录因子、离子通道和参与ABA作用的最可能的其他蛋白(Weiner et al.,2010)。在理想的生长条件下，SnRK2s连续脱磷酸化并通过蛋白磷酸酶家族(进化枝A PP2Cs)灭活，这导致在没有非生物胁迫下几乎检测不到SnRK2激酶活性。ABA通过可溶性ABA受体家族(PYR/PYL蛋白)获得对于SnRK2激酶活性的控制，该受体以ABA依赖的方式抑制PP2C活性。当PP2C活性受到ABA结合的受体抑制时，SnRK2最优选凭借其通过在其激活环上的顺式-和反式-自磷酸化的自激活(autoactivate)的内在能力而变为高活性(Ng et al.,2011)。因此，ABA最终通过受体介导的PP2C活性抑制来控制SnRK2活性。
拟南芥基因组编码共享彼此序列相似性和Pyrabactin抗性1(PYR1)的13种ABA受体，PYR1为受体家族的创始成员((Park et al.,2009)。生物化学研究已显示，PYR1及其两个近亲，PYL1和PYL2，(PYR1样1和2)是在溶液中稳定的二聚体((Dupeux et al.,2011；Hao et al.,2011；Nishimura et al.,2009)。二聚体受体单独和与PP2Cs复合的X射线晶体学研究表明，这些受体的同源二聚体界面(homo-dimer interface)与结合并抑制PP2C活性的界面重叠((Melcher et al.,2009；Miyazono et al.,2009；Yin et al.,2009)。这些结构观察最初暗示了二聚体受体需要ABA介导的二聚体-破坏步骤以抑制PP2Cs和激活ABA信号(Yin et al.,2009)。事实上，实验数据已表明，ABA直接在体外使PYR1二聚体不稳定(Dupeux et al.,2011)。二聚体去稳定化的机制尚不完全清楚，但可能涉及到H60的构象变化，H60为在PYR1同源二聚体界面上的残留物，其在ABA存在下采用了不利于二聚体形成的构象(Dupeux et al.,2011)。H60邻近直接接触ABA羧酸盐的不变残留物K59，使K59突变为不同于F或N废除ABA反应性的任何残留物(US20110271408)。已经提出了配体结合后的二聚体去稳定化通过由K59-ABA触体介导的H60的构象变化受到促进(Dupeux et al.,2011)。因此，二聚体破坏是二聚体ABA受体激活的一个重要方面。
众所周知，ABA外源应用到植物减少其水的使用，提高非生物胁迫耐受性，并且可以具有其他一些有用的效果。因此有兴趣使用ABA、ABA类似物或合成ABA激动剂直接控制胁迫耐受性。例如，已经公开具有对代谢降解的改进抗性的ABA类似物(US20080200339；6004905)，这些化合物具有比ABA本身更持久的效果。还已经公开了天然的ABA可用于改善园艺物种的干旱耐受性(US2008/0227645)，以及其它多种用途。许多激活ABA受体(即激动剂)的合成化合物也已被公开。被确定的第一个合成ABA激动剂是命名为pyrabactin的萘磺酰胺(Park et al.,2009)，其有效地激活种子中的ABA信号传导，但在发生非生物胁迫耐受性的最关键方面的营养组织中具有有限的活性。已经公开了与pyrabactin高度相似的磺酰胺类作为ABA激动剂(US20130045952)和非生物胁迫调节化合物(US20110230350)；且还描述了非磺酰胺的ABA激动剂(US20130045952，US20110271408)。因此存在对于获得对ABA受体活性的化学控制和伴随的调节这类控制提供的非生物胁迫应答的能力的主动关注。
实现用合成化合物对受体的控制通常包括冗长的研发进程，其中与受体相互作用的分子通过结构-活性-研究和/或其它方法进行优化，以在其靶位点使活性和效力最大化。然后将优化的化合物进行进一步的试验，在此期间，其研发会由于大量不希望的性质包括毒性、环境持久性、差的溶解性、快速代谢和缺乏合适的摄取和/或体内流动性而失败。因此，商业农用化学制品在其靶位点有许多除了效力的重要性质。将必要特征的集合灌输到单个分子的过程在农用化学制品研发展仍是一个重大挑战。
获得对植物生理过程的化学控制的可选择路径包括修饰受体，使得其可以被现有的农用化学制品激活。利用这种系统，受体的活性可以通过在表达修饰受体的转基因植物中的农用化学制品配体来控制。这种方法具有以下内在优势，即经验证的农用化学制品可被用于选择性控制受体活性，其绕过产生在新的靶位点具有活性的农用化学制品所需要的开发周期。另一优点涉及靶生物体的选择性。在调节植物生理过程的化合物的情况下，存在在保守靶位点具有活性的化合物往往对于较宽范围的非目标植物物种具有活性的固有问题。其结果是，该化合物可以不加区别地有益于目标和非目标生物体(如竞争型杂草)，这可能是不希望的。通过在靶植物中表达修饰的受体，化合物的有益效果可以被限制于靶生物体。因此，工程改造受体以识别现有的农用化学制品配体，而不是从头发明新的农用化学制品，使得农药开发过程的许多挑战性方面将被绕过，并给予通过其他方法难以实现的目标生物体选择性的水平。
我们最近披露了可通过非天然农用化学制品配体被激活的修饰的脱落酸受体(US20110271408)。这些受体变体通过与对于被特定的农用化学制品配体激活的受体变体的功能选择相结合的受体的易错PCR-诱变被鉴定。选择实验利用将使用酵母双杂交系统结合到酿酒酵母生长的配体介导的受体-PP2C相互作用的能力(Peterson et al.,2010)。所描述的突变主要改变位于该受体的配体结合口袋的氨基酸，其建立对于农用化学制品配体的敏感性，同时消除了固有的ABA敏感性。这种所限定的配体和突变受体的特定配对，允许农用化学制品配体选择性激活突变受体，并通过使所述受体免受内源性配体的控制--因此这种系统允许ABA受体活性的正交控制。在这里，我们公开了用于创建新的正交受体系统的方法。经整个植物ABA应答的正交控制，包括强大的干旱胁迫耐受性，通过使用农药双炔酰菌胺与表达对双炔酰菌胺应答的PYR1变体的转基因植物组合得到证明。
实施例
1.发现配体激活的PYR1变体的改良方法
在我们最初公开的选择实验中意外发现我们在可以通过结构上无关的多种配体激活的受体中独立分离了K59替代突变。如
背景技术：
部分所述，K59接触ABA的羧酸并毗邻H60。由于在二聚体不稳定化作用中K59和H60的作用，K59突变可能会降低配体诱导的二聚体破坏的阈值，但它们的确切生化机制仍然是未知的。鉴于K59替代的敏化作用，我们推论，识别正交受体-配对的过程可以通过诱变已经包含K59突变的PYR1模板加以改进，。此外，在我们的选择实验中分离的大多数突变都位于配体接触的残基，这表明我们可能会通过将突变发生靶向配体接触的残基以进一步提高所述过程。也可以理解的是，由于遗传密码的结构，易错诱导的PCR突变被强烈偏向某些氨基酸取代。因此，任何易错PCR诱变极不可能在靶基因中所有可能的单氨基酸取代取样。鉴于这些考虑，我们推断接触K59突变体PYR1主链中的配体接触残基的位点饱和诱变会改善识别正交受体-配体对的过程。
位点饱和诱变涉及在目标靶残基上直接构建所有19个可能的单氨基酸取代突变。为了测试我们提出的方法，我们构建了PYR1K59R主链中25个配体接触残基处位点饱和突变体的文库。之所以选择这个特定的K59变体，是由于在我们较早的选择实验(US20110271408)中分离到了它；然而，若干其它K59突变对于提高配体敏感性是有利的(除了K59I和K59P之外的全部，如公开于US20110271408)。用其它K59突变体主链制作的位点饱和文库也应该有利于工程改造正交受体。我们将配体接触残基定义为位于内ABA或4ABA接触的水分子，如从检查公众可获得的PYR1-ABA-ABI1X-射线晶体学坐标所推导出的(这些残基的选择描述于(Mosquna et al.,2011))。在PYR1中定义的25个配体接触残基是：P55、F61、I62、V81、V83、L87、P88、A89、S92、E94、E141、F108、I110、H115、R116、L117、Y120、S122、M158、F159、A160、T162、V163、V164和N167。作为专注于工程改造构建活性ABA变体的更大工作的一部分，先前在野生型PYR1主链中，在这些位置构建了一组位点饱和突变(Mosquna et al.,2011)。在这些实验中诱变的PYR1模板是编码与PYR1的GAL4-DNA结合结构域融合物(BD)的PBD-PYR1质粒；该质粒可直接用于测定用pACT-PP2C共转化的适当的酵母菌株中的突变受体-PP2C相互作用，其表达与目标PP2的CGAL4激活结构域融合物(ACT)至。
我们使用基于PCR的诱变将K59R突变并入每个原始PYR1野生型主链突变体，以产生475PYR1K59R突变体的集合。这通过两种方法完成。使用两个突变引物(K59RB5和K59RB3)，利用反向PCR诱变在22个靶位点(除了P55、F61和I62的全部位点)中含有突变的质粒，所述突变引物位于相反方向上且直接位于K59侧翼。用多核苷酸激酶磷酸化后，将这些引物用于每个418 PBD-PYR1突变体模板的PCR扩增。三配体接触残基(P55、F61和I62)离K59太接近而不能利用此方法。为了将K59R引入到突变体的这些位点中，设计与57个剩余的突变体模板的每一个互补的单独的K59R诱变引物。这些引物然后用于反向PCR诱变，如上所述。使用上述两种方法所产生的线性PCR产物使用T4 DNA连接酶连接，用限制性酶Dpn1消化(以除去原始模板DNA)，并转化到感受态大肠杆菌(E.coli)细胞中。转化的菌落通过PCR使用K59R等位基因特异性引物筛选来鉴定已经成功地引入所述K59R突变的质粒。分离并测序K59R突变质粒以确认它们含有引入的K59R突变和原始配体位点突变两者。此诱变工作产生了一组475个PYR1K59R变体，其在25个配体接触残基包含所有可能的单氨基酸取代。
该组475个突变质粒被单独转化到用pACT-HAB1共转化的Y190酵母双杂交报告菌株中，如先前所述((Park et al.,2009)。生成的酵母菌株排列到96孔板，得到我们所说的“口袋文库(pocket library)”。口袋文库菌株被点样到含有选择性合成葡萄糖(减去亮氨酸和色氨酸)培养基的琼脂平板，该培养基补充了100μM的单一测试化合物。分别测试口袋文库菌株以下化合物的反应性：敌草腈、苯并噻二唑、双炔酰菌胺、咯菌腈和解草嗪。在30℃培育测试板2天后，使用先前描述的方法(Park et al.,2009)将菌落氯仿裂解并染色以揭示β-半乳糖苷酶的表达水平。如果存在表现出了测试化合物反应性的突变体，则通过X-gal染色进行鉴定，然后进行随后的优化工作。我们使用这种方法鉴定了赋予对测试化合物的可检测的敏感性的突变(见表1中标记为“口袋文库筛选”的条目)。
这种筛选方法在改变特定配体敏感性的配体接触残基处产生了突变体。我们推断，受体的敏感性可以通过系统地构建在第一轮筛选中确定的最佳突变变体的组合来改善。为了验证这一点，我们使用针对双炔酰菌胺、苯并噻二唑、解草酮或咯菌腈的敏感性鉴定的最强突变构造了突变体组合。选择用于组合诱变的突变以粗体列于表1中；使用快速转换闪电多定点PCR诱变试剂盒(QuickChange Lightning Multi Site-Directed PCR Mutagenesis kit)(Agilent,USA)并使用pBD-PYR1K59R模板DNA和突变引物构建突变体组合，基本上如先前所述(Mosquna et al.,2011)。将突变组合进行序列验证，引入pACT-HAB1 Y190报告菌株，然后测试对一系列化合物浓度(每种测试化合物100、50、25、10、1、0.2％、0.1或0μM)的反应性。这些工作取得了对于检查的4个化合物/受体对具有改善的敏感性的双突变受体变体(见表1中标记为“组合诱变筛选I”的条目)。
实施例2
构建改善的双炔酰菌胺受体
前述工作鉴定了PYR1K59R,F108A,S122G，其对低至1μM的双炔酰菌胺浓度应答。接下来，我们试图通过筛选提高化合物反应性的额外位于口袋的突变，以改善双炔酰菌胺受体。我们使PYR1K59R,F108A,S122G进行两个独立的诱变实验。我们首先使用NNK密码子随机引物检查在PYR1K59R,F108A,S122G主链中没有改变的另外23个配体接触残基中的每个处加入单个额外突变的影响。每个NNK引物用于产生在单配体接触残基含有另外突变的PYR1K59R,F108A,S122G受体库。制备用于此突变体库的DNA，然后转化到pACT-HAB1MAV99报告菌株，这允许基于URA3选择活性受体(Peterson et al.,2010)。将汇集的酵母细胞铺在含有0.5μM双炔酰菌胺的培养基上，这一浓度太低，而不允许表达PBD-PYR1K59R,F108A,S122G的对照MAV99pACT-HAB1报告菌株生长。随后在无双炔酰菌胺下在选择性培养基上测试阳性菌株的生长，以确定变体是否具有组成性(即不依赖于配体的)相互作用。对允许配体依赖性相互作用的突变体进行测序，分离这些突变体的质粒DNA，并导入到Y190pACT-HAB1，使得可以利用X-gal染色评估受体敏感性。对其余22个NNK引物中的每个重复这一过程。这些工作取得了增强PYR1K59R,F108A,S122G的双炔酰菌胺敏感性的10个突变(V81C、V81I、V81T、V83L、L87A、F159L、F159M、F159V、A160V、V164I)(见表1中标记为“NNK诱变筛选”的条目)。
作为第二种方法，我们使用基于重组的诱变来搜索增强PYR1K59R,F108A,S122G对双炔酰菌胺敏感性的突变体组合。使用核苷酸切除和交换技术(NExT)(Müller et al.,2005)以等量的模板DNA诱变等量的PYR1K59R,F108A,S122G模板，模板DNA通过汇集来自以上针对在PYR1K59R,F108A,S122G主链中23个配体接触残基中的每个而制备的NNK质粒文库的库化质粒DNA制得。因此，使用口袋位点突变的文库，用基于重组的诱变来诱变PYR1K59R,F108A,S122G。生成诱变克隆的约20万个成员的文库，并将其转化到MAV99 pACT-HAB1报告菌株中。在含有0.5μM双炔酰菌胺和适当的营养物质和氨基酸的平板上进行选择。为确定菌株生长是否为配体依赖性的，随后测试阳性克隆在缺乏双炔酰菌胺的选择性平板上的生长。接下来，从显示配体依赖性生长的菌株分离质粒，并采用X gal染色表征突变受体的双炔酰菌胺敏感性(在转化到Y190 pACT-HAB1报告菌株中之后)。这些工作导致鉴别了单一的新突变，即Y58H，其提高了PYR1K59R,F108A,S122G受体的双炔酰菌胺敏感性(见表1中标记为“基于重组的诱变筛选”条目)。有趣的是，在重组反应所用的汇集的NNK模板中，并未靶向Y58；因此，这种突变是在诱变过程产生的自发突变。Y58的侧链突出到PYR1的配体结合口袋中，但并不在界限(cut-off)内，在我们的位点饱和诱变中，我们最初使用界限靶向配体结合的残基；因此，扩展口袋文库以包括所有突出到PYR1的配体结合口袋中的残基应提高发现受体的方法。
上述两个优化实验都导致下列突变得到鉴定，当一次引入一个时，所述突变提高PYR1K59R,F108A,S122G的双炔酰菌胺敏感性：Y58H、V81C、V81I、V81T、V83L、L87A、F159L、F159M、F159V、A160V和V164I。鉴于这些突变各自增强自身的敏感性，我们测试这些突变的组合是否可能产生更敏感的受体。设计每个突变的诱变引物并与具有PYR1K59R,F108A,S122G模板DNA的快速转换闪电多定点PCR诱变试剂盒(Agilent,USA)同时使用。对个体克隆进行测序，以确定真正的组合突变体，其转化入Y190 pACT-HAB1酵母菌株并测定双炔酰菌胺敏感性。这些工作导致鉴别了一些改进的受体(“组合诱变筛选II”，表1)，包括PYR1Y58H,K59R,V81I,F108A,S122G,F159L，我们已命名为PYR1MANDI的六重突变体。表达该突变的酵母报告菌株对低至2nM的双炔酰菌胺浓度应答(表1)。因此，我们遵循的5步诱变方案导致构建了具有纳摩尔级敏感性的双炔酰菌胺应答受体。
实施例3
PYR1MANDI以双炔酰菌胺选择性方式有力抑制PP2C活性
在异源有机体如酿酒酵母(S.cerevisiae)中进行的任何官能筛选的一种可能性是，确定的突变体只可以在异源表达系统的环境中工作。因此，我们研究重组PYR1K59R,F108A,S122G和PYR1MANDI蛋白是否在体外抑制PP2C活性，对于响应ABA的野生型PYR1而言，这已经有充分的文件证明(Park et al.,2009)。将两种受体都克隆到pET28以生成6X-His(SEQ ID NO:109)标记的受体。将这些受体均在18℃下在BL21[DE3]pLysS大肠杆菌宿主细胞中过夜表达。根据制造商的说明，从使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，美国)，从超声处理的裂解物纯化6X组氨酸融合蛋白。对于PP2C测定，如前所述((Park et al.,2009)，表达和纯化重组GST-HAB1和GST-ABI2，并如前所述(Park et al.,2009)，使用比色磷酸酶底物对硝基苯基磷酸盐(pNPP)进行PP2C活性测定。采用600nM PP2C和1200nM的重组受体进行PP2C测定。我们注意到，基于pNPP的测定的低敏感性需要比PP2C的理想浓度更高的浓度；其结果是，精确的IC50值不能从显示的数据推断出，然而该数据表明，在PYR1MANDI(图1A，底部线)和PYR1K59R,F108A,S122G(图1A，顶部线)存在下，双炔酰菌胺饱和抑制HAB1和ABI2 PP2C活性。我们注意到，由于这些突变受体所包含的废除ABA反应性的K59R突变，它们不能响应ABA。
我们接下来使用荧光底物4-甲基伞形酮磷酸盐表征重组PYR1MANDI对PP2C活性的影响。重组受体和PP2C蛋白如上所述进行制备并用于检查响应双炔酰菌胺或ABA的PP2C灭活。酶抑制测定采用以下试验条件进行：100nM的6X-His-PYR1MANDI，50nM的GST-PP2C，100mM Tris-OAc(pH 7.9)，100mM NaCl，1mM的MnCl2，1％β-巯基乙醇。2:1比例的受体对于PP2C浓度基于滴定实验，这表明，HAB1 PP2C活性的最大抑制(在饱和的ABA浓度，10μM)需要受体对PP2C 2倍过量的受体。这表明，重组受体的亚群可能无效。因此，在这些反应条件下，活性受体和PP2C的浓度是约等摩尔的，但考虑到我们不知道活性PP2C的精确浓度，其也可能低于50nM。三个ABA调控的进化枝A PP2Cs，GST-HAB1、GST-ABI1和GST-ABI2在不同的反应中分别在同一种酶的条件下进行了试验。所述测定在各种双炔酰菌胺或ABA浓度下进行，使得IC50值可被测定。如图1B所示，这些测定揭示HAB1、ABI1和ABI2的双炔酰菌胺介导的抑制的32.2、26.8和75.5nM的IC50值。因此，PYR1MANDI受体对于双炔酰菌胺激活是高度敏感的，并和多个响应双炔酰菌胺的进化枝A PP2Cs相互作用。这种高水平的敏感性与上述的酵母双杂交结果一致，其中PYR1MANDI和HAB1之间的可检测的相互作用可以在低至2nM的浓度下观察到(见表1)。我们注意到，酵母双杂交报告系统仅要求少部分PYR1MANDI受体结合HAB1，用于相互作用信号，因此该系统是比体外测定潜在的更敏感的指示。此外，数据表明，该受体没有明显被ABA激活。因此，这些体外测定证实，PYR1MANDI被双炔酰菌胺选择性激活。体外和基于酵母双杂交的测定共同表明，PYR1MANDI以双炔酰菌胺选择性方式有效抑制PP2C活性。
实施例4
PYR1MANDI响应双炔酰菌胺在植物体内结合HAB1
先前已经证明，PYR1与PP2Cs的ABA调控的相互作用可以使用在本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时共表达的蛋白通过共沉淀实验中进行监测(Park et al.,2009)。因此，我们研究双炔酰菌胺促进的PYR1MANDI和PP2C HAB1之间的相互作用是否可以使用类似的实验观察到。为了进行这些实验，将PYR1MANDI克隆到载体pEGAD中，作为6X-His-GFP融合蛋白(Cutler et al.,2000)。将HAB1克隆到载体pEGAD中，作为GFP融合蛋白。将两个构建体转化到根癌农杆菌(GV3101)中，并在瞬时表达实验中使用。将携带受体、PP2C和沉默阻遏物p19的土壤杆菌菌株以分别对应于0.1、1.0和0.5的最终OD600单位的比例一起混合。将混合物渗透到两个单独的本塞姆氏烟草(N.benthamiana)叶中，并在2天后，将用50μM双炔酰菌胺或在含有0.02％Silwet L-77的水中制成的模拟溶液处理叶子。20个小时后，将叶在液氮中匀质化，再悬浮于1X TBS、0.1％NP-40、1mM DTT、10％甘油和1X植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，USA)所组成的提取缓冲液中，并通过离心澄清。将25mg的PrepEase镍-NTA琼脂糖(USB，USA)加入到提取物，以分离6X-HIS标记的PYR1MANDI受体和任何相关的蛋白。洗涤树脂3次；结合的蛋白质在SDS-PAGE上样缓冲液中洗脱，通过SDS-PAGE分离，然后电转染到硝酸纤维素膜上。PYR1MANDI和HAB1都表达为GFP融合蛋白，因此可用抗GFP抗体进行检测。印迹用抗GFP单克隆一抗探测，并使用用ECL(Amersham，美国)开发的抗小鼠IgG-HP羊二抗检测。如图2所示，处理共表达6X-His-GFP-PYR1MANDI和GFP-HAB1的本塞姆氏烟草叶导致两种蛋白之间的双炔酰菌胺依赖性性物理相互作用，这表明该受体在植物体中是具有功能的。
实施例5
PYR1MANDI响应双炔酰菌胺抑制种子萌发
在花椰菜花叶病毒35S或拟南芥Rubisco小亚基3B启动子(RBCS)的控制下，我们产生了一系列表达PYR1MANDI的转基因植物。生成这些转基因植物的目的是，检查PYR1MANDI-双炔酰菌胺系统在植物体中调节ABA应答的生理功效。所述PYR1MANDI编码序列从PBD-PYR1MANDI模板进行PCR扩增并克隆到受35S启动子控制的植物转化载体pEGAD。对于RBCS驱动的构建体，将pEGAD中的35S启动子替换为RBCS启动子，其通过PCR从拟南芥基因组DNA扩增；所述pEGAD载体含有草铵膦抗性基因并允许使用市售草铵膦制剂在土壤中选择转基因。将这两个构建体，即P35S::PYR1MANDI和pRBCS::PYR1MANDI引入到根癌农杆菌GV3101中，然后用于使用浸花法(floral dip method，Clough&Bent,1998)转化拟南芥，并使得到的种子在土壤中萌发并用草胺磷处理以识别转化的植物。从约15-16个转基因植物中单独收获种子，然后表征。众所周知的是，ABA抑制种子萌发。为调查PYR1MANDI受体是否能响应种子中的双炔酰菌胺激活ABA信号传导，我们在含有1μM的双炔酰菌胺的生长培养基上使野生型植物和转基因植物的种子萌发。如表2所示，15株表达35S::PYR1MANDI的转基因植物中的5株萌发被双炔酰菌胺抑制，且16株表达RBCS:PYR1MANDI的转基因植物中的7株的萌发被双炔酰菌胺抑制。因此，使用任一启动子制备的约一半转基因植物在萌发测定中响应双炔酰菌胺，这表明PYR1MANDI能够响应种子中的双炔酰菌胺而激活ABA信号传导。可以理解的是，由于位置和其他影响，含有相同DNA构建的独立的转基因植物会显示转基因的表达水平的变化。因此，可能一些转基因植物的缺乏足够的受体表达以响应双炔酰菌胺引发ABA信号传导。因此，PYR1MANDI可以激活ABA信号种子。
实施例6
PYR1MANDI响应双炔酰菌胺引发保卫细胞闭合
双炔酰菌胺在表达PYR1MANDI的转基因植物中抑制萌发的能力表明，ABA信号传导可用该配体-受体对激活。为调查系统是否足以控制在营养组织中ABA的应答，我们产生了用于2个35S驱动系(E15和E16)和2个RBCS驱动系(F29和F34)的纯合转基因系。将这些材料沿野生型植物一侧和以前构建的35S::GFP-PYR1超表达系(Park et al.,2009)生长。这些植物生长直到三周龄，然后用含2μM双炔酰菌胺和0.02％的Silwet或含0.02％的Silwet和双炔酰菌胺载体溶剂(DMSO)的模拟处理溶液进行处理。处理24小时后，采用热成像仪检查叶的温度。公知的是，ABA诱导的保护细胞闭合会减少蒸腾，这导致叶的温度增加。据估计，叶片温度增加1℃与蒸腾速率降低约50％相关(Sirault et al.,2009)。由于保卫细胞孔穴是蒸腾速率的主要决定因素，热成像是在整株水平上间接地推断相对蒸腾速率和保卫细胞孔穴的有效途径。如图3所示，用双炔酰菌胺处理表达PYR1MANDI的纯合转基因植物，导致在处理的24小时之内叶片温度变化较大(约2℃增加)。在野生型植物或表达35S::GFP PYR1的转基因植物中没有观察到双炔酰菌胺这种效果，这表明由双炔酰菌胺诱导的温度效果是由PYR1MANDI转基因介导的。
作为保卫细胞生理学的另一项测量，我们测量暴露于模拟物处理或双炔酰菌胺处理的转基因和对照植物中的失水率。众所周知，ABA处理通过保卫细胞闭合会降低叶片失水。将3周龄的纯合转基因植物(E15、E16、F29和F34)和对照野生型植物用2μM的双炔酰菌胺或模拟溶液(如上所述含0.02％的Silwet)处理。24小时后，整个莲座剥离，随时间监测它们的质量。实验以一式三份进行，测量的标准偏差和平均偏差示于图4中。双炔酰菌胺而非模拟物处理降低表达PYR1MANDI的转基因植物但非野生型植物的水损失。这些实验连同热成像实验表明，双炔酰菌胺可以在表达PYR1MANDI的转基因植物中缩小保护单元的孔穴并减少蒸腾速率，正如同公知ABA对野生型植物的作用。
实施例7
PYR1MANDI应答非常持久
植物用脱落酸的处理导致CYP707A细胞色素P450s的诱导，其在使ABA的8'甲基羟基化A。这最终导致红花菜豆酸(phaseic acid)即不活动的ABA代谢产物的自发形成(Nambara and Marion-Poll,2005)。因此，由于代谢失活，ABA应用随时间失去效果。鉴于双炔酰菌胺是一个非天然的分子，它很可能不是通过CYP707A酶系统降解的。因此，我们研究在双炔酰菌胺处理的PYR1MANDI转基因植物中观察到的提高的叶片温度的持续性。用模拟物、1、5或20μM的双炔酰菌胺处理植物，然后通过热成像在处理后4小时、3天和6天后进行分析。如图5所示，5μM和20μM双炔酰菌胺的效果持续至少6天。此外，对照和1μM处理的植物在实验期间开花，而在5μM和20μM处理的双炔酰菌胺植物中开花被阻止。这些数据表明，双炔酰菌胺处理的效果是持久的和剂量依赖性的。这些数据还表明，由于在双炔酰菌胺处理的4小时内观察到叶片温度增加，因此所述效果迅速发生。
实施例8
PYR1MANDI允许干旱胁迫耐久性的正交控制
植物用ABA处理延缓失水并另外提高植物由干旱恢复的能力。因此，我们在累进失水制度过程中检查了野生型植物、表达35S::GFP-PYR的植物和表达4种PYR1MANDI的纯合转基因植物(E15、E16、F29和F34)的行为。种植了六组植物，三组用于对照模拟物处理，三组用于试验性处理；图6示出的数据为三次重复之一，在所有三次重复中，观察到转基因植物和对照的类似行为。植物在含有相同质量土壤的盆中生长三周，并在每次浇水时接收相同的水量。在萌发三周后，停止植物的定期浇水，并用模拟物或2μM双炔酰菌胺处理植物。4天后重复这些处理随。植物在禁水开始后的第1天、第10天和第11天进行拍摄。如图6所显示，到第10天时，模拟物处理的植物显示出如折叠叶所表明的水分胁迫证据，到第11天时，所有模拟物处理的植物都经历了严重的脱水。PYR1MANDI植物和35S::GFP-PYR1转基因植物都在第10天相对于野生型增加了干旱耐受性；这很可能是PYR1超表达表型，因为先前已经证明PYR/PYL基因的超表达改善干旱耐受性(Santiago et al.,2009)。对于野生型和用双炔酰菌胺处理的35S::GFP-PYR植物在第10天也观察到这种效果。然而，数据表明，双炔酰菌胺处理的PYR1MANDI转基因植物在第11天没有干枯。这与野生型植物和用双炔酰菌胺处理的35S::GFP-PYR1对照植物和所有模拟物处理物的系形成对照。因此，双炔酰菌胺能够在表达PYR1MANDI的转基因植物中改善干旱胁迫耐受性。双炔酰菌胺的有益效果限于表达PYR1MANDI的转基因植物。这些数据表明，PYR1MANDI/双炔酰菌胺系统允许干旱胁迫耐受性的正交控制。
实施例9
PYR1MANDI蛋白表达水平控制植物体内的双炔酰菌胺敏感性
为了进一步表征PYR1MANDI/双炔酰菌胺相互作用的生理效应，我们更详细地表征了3个独立产生的转基因拟南芥系。这些系最初命名为E9、E16和E31，今后称为MPD1、MPD2和MPD3。这些系中的每个对于单个35S::PYR1MANDI插入位点都是纯合的，并且是独立的转化事件的结果。我们首先用萌发测定来表征这些系的相对双炔酰菌胺敏感性。用于转基因和野生型对的照种子用漂白剂表面消毒，然后在4℃下在除了250nM双炔酰菌胺或0.1％的DMSO模拟物处理(载体溶剂)之外还含有1/2MS盐和0.5％蔗糖的0.7％琼脂皮氏培养皿中分层4天。分层后，将培养皿转移至生长室中，以16小时日长周期运行。分层三天后，对种子萌发进行评分。如图7A所示，所述系对于双炔酰菌胺的相对敏感度为MDP1>MDP2>MDP3。MDP1种子表现出萌发几乎被250nM双炔酰菌胺完全抑制，MDP3在萌发过程中显示出最小的敏感性，但在萌芽生长后生长减速弱，这表明它对双炔酰菌胺稍微敏感。为了更明确评估MDP1和MDP2系对双炔酰菌胺的相对敏感性，我们进行萌发剂量应答实验(使用上述的相同的方法)，并证实MDP1系比MDP2对双炔酰菌胺更敏感(图7B)。
对于MDP1和MDP2系之间的敏感程度不一样的一个可能的解释是，MDP1系具有更高的PYR1MANDI表达水平。为了研究这一点，采用先前描述的抗PYR1抗体进行蛋白质印迹分析(Nishimura et al.2010)。在补充有1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的TBS缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.4150mM NaCl)中，从7日龄转基因幼苗和野生型哥伦比亚(Columbia)对照幼苗中提取总蛋白。每个蛋白质样品(25μg蛋白质)用10％SDS-PAGE凝胶分离，通过电转移转到硝化纤维上，然后用抗PYR1抗血清探测，并使用ECL(Amersham)进行检测。如图7C所示，PYR1MANDI蛋白的水平与双炔酰菌胺敏感度相关(蛋白质检测水平遵循MDP1>MDP2>MDP3的顺序)。这些数据表明，受体蛋白的水平是双炔酰菌胺敏感度的重要决定因素。这与当由配体激活时为PP2C活性的竞争性抑制剂的PYR/PYL受体的作用机制一致。这些数据表明，PYR1MANDI蛋白表达水平控制植物体内的双炔酰菌胺敏感度。
实施例9
双炔酰菌胺抑制表达PYR1MANDI的转基因拟南芥植物的根系生长
鉴于MDP1和MDP2转基因系的相对高的双炔酰菌胺敏感性，使这些系进行进一步的生理表征。ABA的生理作用之一是抑制根系生长。因此如果成功激活该ABA应答，双炔酰菌胺应该抑制MDP1和MDP2转基因系但非野生型的根系生长。为了对此进行测试，将野生型、PYR1-OX、MDP1和MDP2基因型的种子在漂白剂中表面灭菌并接种到含1/2MS盐和0.5％蔗糖的0.7％琼脂皮氏培养皿上。在4℃下分层4天后，将培养皿转移至生长室中，以16小时长日周期运行，并使其萌发24小时，然后转移到补充有不同浓度双炔酰菌胺的皮氏培养皿(含1/2MS盐和％蔗糖的0.7％琼脂)中。然后使这些培养皿在生长室中以16小时日长周期垂直生长。转移后72小时测量转移后根系生长量。如图8所示，MDP1和MDP2转基因基因型的根系生长被双炔酰菌胺抑制，但双炔酰菌胺对野生型和PYR1-OX基因型的抑制可忽略不计。这些结果进一步证明，PYR1MANDI受体的表达能响应植物体内的双炔酰菌胺激活ABA信号传导。
实施例10
双炔酰菌胺增加表达PYR1MANDI的转基因拟南芥植物中RAB18和RD29B转录水平
ABA的一个主要作用是调节基因表达。因此，我们检测了ABA和双炔酰菌胺对野生型、PYR-OX、MDP1和MPD2转基因植物中基因表达的影响。将野生型或转基因系的种子进行表面灭菌，在4℃分层4天，然后在室温下在由0.5×MS盐和0.5％的蔗糖组成的液体培养基中在连续光照条件下生长10天，并通过连续振摇提供通风进行生长。10天之后，将培养溶液调节至含有50μM的ABA、2μM双炔酰菌胺或者模拟物处理。在暴露于测试化合物8小时后，使用RNAEasyTM植物RNA分离试剂盒(Qiagen，美国)分离RNA并用DNA酶处理。在使用ABA调节基因RD29B或RAB18的引物的qRT-PCR反应中应用纯化的RNA。进行生物一式三份测量和三重技术重复测量。为了进行qRT-PCR分析，在含有寡-dT20(SEQ ID NO:110)和核糖体RNA引物的反应混合物中，使用上标逆转录酶III(superscript reverse transcriptase III,Invitrogen，美国)从5μg的总RNA中产生cDNA。由相对定量ΔCt法进行实时定量PCR分析。PCR混合物含有cDNA、 SYBR绿/荧光qPCR主混合物(master mix，Fermentas，USA)和330nM的每个基因特异性引物。使用BioRad CFX96实时PCR系统进行RT-PCR反应，并且使用BioRad CFX Manager软件(BioRad，美国)处理该数据。在以下循环条件下进行PCR：在在96孔光学反应板(BioRad，美国)中，在95℃下3分钟，随后在95℃下10秒，在55℃下10秒和72℃下30秒，40个循环。在40个循环后，通过熔解曲线(离解)分析(60-95℃)验证扩增子的特异性。使用内部对照基因PEX4(AT5G25760)归一化输入cDNA。
来自这些基因表达实验的数据示于图9中。这些实验表明，在表达PYR1MANDI的转基因植物MDP1和MDP2中，双炔酰菌胺诱导RD29B和RAB18的高水平转录，但它不能在野生型或PYR1-OX对照中并非如此。因此，与其他观察结果一致，如使用RAB18和RD29B转录水平测量的，双炔酰菌胺能够在表达PYR1MANDI的转基因拟南芥植物中调节ABA应答。此外，这些数据表明，内源ABA调节RD29B和RAB18基因诱导的能力不受PYR1MANDI蛋白表达的损害。而且，通过PYR1-OX系中ABA诱导的RAB18和RD29的水平比野生型植物中通过相同浓度的ABA诱导的水平高。由于这些系超表达PYR1，这些观察结果连同实施例8中报道的那些结果与该PYR1蛋白水平控制对ABA(或在PYR1MANDI的情况下为双炔酰菌胺)应答的程度这一假设一致。
实施例11
双炔酰菌胺诱导表达PYR1MANDI的转基因拟南芥植物的全基因组ABA样转录应答
实施例10的实验表明，双炔酰菌胺可以在35::PYR1MANDI转基因系中调控ABA应答性基因表达，但是该实验没有提供其如何紧密地模仿ABA效果的全基因组图。因此，我们使用RNASeq实验检测了ABA和双炔酰菌胺对野生型和MDP1转基因植物中基因表达的影响。使用NEBNext平台制备用于RNASeq的实施例10得到的总RNA，所述平台由聚(A)mRNA磁性隔离模块(mRNA Magnetic Isolation Module)、用于Illumina的NEBNext Multiplex Oligos，和用于Illumina的NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit(NEBNext超RNA文库制备型试剂盒)，新英格兰生物实验室(New England BioLabs)。使用NEBNext寡核苷酸d(T)25(SEQ ID NO:111)磁珠和5μg总RNA输入分离聚(A)mRNA，如制造商所述。使用试剂盒的第一链合成反应缓冲洗脱mRNA，并通过将样品在94℃孵育15分钟随后通过冷却将洗脱的mRNA与随机引物混合物杂交。使用ProtoScript II反转录酶合成第一链cDNA，随后用试剂盒的组件进行第二链合成反应。使用Agencourt AMPure XP珠纯化产生的双链cDNA，并将NEBNext接头连接至纯化的cDNA。然后使用Agencourt AMPure XP珠对接头连接的DNA进行尺寸选择。尺寸选择的cDNA的量通过PCR富集(使用制造商方案)得到增加，并使用AMPure XP珠纯化。之后使用生物分析仪评估文库质量。然后使用HiSeq仪对该文库进行测序。每个泳道用于分析6个条形码文库。收集来自单端解码(reads)的51个周期的数据。这最终产生了每个条形码样品约两千万的映射解码(mapped read)。
使用基于R的下一代测序分析软件包TOPHat将原始HiSeq数据映射到拟南芥基因组，该软件包将Illumina解码匹配到拟南芥参考基因组序列，然后使用FPKM度量标准(FPKM＝每百万映射的片段每千碱基外显子的片段)计算每个基因的丰度。在所有样品中TOPHat鉴定了22326个基因显示非零FPKM平均值。在所有样品中，有20533个基因的FPKM值大于0.1，并且这些被用来比较全局基因表达模式。如图10A所示，双炔酰菌胺不诱导野生型植物中的显著ABA应答(r＝0.17)，然而它确实表达PYR1MANDI的转基因植物中诱导ABA样应答(r＝0.90；图10B)。此外，PYR1MANDI转基因不干扰内源ABA转录应答，因为野生型和MDP1转基因基因型对ABA的应答是高度相关的(r＝0.92；图10C)。因此，双炔酰菌胺在表达PYR1MANDI的转基因拟南芥植物中选择性地诱导全基因组ABA样转录应答。
实施例12
PYR1MANDI的表达导致基础基因表达的适度改变
PYR1MANDI受体提供了使用正交配体控制ABA应答的方法，但是，如果PYR1MANDI蛋白的表达与基础基因表达中大的变化相关，则其效用可能会受到影响。因此，我们使用在前面的实施例中生成的RNASeq数据在野生型哥伦比亚植物和MDP1(35S::PYR1MANDI)转基因植物中比较mRNA的全基因组基础水平。使用Cufflinks软件包来确定样品间的统计学显著差异。在所有样品中FPKM值大于0.1的20533个基因之中，702个显示出未处理的野生型和MDP1基因型之间的统计学显著表达水平(q<0.05)。在这些中，只有32个基因显示出两个系间超过2倍的差异。在这些中，作为35S::PYR1MANDI转基因的结果，PYR1本身显示出最大差异(其比在MDP1转基因系中高55倍)。在702个显著不同的基因的表达中，表达的平均倍数变化差异为43±23％。因此，这些分析表明，在35S启动子下的PYR1MANDI的表达与在拟南芥中基础基因表达中相对较小的变化相关联。
实施例13
PYR1MANDI能正交控制干旱胁迫耐受性的其他证据
实施例6和8公开了，PYR1MANDI转基因植物的双炔酰菌胺处理足以闭合保卫细胞(通过热成像所示)，并赋予干旱耐受性。为了进一步研究这些应答，我们使用野生型哥伦比亚基因型、PYR1-OX基因型和MDP1和MDP2基因型进行三个额外的实验。每个实验独立于其它实验在在8个月的不同时间过程中进行。每个实验表征3盆(pot)每种基因型(每盆含有4个植物)。2周(实验1)或3周后(实验2和3)停止浇水，将植物用模拟物或在含有0.02％的Silwet L-77的水中制成的1μM双炔酰菌胺溶液处理。每4天(实验1)或3天(试验2和3)重复这些处理。处理后24小时获取热像；图11示出了在实验3中观察到的一组有代表性的热应答。经过禁水10-11天后再灌溉植物，以评估极端禁水后的存活率。图12显示了再灌溉后2天实验3的植物的代表性图像。每个图像中的插入内容是来自实验1(上部数字)和实验2和3(下部数字)的存活计数。存活率已被分开，因为实验1的实验方案与实验2和3不同。
使植物生长约4周，直到初始花分生组织变得明显，在这之后停止浇水，将植物用模拟物或1μM的双炔酰菌胺溶液处理。3天、6天和9天后重复这些处理。第一应用24小时后，采集热像，代表性实验的结果示于图11中。MDP1和MDP2转基因系在双炔酰菌胺而非模拟物处理之后显示增加的叶片温度。这些观察表明，保卫细胞闭合，即ABA介导的应答，在PYR1MANDI转基因植物中被选择性地触发，如基于实施例8中所述的实验预期的。禁水11日后将植物再浇水，以评估极端禁水后的存活。如图12所示，双炔酰菌胺处理的MDP1和MDP2基因型的存活率相对于野生型和PYR1-OX对照都大大提高。数据还表明，PYR1的超表达与提高的胁迫耐受性相关联，这与超表达不同PYR/PYL受体的转基因植物的先前公布的观察结果一致(Santiago et al.2009)。35S::PYR1MANDI超表达在没有双炔酰菌胺时不会提供保护，这大概是因为该突变蛋白不能被内源ABA激活。
实施例14
双炔酰菌胺引起超表达PYR1MANDI的转基因番茄的保卫细胞闭合
核心ABA应答途径是高度保守的，因此，预期PYR1MANDI应该能够激活ABA应答，以响应大部分陆生植物中的双炔酰菌胺。为了研究PYR1MANDI的生理活性在除了拟南芥的其他物种中是否是功能性的，我们制作了转基因35S::PYR1MANDI番茄。改良用于构建拟南芥转基因(实施例5所述)所采用的相同构建体，以含有卡那霉素选择标记。通过农杆菌介导的转化来转化番茄，如Sun et al.(2006)所描述，但有一些改良，进行转化。在皮氏培养皿中灭菌的湿滤纸上萌发表面灭菌的番茄种子(品系UC82B)。从7日龄幼苗中切下子叶并浸入农杆菌在含有100μM乙酰丁香酮和10μM2-巯基乙醇的MS培养基中的悬浮液中10分钟。然后将外植体置于含有MS盐、3％蔗糖、0.3％Gelite和1.5mg/L玉米素的共培育培养基中。黑暗中共培养3天后，将外植体转移到含有MS盐、3％蔗糖、0.3％Gelite、1.5mg/L玉米素和100mg/L卡那霉素和125mg/L羧苄青霉素的愈伤组织诱导培养基中。每2周将外植体转移到新制备的培养基中。将显示枝芽的愈伤组织转移至含有1mg/L玉米素的培养基中以模拟枝伸长。切下1厘米长度的转基因枝，转移到含有MS盐、1.5％蔗糖、0.3％Gelite、1mg/L异丁酸、50mg/L卡那霉素和125mg/L羧苄青霉素的生根培养基中。2-3周后将显示良好发育根系的幼植物转移到土壤中。
选择三个转基因番茄系用于进一步表征(系1-3)。使用α-PYR1抗体使来自这些系的叶蛋白进行蛋白质印迹分析，如实施例9中所述。考虑到表达水平影响双炔酰菌胺反应性，我们比较了番茄转基因和拟南芥MDP1系之间的PYR1MANDI蛋白水平。如图13A所示，三个番茄系都具有可检测的PYR1MANDI蛋白，尽管其水平比存在于拟南芥MDP1系中的那些水平低。
为了研究PYR1MANDI在这些转基因植物中的生理活性，我们通过扦插繁殖主要转基因，这使我们能够选择同样大小的植物用于生理分析。为了制备这些克隆，切下约5厘米长的枝，并用市售生根粉(Bonide,Oriskany,NY)处理后种植在土壤中。使植物在生长室中以16小时光照和25℃下的周期生长。克隆建立3周后，将番茄幼苗和野生型对照用模拟物溶液(0.1％DMSO和0.05％的Silwet-77)处理，然后在24小时后收集热像。三天后将植物用含有10μM双炔酰菌胺、0.1％DMSO和0.05％的Silwet-77的溶液处理。然后在处理后24小时再次获取热像。如图13B所示，响应双炔酰菌胺，转基因35S::PYR1MANDI番茄植株显示叶片温度增加，这表明PYR1MANDI在番茄中是有功能的。而且，该应答的强度与PYR1MANDI蛋白水平相关，如在拟南芥的实验中观察到的。这些数据表明，双炔酰菌胺在表达PYR1MANDI的转基因番茄中引发保卫细胞闭合，并表明突变的PYR1MANDI受体的生理作用并不限于拟南芥。
表1
表2
参考文献
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