一株具有催化合成槐定碱的菌株的制作方法与工艺

本发明涉及微生物领域，具体为一株具有催化合成槐定碱的菌株。

背景技术：
槐定碱(Sophoridine)及其制剂盐酸槐定碱注射液(SophoridineHydroehlorideInjection)已于2005年8月22日获国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的新药证书(国药证字H20O51131,30)及药品批准文号(国药准字H20051682,81)，是我国研制、拥有自主知识产权国家一类抗癌新药。槐定碱的传统制备方法是从植物苦豆子中提取，苦豆子为豆科槐属植物，主要分布于中国北方的荒漠、半荒漠地区，是宁夏和新疆的重要药用植物资源和自然植被组成部分。由于其较高的药用价值和生态功能，苦豆子资源的合理保护与开发利用越来越引起人们的重视，宁夏回族自治区已将苦豆子列入重点保护的六大地道药材之一，合理开发和利用其野生资源更显得尤为重要。因此，有必要开发槐定碱的新型制备方法。微生物转化反应因为条件温和、区域选择性和立体选择性强、副产物少等优点而成为当前研究的热点。此外，微生物生长速度快，周期短，可以避免因条件剧烈产生的不必要的副反应和副产物，符合现在绿色化学和可持续发展化学的发展需要。而微生物催化反应中最重要的就是作为催化剂的微生物菌株。土壤是微生物生活的最好的场所。土壤具有微生物生长所需要的各种条件。首先，土壤中有丰富的有机质，能为微生物提供碳源、氮源和能量；同时也有丰富的无机矿物质，为微生物的生长提供矿物养料。土壤的良好持水性，保证了微生物生长繁殖所需要的水分。土壤的多孔性贮留了许多空气，能满足好气性微生物的需求。另外，土壤的酸碱度接近中性，渗透压在3～6大气压之间，与微生物生长繁殖所要求的相似。土壤中，温度相对稳定。这些，都能满足微生物生长繁殖的要求。因而土壤事实上是“微生物天然的培养基”。在这里微生物的种类最多，数量也最大。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一株具有催化氧化槐定碱生成槐定碱能力的菌株，菌种名称：Escherichiacoli，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日：2014年12月24日，保藏编号：CCTCCNO：2014659。为达到上述目的采用的技术方案是：本发明使用的菌种富集分离培养基为：蛋白胨（peptone）：5-15g、酵母浸粉（yeastextract）：2-10g、氯化钠（NaCl）：5-20g，用普通自来水补足1000mL，pH：自然pH值。从贵州省遵义医学院三宿舍前以及学校后山两处土壤为来源分离土壤微生物，得到一株具有催化氧化槐定碱生成槐定碱能力的菌株，菌种名称：Escherichiacoli，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日：2014年12月24日，保藏编号：CCTCCNO：2014659。采用该微生物菌种只需一步反应，由氧化槐定碱制备抗癌药物槐定碱。与现有技术相比，本发明的菌株通过还原化合物氧化槐定碱制备槐定碱的新方法优点在于：（1）选用天然产物氧化槐定碱为原料，一步催化反应即可合成槐定碱；（2）选择微生物酶为催化剂，其本质是蛋白质，具有强的区域选择性和立体选择性，具有高度的专一性，而且酶本身是生物体的组成部分，所以催化反应的条件比较温和，通过不需要化学反应的高温、高压以及特殊试剂等条件；（3）环境友好，因为反应过程无需有毒试剂、有毒药品，所以符合当今绿色化学的生产需求。综述所述，该方法采用的原料及催化剂便宜、易得，反应条件温和、易控，环境友好、无污染，能很好地满足绿色化学和可持续发展化学的发展，及其对现代环境保护和低碳经济的需求。附图说明图1为本发明菌种的电子显微镜照片；图2为本发明菌种催化生成槐定碱的情况；图3为本发明菌株的系统发育分析；图4为本发明中目标化合物的13C-NMR；图5为本发明中目标化合物的1H-NMR。具体实施方式下面结合实施例便于更好地理解本发明，但下列实施例仅仅是进一步阐明本发明，并无将本发明局限于该具体实施例的意图。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。1、槐定碱催化合成菌株的获得。培养基制作：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，用自来水补足1000mlpH：自然pH值，15×150试管装培养基6-7ml，100ml三角瓶装培养基40ml，121℃高温蒸汽灭菌25min，固体培养基每升培养基加20g琼脂。选取贵州省遵义医学院三宿舍前和学校后山两处的土壤，距离地面10-20cm，装入已灭菌的三角瓶，置于4℃冰箱待用。称取5g土壤样品于250ml三角瓶（内装50ml无菌水以及玻璃珠）中，震荡混匀30min。静止后量取1ml上清液至于100ml三角瓶中，在37℃，140rpm黑暗下震荡培养12小时，加入底物氧化槐定碱，继续在相同条件下共培养2天，用体积乙酸乙酯萃取一次，加压浓缩后经薄层色谱（TLC）检测转化结果。TLC条件：展开剂：三氯甲烷-甲醇=5：1，显色剂：碘以及改良碘化铋钾。经TLC鉴定有阳性转化反应的土壤样品进行浓度梯度稀释（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）以及划线培养，挑取但菌落，进行划线纯化3次，得到纯培养物。各个纯培养物再用试管重复转化过程，筛选活性菌株。2、活性菌株的种属鉴定分析。本发明一方面通过显微结构对活性菌株进行种属鉴定分析，在电镜下经革兰氏染色观察活性菌株的细胞大小、形状，细胞成G-，杆状。如图1，为阳性菌株的革兰氏染色结果(10*100)。本发明一方面通过采用分子生物学技术通过16SrDNA序列对活性菌株进行种属鉴定分析。技术路线为：总DNA提取→16SrDNA片段扩增→序列测定→blast比较分析。将筛选得到的活性菌株利用酚/氯仿法提取基因组总DNA为模板。利用细菌16SrRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，通用引物序列27F(5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇)和1492R(5＇－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3＇)，PCR反应条件为:50μL反应体系94℃，预变性5min;PCＲ热循环程序为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，扩增30个循环，72℃总延伸5min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。16SrRNA的PCR扩增产物测序由上海立菲生物公司完成。测序结果用NCBI数据库中Blast软件在线比对。从GenBank数据库中获得相似性较高的典型菌株的16SrRNA序列作为参比对象，采用MEGA5.0软件进行聚类分析和构建NJ系统发育树。如图3，为本发明菌株的系统发育分析。3、活性菌株催化合成抗癌药物槐定碱的应用底物氧化槐定碱南京元宝峰医药科技有限公司。微生物催化剂EscherichiacoliCCTCCNO：2014659,分离自遵义医学院土壤中，现保存于中国典型培养物保藏中心。氧化槐定碱的放大发酵培养采用两步发酵法，先将种子培养液（250mL培养基/500mL三角瓶）于37℃、140rpm恒温振荡培养1～2天，以2%的接种量接入放大培养基550mL/1000mL中和1350ml/2000mL，同样条件下培养1～2天天，加入底物940mg（ethanol溶解），3天后用乙酸乙酯萃取培养液，减压蒸干得到粗提物4.04g。取柱层析硅胶（200-300目），用氯仿浸泡3小时，用二乙胺调节pH＞7可填柱。装柱完成后，用选定的洗脱液以大约8ml/min的流速平衡柱体，然后将粗提取4.04g用甲醇溶解，按1：2的质量比用200~300目的硅胶拌样，用氯仿：甲醇=（40:135:130:1……0:1）分段洗脱，根据TLC检测和硫酸显色反应及碘化铋钾反应显色，进行各馏分间的合并和浓缩，得到含有目标转化产物的组分C和其他组分H、I、L、M、E。经SephadexLH-20葡萄糖凝胶柱层析对目标转化产物进行纯化，用氯仿:甲醇=1:1洗脱，流速约为0.4ml/min，小试管收集流液，每管约5ml，一边点板分析一边洗脱。根据TLC分析检测和流酸显色反应及碘化铋钾反应显色进行相同的点合并和浓缩。得到J、A、D、K四个组分，其中组分A含有目标转化产物，对目标转化产物A进一步采用反复硅胶柱色谱层析和SephadexLH-20葡萄糖凝胶柱层析和重结晶的方法进行分离纯化得到目标转化产物（96.8mg），通过理化性质和现代波谱学手段（1H-NMR、13C-NMR）鉴定了转化产物的结构。如图2，为TCL法检测菌株催化合成槐定碱（H：槐定碱，YH：氧化槐定碱）。白色针晶（甲醇）。1H-NMR（CDCl3，TMS）δppm：3.21～3.45（3H，m，11-H，17-2H），2.78（2H，m，10,2-He），2.32（3H，m，14-2H，6-H），2.12（2H，m，10,2-He），2.07（2H，m，3-Ha，5-H），1.92（2H，m，12,4-He），1.85～1.01（10H，m）。13C-NMR(CDCl3，TMS)δppm：170.1（C-15），63.4（C-6），56.0（C-2），55.8（C-11），50.4（C-10），47.7（C-17），41.0（C-7），32.6（C-14），30.9（C-5），30.3（C-12），28.2（C-4），23.8（C-3），21.9（C-8），21.6（C-9），19.0（C-13）。如图4，为槐定碱的13C-NMR谱。如图5，为槐定碱的1H-NMR谱。