嘧啶‑二胺双重HSP90/TRAP1抑制剂的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年9月11日提交的美国临时申请第62/049,095号的权益，其全部内容援引加入本文。

本发明涉及新的hsp90/trap1双重抑制剂、它们的制备方法、包含这些抑制剂的药物组合物、以及它们在癌症治疗中的用途。

发明背景

多形性胶质母细胞瘤(gbm)是最恶性和侵袭性的人脑肿瘤，尽管使用强化治疗方式，但其具有保持在低于5％的5年存活率。尽管通过单独或组合实施新一代的靶向分子疗法的积极多元模式疗法，但预后仍然令人失望(munsonj,bonnerm,friedl,hofmeklerj,arbiserj等人(2013)identifyingnewsmallmoleculeanti-invasivecompoundsforgliomatreatment.cellcycle12:2200-9)。为了改善患有gbm的患者的结果，新治疗的开发至关重要。与化疗靶向癌细胞中的单一蛋白或信号传导途径相反，靶向癌细胞中的主要调节物如热休克蛋白90(hsp90)的观念具有吸引力，并且对于目前治疗难以治愈的高度异质性和侵袭性癌症如gbm可能是有希望的(munsonj,bonnerm,friedl,hofmeklerj,arbiserj等人(2013)identifyingnewsmallmoleculeanti-invasivecompoundsforgliomatreatment.cellcycle12:2200-9；和xuw,neckersl(2007)targetingthemolecularchaperoneheatshockprotein90providesamultifacetedeffectondiversecellsignalingpathwaysofcancercells.clincancerres.13:1625-9)。靶向atp结合袋的新一代小分子hsp90抑制剂(hsp90i)表现出大有希望的针对广泛癌症的效力，连同改进的安全性。但是，虽然大有希望，但是hsp90i临床试验的结果已最佳混合，表明需要更有效的hsp90i(mcdonalde,workmanp,jonesk.(2006)inhibitorsofthehsp90molecularchaperone:attackingthemasterregulatorincancer.currtopmedchem.6:1091-107；siderak,patsavoudie(2014)hsp90inhibitors:currentdevelopmentandpotentialincancertherapy.recentpatanticancerdrugdiscov9:1-20；和traversj,sharps,workmanp(2012)hsp90inhibition:two-prongedexploitationofcancerdependencies.drugdiscovtoday(5-6):242-52)。有至少13种hsp90抑制剂候选药物目前正进行临床试验，作为单一药剂或组合疗法用于多种适应症(siderak,patsavoudie(2014)hsp90inhibitors:currentdevelopmentandpotentialincancertherapy.recentpatanticancerdrugdiscov9:1-20)。这些药物代表源于天然产物支架至基于合成结构的设计的各种化学物质(siderak,patsavoudie(2014)hsp90inhibitors:currentdevelopmentandpotentialincancertherapy.recentpatanticancerdrugdiscov9:1-20；和porterjr,fritzcc,depewkm(2010)discoveryanddevelopmentofhsp90inhibitors:apromisingpathwayforcancertherapy.curropinchembiol14:412-20)。值得注意的是，在描述的大量小分子hsp90抑制剂中，仅少量已知通过血脑屏障，这是cns癌症如gbm的绝对药物要求(baor1,laicj,quh,wangd,yinl,等人(2009)cudc-305,anovelsynthetichsp90inhibitorwithuniquepharmacologicpropertiesforcancertherapy.clincancerres.15:4046-57；ernstjt,neubertt,lium,sperrys,zuccolah,等人(2014).identificationofnovelhsp90α/βisoformselectiveinhibitorsusingstructure-baseddrugdesign.demonstrationofpotentialutilityintreatingcnsdisorderssuchashuntington'sdisease.jmedchem57:3382-400；sauvageotcm,weatherbeejl,kesaris,wintersse,barnesj,等人(2009).efficacyofthehsp90inhibitor17-aaginhumangliomacelllinesandtumorigenicgliomastemcells.neurooncol.11:109-121；和zhuh,woolfendens,bronsonrt,jafferzm,barluengas,等人(2010).thenovelhsp90inhibitornxd30001inducestumorregressioninageneticallyengineeredmousemodelofglioblastomamultiforme.molcancerther.9:2618-2626)。

可以认为hsp90是癌细胞中的主要调节物，这是由于其作为分子伴侣蛋白的作用，促进癌细胞生长和/或存活的多种突变、嵌合和过量表达的信号蛋白的稳定性和功能需要其关联。抑制这样的主要调节物用于癌症疗法的希望是同时引起多个致癌信号传导途径的组合抑制的潜力。随着最近发现有效否定选择性靶向的抗癌剂效力的反馈环，对这样的多管齐下的方法有了新的兴趣(altieridc,steings,lianjb,languinolr(2012)trap-1,themitochondrialhsp90.biochimbiophysacta.1823:767-773；和siegelinmd(2013)inhibitionofthemitochondrialhsp90chaperonenetwork:anovel,efficienttreatmentstrategyforcancer？cancerlett333:133-46)。

hsp90和细胞中发现的hsp90的两种区室化同系物(即内质网grp94和线粒体trap1)在应答细胞应激时在包括gbm在内的许多癌症中表现出升高的水平和/或增加的atpase活性(okayamas,kopelovichl,balmusg,weissrs,herbertbs,等人(2014)p53proteinregulateshsp90atpaseactivityandtherebywntsignalingbymodulatingaha1expression.jbiolchem289:6513-25；burrowsf,zhangh,kamala(2004)hsp90activationandcellcycleregulation.cellcycle3:1530-6；ferrarinim,heltais,zocchimr,rugarlic.(1992)unusualexpressionandlocalizationofheat-shockproteinsinhumantumorcells.intjcancer.51:613-9；costantinoe,maddalenaf,calises,piscazzia,tirinov,等人(2009)trap1,anovelmitochondrialchaperoneresponsibleformultidrugresistanceandprotectionfromapoptosisinhumancolorectalcarcinomacells.cancerlet279:39-46；kangbh,plesciaj,dohit,rosaj,doxseysj,等人(2007)regulationoftumorcellmitochondrialhomeostasisbyanorganelle-specifichsp90chaperonenetwork.cell131:257-70；mclaughlinm,vandenbroeckk(2011)theendoplasmicreticulumproteinfoldingfactoryanditschaperones:newtargetsfordrugdiscovery？brjpharmacol162:328-45；和siegelinmd,plesciaj,raskettcm,gilbertca,rossah,等人(2010)globaltargetingofsubcellularhsp90networksfortherapyofglioblastoma.molcancerther9:1638–1646)。考虑到这些hsp90同系物的atp结合袋内的显著同源性，具有拓宽的活性以包括一种或两种这些同系物的新一代hsp90抑制剂可以提高对这种抑制剂类别的效力(feltssj,owenba,nguyenp,trepelj,donnerdb,等人(2000)thehsp90-relatedproteintrap1isamitochondrialproteinwithdistinctfunctionalproperties.jbiolchem275:3305-12)。靶向一种或两种线粒体hsp(trap1和线粒体hsp90)的抑制剂特别有吸引力，这是基于线粒体hsp在癌细胞中表现出抗凋亡和抗氧化特性的发现(matassads1,amorosomr,agliaruloi,maddalenaf,sisinnil,等人(2013)translationalcontrolinthestressadaptiveresponseofcancercells:anovelrolefortheheatshockproteintrap1.celldeathdis4:e851:1-10)。trap1促进肿瘤生长，这是由于其在许多保护性过程中的作用，包括针对线粒体凋亡和耐药性的保护(chaeyc,cainomc,lisantis,ghoshjc,dohit,等人(2012)controloftumorbioenergeticsandsurvivalstresssignalingbymitochondrialhsp90s.cancercell22:331–344；maddalenaf1,sisinnil,lettinig,condelliv,matassads,等人(2013)resistancetopaclitxelinbreastcarcinomacellsrequiresaqualitycontrolofmitochondrialantiapoptoticproteinsbytrap1.moloncol7:895-906；和wangr,shaof,liuz,zhangj,wangs,等人(2013)thehsp90inhibitorsnx-2112,inducesapoptosisinmultidrugresistantk562/adrcellsthroughsuppressionofakt/nf-jbanddisruptionofmitochondria-dependentpathways.chemico-biologicalinteractions205:1–10)。在体外和体内已证明针对胞质hsp90和线粒体hsp的抑制剂对gbm有效(gasparn,sharpsy,ecclessa,gowans,popovs,等人(2010)mechanisticevaluationofthenovelhsp90inhibitornvp-auy922inadultandpediatricglioblastoma.molcancerther.9:1219-1233)。鉴于这些发现，双重hsp90/trap1抑制剂会具有显著的治疗效果，特别是在gbm和其他癌症的治疗中。

发明概述

现在已发现本文描述的化合物及其药学可接受的组合物是有效的双重hsp90/trap1抑制剂。此类化合物包括式(i)的那些化合物或者其药学可接受的盐：

其中r¹、r²、r³、r⁴和r⁵如本文描述和定义。

所提供的化合物及其药学可接受的组合物是双重hsp90/trap1抑制剂，并且用于治疗各种癌症。这样的癌症包括本文描述的那些癌症。

所提供的化合物可以单独使用(即，作为单一疗法)，或者与一种或多种有效治疗本文描述的任何适应症的治疗剂联用。

附图说明

图1表示细胞存活力，其中(a)表示在化合物1的存在下u251mg细胞存活力，测量细胞脱氢酶活性；(b)表示在化合物1的存在下u251mg细胞存活力，测量atp定量；(c)表示在化合物1的存在下u251mg胱天蛋白酶3/7活性；并且(d)表示用化合物1处理之后u251mg细胞中的tmre荧光。

图2表示细胞客户蛋白(clientprotein)降解和hsp70诱导，其中(a)表示用化合物1处理时降低的akt1水平；(b)表示用化合物1处理时egfr水平降低；(c)表示用化合物1处理时hsp70水平升高。

图3表示线粒体完整性，其中(a)表示用化合物1处理之前和之后的线粒体ocr；(b)表示用化合物1处理时的氧化应激；(c)表示分离自用化合物1处理的u251mg细胞的装载tmre的线粒体。

图4是图形描述，其中a.绘制mda-mb-231乳腺癌细胞系中化合物a(实心圆)和化合物b(空心圆)的细胞效力(ec50,μm)。利用celltiter-glo测定(promega)，按照制造商的方案测定细胞存活力；并且b.绘制mda-mb-231细胞系中化合物a和化合物b对胱天蛋白酶活性的效应。用化合物a(实心条图)或化合物b(空心条图)处理48小时之后利用胱天蛋白酶glo3/7测定试剂盒(promega)测量胱天蛋白酶3/7活性。利用单尾学生t检验确定统计显著性。**.p>0.01,***,p<0.001；****,p<0.0001。

图5是图形描述，其示出化合物a和化合物b的体外pd效应，显示mda-mb-231细胞系中hsp90客户蛋白的抑制。用化合物a(实心条图)或化合物b(空心条图)处理48小时之后利用来自r&dsystems的elisa试剂盒定量细胞裂解物中的akt1(a)和erk1(b)水平。如图4中确定统计显著性。

图6是图形描述，其示出hsp90/trap1抑制剂对mda-mb-231细胞线粒体完整性的效应。(a)化合物a引起mda-mb-231细胞的四甲基罗丹明乙酯(tmre)荧光的剂量依赖性减少，指示线粒体功能障碍，2小时(空心条图)或4小时(实心条图)。(b)与培养基中的水平相比，分离自mda-mb-231细胞的线粒体中的化合物b积累的定量。数据是来自两个独立实验的一式三份样品的平均值±sem。

图7图形示出：a.人vshei193细胞系中化合物a(实心圆)和化合物b(空心圆)的细胞效力(ec50,μm)。利用celltiter-glo测定(promega)，按照制造商的方案测定细胞存活力；b.hei193细胞系中化合物a和化合物b对胱天蛋白酶活性的效应。用化合物a(实心条图)或化合物b(空心条图)处理48小时之后利用胱天蛋白酶glo3/7测定试剂盒(promega)测量胱天蛋白酶-3/7活性。利用单尾学生t检验确定统计显著性。**:p>0.01；***:p<0.001；****:p<0.0001。

图8图形示出化合物a和化合物b的体外药效学效应和moa，显示临床相关的人vs肿瘤细胞模型hei193中的hsp90客户蛋白减少。用化合物a(实心条图)或化合物b(空心条图)处理48小时之后利用来自r&dsystems的elisa试剂盒定量来自hei193细胞的细胞裂解物中的akt1(a)和erk1(b)水平。如图7中确定统计显著性。

图9图形示出hsp90/trap1i对hei193细胞线粒体完整性的效应。(a)化合物a(实心条图)引起hei193细胞中四甲基罗丹明乙酯(tmre)荧光的剂量依赖性减少，指示早在处理之后2小时观察到的线粒体去极化。候选药物ganetespib(空心条图)在相同浓度下产生明显较弱的反应。(b)化合物a(20um)在分离自hei193细胞的线粒体中累积至与培养基中相比大6倍的水平。数据是来自两个独立实验的一式三份样品的平均值±sem。如图4中确定统计显著性。

图10图形示出化合物a和化合物b抑制mayo诊所患者衍生的gbm肿瘤细胞增殖。将gbm细胞系用所示浓度的化合物a(a)&化合物b(b)处理132小时。3个独立实验的±sd在图中示出，表示相对于未处理条件的活细胞百分比。

图11在一系列条形图中示出化合物a和化合物b的体外药效学效应，显示临床相关的mayo诊所gbmpdx细胞系中hsp90客户蛋白的抑制。用无药物(间格条图)或化合物a(实心条图)或化合物b(空心条图)处理48小时之后利用来自r&dsystems的elisa试剂盒定量来自3个mayo诊所gbmpdx细胞系的细胞裂解物中的egfr和akt1水平。

图12在条形图中示出化合物a也引起u251mg细胞的tmre荧光的剂量依赖性减少，指示线粒体功能障碍，2小时(空心条图)或4hr(实心条图)。

某些实施方案的详细描述

化合物的一般描述

在某些实施方案中，本发明提供式(i)的化合物或者其药学可接受的盐：

其中

r¹为氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基；

r³、r⁴和r⁵各自独立地为氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基、卤代(c1-c3)烷氧基、氰基、

r²为杂芳基、环烷基或杂环基，其各自任选地被1-2个独立地选自r⁶的基团取代；

p为0、1或2；

每个r⁶独立地选自卤代、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、(c1-c6)烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、芳基烷基、杂环基、羟基(c1-c6)烷基、co2h、(ch2)1-3cooh、(c1-c3)烷基羰基氧基、(c3-c6)环烷基、羟基(c3-c6)环烷基、(c4-c7)环烷基烷基、(c2-c6)烯基、卤代(c2-c6)烯基、羟基(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c3-c6)环烷基(c2-c4)炔基、卤代(c1-c6)烷基、卤代(c3-c6)环烷基、卤代(c4-c7)环烷基烷基、(c1-c6)烷氧基、(c3-c6)环烷氧基、(c4-c7)环烷基烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基、卤代(c3-c6)环烷氧基、卤代(c4-c7)环烷基烷氧基、(c1-c6)烷硫基、(c3-c6)环烷硫基、(c4-c7)环烷基烷硫基、卤代(c1-c6)烷硫基、卤代(c3-c6)环烷硫基、卤代(c4-c7)环烷基烷硫基、(c1-c6)烷基亚磺酰基、(c3-c6)环烷基亚磺酰基、(c4-c7)环烷基烷基亚磺酰基、卤代(c1-c6)烷基磺酰基、卤代(c3-c6)环烷基亚磺酰基、卤代(c4-c7)环烷基烷基亚磺酰基、(c1-c6)烷基磺酰基、(c3-c6)环烷基磺酰基、(c4-c7)环烷基烷基磺酰基、卤代(c1-c6)烷基磺酰基、卤代(c3-c6)环烷基磺酰基、卤代(c4-c7)环烷基烷基磺酰基、(c1-c6)烷基氨基、二(c1-c6)烷基氨基、(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷氧基、卤代(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷氧基羰基、h2nco、h2nso2、(c1-c6)烷基氨基羰基、二(c1-c6)烷基氨基羰基、(c1-c3)烷氧基(c1-c3)烷基氨基羰基、杂环基羰基、(c1-c6)烷基氨基磺酰基、二(c1-c6)烷基氨基磺酰基、杂环基磺酰基、(c1-c6)烷基羰基氨基、(c1-c6)烷基羰基氨基(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基磺酰基氨基、(c1-c6)烷基磺酰基氨基(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基羰基(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基、卤代(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基、羟基(c1-c6)烷氧基、芳基、杂芳基、氧代、氨基(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基氨基(c1-c6)烷基、二(c1-c6)烷基氨基(c1-c6)烷基、氨基(c2-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基氨基(c2-c6)烷氧基、二(c1-c6)烷基氨基(c2-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基羰基、羟基(c1-c6)烷基羰基、(c1-c6)烷基羟基羰基、(c1-c6)烷基羟基(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基羰基、(c3-c6)环烷基氨基羰基、{(c3-c6)环烷基}{(c1-c6)烷基}氨基羰基、二(c3-c6)环烷基氨基羰基、(c3-c6)环烷基氨基磺酰基、{(c3-c6)环烷基}{(c1-c6)烷基}氨基磺酰基、二(c3-c6)环烷基氨基磺酰基、氰基(c1-c6)烷基、氨基羰基(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基氨基羰基(c1-c6)烷基、二(c1-c6)烷基氨基羰基(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基氨基羰基(c1-c6)烷基、{(c3-c6)环烷基}{(c1-c6)烷基}氨基羰基(c1-c6)烷基、[(c1-c6)烷基(c4-c6)杂环基](c1-c6)烷基以及二(c3-c6)环烷基氨基羰基(c1-c6)烷基；

r⁷和r⁸独立地为氢或烷基，例如，(c1-c3)烷基；

r⁹为h或烷基，例如，(c1-c3)烷基。

2.化合物和定义

如本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟(氟代,-f)、氯(氯代,-cl)、溴(溴代,-br)和碘(碘代,-i)的原子。

单独或作为较大基团如“卤代烷基”的一部分使用的术语“烷基”表示饱和的单价直链或支链的烃基，除非另有说明，其具有1-10个碳原子，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。“单价”表示在一点连接至分子的剩余部分。

如本文所述，单独或作为较大基团的一部分使用的术语“环烷基”是指饱和的环状脂族单环或双环系统，除非另有说明，其具有3-10个碳环原子。单环环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基和环辛基。双环环烷基包括例如稠合至另一环烷基的环烷基，如萘烷，或者稠合至芳基(例如，苯基)或杂芳基的环烷基，如四氢萘基、二氢化茚基、5,6,7,8-四氢喹啉和5,6,7,8-四氢异喹啉。应当理解双环环烷基的连接点可以在导致稳定结构的环烷基部分上或者在导致稳定结构的芳基(例如，苯基)或杂芳基上。应当进一步理解当具体说明时，环烷基上任选存在的取代基可以存在于任何可取代的位置上，并且包括例如连接环烷基的位置。

术语“杂环基”表示4-、5-、6-和7-元饱和或部分不饱和的杂环，其包含1-4个独立地选自n、o和s的杂原子。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团”、“杂环部分”和“杂环自由基”可以互换使用。杂环基环可以在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子连接至其侧基。此类饱和或部分不饱和的杂环自由基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、氧杂环丁烷基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、吗啉基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢嘧啶基和四氢嘧啶基。杂环基可以是单环或双环的。除非另有说明，双环杂环基包括例如稠合至另一不饱和的杂环自由基或者芳香环或杂芳基环的不饱和或饱和的杂环自由基，例如，色满基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英基、四氢萘啶基、吲哚酮基(indolinonyl)、二氢吡咯并三唑基、咪唑并嘧啶基、喹啉酮基、二氧杂螺癸基(dioxaspirodecanyl)。应当理解双环杂环基连接的点可以在导致稳定结构的杂环基或芳香环上。还应当理解当具体说明时，杂环基上任选存在的取代基可以存在于任何可取代的位置上，并且包括例如连接杂环基的位置。

单独使用或者作为较大基团如“杂芳基烷基”、“杂芳基烷氧基”或“杂芳基氨基烷基”的一部分使用的术语“杂芳基”是指5-10-元芳族基团，其包含1-4个选自n、o和s的杂原子，并且包括例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳(heteroar-)”还包括其中杂芳环稠合至一个或多个芳基环的基团，其中连接基或连接点在杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、喹唑啉基和喹噁啉基。杂芳基可以是单环或双环的。应当理解当具体说明时，杂芳基上任选存在的取代基可以存在于任何可取代的位置上，并且包括例如连接杂芳基的位置。

如本文所用，单独或与其他术语共同使用的术语“芳基”是指仅含环碳原子的6-14元芳环。芳基环可以是单环、双环或三环的。非限制性实例包括苯基、萘基或蒽基等。还应当理解当具体说明时，芳基上任选存在的取代基可以存在于任何可取代的位置上。在一实施方案中，芳基是未被取代的或者单取代或二取代的。

如本文所用，术语噁烷与四氢吡喃同义，并且两者在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“个体”和“患者”可以互换使用，并且表示需要治疗的哺乳动物，例如，陪伴动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，所述个体是需要治疗的人。

本发明的化合物可以以药学可接受的盐的形式存在。为了用于药物，本发明的化合物的盐是指无毒的“药学可接受的盐”。药学可接受的盐形式包括药学可接受的酸性/阴离子盐或碱性/阳离子盐。

药学可接受的碱性/阳离子盐包括钠、钾、钙、镁、二乙醇胺、n-甲基-d-葡糖胺、l-赖氨酸、l-精氨酸、铵、乙醇胺、哌嗪和三乙醇胺的盐。

药学可接受的酸性/阴离子盐包括例如乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、碳酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰对氨基苯基砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、氢溴酸盐、盐酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐和甲苯磺酸盐。

3.示例性化合物的描述

在第一实施方案中，本发明提供式(i)的化合物或者其药学可接受的盐：

其中变量如上文所述。

在第二实施方案中，式(i)的化合物具有式(ii)：

或者其药学可接受的盐，其中变量如上文对式(i)所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第三实施方案中，式(i)或式(ii)中的r¹为卤代，其中其余变量如对式(i)中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第四实施方案中，式(i)或式(ii)中的r¹为氯，其中其余变量如对式(i)或第三实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第五实施方案中，式(i)或式(ii)中的r³、r⁴和r⁵各自独立地为(c1-c3)烷基或(c1-c3)烷氧基、氰基、羧基、n-甲酰胺或乙酰基氨基，其中其余变量如对式(i)或者第三或第四实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第六实施方案中，式(i)或式(ii)中的r³和r⁵各自为(c1-c3)烷基；并且r⁴为(c1-c3)烷氧基，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四或第五实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第七实施方案中，式(i)或式(ii)中的r³和r⁵各自为甲基；并且r⁴为甲氧基，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五或第六实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第八实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为杂芳基，其可以是单环或双环的；杂环基，其可以是单环或双环的，所述杂芳基或杂环基各自任选地被1-2个独立地选自r⁶的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六或第七实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第九实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为吡啶基、吡嗪基、四氢萘基、四氢喹啉基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英基、或色满基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、呋喃基、噁烷基(oxanyl)、二氢吡喃基或吡喃基，其各自任选地被1-2个独立地选自r⁶的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七或第八实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为吡啶基、吡嗪-2-基、色满-2-基、色满-3-基、色满-6-基、色满-7-基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-2-基、2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基、5,6,7,8-四氢喹啉-7-基、1,2,3,4-四氢萘-6-基、1,2,3,4-四氢萘-2-基、呋喃基、噁烷-2-基、噁烷-3-基、噁烷-4-基、3,4-二氢-2h-吡喃-2-基、3,4-二氢-2h-吡喃-3-基、3,4-二氢-2h-吡喃-4-基、吡喃-1-基、吡喃-2-基、吡喃-3-基、1-四氢呋喃基、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基，其各自任选地被1-2个独立地选自r⁶的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十一实施方案中，式(i)或式(ii)中的r⁶选自卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基和卤代(c1-c3)烷氧基，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十二实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为吡啶基或噁烷基，其中各自任选地被1-2个选自卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基和卤代(c1-c3)烷氧基的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十三实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²是未被取代的吡啶基或噁烷基，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十四实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为吡啶基、吡咯，或者吡咯或吡啶基的二氢或四氢衍生物，或者为吡喃或呋喃或二氢呋喃或二氢吡喃或噁烷或四氢呋喃。r²基团任选地被1-2个选自卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基和卤代(c1-c3)烷氧基的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在各种实施方案中，上述基团中的氮环杂原子和氧环杂原子可以在环的任何位置上。当r²为杂环时，n-(ch2)pch2基团和r⁶连接的位置可以在杂环的相同碳原子上。但是，应当理解每个碳原子连接有4个键。因此，本段中描述的含氮基团中的氮原子可以在5-元环的1、2-或3-位或者在6-元环的1、2-或3-或4-位中。相似地，氧环原子可以在5-元环的1、2-或3-位或者6-元环的1、2-或3-或4-位中。

在第十五实施方案中，式(i)或式(ii)中的r²为吡啶基或吡咯，或者四氢呋喃或噁烷，其中r²可以任选地被1-2个选自卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基和卤代(c1-c3)烷氧基的基团取代，其中其余变量如对式(i)或者第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案中所述，除了p为0或1。在一实施方案中，当r²为噁烷时，p为0。在另一实施方案中，当r²为吡啶基时，p为1。

在第十六实施方案中，式(i)的化合物具有式(iii)：

或者其药学可接受的盐，其中

r¹为卤代；

r³和r⁵为(c1-c3)烷基；

r⁴为(c1-c3)烷氧基；并且

r⁶选自氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基和卤代(c1-c3)烷氧基。

在第十七实施方案中，式(iii)中的r⁶为氢，其中其余变量如对式(iii)所述。

在第十八实施方案中，式(i)的化合物具有式(iv)：

或者药学可接受的盐，其中r¹、r³、r⁴、r⁵、r⁶和p如上述任何实施方案中定义。应当理解在上式中，r⁶和n(ch2)pch2基团可以在噁烷基环的不同碳原子上或在噁烷基环的相同碳原子上取代。

例如，在一实施方案中，所述化合物具有式iv，其中r¹、r³、r⁴和r⁵如上述实施方案中任一个中定义。

在另一实施方案中，r¹、r³、r⁴和r⁵各自独立地为氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基，并且r⁶选自氢、烷基、芳基，其是未被取代的或者被卤代、烷基或卤代烷基取代，或者r⁶为包含氮作为唯一的环杂原子的5-或6-元杂芳基。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中

r¹为卤代；

r³和r⁵为(c1-c3)烷基；

r⁴为(c1-c3)烷氧基；并且

r⁶选自氢、烷基、吡啶基，其可以是未被取代的或者被烷基或卤代取代，或者r⁶为苯基，其可以是未被取代的或者被卤代或烷基取代。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中式(iv)中的r⁶为氢、4-氟苯基、2-吡啶基或5-甲基-2-吡啶基，其中其余变量如对式(iv)所述。

在另一实施方案中，所述化合物具有式iv，其中p为0，其中r¹、r³、r⁴和r⁵如上述实施方案中任一个中定义。

在另一实施方案中，所述化合物具有式iv，其中p为0，r¹、r³、r⁴和r⁵各自独立地为氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基，并且r⁶选自氢，未被取代的或者被卤代、烷基或卤代烷基取代的芳基，或者包含氮作为唯一的环杂原子的5-或6-元杂芳基。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中p为0，

r¹为卤代；

r³和r⁵为(c1-c3)烷基；

r⁴为(c1-c3)烷氧基；并且

r⁶选自可以是未被取代的或者被烷基或卤代取代的吡啶基，或者可以是未被取代的或者被卤代或烷基取代的苯基，或者r⁶为氢。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中式(iv)中的r⁶为4-氟苯基、2-吡啶基或5-甲基-2-吡啶基，其中其余变量如对式(iv)所述，并且p为0。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(v)

或者其药学可接受的盐，其中

r¹、r³、r⁴和r⁵和p如本文上述任何实施方案中定义。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(v)，其中

p为0。

在另一实施方案中，所述化合物具有式iv，其中p为0，其中r¹、r³、r⁴和r⁵如上述实施方案中任一个中定义。

在另一实施方案中，所述化合物具有式iv，其中p为0，r¹、r³、r⁴和r⁵各自独立地为氢、卤代、(c1-c3)烷基、卤代(c1-c3)烷基、(c1-c3)烷氧基或卤代(c1-c3)烷氧基，并且r⁵选自未被取代的或者被卤代、烷基或卤代烷基取代的芳基，或者包含氮作为唯一的环杂原子的5-或6-元杂芳基。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中p为0，

r¹为卤代；

r³和r⁵为(c1-c3)烷基；

r⁴为(c1-c3)烷氧基；并且

r⁶选自氢、可以是未被取代的或者被烷基或卤代取代的吡啶基、或者可以是未被取代的或者被卤代或烷基取代的苯基。

在另一实施方案中，所述化合物具有式(iv)，其中式(iv)中的r⁶为氢、4-氟苯基、2-吡啶基或5-甲基-2-吡啶基，其中其余变量如对式(iv)所述，并且p为0。

本发明的化合物的具体实例在实施例中提供。本发明包括这些化合物的药学可接受的盐以及中性形式。

在某些实施方案中，本发明提供前述化合物或后文所述实例的任一种，或者其药学可接受的盐。

在某些实施方案中，本发明提供一种治疗患有hsp90/trap1介导的癌症的患者(例如，人)的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的本文所述的任何化合物，或者其药学可接受的盐或组合物。

4.使用、配制和给药

药学可接受的组合物

根据另一实施方案，本发明提供一种利用包含式(i)的化合物以及药学可接受的载体、辅剂或媒介物的组合物治疗患有hsp90/trap1介导的癌症的个体(例如，人)的方法。在某些实施方案中，所提供的组合物中式(i)的化合物的量是这样的，其作为生物样品或个体中的hsp90/trap1的双重抑制剂是有效的。在某些实施方案中，配制所提供的组合物用于向需要此类组合物的个体给药。在某些实施方案中，配制所提供的组合物用于向个体口服给药。

术语“药学可接受的载体、辅剂或媒介物”是指不破坏配制的化合物的药理学活性的无毒的载体、辅剂或媒介物。本发明的组合物中可以使用的药学可接受的载体、辅剂或媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素系物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。remington'spharmaceuticalsciencesed.bygennaro,mackpublishing,easton,pa.,1995(其内容援引加入本文)公开了配制药物组合物中使用的各种载体及其已知的制备技术。

本文所述的组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、含服、阴道或通过植入型药盒给药。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。

用于口服给药的液体剂型包括但不限于药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物，所述液体剂型还可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包含辅剂，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可注射制剂(例如，无菌可注射的水性或油质混悬剂)可以根据已知的技术利用合适的分散剂或润湿剂(wettingagent)以及助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液剂、混悬剂或乳剂，例如1,3-丁二醇中的溶液剂。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸用于制备注射剂。

可注射的制剂可以例如通过细菌过滤器(bacterial-retainingfilter)过滤或者通过掺入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂为无菌固体组合物形式，可以在使用之前将其溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射的介质中。

为了延长所提供的化合物的作用，从皮下或肌内注射起减缓化合物的吸收常常是期望的。这可以通过使用具有不良水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬剂来完成。化合物的吸收速率则取决于其溶出速率，而后者则可能取决于晶体大小和晶形。或者，肠胃外给药的化合物形式的延迟吸收通过将该化合物溶解或悬浮于油媒介物中来完成。可注射的贮库(depot)形式是通过形成化合物在生物可降解的聚合物(例如聚丙交酯-乙交酯(polylactide-polyglycolide))中的微囊基质来制备的。根据化合物与聚合物的比例以及所采用的具体聚合物的性质，可以控制化合物释放的速率。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮库可注射的制剂还可以通过将化合物包裹于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)混合，和/或与以下物质混合：a)填充剂或増量剂(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂(humectant)，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂(solutionretardingagent)，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，以及它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物还可以用作软明胶胶囊和硬明胶胶囊中的填料，使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。可以制备具有包衣和壳(例如肠溶衣以及药物配制领域公知的其他包衣)的片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可以任选地包含遮光剂，并且还可以是这样的组合物，它们仅仅或者优选地在肠道的某些部分中任选地以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物还可以用作软明胶胶囊和硬明胶胶囊中的填料，使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂。

所提供的化合物还可以是微囊形式，具有一种或多种如上文所述的赋形剂。可以制备具有包衣和壳(例如肠溶衣、控释包衣以及药物配制领域公知的其他包衣)的片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。在此类固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂混合，所述惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉。作为正常实践，此类剂型还可以包含除惰性稀释剂之外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。

它们可以任选地包含遮光剂，并且还可以是这样的组合物，它们仅仅或者优选地在肠道的某些部分中任选地以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于本发明的化合物的局部或透皮给药的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性组分与药学可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼液也包括在本发明的范围内。

此外，本发明包括使用透皮贴剂，其具有将化合物控制递送至身体的额外优点。此类剂型可以通过将所述化合物溶解或分散于适当介质中来制备。吸收促进剂也可以用来增加化合物通过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或者通过将所述化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

本文提供的药学可接受的组合物可以配制用于口服给药。此类制剂可以与食物或不与食物一起给药。在一些实施方案中，本发明的药学可接受的组合物不与食物一起给药。在其他实施方案中，本发明的药学可接受的组合物与食物一起给药。

可以与载体材料组合以制备单一剂型组合物的所提供的化合物的量会根据待治疗的患者和给药的特定模式变化。

还应当理解任何特定患者的具体剂量和治疗方案会取决于各种因素，包括年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、治疗医生的判断以及治疗的特定疾病的严重程度。组合物中所提供的化合物的量还取决于组合物中的特定化合物。

化合物和药学可接受的组合物的用途

本文描述的化合物和组合物一般可用于hsp90/trap1的双重抑制。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括给药所提供的化合物或组合物。

如本文所用，术语“治疗”是指逆转、缓解、延迟疾病或病症或者其一种或多种症状的发生，或者抑制疾病或病症或者其一种或多种症状的发展，如本文所述。在一些实施方案中，可以在一种或多种症状已发展之后给予治疗，即治疗性治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下给予治疗。例如，可以在症状发生之前向易感个体给予治疗(例如，根据症状历史和/或根据遗传或其他易感性因素)，即预防性治疗。还可以在症状已缓解之后继续治疗，例如防止或延迟它们的复发。

术语“癌症”或“肿瘤”是本领域公知的，是指例如个体中具有典型的致癌细胞特征的细胞的存在，如不受控制的增殖、永生性、转移潜力、快速生长和增殖速率、减少的细胞死亡/凋亡以及某些特征性形态学特征。

如本文所用，“癌症”或“肿瘤”是指人中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌(carcinomas)和肉瘤。如本文所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用，并且为单数或复数形式，是指已经历使它们成为宿主生物体病理的恶性转化的细胞。通过成熟的技术特别是组织学检查，可以容易地区分原发癌细胞(即，获得自恶性转化部位附近的细胞)与非癌性细胞。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且还包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。

在某些实施方案中，根据本文所述方法可治疗的癌症包括癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤和白血病。在一实施方案中，可治疗的癌症包括胰腺癌、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、骨癌、脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌、口腔癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌和外阴癌。在另一实施方案中，皮肤癌选自黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌和皮肤t-细胞淋巴瘤(ctcl)。在另一实施方案中，肿瘤学病症是三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer)。

术语“肉瘤”一般是指由胚胎结缔组织样物质组成且一般由包埋在纤维状或均质物质中的紧密细胞构成的肿瘤。可以用iv制剂中的coq10的胶体分散体治疗的肉瘤的实例包括例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(abemethy'ssarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维耳姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、b细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、t-细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤以及毛细管扩张性肉瘤。

术语“黑素瘤”用来表示产生自皮肤和其他器官的黑色素细胞系统的肿瘤。可以用iv制剂中的coq10的胶体分散体治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤、s91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、指甲下黑素瘤(subungalmelanoma)和浅表扩散性黑素瘤。

术语“癌”是指由倾向于浸润周围组织并产生转移的上皮细胞组成的恶性新生长。如本文所述，可以用iv制剂中的coq10的胶体分散体治疗的癌包括例如腺泡癌、腺泡状癌、囊性腺样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinomaadenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basalcellcarcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、肛管基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管肺癌、髓样癌(cerebriformcarcinoma)、肝小胆管癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮、柱状细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌(cylindricalcellcarcinoma)、导管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚胎性癌、髓样癌(encephaloidcarcinoma)、表皮状癌(epiermoidcarcinoma)、腺样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌(giantcellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandularcarcinoma)、颗粒细胞癌、基底细胞癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌、肝细胞癌、许特尔细胞癌、透明癌、肾上腺样癌(hypemephroidcarcinoma)、幼稚性胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔肿瘤、库尔契茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinomalenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinomamedullare)、髓样癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌、软癌、梅克尔细胞癌、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucouscarcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinomaossificans)、骨化性癌(osteoidcarcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、粉刺癌、肾的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌(scirrhouscarcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌、鳞癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinomatuberosum)、结节性皮癌(tuberouscarcinoma)、疣状癌以及绒毛状癌。

本发明进一步涉及用于治疗或改善本文所述癌症的联合疗法。在一些实施方案中，所述联合疗法包括给药式i表示的至少一种化合物与一种或多种选自以下的药剂的组合：生长因子、抗炎剂、血管加压剂、胶原酶抑制剂、外用类固醇、基质金属蛋白酶抑制剂、抗坏血酸盐、钙网蛋白、四环素、纤连蛋白、胶原、血小板反应蛋白、转化生长因子(tgf)、角质形成细胞生长因子(kgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)、血小板衍生的生长因子(pdgf)、neu分化因子(ndf)以及透明质酸。

本发明进一步提供一种治疗个体如人的方法，所述个体患有上述病症或疾病之一。

本发明进一步涉及所提供的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗和/或预防和/或改善本文提到的疾病和病症。

本文描述的化合物或组合物可以利用有效治疗或减轻本文所述一种或多种癌症的严重程度的任何量和任何给药途径给药。需要的确切量随个体变化，取决于个体的物种、年龄和一般条件，感染的严重程度，特定药剂，其给药模式等。所提供的化合物优选配制为单位剂型便于给药和剂量的均一性。如本文所用的表述“单位剂型”是指适合待治疗的患者的药剂的物理上分离的单位。然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的每日总使用由主治医师在健全的医学判断的范围内决定。任何特定患者或生物体的具体有效剂量水平取决于各种因素，包括治疗的病症和病症的严重程度；采用的具体组合物的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间、给药途径和采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物组合或同时使用的药物，以及医学领域公知的相似因素。

本发明的药学可接受的组合物可以向人和其他动物口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹腔内、局部(通过粉末、软膏剂或滴剂)、含服、作为口腔或鼻腔喷雾剂而给药，取决于治疗的感染的严重程度。在某些实施方案中，所提供的化合物可以以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg个体体重、优选约1mg/kg至约25mg/kg个体体重的剂量水平口服或肠胃外给药，每天一次或多次，以便获得期望的疗效。

如本文所用，术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物，获得自哺乳动物的活检材料或其提取物，以及血液、唾液、尿液、粪便、精液、泪液或其他体液或者它们的提取物。

可以与载体材料组合以制备单一剂型的所提供的化合物和额外的治疗剂(如上文所述包含额外的治疗剂的那些组合物中)的量会根据治疗的宿主和特定给药模式变化。

在包含额外的治疗剂的那些组合物中，所述额外的治疗剂和所提供的化合物可以协同作用。因此，此类组合物中额外的治疗剂的量会少于仅用所述治疗剂的单一疗法中需要的量。

本发明的组合物中存在的额外的治疗剂的量不会超过包含所述治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常给药的量。

实施例

如下文实施例中所述，在某些示例性实施方案中，根据以下一般方法制备化合物。应当理解，如本文所述，虽然一般方法描述本发明的某些化合物的合成，但以下一般方法和本领域技术人员已知的其他方法可以适用于所有化合物以及这些化合物中每种的亚类和种类。

可以通过本领域公知的技术制备式(i)的化合物。以下路线i是示例性的。通过使式(502)的中间化合物与适当的式(503)的氯嘧啶-胺中间体在合适的碱如三乙胺的存在下在微波辐照下在中等温度(例如，65℃)下于极性非质子溶剂如二甲基甲酰胺(dmf)中反应来获得作为期望产物的最终嘧啶类似物。可以通过使式(500)的化合物与式(501)的胺反应来制备式(502)的中间化合物，所述反应在极性非质子溶剂如二甲基甲酰胺(dmf)中于合适的碱如n,n-二异丙基乙胺(dipea)的存在下通过加热进行，如在微波辐照(mw)下于高温(例如，120℃)下进行。

路线i：

式i的化合物的制备

根据下文列出的一般方法制备式(i)的化合物。

实施例1：6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-[2-(吡啶-2-基)乙基]嘧啶-2,4-胺(化合物1)

(a)[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基][2-(吡啶-2-基)乙基]胺

在10.0ml棕色玻璃瓶中，将2-(2-氨基乙基)-吡啶(488.8mg,4.0mmol)溶于dmf(2.0ml)中，然后添加二异丙基乙胺(346.9ul,2.0mmol)。然后将2-氯甲基-3,5-二甲基-4-甲氧基吡啶盐酸盐(222mg,1.0mmol)添加至反应混合物，然后用盖封闭瓶并在100℃下继续加热1.5小时。然后用水(10ml)洗涤反应混合物并萃取入二氯甲烷(30ml)中。在硫酸钠上干燥有机层并在减压下蒸发。在真空柱色谱上利用己烷-etoac(0-100％)和/或二氯甲烷-甲醇(0–20％)作为溶剂系统纯化所得的剩余物。将纯产物流分合并并蒸发以产生浅黄色液体状的[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基][2-(吡啶-2-基)乙基]胺(245mg,0.9mmol,90％收率)。对c16h21ln3o计算的ms:m/z[m+h]⁺，272；实测值272。

(b)6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-[2-(吡啶-2-基)乙基]嘧啶-2,4-胺(化合物1)

在10.0ml棕色玻璃瓶中，将[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基][2-(吡啶-2-基)乙基]胺(136mg,0.5mmol)溶于乙醇(2.0ml)中，然后添加三乙胺(140ul,1.0mmol)。然后将2-氨基4,6-二氯嘧啶(98mg,0.6mmol)添加至上述混合物中，然后用盖封闭瓶并在100℃下加热5-10小时。蒸发反应混合物并用水(15ml)洗涤，萃取入二氯甲烷(2x25ml)。合并有机层，在硫酸钠上干燥并蒸发。然后在真空柱色谱上利用己烷-etoac(0-100％)和/或二氯甲烷-甲醇(0–20％)作为溶剂系统纯化。将纯产物流分合并并蒸发以产生褐色固体状的6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-[2-(吡啶-2-基)乙基]嘧啶-2,4-胺(110mg,0.276mmol,55％收率)。¹hnmr(cdcl3,400mhz):8.51(d,j＝7.2hz,1h),8.16(s,1h),7.56(dt,j＝6.4,1.2hz,1h),7.11(m,2h),5.94(brs,1h),4.76(brs,4h),3.81(m,2h),3.74(s,3h),3.03(t,j＝5.6hz,2h),2.22(s,3h),2.17(s,3h)；对c20h23cln6o计算的ms:m/z[m+h]⁺，399；实测值399。

实施例2：6-氯-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]嘧啶-2,4-二胺(化合物a)

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成6-氯-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]嘧啶-2,4-二胺。制得白色固体状的化合物(75mg,31％收率)。¹hnmr(499mhz,氯仿-d)δ8.06(s,1h),7.34–7.19(m,2h),7.04(t,j＝8.6hz,2h),5.55(s,1h),4.70(s,2h),3.91(d,j＝9.5hz,2h),3.71(s,3h),3.55(d,j＝8.8hz,2h),2.18(s,3h),2.16–2.00(m,2h),1.88(s,3h),1.58(s,2h)；对c25h29clfn5o2计算的ms:m/z[m+h]⁺，487；实测值487。

实施例3：6-氯-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}-4-n-[(4-甲氧基-3-甲基吡啶-2-基)甲基]嘧啶-2,4-二胺(化合物c)

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成6-氯-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}-4-n-[(4-甲氧基-3-甲基吡啶-2-基)甲基]嘧啶-2,4-二胺。制得白色固体状的所得化合物(155mg,66％收率)。¹hnmr(499mhz,dmso-d6)δ8.10(d,j＝5.7hz,1h),7.53–7.31(s,2h),7.27–7.05(m,2h),6.83(d,j＝5.7hz,1h),6.35(s,2h),5.71(s,1h),3.79(s,3h),3.30(m,2h)2.69(s,7h),2.18(t,j＝8.1hz,5h),1.95–1.85(m,4h)；对c24h27clfn5o2计算的ms:m/z[m+h]⁺，473；实测值473。

实施例4：6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(6-甲基吡啶-2-基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(化合物d)

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(6-甲基吡啶-2-基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺。制得白色固体状的化合物(153mg,63％收率)。¹hnmr(499mhz,dmso-d6)δ8.02(s,1h),7.60(t,j＝7.7hz,1h),7.20(d,j＝8.0hz,1h),7.11(d,j＝7.6hz,1h),6.29(s,2h),5.61(s,1h),3.76(s,4h),3.67(s,3h),3.26(s,4h),2.49(s,3h),2.43(s,3h),2.12(s,3h),1.85(d,j＝39.6hz,4h)；对c25h31cln6o2计算的ms:m/z[m+h]⁺，484；实测值484。

实施例5：6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(吡啶-2-基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(化合物e)

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成6-氯-4-n-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(吡啶-2-基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺。制得白色固体状的化合物(140mg,60％收率)。¹hnmr(499mhz,dmso-d6)δ8.59(dd,j＝1.8,4.9hz,1h),8.01(s,1h),7.73(td,j＝1.9,7.7hz,1h),7.45(d,j＝8.0hz,1h),7.27(ddd,j＝1.0,4.7,7.4hz,1h),6.29(s,3h),5.63(s,1h),3.77(s,4h),3.66(s,3h),3.30–3.09(m,4h),2.31(m,3h),2.12(s,3h),1.97–1.75(m,4h)；对c24h29cln6o2计算的ms:m/z[m+h]⁺，470；实测值470。

实施例6：6-氯-4-n-[(4-氯-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(化合物b)

(a)2-(氯甲基)-3,5-二甲基吡啶-4-醇

在50ml圆底烧瓶中，将3,5-二甲基-4-甲氧基吡啶盐酸盐(444mg,2.0mmol)悬浮于二氯甲烷(5.0ml)中。然后在0℃下利用注射器将三溴化硼(1.0m于二氯甲烷中)溶液(6.0ml,6.0mmol)添加至反应混合物中。然后允许缓慢升至室温并继续过夜。然后冷却至0℃，并且用饱和的nahco3溶液随后5.0ml水终止。然后用乙酸乙酯(10ml)萃取。然后用更多饱和的nahco3溶液将水层碱化，并且通过过滤收集沉淀的产物。干燥产物(180mg)并用于下一步，没有进一步纯化。对c8h10clno计算的ms:m/z[m+h]⁺，172；实测值172。

(b)4-氯-2-(氯甲基)-3,5-二甲基吡啶盐酸盐

在10ml玻璃瓶中，将2-(氯甲基)-3,5-二甲基吡啶-4-醇(172mg,1.0mmol)悬浮于pocl3(2.0ml)中，然后封闭盖并在80℃下加热1小时。然后完全蒸发至干燥并分析以获得褐色固体(225mg)，直接用于下一步。对c8h9cl2n计算的ms:m/z[m+h]⁺，191；实测值191。

(c)[(4-氯-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]({[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基})胺

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成[(4-氯-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]({[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基})胺。制得胶状固体的化合物(251mg)。对c20h24clfn2o计算的ms:m/z[m+h]⁺，364；实测值364。

(d)6-氯-4-n-[(4-氯-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(化合物b)

按照实施例1中描述的方法和适当的原料合成6-氯-4-n-[(4-氯-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基]-4-n-{[4-(4-氟苯基)噁烷-4-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺。制得白色固体状的化合物(38mg,16％收率)。¹hnmr(499mhz,dmso-d6)δ8.14(s,1h),7.41(t,j＝7.0hz,2h),7.15(t,j＝8.8hz,2h),6.38(s,2h),5.69(s,1h),3.83(m,4h),2.23(s,3h),1.97(m,8h)；对c24h26cl2fn5o计算的ms:m/z[m+h]⁺，491；实测值491。

实施例7：化合物a的制备

方法(a)在4.0ml玻璃瓶中，在2mletoh中合并原料101和102。添加et3n，并且在100℃下继续反应3小时。将产物转移至圆底烧瓶(25ml)，添加5ml的ch2cl2并在减压下蒸发。之后添加额外的30ml的ch2cl2，并且用水在分液漏斗中洗涤。将分离的有机层在硫酸钠上干燥并蒸发。将剩余物在vcc上利用己烷-etoac(0-100％)纯化，并且将纯产物流分合并并蒸发至最终产物cap01088。最终产物的收率为75mg，并且通过nmr和质谱证实。¹hnmr(499mhz,cdcl3):88.06(s,1h),7.34-7.19(m,4h),7.04(t,j＝8.6hz,2h),5.55(s,1h),4.70(s,2h),3.91(d,j＝9.5hz,2h),3.71(s,3h),3.55(d,j＝8.8hz),2.18(s,3h),2.16-2.00(m,3h),1.88(s,3h),1.58(s,2h)。计算的质量：486；实测值486.9

方法(b)将2-(氯甲基)-4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶盐酸盐(101)溶于dmf中，并且用相应的亲核伯胺(102)处理，然后用n,n–二异丙基乙胺(dipea)处理。利用微波辐照将所得的反应混合物在120℃下加热10min。在反应完成时，利用自动化制备hplc纯化粗二取代胺(3)产物。然后将来自上述反应的胺产物的悬浮液和4-r,6-氯-嘧啶-2-胺(4)溶于dmf中并用et3n处理，并且将所得的反应混合物在65℃下加热2.5小时。水性检查之后，利用自动化制备hplc纯化粗产物以获得最终的嘧啶类似物作为期望产物。

生物学测定

一般方法

重组蛋白

将重组全长人hsp90和δ59trap1克隆入pet载体用于大肠杆菌(e.coli)表达，用tev可切割的n-端6his-亲和纯化标签。在转化为bl21(de3)之前，序列证实所有克隆的载体。利用nta树脂(lifetechnologies)然后尺寸排阻色谱利用fplc纯化表达的蛋白。通过maldi-tof证实纯化蛋白的分子质量，并且通过sds-page评价纯度。

细胞培养

在37℃和5％co2下于补充了glutamax且包含10％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素(lifesciences)的rpmi培养基中维持u251mg细胞。

荧光偏振(fp)位移测定

fp测定基于fitc-标记的格尔德霉素(ga-fitc)的hsp90或trap1抑制剂的定量位移，并且如howesr,barrilx,dymockbw,grantk,northfieldcj,等人(2006)afluorescencepolarizationassayforinhibitorsofhsp90(2006).analbiochem.350:202-213所述进行。测定条件为20mmhepes，ph-7.5，50mmkcl，5mmmgcl2，20mm钼酸钠，2mmdtt，0.01％np40，100ug/mlbsa，50nmhsp90或200nmtrap1，1％dmso以及8nm(对于hsp90)或20nm(对于trap1)ga-fitc，存在递增浓度的受试化合物。将测定混合物在4℃下温育24h，并且在环境温度下用polarstaromega微量滴定酶标仪在485nm的激发和520nm的发射下测量孔中fp的变化。

细胞存活力测定

使用细胞计数试剂盒(cck-8测定试剂盒，dojindo)和adp-glo测定(lifetechnologies)来定量受试化合物对细胞存活力的影响。将u251mg细胞接种至96孔组织培养板中，并且在37℃和5％co2下温育16h。将递增浓度的受试化合物添加至孔中，从包含dmso的储备溶液至0.05％的最终dmso浓度，并且在37℃下温育72hr。然后将cck-8试剂盒试剂或adp-glo试剂添加至孔中，并且利用synergyht微量滴定酶标仪(biotek)在450nm(对于cck测定)下测量吸光度或者利用polarstaromega微量滴定酶标仪(bmg)测量发光(对于adp-glo测定)。

胱天蛋白酶激活测定

如上文所述将u251mg细胞接种，维持，并用受试化合物在37℃下处理48h。利用胱天蛋白酶-3/7发光测定试剂盒(promega)根据制造商的建议完成总细胞胱天蛋白酶-3和7活性的定量，并用polarstaromega微量滴定酶标仪(bmg)分析。

生物标记定量

将u251细胞平板接种在6孔格式培养皿中，于37℃和5％co2下过夜，然后用递增浓度的受试化合物在37℃和5％co2下处理48h。利用elisa试剂盒(r&dsystems)根据制造商的建议并利用synergyht微量滴定酶标仪(biotek)完成细胞裂解物中总akt1、egfr和hsp70的定量。如试剂盒方法中推荐地制备细胞裂解物。利用bradford测定(thermoscientific)确定利用离心澄清的裂解物的蛋白浓度，并且将该值用来归一化生物标记值。

四甲基罗丹明乙基酯(tmre)测定

对于基于细胞的测定，将细胞用各种浓度的受试化合物在37℃和5％co2下处理48小时。然后将tmre(200nm)添加至孔中30min，并且在洗涤细胞后利用倒置zeisslsm710共聚焦显微镜通过荧光显微镜术或利用荧光酶标仪(544ex/590em)通过分光光度法监测荧光活性的变化。通过与添加tmre之前用20umfccp预处理10min的匹配孔比较来计算具体tmre荧光。对于线粒体测定，未处理的u251mg细胞在t75培养瓶中生长至汇合。利用线粒体分离试剂盒(thermoscientific)分离来自这些细胞的线粒体并在37℃下装载试剂盒缓冲液中的0.1mmtmre20min。洗涤之后，将装载tmre的线粒体(2ug/孔)在96孔黑板中用受试化合物温育，并且利用荧光酶标仪(ex544/em590)在30℃下动态监测荧光的变化。对照孔中用20umfccp处理之后的荧光强度对应于完全去极化状态。

线粒体呼吸功能测定

利用seahorsexf^e24细胞外流量分析仪(seahorsebioscience)实时测定受试化合物对线粒体耗氧率(ocr)的效应。基本上如制造商推荐地进行基于细胞的测定。简单地说，利用适当的细胞密度将细胞接种于24孔xf板中。在运行测定之前将“fluxpak”筒(包含o2和h⁺敏感荧光团)在xf校准溶液中水合过夜。第二天，向细胞补充xf测定培养基(未缓冲的包含10mm葡萄糖和2mm丙酮酸盐的dmem)并再置于不含co2的37℃培养箱中持续1小时。用受试化合物注射孔之前测量基底ocr。随后，通过用0.125mg/ml寡霉素(atp合成酶抑制剂)、0.5mmfccp(解偶联剂)和1mm鱼藤酮(复合物i抑制剂)顺序处理细胞同时连续测量ocr来确定线粒体生物能学应激。

式(i)的hsp90/trap1抑制剂的效力和u251mg细胞功效

化合物1的hsp90iki值确定为39.4nm，并且trap1ki值确定为50.4nm。然后在各种基于u251mg细胞的测定中评价化合物1的hsp90抑制剂功效。利用细胞脱氢酶活性和atp定量确定与细胞在37℃下温育72h后在化合物1的存在下的u251mg细胞存活力。这两个测定均给出相似的结果，化合物1产生1.72和2.5um的ic50值(图1a和1b)。在50um化合物1的存在下持续48h后u251mg胱天蛋白酶3/7活性增加6.8倍(图1c)。对于化合物1，在低至1.6um的浓度的存在下观察到胱天蛋白酶活性增加。在用化合物1处理48hr之后的细胞中，胱天蛋白酶3/7的增加(凋亡的度量)与细胞不能隔离tmre成正比，后者反映线粒体通透性转变(图1d)。

增加的akt激活和egfr表达是gmb中的标识。elisa用来定量hsp90抑制剂介导的akt1和egfr降解。化合物1显著降低akt1水平，在15.6um的浓度下降低79％，具有2.4um的ic50值(图2a)。对于化合物1，在16um的浓度下egfr水平降低71％(图2b)。hsp70是成熟的hsp90抑制剂的生物标记，其对hsp90抑制应答在细胞中特征性增加。在相同浓度下在15.6um化合物1的存在下u251mg细胞中的hsp70水平升高6倍(图2c)。

hsp90/trap1抑制剂的线粒体靶向：

trap1被认为是癌症治疗的重要分子靶标，这是由于其在细胞应激的条件下保持细胞完整性中的关键作用。已显示trap1抑制剂通过引起快速线粒体通透性转变诱导癌细胞凋亡，并且还可以参与负责多重耐药性的促生存途径。为了确定本文所述化合物对u251mg细胞的凋亡效应是否对线粒体完整性表现出相似模式，将细胞在胱天蛋白酶测定中使用的相同条件下用化合物1处理，之后将细胞用tmre处理30min，有或无fccp预处理。结果显示特定tmre荧光减少，指示线粒体膜电位降低，其与化合物1的浓度成比例(图1d)且与胱天蛋白酶3/7活性的增加平行(图1c)。与未处理的相比，特定tmre荧光在5um的化合物1下减少42％，并且在50um的化合物1下减少73％。

还通过在顺序添加线粒体应激物寡霉素、fccp和鱼藤酮之后在化合物1的存在下温育细胞来在应激条件下测量线粒体呼吸率，从而评价化合物对u251mg细胞线粒体功能的效应。化合物1引起orc的快速(分钟)剂量依赖性减少，指示功能失调的线粒体生物能学和增加的氧化应激(图3a和3b)。

为了证实化合物1接近位于线粒体基质中的trap1和hsp90，将化合物1与分离自u251mg细胞的装载tmre的线粒体在30℃下温育，并且连续监测tmre荧光强度的变化。化合物1在几分钟内引起线粒体电位的剂量依赖性降低(图3c)，表明所述化合物有效穿透线粒体外膜和内膜，并且能够通过trap1和线粒体hsp90抑制直接破坏分离的线粒体的功能完整性。化合物1将膜电位减少至52％(20um)和61％(4um)。

程序性肿瘤细胞死亡和细胞生物标记测定

程序性细胞死亡：肿瘤细胞系mda-mb-231和hei-193分别获得自atcc和ucsdveteransmedicalcenter。利用0.25％胰蛋白酶/edta提取之后将细胞在培养基中培养并传代。将细胞以1.3x10⁴个细胞/孔于100μl体积的培养基中接种至96孔组织培养板中。将细胞培养24小时之后，将递增浓度的hsp90抑制剂从包含dmso的储备溶液一式三份添加至孔中，并且通过搅拌温和混合。所有孔中的最终dmso浓度为0.25％。将细胞培养48小时。利用根据制造商的建议使用的均质胱天蛋白酶3/7测定试剂盒测量胱天蛋白酶3/7活性。详细地说，将等体积的胱天蛋白酶3/7测定试剂盒试剂添加至孔中，并且在环境温度下利用微量滴定酶标仪在3、6和23小时之后采集荧光读数(ex/em485/528)。在dmso中制备罗丹明110储备溶液(10mm)，并且用水稀释在4000-62.5nm的范围内。测量稀释液的荧光强度以获得标准曲线。利用培养基将细胞接种至组织培养板中。接种之后，将培养物在37℃和5％co2下温育16小时。将递增浓度的hsp90抑制剂从包含dmso的储备溶液添加至培养物中，并且通过搅拌温和混合。所有孔中的最终dmso浓度为0.25％。将培养物平板接种在386孔格式中，并且在37℃和5％co2下温育72小时。用根据制造商的建议使用的atplite试剂盒(perkinelmer)测量细胞存活力。将培养物在环境温度下平衡30min，并且将10μl的atplite试剂盒试剂添加至每个孔中。将培养物在黑暗中以1,000rpm混合2min，并且利用微量滴定酶标仪(polarstaromega微量滴定酶标仪；bmglabtech)完成发光定量(图4和7)。

细胞生物标记测定：将细胞在培养基(rpmi-glutamax，10％fcs，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养。利用0.25％胰蛋白酶/edta提取之后将细胞传代，并且将3x10⁵个细胞接种在六孔板的每个孔中(总体积2.5ml/孔)。将细胞培养24小时之后，将增加浓度的hsp90抑制剂从包含dmso的储备溶液一式三份添加至孔中，并且通过搅拌温和混合。所有孔中的最终dmso浓度为0.25％。然后在裂解物制备之前将处理的细胞培养48小时。从孔中去除培养基，并且将孔用包含1mmcacl2和0.5mmmgcl2的dpbs洗涤两次。然后将细胞在裂解缓冲液(pbs，0.5％tx-100，1mmedta，5mmnaf，1mm原钒酸钠，2.5mm焦磷酸钠和1xhalt蛋白酶抑制剂)中裂解。将100μl的裂解缓冲液/孔用于6孔板，并且将40μl用于12孔板。将裂解物储存在-80℃下直至测定akt1和erk1。利用根据制造商的建议使用的bca蛋白测定试剂盒确定细胞裂解物中的蛋白浓度。

将25μl的各裂解物在pbs中的1:10稀释液添加至96孔板的孔中。通过添加25μl的2.0-0.125mg/ml的牛血清白蛋白(bca蛋白测定试剂盒提供)稀释液制备标准曲线。添加200μl的bca蛋白测定试剂盒试剂，并且将混合物在37℃下温育30min。利用微量滴定酶标仪(model#synergyht；biotekinc.,winooski,vt)确定蛋白浓度。

利用根据制造商的建议使用的来自r&dsystems的试剂盒测量细胞裂解物中的akt1和erk1水平。在1:24稀释液中测定细胞裂解物的akt1和erk1elisa。从标准曲线推断细胞裂解物中的akt1和erk1浓度并对裂解物蛋白浓度校正。利用微量滴定酶标仪(model#synergyht；biotekinc.,winooski,vt)确定akt1和erk1水平(图5和8)。

利用mayo诊所患者衍生的(pdx)gbm细胞系的细胞生物标记测定：

将来自pdx模型的短期外植体培养物接种至96孔perfecta3d悬滴板中以在2天后在每个孔中形成单球体。通过离心将球体转移至圆底96孔板，然后与梯度浓度的受试化合物温育(8个球体/化合物浓度)。在5天的过程中利用incucyte系统(essenbioscience,mi,us)每6小时监测球体体积以提供与肿瘤重新生长测定相似的生长曲线。用无药物(第一条)或cap01088或cap01011处理48小时之后利用来自r&dsystems的elisa试剂盒在来自3个mayo诊所gbmpdx细胞系的细胞裂解物中定量在临床相关的mayo诊所gbmpdx细胞系中显示hsp90客户蛋白(egfr和akt1)抑制的cap01088和cap01100的体外药效学效果(图10和11)。

线粒体摄入和膜电位去极化

利用四甲基罗丹明乙基酯(tmre)测定评价线粒体完整性。tmre测定试剂盒(abcam)用来评价hsp90/trap1抑制剂诱导的线粒体膜电位变化。对于全细胞测定，将细胞用各种浓度的受试化合物在37℃和5％co2下处理48小时。然后将tmre(200nm)添加至孔中30min，并且在洗涤细胞之后利用荧光酶标仪(ex544/em590)监测荧光活性的变化。通过与添加tmre之前用20um的去极化质子离子载体羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(fccp)预处理10min的匹配孔比较来计算特定tmre荧光。对于线粒体测定，利用来自thermoscientific的试剂盒分离线粒体并装载0.1mmtmre。将装载tmre的线粒体(2μg/孔)用受试化合物温育，并且在30℃下利用荧光酶标仪(ex544/em590)动态监测荧光的变化(图6a、9a和12)。

线粒体中药物累积的分析

将分离自mda-mb-231和hei-194肿瘤细胞系的线粒体(100μg)用20μmcap01088在30℃下于线粒体温育缓冲液(mib：0.2m蔗糖，10mmtris-mops，ph7.4，5mmsuccinaye，1mmpi，2μm鱼藤酮和10μmegta，根据需要修改)中温育30min。将线粒体在冰上冷却，并且通过以8000g离心10min来收集。收集上清液，将线粒体颗粒用mib洗涤两次并溶于裂解缓冲液(乙腈/甲醇，3:1)中。利用watershplc/质谱仪分析上清液和线粒体提取物中cap01088的浓度(图6b和9b)。

结果还在下文列出：

给出上述优选实施方案和实例以说明本发明的范围和精神。这些实施方案和实例使得其他实施方案和实例对于本领域技术人员显而易见。所述其他实施方案和实例在本发明的范围内。因此，本发明应当仅受限于所附权利要求。