该发明涉及一个通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造β-胡萝卜素或番茄红素的简单而高效的方法，该方法的突出特征是三孢布拉霉菌菌株的生产率高。高生产率是通过正确执行本发明的方法而实现的，执行过程中考虑了丝状生长的半菌株的形态状况以及混合菌株时的生长状态(也称为配对)。
背景技术：
：类胡萝卜素是天然染料，染色颜色黄色至红，往往出现在蔬菜中。作为抗氧化剂和维生素A的前体，类胡萝卜素一直是大量研究的对象。由于其抗氧化性，它们可以预防许多疾病，例如：癌症、动脉硬化、风湿病或阿尔茨海默氏症。其中，番茄红素(出现在例如西红柿中)具有最大的抗氧化能力，被认为能够有效对抗特别活性的单线态氧。工业上，类胡萝卜素被当做食品添加剂和着色剂用在人造黄油、油、酱汁、汤和果汁中，也用作动物饲料添加剂。类胡萝卜素可使用化学和生物技术制造。通过生物技术生产的类胡萝卜素可以很容易具有复杂的结构以及自然出现的构象异构。生产β-胡萝卜素的工业生物技术工艺以使用盐生杜氏藻或者三孢布拉霉菌菌株为基础，其中使用三孢布拉霉菌时进行正负菌株混合发酵，以达到β-胡萝卜素的最大产量。在现有技术水平，通过三孢布拉霉菌发酵制造β-胡萝卜素在众多专利文献中都有描述，例如在EP1367131A1、WO93/20183A1以及WO02/010429A1中。上述文献描述的发酵方法都基于一个原理：正的和负的半菌株共同在生物反应器中接种。WO93/20183A1描述了使用所选变异的三孢布拉霉菌菌株在特定发酵条件下生产β-胡萝卜素。WO02/010429A1披露了一种发酵方法，在发酵过程中通过定义的pH值调节并添加大豆卵磷脂作为培养基，从而提高β-胡萝卜素相对于其他类胡萝卜素的生产率。EP1367131A1中描述的发酵条件规定了编程化的氧和/或β-紫罗兰酮添加以及对所使用菌株营养生长阶段的控制。US5,422,247A和WO2005/030976A2中揭示了其它的发酵方法，其中包括对pH值以及必要时对氧分压的调节。在文献中还描述了使用化学组分用于增产。但这样的成分可能有毒，另外，它们用于食物或药物目的时的合法授权可能有问题。技术实现要素：因此，本发明的目的是提供一种生产类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和番茄红素的有效方法，不需要化学添加剂，但提供良好的产品产率。另外，它还应该成本尽量低，且执行简单、耗费少，并能减少发酵时间。本发明的任务是通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造β-胡萝卜素或番茄红素，从中选出类胡萝卜素并从获得的生物质或从发酵液油相获取类胡萝卜素的方法而完成的，其特征为，首先分别预培养正和负菌株至完全形成形态，然后将负菌株接种到生物反应器中并在负菌株指数式增长过程中将正菌株按1:5到1:100的体积比(也称为配对比)添加到负菌株中以诱导形成类胡萝卜素，两种菌株在18℃至24℃下，且无需pH值及氧分压调节地条件下发酵，必要时直至形成类胡萝卜素(繁殖期)结束。在本发明的优选实施方案中，菌株分别预培养为26℃-30℃，特别优选为28℃。单独预培养负菌株要进行约55小时。约55小时后，负菌株被转移到生物反应器中。生物反应器中负菌株的发酵同样优选为26℃-30℃，特别优选为28℃。生物反应器中负菌株的培养要进行约13到14个小时(营养期)。同样特别优选正负菌株共同发酵(繁殖期)形成类胡萝卜素在22℃下进行。根据本发明，负半菌株的培养以反应器规模进行，直至完全形成菌丝(营养期)，然后在负菌株指数式增长过程中正半菌株会作为诱导措施添加进去。由此可以缩短发酵过程的时间并节省成本。此外，在营养期和繁殖期之间生长最佳温度也从26℃至30℃转换到18℃到24℃。较低的温度不仅不会抑制半菌株的活性，还能促进产品在发酵过程中的稳定性。本方法中，无需调节pH值或氧含量就能成功培养出产品并达到良好的产品产出率。由于无需调节pH值，所以无需添加酸或碱，因此节省了成本。在整个产品形成(繁殖期)过程中放气速率、转速和温度保持恒定，这显然有利于真菌与主要条件匹配。产品形成使用的特征是BDS(生物干燥剂)含量和pH值同时降低。类胡萝卜素形成的终止标准可以通过pH值明显增加检测出来。也就是说，pH值增加0.5到0.8后，类胡萝卜素形成终止。菌株在锥形瓶中单独预培养过程中的搅拌速度优选为130-156转/分钟。根据本发明，优选地将在生物反应器(营养期)中培养负菌株的搅拌速度调节到230-350转/分钟(rpm)，特别优选244-344转/分钟。营养期的放气体积流量优选约1vvm(空气体积/发酵罐体积/分钟)。在繁殖期，也就是产品形成的阶段，又称为诱导后正负菌株共同发酵的阶段，搅拌速度和放气体积流量的条件与营养期一样。配对比例(以正菌株与负菌株体积比例的方式注明)在本发明特定实施方案中为1:5到1:20，特别优选1:5到1:10。在本发明方法的繁殖期中，也就是产品形成的阶段，又称为诱导后正负菌株共同发酵的阶段，三孢布拉霉菌使用的的培养基能够作为培养基或发酵培养基，特别是那些同时包含碳水化合物和有机氮化合物的培养基。培养基中也可以添加脂类。根据本发明，培养基中碳水化合物优选淀粉或糖。研究表明，尤其是使用糖含量为10至50g/L的含糖培养基时，获得良好的类胡萝卜素产出率。含糖培养基优选包括糖蜜、麦芽汁或淀粉工业的副产品或它们的组合。诱导后正负菌株共同发酵的阶段的培养基优选包含脂类的培养基。脂类最好是一种或多种油。而油最好是一种或多种天然油。特别是在培养基中可以使用植物油，优选天然植物油。合适的植物油的实例有橄榄油、菜籽油、玉米油和葵花籽油。如果要使用根据本发明的方法制造番茄红素，则优选给正负菌株共同发酵(繁殖期)时的培养基添加一种环化酶抑制剂，优选咪唑和/或咪唑衍生物。根据本发明的方法在制造番茄红素时也允许不添加潜在有毒的化学物质，例如环化酶抑制剂。此时，番茄红素优选从发酵液的油相中获得。在本发明的方法中，可以使用所有已知的和培养集合中获得的三孢布拉霉菌半菌株，例如DSM2388负菌株和DSM2387正菌株或ATCC14272负菌株和ATCC14271正菌株。在本发明的实施例中，也可以使用BS01负菌株(在德国不伦瑞克的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)国际保藏单位中保存在编号DSM16755下)和BS01正菌株(同样保存在该处编号DSM16754下)。在本发明具体的实施方案中，主要有以下步骤：(1)在锥形瓶中，28℃和145rpm下，正负菌株分别单独预培养，负菌株培养约55小时，正菌株培养约68小时。(2)在大约55小时后，负菌株转移到反应器中，在28℃、放气速率大约1vvm和搅拌转速244-344rpm下，发酵大约13-14小时。(3)添加正菌株后，将培养温度调节到22℃。正菌株和负菌株的体积比为1:9。优选地，搅拌转速保持在244-344rpm。(4)不需调节pH值。对生物质的处理按照专业人员通常已知的方法进行，例如固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取。总之，可以确定，本方法仅通过物理参数控制就能保证布拉菌株的高生产效率，由此根据本发明制造的类胡萝卜素在食品和药物合法授权方面会毫无问题，因为根据本发明的方法没有毒性或其他危险物质残留在产品中。使用本发明的方法，生物干物质中类胡萝卜素的生产量最少达到2％，优选能达到4％到6％。使用本发明的方法，类胡萝卜素不仅能从得到的生物质中获取，而且也可以或者额外从发酵液的油相中获得。我们已经知道，在三孢布拉霉菌中在繁殖期时类胡萝卜素形成的更多，而其中负菌株首先在脂类或油间层储积。类胡萝卜素，特别是疏水性β-胡萝卜素在该细胞内油相储积。发酵结束后，类胡萝卜素可以从得到的生物质中获取，将细胞破碎并将类胡萝卜素或类胡萝卜素-油混合物从细胞内油相中萃取出来。令人惊奇的是，结果表明，实施本发明过程时，大量的类胡萝卜素由发酵期间的生物体释放并作为类胡萝卜素-油混合物释放到发酵液中。由此，使用本发明的方法借助分离发酵液油相就能获得类胡萝卜素。无需破坏细胞，而且获取的类胡萝卜素无需其他流程步骤就能继续使用。本发明提供一种制造类胡萝卜素的方法，通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵获得β-胡萝卜素或番茄红素，从中选出类胡萝卜素并从发酵液油相中提取类胡萝卜素，其突出特征为，首先分别预培养正和负菌株至完全形成形态，然后将负菌株接种到生物反应器中，并在负菌株指数式增长过程中将正菌株按1:5到1:100的体积比(也称为配对比)添加到负菌株中以诱导形成类胡萝卜素，两种菌株在18℃至24℃下，均无需调节pH值及氧分压下发酵，必要时直至形成类胡萝卜素(繁殖期)阶段结束。接着，将油相从发酵液中分离，如有必要需要过滤，由此肉眼可见的成分，也就是平均直径1μm或更大的成分从油相中被清除。这样可以得到可以应用的含类胡萝卜素的油，经过进一步的提纯可以获得更纯的类胡萝卜素馏分。通过将生物在繁殖期形成的类胡萝卜素以类胡萝卜素-油混合物的形式从细胞内部释放出来，在本发明的方法中，不论发酵培养基本身是否包含脂类或油，均可以从发酵液形成的油相中获取类胡萝卜素。对于按照本发明的方法，要从发酵液获取类胡萝卜素，最好是使用包含一种或多种脂类的培养基。脂类最好是一种或多种油。而油最好是一种或多种天然油。特别是可以在培养基中使用植物油，优选天然植物油。合适的植物油的实例有橄榄油、菜籽油、玉米油和葵花籽油。与之前从得到的生物质中获取类胡萝卜素，因此通常采用不连续设计的方法不同，按照本发明的方法在从发酵液油相获取类胡萝卜素时也允许连续的或至少是多周期性的工艺方案。为保证连续的或多周期性的工艺方案，在诱导后要给发酵料重新添加培养基，这样发酵料中提供的营养成分能允许发酵料持续培养。其中，添加发酵培养基可以进行一次、多次或定期进行。添加发酵培养基的方式优选为保证发酵料中碳源的浓度不低于菌株死亡的阈值。例如，首次添加发酵培养基为放入正菌株诱导后20小时到60小时的时间段内。添加发酵培养基可以多次或定期进行。例如，首次添加发酵培养基在通过放入正菌株诱导后20小时到60小时的时间段内，而接下来每一次添加都在前一次添加后24小时到48小时的时间段内。各次添加的时间间隔可能或长或短。起决定作用的是，培养基含量不持续或较长时间的低于导致抑制真菌的浓度。在特定实施方案中，通过一个使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造从β-胡萝卜素或番茄红素中选出的类胡萝卜素和从发酵液油相获取类胡萝卜素的符合本发明的方法的突出特征是以下步骤：(1)在锥形瓶中正负菌株在28℃和145rpm下分别单独预培养，负菌株培养约55小时，正菌株培养约68小时。(2)在大约55小时后，负菌株转移到反应器中，在28℃、放气速率大约1vvm和搅拌转速244-344rpm下发酵大约13-14小时。(3)通过添加正菌株诱导类胡萝卜素生成后将培养温度设定为22℃。正菌株和负菌株的体积比为1:9。(4)不需调节pH值。(5)添加正菌株后20小时到60小时向发酵液添加新的发酵培养基，培养基可选地含油。(6)可以选择继续给发酵液添加发酵培养基，接下来每一次添加都在前一次添加后24小时到48小时的时间段内。在期间发酵最好在不变的条件下持续进行。(7)从剩余的发酵液中分离油相(含类胡萝卜素的)，如有必要需要过滤以获得含类胡萝卜素的油或油混合物。在本发明的方法中，由于环境条件的改变，例如通过添加发酵培养基重新或进一步添加营养成分，次级代谢产物如类胡萝卜素从菌株的微生物油中被排出。该过程类似排毒，保证了菌株继续存活。通过从发酵液中排出细胞内的类胡萝卜素-油混合物，可直接得到发酵液油相的类胡萝卜素，无需从生物质中昂贵且费时地分离类胡萝卜素。因此，无需对生物质进行机械、热学、酶或化学处理，可以将类胡萝卜素作为天然类胡萝卜素直接以发酵液油相的形式提取。通过这里建议的方法实施方案，类胡萝卜素提取可以通过连续的方法进行，其产率比常规的方法更高，特别是当不仅能从发酵液的油相中，而且还另外也可以从生物质中得到类胡萝卜素时。通过多次添加发酵培养基，在本发明的方法中可以提高油产物的类胡萝卜素和叶黄素含量。为了达到持续或周期性的方法实施方案和尽量多的添加周期，在按照本发明的方法中，可以给发酵液一次或多次性添加额外的正或负半菌株并相应地给油继续充实类胡萝卜素。已经表明，通过本发明的方法，特别是在从发酵液油相获取类胡萝卜素时，可以生产类胡萝卜素含量，特别是天然类胡萝卜素含量400mg/L或者更多，最好1500mg/l或更多，特别是400到1500mg/L及更多的油或油混合物。已经表明，通过本发明的方法，特别是在从发酵液油相获取类胡萝卜素时，可以生产番茄红素含量，特别是天然番茄红素含量2mg/L或者更多，最好2到20mg/L及更多的油或油混合物。因此使用本发明的方法可以生产不受细胞破碎过程中的流程影响的天然类胡萝卜素。由此，本发明也涉及天然类胡萝卜素或包含天然类胡萝卜素的油或油混合物，其中天然类胡萝卜素可以按照本发明的方法制造。按照本发明的含类胡萝卜素的油或油混合物最好具有浓度为400mg/l或更大的天然类胡萝卜素。按照本发明的含类胡萝卜素的油或油混合物最好具有以下特征：β-胡萝卜素浓度为20至1500mg/L，特别优选30至1300mg/L，非常特别优选300至1300mg/L。按照本发明的方法制造的含类胡萝卜素的油或油混合物，优选番茄红素浓度大于2mg/L，特别优选2至20mg/L，非常特别优选2至15mg/L。在具体实施方案中，按照本发明的含类胡萝卜素的油或油混合物具有至少30mg/L的β-胡萝卜素以及至少2mg/L的番茄红素，优选至少400mg/L的β-胡萝卜素以及至少5mg/L番茄红素。符合本发明的含类胡萝卜素的油或油混合物可以例如包含：≥0.25mg/L叶黄素，≥2mg/L的β-隐黄质，≥2mg/L番茄红素，≥3mg/Lγ-胡萝卜素，≥0.25mg/Lα-胡萝卜素，和≥30mg/Lβ-胡萝卜素。例如，含类胡萝卜素的油或油混合物可以例如包含：0.25-1mg/L叶黄素，2-25g/Lβ-隐黄质，2-15g/L番茄红素，3-35mg/Lγ-胡萝卜素，0.2-25mg/Lα-胡萝卜素，和30-1300mg/Lβ-胡萝卜素。特别，含类胡萝卜素的油或油混合物可以例如包含：0.28-0.71mg/L叶黄素，2.05-24.9mg/Lβ-隐黄质，2.09-14.35mg/L番茄红素，3.01-31.8mg/Lγ-胡萝卜素，0.29-24.9mg/Lα-胡萝卜素，和30.9-1295mg/Lβ-胡萝卜素。接下来将通过实例更详细地说明本发明，但并不限于此。附图说明图：图1至7显示：图1：天然葵花籽油HPLC色谱。图2：3次添加含淀粉培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素的油的HPLC色谱。图3：5次添加含淀粉培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素的油的HPLC色谱。图4：5次添加含葡萄糖培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素的油的HPLC色谱。图5：天然玉米胚芽油HPLC色谱。图6：一次添加含淀粉培养基(玉米胚芽油)后含类胡萝卜素的油的HPLC色谱。图7：5次添加含淀粉培养基(玉米胚芽油)后含类胡萝卜素的油的HPLC色谱。具体实施方式示例示例1：半菌株DSM2387和DSM2388分别在YPsS固体介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：20g/L)中培养。产孢应在3日内获得。自培养第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液杀菌漂洗。一个300mL的烧瓶使用200mLYPsS介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分钟的介质在冷却到室温后注入2*106个孢子。正负菌株单独在28℃下分别预培养，负菌株培养55小时，正菌株68小时。摇动频率为145rpm。给额定容积5L的反应器填充3200mL液体介质(YPsS无酵母抽提物)并在121℃下消毒30分钟。介质冷却后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液体介质各组分的称重在3572mL时进行。培养温度调节到28℃后，在反应器中注入200ml的DSM2388培养料。进行培养13小时，以便菌株进入指数生长期。接着，添加400mL的DSM2387培养料以诱导类胡萝卜素形成。繁殖期时温度降低到22℃。36至48小时内生物质开始强烈染橙色。培养无需控制pH值和pO2值。在300rpm的搅拌器速度下以1VVM连续加气。完成培养后进行生物质处理(固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取)。生物质中β-胡萝卜素的产量为3.2％到6.18％。示例2：半菌株DSM2387和DSM2388分别在YPsS固体介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：20g/L)中培养。产孢应在3日内获得。自培养第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液杀菌漂洗。一个300mL的烧瓶使用200mLYPsS介质(麦芽汁：10g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分钟的介质在冷却到室温后注入2*106个孢子。正负菌株单独在28℃下分别预培养，负菌株培养55小时，正菌株68小时。摇动频率为145rpm。给额定容积5L的反应器填充3200mL液体介质(麦芽汁：10g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，葵花籽油：30g/L)并在121℃下消毒30分钟。介质冷却后加入消毒的酵母抽提物(14.292g/360mL)和硫胺素(0.0072g/12mL)。液体介质各组分的称重在3572mL时进行。培养温度调节到28℃后，在反应器中注入200mL的DSM2388培养料。进行培养13小时，以便菌株进入指数生长期。接着添加400mL的DSM2387培养料以诱导类胡萝卜素形成。繁殖期时温度降低到22℃。40至56小时内生物质开始强烈染橙色。培养无需控制pH值和pO2值。在300rpm的搅拌器速度下以1VVM连续加气。完成培养后进行生物质处理(固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取)。生物质中β-胡萝卜素的产量为1.8％到2.3％。示例3：半菌株ATCC14271和ATCC14272分别在YPsS固体介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：20g/L)中培养。产孢应在3日内获得。自培养第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液杀菌漂洗。一个300mL的烧瓶使用200mLYPsS介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分钟的介质在冷却到室温后注入2*106个孢子。正负菌株单独在28℃下分别预培养，负菌株培养55小时，正菌株68小时。摇动频率为145rpm。给额定容积5L的两个反应器分别填充3200mL液体介质(YPsS无酵母抽提物)并在121℃下消毒30分钟。介质冷却后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液体介质各组分的称重在3572mL。将培养温度调节到28℃后，在反应器中注入200mL的ATCC14271培养料和ATCC14272培养料。进行培养14小时，以便菌株进入指数生长期。在额定容积15L的反应器中预先加入9LYPsS介质，消毒，然后注入500mLATCC14272。菌株在14小时后进入指数增长期。添加1L的ATCC14271培养料，以诱导产品形成。繁殖期时温度降低到22℃。在接下来50至64小时内生物质开始强烈染橙色。培养无需控制pH值和pO2值。在300rpm的搅拌器速度下以1VVM连续加气。完成培养后进行生物质处理(固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取)。生物质中β-胡萝卜素的产量为3.8％到4.5％。示例4：半菌株DSM2387和DSM2388分别在YPsS固体介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：20g/L)中培养。产孢应在3日内获得。自培养第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液杀菌漂洗。一个300mL的烧瓶使用200mLYPsS介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分钟的介质在冷却到室温后注入2*106个孢子。正负菌株单独在28℃下分别预培养，负菌株培养55小时，正菌株68小时。摇动频率为145rpm。给额定容积5L的反应器填充3200mL液体介质(YPsS无酵母抽提物)并在121℃下消毒30分钟。介质冷却后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液体介质各组分的称重在3572mL时进行。培养温度调节到28℃后，在反应器中注入200mL的DSM2388培养料。进行培养13小时，以便菌株进入指数生长期。接着添加400mL的DSM2387培养料以诱导类胡萝卜素形成。繁殖期时温度降低到22℃。36至48小时内生物质开始强烈染橙色。培养无需控制pH值和pO2值。在300rpm的搅拌器速度下以1VVM连续加气。添加正菌株24小时后向发酵液添加新的发酵培养基。培养介质的添加以12到48小时的时间间隔多次重复进行，以便强化效果。10至48小时内，葵花籽油开始强烈染橙到红色。完成培养后进行生物质和油相处理(固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取)。生物质中β-胡萝卜素的产量为3％到6％，七次添加新发酵培养基时，油相中β-胡萝卜素含量为500-1500mgL-1。示例5：半菌株ATCC14271和ATCC14272分别在YPsS固体介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：20g/L)中培养。产孢应在3日内获得。自培养第三天起，孢子可以用0.2％Span20溶液杀菌漂洗。一个300mL的烧瓶使用200mLYPsS介质(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸镁：0.45g/L，磷酸氢二钾：1.0g/L，琼脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，玉米胚芽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分钟的介质在冷却到室温后注入2*106个孢子。正负菌株单独在28℃下分别预培养，负菌株培养55小时，正菌株68小时。摇动频率为145rpm。给额定容积5L的反应器填充3200mL液体介质(YPsS无酵母抽提物)并在121℃下消毒30分钟。介质冷却后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液体介质各组分的称重在3572mL时进行。培养温度调节到28℃后，在反应器中注入200mL的DSM2388培养料。进行培养13小时，以便菌株进入指数生长期。接着添加400mL的DSM2387培养料以诱导类胡萝卜素形成。繁殖期时温度降低到22℃，36至48小时内生物质开始强烈染橙色。培养无需控制pH值和pO2值。在300rpm的搅拌器速度下以1VVM连续加气。添加正菌株30小时后向发酵液添加新的发酵培养基。培养介质的添加以12到48小时的时间间隔多次重复进行，以便强化效果。10至48小时内葵花籽油开始强烈染橙到红色。完成培养后进行生物质和油相处理(固体-液体分离或必要时生物质颗粒温和干燥后的固体提取)。生物质中β-胡萝卜素的产量为3％到6％，4次添加新发酵培养基时，油相中β-胡萝卜素含量为400-600mgL-1。示例6：要确定油在类胡萝卜素和叶黄素方面的构成，对示例4和5中含类胡萝卜素的油进行HPLC分析(表1)。表1:HPLC法HPLC：泵：MerckHitachiL-6200A自动取样器：MerckHitachiAS-4000AUV-VIS探测器：MerckHitachiL-4250接口：AgilentInterface35900E软件：OpenLAB为了确定本发明的油中的类胡萝卜素和叶黄素的浓度，制造了现有标准的菌株溶液(表2)。为此，溶解定量的油或丙酮(CarlRoth有限公司和两合公司)并存放到棕色瓶中。在HPLC分析之前过滤菌株溶液，以保证溶液无颗粒。根据算出的校准线(浓度比面积)可以从含类胡萝卜素的油的峰面积推算出浓度。表2：标准标准供货商菌株溶液[mgL-1]玉米黄素SigmaAldrich叶黄素SigmaAldrich45β-隐黄质SigmaAldrich12.8番茄红素VWR20γ-胡萝卜素CaroteNature10α-胡萝卜素SigmaAldrich20β-胡萝卜素SigmaAldrich130为了分析含类胡萝卜素的油，通过倾析分离出仍然含部分发酵液和生物质的油。通过对3044g试样5分钟的离心分离，能够明确分离出生物质、发酵液和油相。为了进行HPLC测定，油试样被分离过滤(孔径0.45pm；PTFE注射过滤器；CarlRoth有限公司及两合公司)，以保证试样无颗粒。这种方法特别适合实验室规模，为了从技术上实现，使用分离器和离心机进行液体-液体分离。研究的油的谱显示在图1到7中。其中图1显示天然葵花籽油的HPLC色谱；图2显示按照示例4在3次添加含淀粉培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素油的HPLC色谱；图3显示按照示例4在5次添加含淀粉培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素油的HPLC色谱；图4显示按照示例4在5次添加含葡萄糖培养基(葵花籽油)后含类胡萝卜素油的HPLC色谱；图5显示玉米胚芽油的HPLC色谱；图6显示按照示例5在添加含淀粉培养基(玉米胚芽油)后含类胡萝卜素油的HPLC色谱；而图7显示按照示例5在5次添加含淀粉培养基(玉米胚芽油)后含类胡萝卜素油的HPLC色谱。为了能精确定量类胡萝卜素和叶黄素，第一步确定所使用油的组成。从含类胡萝卜素油试样的峰面积中减去计算出的峰面积。由此得出的重要峰值检测为叶黄素、β-隐黄质、番茄红素以及α、β和γ-胡萝卜素(表3)。表3：通过HPLC测定的不同培养条件下含量的最小和最大值，单位：mgL-1。其中最小和最大值表示所有含类胡萝卜素的油试样的相应最小和最大值。当反应器规模为8次添加后，β-胡萝卜素含量能够达到1295mgL-1。在摇瓶试验中，在4到5次添加后，β-胡萝卜素含量的最大值约为700mgL-1。油相中的类胡萝卜素含量取决于制造方法与策略。一到两次添加后，例如β-胡萝卜素的含量约为50-100mgL-1。通过重复添加含淀粉、糖浆或葡萄糖的介质，可以增加油中的β-胡萝卜素含量，在四到五次添加后，会增加至约500-800mgL-1，在次添加时会增加到1000mgL-1以上。当前试验，添加的时间间隔为20到50小时，但该时间间隔也可以更短或更长。类胡萝卜素和叶黄素含量主要取决于添加次数、使用的油和培养基。类胡萝卜素的主要部分包含大约80-97％的β-胡萝卜素，检测出的其他类胡萝卜素取决于使用的培养基、使用的油以及添加的次数。特别是，添加的次数降低了其他类胡萝卜素的比例，从而也提高了β-胡萝卜素的百分比，其中合成过程也可以改变含类胡萝卜素油的含量。当前第1页1 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