病毒载体、细胞及构建体的制作方法

本发明涉及病毒载体、细胞及构建体。

背景技术：

由于在采取以及投药时的侵袭性低，血液细胞作为再生医疗等的治疗用细胞，最常被临床应用。尤其是造血干细胞以及造血前体细胞在过去大约30年中，被用于以造血器官为中心的恶性肿瘤的治疗方法中，现在也作为最为常用的治疗方法而使用。除此之外，淋巴球、nk细胞、nkt细胞以及树状细胞等血液细胞，作为对于恶性肿瘤细胞的免疫细胞疗法，临床试验正在进行。

进一步，近年来，关于使用了改变遗传基因的血液细胞的遗传基因治疗，对于重症先天性疾病或恶性肿瘤在进行临床试验。尤其是导入t细胞受体或导入嵌合抗原受体遗传基因的遗传基因改变t细胞疗法，作为能够预期对恶性肿瘤具有显著的治疗效果的新治疗法而受到瞩目。

现在，对t细胞的遗传基因导入使用慢病毒载体或转录病毒载体。但是，在慢病毒载体以及转录病毒载体的情况下，由对dna基因的插入引起的基因毒性是个问题。

对此，作为对dna基因的插入的可能性较低的遗传基因导入法，已知有使用腺病毒载体的方法，进而使用mrna以及质粒等非病毒载体的方法。但是，腺病毒载体以及非病毒载体，导入效率极低，能够使用的细胞种类有限。

作为对dna基因的插入的可能性低的遗传基因导入法，还已知有仙台病毒载体。例如，专利文献1中公开了，使f遗传基因缺损，以使得不会放出2次性感染性病毒粒子的改变了的仙台病毒载体。另外，在专利文献2中公开了，搭载有与细胞的重新编码相关的遗传基因的仙台病毒载体。

与仙台病毒同属于副粘病毒科(paramyxoviridae)的麻疹病毒，是对免疫细胞以及上皮细胞保持极高感染力的病毒。在专利文献3中公开了一种麻疹病毒，其保持被分段为多段的基因组，至少1段分段基因组含有在宿主内可表达的外来遗传基因。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本专利第3602058号公报

专利文献2:国际公开第2010/008054号

专利文献3:国际公开第2007/007921号

技术实现要素：

发明所要解决的问题

在t细胞导入遗传基因的情况下，上述专利文献1以及专利文献2所公开的仙台病毒载体，不仅仙台病毒载体的制备比较困难，且存在仙台病毒易于残留、难以去除的不良情况。另外，对于非仙台病毒本身的宿主的人而言，仙台病毒载体产生怎样的影响这一方面的见解少，在安全性方面对于实际的临床应用还不得不犹豫不决。

另外，与腺病毒载体同样的，上述专利文献1以及专利文献2所公开的仙台病毒载体以及上述专利文献3所公开的麻疹病毒，为了提高遗传基因的导入效率，有必要在遗传基因导入之前刺激t细胞以使其活化。因此，存在由于t细胞的活化诱导出t细胞的分化的悬疑，对初始t细胞以及未分化b细胞等的遗传基因导入是困难的。

如上所述的现有的病毒载体，在对人使用时不能充分保证安全性，能够有效地导入遗传基因的细胞是有限的。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供安全性高、且对于广范围内的细胞能够有效地导入遗传基因的病毒载体、细胞以及构建体。

解决问题的手段

根据本发明第1方面的病毒载体，具有来自属于副粘病毒科的病毒的基因组，所述基因组中对h蛋白质进行编码的遗传基因以及对f蛋白质进行编码的遗传基因的两者均被改变，所述基因组包含外来遗传基因。

该情况下，可选地，所述基因组被分段为多个，各分段基因组具有前导序列和尾随序列。

另外，可选地，所述基因组被分段为2段。

另外，可选地，所述改变为，

对所述h蛋白质进行编码的遗传基因的缺损、或所述h蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失或被附加的变异，以及

对所述f蛋白质进行编码的遗传基因的缺损、或所述f蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失或被附加的变异。

另外，可选地，在所述基因组中对m蛋白质进行编码的遗传基因具有，所述m蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失、或被附加的变异。

另外，可选地，属于所述副粘病毒科的病毒是麻疹病毒。

另外，可选地，所述外来遗传基因包含oct3/4、sox2以及klf4。

根据本发明第2方面的细胞，是通过上述根据本发明第1方面的病毒载体导入所述外来遗传基因的细胞。

在此情况下，可选地，上述根据本发明第2方面的细胞，是含有造血干细胞的血液细胞。

需要说明的是，可选地，所述血液细胞为初始t细胞、干细胞样记忆t细胞或未分化b细胞。

另外，可选地，所述外来遗传基因为包含oct3/4、sox2以及klf4的基底状态的多能性干细胞。

根据本发明第3方面的构建体，包含核酸，所述核酸成为来自于所述副粘病毒科的病毒的、在3’末端配置前导序列、5’末端配置尾随序列的分段为多段的基因组的模型，所述分段基因组中，对h蛋白质进行编码的遗传基因以及对f蛋白质进行编码的遗传基因这两者都被改变。

发明效果

根据本发明，能够以高安全性且对于广范围的细胞有效地进行遗传基因的导入。

附图说明

图1是显示搭载有6遗传基因的非传播型麻疹病毒载体的分段基因组的结构的图。

图2是显示图1所示麻疹病毒载体质粒的结构的图。

图3是显示导入有麻疹病毒载体的bj细胞以及活化t细胞的荧光图像的图。

图4是显示搭载有麻疹病毒载体的遗传基因的发现解析的结果的图。

图5是显示麻疹病毒载体以及仙台病毒载体对各血球系细胞的导入效率的图。

图6是显示麻疹病毒载体以及仙台病毒载体对来源于脐带血t细胞的导入效率的图。

图7是显示麻疹病毒载体以及仙台病毒载体对于来源于末梢血t细胞的各分化的导入效率的图。

图8是显示由bj细胞建立的多能性干细胞(ips细胞)的群体的相位差图以及荧光图像的图。

图9是显示由t细胞建立的ips细胞的初代群体的相位差图以及荧光图像的图。

图10是显示来源于bj细胞的ips细胞的未分化标记的表达的图。

图11是通过rt-pcr法对未分化标记以及来源于病毒的遗传基因的表达的解析结果的图。

图12是显示体外中三胚层类分化诱导的解析结果的图。

图13是显示畸胎瘤形成试验中三胚层类分化能的解析结果的图。

图14是显示来源于bj细胞的ips细胞的核型解析结果的图。

图15是显示基底状态的ips细胞的形态的图。

具体实施方式

对于根据本发明的实施方式进行说明。

(实施方式1)

首先，对于实施方式1进行详细说明。根据本实施方式的病毒载体，包含来源于属于副粘病毒科的病毒的基因组。

属于副粘病毒科的病毒(以下仅称作「病毒」)，是具有(－)链rna基因组的rna病毒。作为病毒，可以例举麻疹病毒(measlesvirus)、仙台病毒(sendaivirus)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、1型副流感病毒(parainfluenzavirus1)、2型副流感病毒(parainfluenzavirus2)、3型副流感病毒(parainfluenzavirus3)、5型副流感病毒(parainfluenzavirus5、simianvirus5)、偏肺病毒(metapneumovirus)、rs病毒(respiratorysyncytialvirus)、牛疫病毒(rinderpestvirus)、以及犬瘟热病毒(distempervirus)。上述属于副粘病毒科的病毒，优选为麻疹病毒。

属于副粘病毒科的病毒的基因组，在未分段的单链rna中，在3’末端具有前导序列(le),在5’末端具有尾随序列(tr)。在前导序列与尾随序列之间配置有对构成病毒的功能性蛋白质进行编码的各种遗传基因。前导序列具有启动子活性。尾随序列，在反基因组的情况下，具有启动子活性。

对功能性蛋白质进行编码的主要的遗传基因，有对n蛋白质进行编码的遗传基因(n遗传基因)、对p蛋白质进行编码的遗传基因(p遗传基因)、对m蛋白质进行编码的遗传基因(m遗传基因)、对f蛋白质进行编码的遗传基因(f遗传基因)、对h蛋白质进行编码的遗传基因(h遗传基因)以及对l蛋白质进行编码的遗传基因(l遗传基因)。基因组中的6个遗传基因的各自的两末端存在称作转录开始序列以及转录结束序列的转录的控制序列。

n蛋白质，对于病毒的基因组从5’末端开始依次有秩序地排列结合，包装基因组rna。p蛋白质，作为rna依赖性rna聚合酶的小亚单位而发挥功能，与病毒的基因组的转录复制有关。需要说明的是，从p遗传基因，通过rna編集(rnaediting)机构等可以合成v蛋白质以及c蛋白质等的辅助蛋白质。l蛋白质，作为rna依赖性rna聚合酶的大亚单位而发挥功能，与p蛋白质一起与病毒的基因组的转录复制有关。

m蛋白质，是从内侧支撑病毒粒子的结构的基质蛋白质。f蛋白质，与细胞融合相关，对病毒具有病原性。h蛋白质是病毒受体结合蛋白质。h蛋白质，结合在作为野生型病毒用于感染的受体的slam(signalinglymphocyteactivationmodule,淋巴细胞活化信号分子)或结合素4(nectin4)。slam以及结合素4，由于仅在有限的细胞种类上表达，限制了病毒的宿主域。

所述来源于属于副粘病毒科的病毒的基因组，意味着具有对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因，在感染细胞中可以被增殖的基因组。

在根据本实施方式的病毒载体中所包含的上述基因组中，h遗传基因以及f蛋白质这两者被改变。h遗传基因的改变，例如是h遗传基因的缺损。通过使h遗传基因发生缺损，可以使得h蛋白质的表达消失。另外，h遗传基因的改变，还可以是h蛋白质的1个或多个氨基酸发生置换、缺失、或被附加的变异。

更具体而言，h遗传基因的改变，例如为h蛋白质的第390号的天冬酰胺置换为异亮氨酸(n390i)、第416号的天冬酰胺置换为天冬酰胺酸(n416d)、第446号的苏氨酸置换为丝氨酸(t446s)、第481号的天冬酰胺置换为酪氨酸(n481y)以及第492号的谷氨酸置换为谷氨酰胺(e492g)。通过这些置换，h蛋白质，除了slam以及nectin4之外，可以结合于几乎在所有的细胞中能够确认其表达的膜辅助蛋白(membraneco-factorprotein，cd46)。

通过改变h遗传基因，对于野生型的h蛋白质，能够改变h蛋白质的结构或功能。如上所述，h蛋白质是病毒受体结合蛋白质，因此，该病毒载体，通过h遗传基因的改变，可以将slam以及nectin4以外的分子作为受体进行利用。也就是说，通过改变h遗传基因，能够增加可以感染病毒载体的细胞种类。

f遗传基因的改变，例如为f遗传基因的缺损。通过使f遗传基因缺损，能够使得f蛋白质的表达消失。例如，在使用麻疹病毒的基因组的情况下，使得f蛋白质缺损的病毒载体，除了特殊的细胞株(vero/slam/f细胞)之外，在其他细胞内不产生具有病原性的病毒。因此，只要不被上述特殊的细胞株感染，能够使得该病毒载体的传播性消失。

f遗传基因的改变，也可以是f蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失或被附加的变异。通过该变异，对于野生型的f蛋白质，可以改变f蛋白质的结构或功能。

另外，上述基因组中对m蛋白质进行编码的遗传基因，可以具有m蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失或被附加的变异。作为变异的例，可以例举m蛋白质的第64号的脯氨酸被置换为丝氨酸(p64s)以及第89号的谷氨酸被置换为谷氨酰胺(e89g)。m蛋白质是从内侧支撑病毒粒子结构的基质蛋白质，因此，通过在m蛋白质中导入变异，能够增加病毒粒子形成能，进而降低细胞融合能。

根据本实施方式的病毒载体中所含的上述基因组，具有外来遗传基因。因此，该病毒载体，能够使得外来遗传基因进行表达。外来遗传基因，不限于此，可以例举对引起病毒、细菌以及寄生虫等的病原性的各种蛋白质进行编码的遗传基因、对各种细胞因子进行编码的遗传基因、对各种肽类激素进行编码的遗传基因、以及对细胞的重新编码因子进行编码的遗传基因等。另外，作为外来遗传基因，可以插入对gfp(greenfluorescentprotein，绿色荧光蛋白)或egfp(enhancedgreenfluorescentprotein，增强型绿色荧光蛋白)进行编码的遗传基因等报告基因。

外来遗传基因的个数没有特殊限定，优选为2-6个。作为具体的示例性的外来遗传基因，可以举出重新编码因子的oct3/4、sox2以及klf4等。当然，其他的重新编码因子l－myc以及pin1等作为外来遗传基因，也可以在基因组中进一步插入。

对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因以及外来遗传基因，在基因组中的配置，只要是在前导序列与尾随序列之间即可，没有特殊限制。在基因组中对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因的相互位置关系，与野生型的病毒的基因组中的排列顺序等的位置无关，可以任意确定。

根据本实施方式的病毒载体中所含的上述基因组，可以被分段为多段。所谓分段是指，基因组rna被断片化为多个rna。也就是说，被分段为多个的分段基因组，是作为1个基因组发挥功能的一组rna群。分段基因组的个数，没有特殊限定，优选为最多6个，尤其优选为2个。

在此情况下，各个分段基因组具有前导序列和尾随序列。优选地，分段基因组的各个的一端配置有前导序列，另一端配置有尾随序列。在此情况下，被分段的各基因组的前导序列与尾随序列之间，配置有对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因的任一个、以及外来遗传基因。

对功能性蛋白质进行编码的遗传基因以及外来遗传基因，可以插入被分段为多个的基因组的1个之中，也可以插入至2个以上。在使多个外来遗传基因表达的情况下，即可以在被分段为多个的基因组的1个中插入全部的多个外来遗传基因，也可以在被分段为多个的基因组的2个以上中，分别插入1个以上的外来遗传基因，作为整体而插入多个外来遗传基因。在被分段为多个的基因组的1个之中插入多个外来遗传基因的情况下，其个数，只要在对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因的表达效率不显著降低的范围内，没有特殊限制。

在被分段为多个的基因组中外来遗传基因的配置没有特殊的限制。例如，将麻疹病毒的基因组分段为2个，使f遗传基因缺损，将重新编码因子作为外来遗传基因而插入的情况下，在第1分段基因组中，从3’末端向着5’末端，依次配置前导序列、oct3/4、n遗传基因、p遗传基因、被改变的m遗传基因、sox2、尾随序列，在第2分段基因组中，从3’末端向着5’末端，依次配置前导序列、klf4、被改变的h遗传基因、l遗传基因、尾随序列。作为外来遗传基因而插入l-myc以及pin1的情况下，优选地，在sox2与尾随序列之间插入l－myc，在h遗传基因与l遗传基因之间插入pin1。

除了h遗传基因、f遗传基因以及m遗传基因之外对上述功能性蛋白质进行编码的遗传基因，与野生型病毒的基因组中所含的各遗传基因的碱基序列可以不完全相同，只要在转录以及复制时的活性与野生型的活性同等或其之上即可，可以是导入有变异的遗传基因。对功能性蛋白质进行编码的遗传基因，在转录以及复制时的活性只要是与天然型的各蛋白质同等或其之上，可以有1个或数个，例如1-15个，优选为1-8个，更优选为1-5个氨基酸的缺失、置换、或被附加的由氨基酸形成的对蛋白质进行编码的碱基序列。该变异性的蛋白质与天然型蛋白质的氨基酸序列的相同性，例如优选为90-100％，但只要保持在转录及复制时的活性，氨基酸的相同性例如可以为40-90％。

图1示出了作为外来遗传基因而具有对上述重新编码因子进行编码的遗传基因以及对egfp进行编码的遗传基因的分段基因组的优选示例。在2个该分段基因组中，在h蛋白质实施n390i、n416d、t446s、n481y以及e492g的变异来改变h遗传基因(h8)，进一步，使f遗传基因缺损。另外，对m蛋白质实施p64s以及e89g的变异来改变m遗传基因(m6489)。需要说明的是，p遗传基因作为p/v/c而示出。

该病毒载体，具有细胞感染能以及传播力。所谓细胞感染能是指，通过保持对成为宿主的细胞的结合能以及膜融合能，从而能够在细胞内导入病毒内部的基因组等的能力。另外，所谓传播力是指，将导入细胞内的基因组进行复制，形成感染性粒子或根据其的复合体，从而将该基因组传播给别的细胞的能力。

根据本实施方式的病毒载体，可以通过公知的病毒载体的制备方法来制备。例如，该病毒载体可以通过如下方法来制备，即使用与病毒的基因组相对应的cdna,或使用病毒的基因组，进行病毒粒子的重建再造。此处，所谓病毒粒子的重建是指，人工制备病毒的基因组，在试管内或细胞内，制备原病毒或重组病毒。

在任一方法中，通常，从病毒分离出基因组，通过逆转录反应等来制备基因组的cdna。接着，在对基因组进行分段的情况下，通过公知的转基因技术以及核酸増幅法等，将该cdna断片化成多个cdna，继而进行外来遗传基因的插入等操作。断片化的方法，只要能够基于从基因组制备的cdna碱基序列等结果能够调制出多个cdna断片的方法即可，没有特殊的限制。

作为基于从基因组制备的cdna碱基序列的调制方法，可例举，将从基因组制备的cdna中的预定区域作为模型通过pcr法等获得增幅断片的方法。预定的区域，可以考虑要表达的基因组的结构进行适当设定，没有特殊限制。预定的区域，优选设定为可以将对病毒的功能性蛋白质进行编码的各遗传基因断片分别进行增殖。在设定这样的区域的情况下，可以通过将所得的各遗传基因的增殖断片，以预定的种类、个数、排列顺序(位置)进行结合，来调制cdna断片。

在分段基因组插入外来遗传基因时，可以将通过另行调制的包含外来遗传基因的dna断片,使用公知的转基因技术插入上述分段化的cdna中。图1中所示的与包含n遗传基因的第1分段基因组对应的cdna的碱基序列以及与包含h遗传基因的第2分段基因组对应的cdna的碱基序列，分别示作序列号1与序列号2。

病毒粒子的重建，可以使用包含所调制的cdna断片的dna，优选为质粒dna，或将cdna预先在体外中转录的rna。

通常，即使将属于副粘病毒科的病毒的基因组或其反基因组以裸rna直接导入至宿主细胞内，也不会成为rna依赖性rna聚合酶的模型。为了成为模型，在由该rna依赖性rna聚合酶引起的rna合成反应的初期阶段，必须存在n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质，形成这些蛋白质与基因组rna的复合体(rnp复合体)。因此，在重建病毒载体时，希望使得n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质同时表达，或者使用能够使n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质表达的宿主。除此之外，在使上述病毒载体中所含的rna的f遗传基因缺损的情况下，优选使用f蛋白质也可以表达的宿主。

上述病毒载体，例如在病毒的n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质表达的宿主内，可以通过导入上述基因组或其crna来制备。另外，在病毒的n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质表达的宿主内，还可以导入含有成为上述基因组或其crna的模型的cdna的dna，和该dna的转录单元。另外，还可以在宿主内导入含有成为上述基因组或其crna的模型的cdna的dna、含有病毒的n遗传基因的dna、含有病毒的p遗传基因的dna、含有病毒的l遗传基因的dna、以及这些dna的转录单元。

作为上述宿主表达的n蛋白质、p蛋白质以及l蛋白质，只要具有与这些的天然型蛋白质的活性同等或以上，可以使用非完全相同的蛋白质，例如，可以使用有1个或数个，例如1-15个，优选为1-8个，更优选为1-5个氨基酸缺失、被置换或被附加的氨基酸所形成的蛋白质，或来源于其他病毒或氨基酸序列很大不同的完全另外的蛋白质。

上述宿主，只要是上述功能性蛋白质以及外来遗传基因能够表达的细胞即可，没有特殊限制。例如，可以例举培养的哺乳动物或鸟类的细胞、鸡蛋等。具体而言，作为培养细胞，例如可以使用bhk－t7/9细胞、cho、293细胞、b95a、猴子细胞cos－7、vero、小鼠l细胞、大鼠gh3、人fl细胞、llcmk2、mdck、mdbk、cv－1、hela、hepg2、p19、f9、pciz、baf3、jurkat、人pbmcn、mt－4、molt－4、nih3t3、l929、vero/hslam、cho/hslam、a549/hslam、hela/hslam、293t、bhk以及鸡胚纤维芽细胞等。另外，还可以使用sf9细胞、sf21细胞等昆虫细胞。

作为上述转录单元，例如，优选为预定的dna依赖性rna聚合酶表达的重组痘苗病毒、包含预定的dna依赖性rna聚合酶遗传基因的dna等。

另外，由上述制造方法得到的病毒载体，可以通过与其他细胞共同培养等使其选择性且有效地增殖。例如，在使用麻疹病毒的病毒载体的情况下，将含有通过上述制造方法所得的重建的病毒载体的培养细胞，播种在预先培养的vero/slam/f细胞上,通过共同培养，可以得到病毒载体感染以及増殖的vero/slam/f细胞的巨细胞。

更具体而言，例如，在制备麻疹病毒载体的情况下，将与图1所示分段基因组对应的2个质粒，根据需要与包含对功能性蛋白质进行编码的遗传基因的其他质粒同时，导入适当的细胞。此后，回收细胞，播种至vero/slam/f细胞上,采取所出现的巨细胞，则能够获得麻疹病毒载体。使麻疹病毒载体感染新的vero/slam/f细胞，在增殖后可以释放麻疹病毒载体。该情况下，通过离心分离可以将包含病毒的上清作为病毒液进行回收。

如以上详细说明的，根据本实施方式的病毒载体，由于h遗传基因被改变，可以感染多种细胞种类，即能够扩大宿主域。另外，该病毒载体由于f遗传基因被改变，能够防止产生具有细胞感染能的病毒，使其传播性消失，从而能够提高安全性。另外，上述病毒载体，复制过程的全程在细胞质内进行，不伴随dna合成，因此没有基因毒性的悬念，安全性极高。

需要说明的是，根据本实施方式的病毒载体所含有的基因组，可以被分段为多个。由此，可以搭载多个外来遗传基因或尺寸大的遗传基因。另外，各个分段基因组可以具有前导序列和尾随序列。在属于副粘病毒科的病毒中，已知有越是下游(5’侧)的遗传基因其表达越降低的特殊性遗传基因的表达模式，通过使分段基因组的各自具有前导序列和尾随序列，使得聚合酶能够对各个分段基因组发生作用，从而能够提高各遗传基因的表达量。另外，在宿主中能够同时使得多个外来遗传基因同时表达。进一步，通过将基因组分段为2个，为了较高地维持蛋白质的表达效率，使基因组成为适当尺寸。当然，即使未分段的1个基因组也能够发挥相同的功能。

需要说明的是，在本实施方式中，对分段基因组上的m蛋白质进行编码的遗传基因可以具有，m蛋白质的1个或多个氨基酸被置换、缺失、或被附加的变异。由此，可以进一步提高对于该病毒载体的细胞的遗传基因导入效率以及安全性。

另外，本实施方式中，病毒可以是麻疹病毒。麻疹病毒，由于对免疫细胞具有强的指向性，通过上述病毒载体，对于b细胞、t细胞以及颗粒球可以高效地导入遗传基因。进一步，上述病毒载体，如下述实施例所示，对于未活化的初始t细胞、中央记忆性t细胞、效应记忆性t细胞以及b细胞进一步含有造血干细胞的血液细胞，也可以极高效率导入遗传基因。另外，麻疹病毒，本身即是以人为宿主，对人的影响方面的见解有所积累，在考虑安全方面的同时能够适当地使用。

需要说明的是，在本实施方式中，作为外来遗传基因的例子，例举了oct3/4、sox2以及klf4。作为根据本实施方式的病毒载体的基因组使用麻疹病毒的基因组的情况下，通过搭载有对重新编码因子进行编码的遗传基因的该病毒载体，能够制备现有的方法非常难以制备的基底状态的ips细胞。

需要说明的是，根据本实施方式的病毒载体所含有的rna，除了与病毒本身具有的基因组相同的(－)链rna之外，根据需要，也可以是(+)链rna。

根据其他实施方式，提供了适于制备上述病毒载体中所含有的基因组的构建体。该构建体，含有核酸，所述核酸成为来源于属于副粘病毒科的病毒的、3’末端配置有前导序列、5’末端配置有尾随序列的多个分段基因组的模型，该分段基因组中对h蛋白质进行编码的遗传基因以及对f蛋白质进行编码的遗传基因这两者被改变。

上述核酸，可以为基于上述分段基因组而制备的cdna或crna。例如，该核酸可以为与被分段的各基因组对应的多个cdna或质粒dna。

例如，将麻疹病毒的基因组分段为2个，在使f遗传基因缺损的情况下，上述构建体含有与从3’末端向着5’末端依次配置有前导序列、n遗传基因、p遗传基因、m遗传基因以及尾随序列的基因组相对应的cdna，和含有与从3’末端向着5’末端依次配置有前导序列、h遗传基因、l遗传基因以及尾随序列的基因组相对应的cdna。

该构建体，可以使用现有基因工程中的转基因技术，容易地插入外来遗传基因。通过将该构建体用于如上所述的病毒粒子的重建，能够有效地制备含有上述分段基因组的病毒载体。

该构建体，通过现有的转型或感染技术，能够导入至原核细胞或真核细胞。例如，可以将该表达构建体以质粒的形态导入各种细胞中。

需要说明的是，上述构建体所含有的核酸，可以是来源于属于副粘病毒科的病毒的基因组的、3’末端配置有前导序列、5’末端配置有尾随序列的多个分段基因组的crna。另外，上述构建体还可以含有成为来源于属于副粘病毒科的病毒的基因组的、在3’末端配置有前导序列、在5’末端配置有尾随序列的基因组的模型的核酸，在该基因组中对h蛋白质进行编码的遗传基因以及对f蛋白质进行编码的遗传基因这两者均被改变。

(实施方式2)

接下来，对实施方式2进行说明。根据本实施方式的细胞，是通过根据上述实施方式1的病毒载体导入有外来遗传基因的细胞。

病毒载体，可以通过公知的方法使细胞感染。例如，将含有细胞的培养液中添加病毒载体，在室温下以1200×g离心分离45分钟。其他，作为使细胞感染病毒载体的方法，可以例举电穿孔法、脂质体转染法、热休克法、peg法、磷酸钙法、以及deae葡聚糖法等各种使细胞感染病毒的方法。

细胞，没有特殊的限制，除了人的体细胞、成纤维细胞、血液细胞之外，还可以为猴子的体细胞等。作为细胞，优选为b细胞、活化或未活化的t细胞、顆粒球、含有造血干细胞的血液细胞等。尤其优选的细胞为初始t细胞、干细胞样记忆性t细胞或未分化b细胞。在细胞中导入外来遗传基因时，该病毒载体效价没有特殊的限制，但moi(multiplicityofinfection，感染复数)为1-100，优选为3-20，更优选为5-10。

通过作为外来遗传基因而至少含有oct3/4、sox2以及klf4的上述病毒载体儿导入有外来遗传基因的细胞，未分化标记表达，诱导为具有三胚层类分化能的ips细胞。通过上述病毒载体导入遗传基因，由此还能够诱导基底状态的ips细胞。

如上详细说明，根据本实施方式的细胞，通过上述病毒载体导入有遗传基因，从而可以是所希望的多个外来遗传基因，同时长期地表达。另外，作为遗传基因导入的对象可以选择初始t细胞、干细胞样记忆性t细胞或未分化b细胞、进而造血干细胞，因此，根据本实施方式的细胞，对于使用改变了遗传基因的血液细胞的遗传基因治疗，尤其是遗传基因改变t细胞疗法是极为有用的。

另外，该细胞通过含有oct3/4、sox2以及klf4的上述病毒载体导入外来遗传基因，诱导成基底状态的ips细胞。基底状态的ips细胞，増殖效率高、即使以单细胞进行播种也能够增殖，因此能够大量制备并易于保存。另外，由于为基底状态，能够在广范围的细胞种类中进行分化。

需要说明的是，根据本实施方式的细胞的用途，根据外来遗传基因可以为各种各样。通过使导入至细胞的外来遗传基因为t细胞受体遗传基因或嵌合抗原受体遗传基因，可以用于对恶性肿瘤的t细胞疗法。另外，通过作为外来遗传基因在t细胞中导入锌指糖核酸酶等破坏ccr5遗传基因(基因组编辑)，由此可以对hiv/aids进行治疗。通过在腺苷脱氨酶(ada)等酶缺乏症患者的细胞中导入对酶进行编码的遗传基因，可以对酶缺乏症进行治疗。

需要说明的是，在其他实施方式中，提供了ips细胞的制备方法。该ips细胞的制备方法包含使细胞感染根据上述实施方式2的病毒载体的感染步骤。该细胞可以是血液细胞，为未活化(刺激)的免疫细胞，优选为初始t细胞。该ips细胞的制备方法包含基底状态的ips细胞的制备方法。

实施例

通过以下的实施例，对本发明进行进一步具体的说明，但本发明不限于实施例。

(细胞培养)

下述实施例中的细胞培养如下进行。小鼠胚胎成纤维细胞(mef细胞)、vero/slam细胞、成纤维细胞株的bj细胞，通过在达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeagle’smedium)(nacalaitesque公司制备)中含有10％的胎牛血清(fbs)(hyclone公司制备)的培养液来培养。vero/slam/f细胞由在dmem中含有0.5mg/ml的g418(nacalaitesque公司制备)以及7.5％的fbs的培养液来进行培养。

bhk－t7/9细胞，通过α改变最小基本伊格尔培养基(α－memminimumessentialmediumeagle)(lifetechnologies公司制备)中含有600μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)(nacalaitesque公司制备)以及10％fbs的培养液来培养。源于健康人末梢血的血液细胞，通过在rpmi1640(nacalaitesque公司制备)中含有10％fbs的培养液来培养。源于脐带血或源于健康人的t细胞，通过rpmi1640中含有10％fbs的培养液、在该培养液中进一步添加有175iu/ml的人重组il-2(peprotech公司制备)的培养液、或kbm502培养液(kohjinbio公司制备)来培养。源于脐带血的造血干细胞，通过在stemspan(注册商标)培养液(veritas公司制备)中添加有人重组scf、人重组flt－3l以及人重组tpo(全部为peprotech公司制备)的培养液来培养。

所有的primed型ips细胞，通过人es细胞维持培养液在mef细胞上进行培养。人es细胞维持培养液的组成为，在dmem/f12(nacalaitesque公司制备)中含有20％ksr(lifetechnologeis公司制备)、2-巯基乙醇(2－mercaptoethanol,sigma公司制备)、2mm的l-谷氨酰胺(l-glutamine，nacalaitesque公司制备)、1％的非必要氨基酸(non-essentialaminoacids，nacalaitesque公司制备)、4ng/ml的碱性成纤维成长因子(basicfgf,peprotech公司制备)。

基底状态的ips细胞，通过混合培养液在mef细胞上进行培养。该混合培养液的组成为，在dmem/f12中含有20％ksr、2-巯基乙醇、2mm的l-谷氨酰胺、1％的非必要氨基酸、1μm的chir99021(militenyibiotec公司制备)、1μmpd0325901(militenyibiotec公司制备)、1000单位/ml的人重组lif(nacalaitesque公司制备)。

(实施例1：非传播型遗传基因改变麻疹病毒载体的构建)

通过如下产生非传播型遗传基因改变麻疹病毒载体，即，将含有对构成麻疹病毒的功能性蛋白质进行编码的遗传基因的2个质粒(mv－hl－k－pin1－egfp以及mv－npm－osm)和有助于病毒合成的4个质粒(pcite－ic－n、pcite－ic－pδc、pciteko－9301b－l、pca7－ic－f)，如下，与作为包装细胞在bhk－t7/9细胞中导入slam遗传基因以及麻疹病毒的f遗传基因的vero/slam/f细胞通过共培养而产生的。作为外来遗传基因，插入在ips细胞的制备中使用的oct3/4遗传基因、sox2遗传基因、l－myc遗传基因、klf4遗传基因以及pin1遗传基因、以及作为报告遗传基因的egfp遗传基因。

首先，对于麻疹病毒株mv－ic323－egfp中的野生型的h遗传基因以及m遗传基因通过转基因进行改变，以使得在h蛋白质上插入n390i、n416d、n481y、e492g的变异，以及在m蛋白质上插入p64s、e89k的变异。

接着，如图2所示，通过如下的重组制备mv－npm－osm质粒，即将插入有上述变异的mv－ic323－egfp的egfp遗传基因重组为oct3/4遗传基因，将f遗传基因重组为sox2遗传基因，将h遗传基因以及l遗传基因重组为l－myc遗传基因。另一方面，通过如下制备mv－hl－k－pin1－egfp质粒，即将插入有上述变异的mv－ic323－egfp的n遗传基因、p遗传基因、m遗传基因以及f遗传基因重组为klf4遗传基因，在l遗传基因与h遗传基因之间插入pin1遗传基因。

使用mv－npm－osm质粒以及mv－hl－k－pin1－egfp质粒和4个质粒(pcag－t7－ic－f、pcite－ic－n、pcite－ic－pδc、pcite－ko－9301b－l)，在bhk－t7/9细胞中导入遗传基因。2天后通过培养皿回收细胞，播种至vero/slam/f细胞上，2天后采取巨细胞，回收麻疹病毒载体。使新的vero/slam/f细胞感染回收的麻疹病毒载体，增殖后回收细胞。将回收的细胞再悬浊于dmem中，通过反复冻结-融化，从细胞内向培养液中释放麻疹病毒载体(mvv)。此后，通过离心分离，作为病毒液仅回收上清，分配后，在－80℃下保存。在vero/slam细胞中添加该病毒液，2天后，通过流失细胞法解析gfp阳性细胞的比例，来确定效价。

(实施例2：非传播型遗传基因改变麻疹病毒载体的评价)

对实施例1制备的mvv使用活化t细胞或bj细胞进行评价。活化t细胞如下制备，即将来源于健康人的末梢血在kbm502培养液中使用dynabeads(注册商标)的人t细胞激活剂cd3/cd28(humant-activatorcd3/cd28，lifetechnologies公司制备)，刺激5天来制备。更具体而言，将5×10⁴个各细胞播种至12孔板，添加与效价相对应的量的病毒液。接着，通过离心法(室温、1200×g、45分钟)导入遗传基因后，通过pbs清洗，交换培养液。2天后，通过流式细胞法对活化t细胞的gfp阳性细胞中的5个遗传基因(oct3/4、sox2、klf4、l－myc以及pin1的表达进行解析。使用bdcytofix/cytoperm(商标)固定/透化试剂盒(fixation/permeabilizationkit,bd公司制备)对源于外来遗传基因的蛋白质表达进行解析。使用的抗体为抗oct3/4抗体、抗sox2抗体、抗klf4抗体(以上均由santacruz公司制备)、抗myc抗体以及抗pin1抗体(以上均由r&d公式制备)。

(结果)

图3示出了bj细胞以及活化t细胞的荧光图像。两细胞均确认了荧光。因此，可以确认，mvv在bj细胞以及活化t细胞中导入了遗传基因。

图4示出了活化t细胞的gfp表达的解析结果。使用mvv，对活化t细胞导入遗传基因，对导入后第3天的gfp阳性细胞中的上述5个遗传基因的表达进行解析。从其结果可以确认，除了egfp遗传基因之外，5个遗传基因均同时表达。

(实施例3：通过非传播型遗传基因改变麻疹病毒载体导入遗传基因及其解析)

从征得同意的健康人采取末梢血或脐带血10ml左右，使用淋巴球分离液(nacalaitesque公司制备)分离出单核球。同时，通过由nh4cl、khco3以及edta(均为nacalaitesque公司制备)调制的溶血剂对1ml左右的末梢血或脐带血进行溶血。将由这些方法回收的血液细胞，通过离心法(室温、1200×g、45分钟)使用mvv进行遗传基因导入(moi＝5)。遗传基因导入后，用pbs(－)(将pbs片剂(タカラバイオ公司制备)用纯水进行溶解，实施高压釜灭菌来调制)进行清洗，交换培养液。2天后，回收细胞，通过流式细胞法以gfp的表达为指标，对各血球系譜的遗传基因导入率以及各细胞系谱中麻疹病毒受体的表达进行解析。

作为对照组，对于搭载了gfp遗传基因的仙台病毒载体(sev)(plasmex(注册商标)－ag；从医学生物学研究所获得)，以与mvv同样的方法进行遗传基因导入。各血球系谱解析中所使用的抗体为，单球：apc－cy7标识抗cd14抗体(biolegend公司制备)、pe标识抗cd11b抗体(bd公司制备)；好中球：percp－cy5.5标识抗cd15抗体(biolegend公司制备)；b细胞：apc－cy7标识抗cd19抗体(biolegend公司制备)；t细胞：apc标识抗cd3抗体(biolegend公司制备)、apc－cy7标识抗cd4抗体(biolegend公司制备)、pe－cy7标识抗cd8抗体(biolegend公司制备)、apc标识抗cd45ra(biolegend公司制备)、pe标识抗cd197抗体(biolegend公司制备)；nk细胞：pe－cy7标识抗cd56抗体(biolegend公司制备)。对所使用的病毒受体的抗体，为pe标识抗cd46抗体(ebioscience公司制备)、pe标识抗cd150抗体(biolegend公司制备)、以及pe标识抗nectin4抗体(r&d公司制备)。需要说明的是，单球定义为cd14⁺且cd11b⁺。b细胞定义为cd19⁺且cd3^－。t细胞定义为cd3⁺且cd19^－。好中球定义为cd15⁺。nk细胞定义为cd3^－且cd19^－且cd56⁺。

(结果)

图5示出了来源于末梢血的各血球系细胞的gfp阳性率。在单球情况下，两带菌者均确认了高遗传基因导入率，但b细胞、t细胞以及好中球中，mvv与sev相比较，具有较高的遗传基因导入率。

图6示出了来源于脐带血的未活化的t细胞的gfp阳性率。sev即使在moi＝10下也未能导入遗传基因，相对于此，mvv在moi＝5时显示了高的遗传基因导入率。

将t细胞分化为cd45ra以及ccr7(cd197)，研究各分化中的遗传基因导入率。如图7所示，在暴露至抗原之前的初始t细胞以及干细胞样记忆性t细胞分化(cd45ra高且cd197高)、以及通过抗原的再暴露増殖的中央记忆性t细胞(cd45ra低且cd197高)以及效应记忆性t细胞分化(cd45ra低且cd197低)中，确认了通过mvv产生高效率的遗传基因导入。另一方面，从cd8⁺细胞的结果可知，在效应t细胞分化(cd45ra高且cd197低)中，未能确认由mvv产生遗传基因导入的效率化。

上述结果表明，对于包含仙台病毒载体的现有方法难以进行遗传基因导入的初始t细胞以及干细胞样记忆性t细胞，可以通过mvv产生高效地遗传基因导入。因此，根据本实施例的mvv，预示了在使用遗传基因改变t细胞的遗传基因治疗、特别是遗传基因改变t细胞疗法中可以成为创新性治疗用菌群。另外，mvv即使对于初代培养b细胞也能够高效地导入遗传基因。

(实施例4：使用非传播型遗传基因改变麻疹病毒载体建立ips细胞)

对bj细胞，使用mvv通过离心法(室温、1200×g、45分钟)进行遗传基因导入(moi＝5)，用pbs清洗后交换培养液。在遗传基因导入后第7天，将bj细胞播种至mef细胞上，在37℃、5％co2恒温箱内培养1天，次日，培养基换成人es细胞维持培养液。此后，隔1日交换培养液，并在37℃、5％co2恒温箱内培养，在遗传基因导入后第27天，收集人es细胞样菌落(参考图8)。

另外，将来源于健康人的末梢血的单核球在kbm502培养液中，使用dynabeads(注册商标)人t刺激活化剂(humant-activatior)cd3/cd28进行刺激，在37℃、5％co2恒温箱内培养。在培养后第5天回收细胞，使用mvv将重新编码因子通过离心法(室温、1200×g、45分钟)导入遗传基因，将细胞在次日播种至mef细胞上，在37℃、5％co2恒温箱内培养。培养开始后第20天回收es细胞样菌落(参考图9)，播种至新鲜的mef细胞上。

对于从bj细胞建立的上述ips细胞，实施免疫抗体染色法以及rt－pcr法，确认了未分化标记的表达。免疫抗体染色法，对人ips细胞使用4％多聚甲醛-磷酸缓冲溶液(nacalaitesque公司制备)在4℃下固定30分钟，通过0.1％triton(注册商标)x－100(nacalaitesque公司制备)处理后，使用5％脱脂奶(nacalaitesque公司制备)封闭。作为一次抗体使用抗nanog抗体(r&d公司制备)、抗oct3/4抗体、抗ssea－4抗体、抗tra－1－60抗体以及抗tra－1－81抗体(均为santacruz公司制备)在4℃下染色1晚，通过二次抗体(抗羊ing，anti－goating(lifetechnologies公司制备))在室温下染色30分钟。碱性磷酸酶染色使用碱性磷酸检测试剂盒(alkalinephospatasedetectionkit(merckmillipore公司制备)。

在rt－pcr法中，从由bj细胞建立的上述ips细胞，使用rna小量提取试剂盒(rneasyminikit,quiagen公司制备)提取rna，使用用于rt-pcr的上链iii第一链合成系统(superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr,lifetechnologies公司制备)来合成互补链dna(cdna)。此后，使用takaraextaq(注册商标)聚合酶(takarabio公司制备)进行増幅反应，使用1.5％琼脂糖凝胶(nacalaitesque公司制备)进行电泳。在rt－pcr法中所使用的引物的碱基序列是，对endooct3/4为序列号3以及序列号4、对endosox2为序列号5以及序列号6、对endoklf4为序列号7以及序列号8、对endomyc为序列号9以及序列号10、对nanog为序列号11以及序列号12、对tert为序列号13以及序列号14、对dnmt3b为序列号15以及序列号16、对mv－n蛋白质为序列号17以及序列号18、对mv－l蛋白质为序列号19以及序列号20、以及，对β－肌动蛋白为序列号21以及序列号22。

通过体外胚状体形成法研究三胚层分化诱导。从bj细胞建立的上述ips细胞由mef使用es细胞解离液(胶原酶iv(lifetechnologies公司制备)、0.25％胰蛋白酶(lifetechnologies公司制备)以及ksr的混合液)进行解离，再悬浊于人es细胞维持培养液中，播种至非粘结性6孔板中，在37℃、5％co2恒温箱内培养。次日，回收浮游细胞，并悬浊至未添加碱性成纤维成长因子的人es细胞维持培养液中，在37℃、5％co2恒温箱内培养。培养开始后第14天回收细胞，使用0.25％胰蛋白酶/edta混合液(nacalaitesque公司制备)解离细胞，播种至使用0.1％明胶溶液(nacalaitesque公司制备)涂覆的培养皿中，在37℃、5％co2恒温箱内培养7天。

使用免疫抗体染色法确认了从bj细胞建立的上述ips细胞的三胚层分化。所使用的抗体为抗甲种胎儿球蛋白(alpha－fetoprotein)抗体(r&d公司制备)、抗波形蛋白(vimentin)抗体(santacruz公司制备)以及抗结合素(nectin)抗体(santacruz公司制备)。

对从bj细胞建立的上述ips细胞，进行畸胎瘤形成试验。将1×10⁶个ips细胞注入免疫缺陷小鼠(从试验动物中央研究所获得)的睾丸内，在9～13星期后，取出畸胎瘤。此后，用20％的福尔马林(和光纯药工业会社制)固定畸胎瘤组织，进行苏木-碘染色。另外，对从bj细胞建立的上述ips细胞的核型进行解析(chromocenter公司)。

(结果)

如图10所示，在未分化的细胞表达的碱性磷酸酶、nanog、oct3/4、ssea－4、tra－1－60以及tra－1－81的表达，在ips细胞得到确认。rt－pcr法的结果示于图11。ips细胞的各试样确认了遗传基因导入了的oct3/4、sox2、klf4以及l－myc的表达。另外，还确认了未分化标记的nanog、tert以及dnmt3b的表达。需要说明的是，未见来源于麻疹病毒的n蛋白质以及l蛋白质的表达。进而，确认了上述ips细胞的三胚层分化(参考图12)。

如图13所示畸胎瘤形成试验的结果确认了三胚层分化能。由此表明了从bj细胞建立的上述ips细胞的多分化能。如图14所示该ips细胞具有46根染色体，核型正常。

(实施例5：基底状态(groundstate)的ips细胞的建立和分化诱导以及解析)

将由理化学研究所获得的源于脐带血的cd34阳性细胞进行解冻，使用在stemspan中添加了scf、tpo、flt3l的培养液在37℃、5％co2恒温箱内进行培养。次日，使用mvv通过离心法(室温、1200×g、45分钟)进行遗传基因导入，通过上述培养液培养2天。在第3天播种于mef细胞上，在第4天将培养液换成人es细胞维持培养液。此后，隔1天交换培养液并继续在37℃、5％co2恒温箱内培养。采取在遗传基因导入后第14天出现的菌落(参考图15)，通过0.25％胰蛋白酶/edta混合溶液解离成单细胞，播种至mef细胞上，并在37℃、5％co2恒温箱内培养。

(结果)

如图15所示，建立了基底状态的ips细胞。基底状态的ips细胞，隔4天用0.25％胰蛋白酶/edta混合溶液进行解离至单细胞以作为传代，其结果，不使用y－27632进行10次传代以上也能够维持菌落形态。另外，将培养液换成人es细胞维持培养液，将mef细胞的播种浓度变薄，由此也能够确认人es细胞样菌落的出现。

在不脱离本发明的广义的精神及范围内，本发明能够进行各种实施方式以及变形。另外，上述实施方式仅仅是用于说明本发明，不能够限定本发明的范围。即，本发明的范围，不是通过实施方式，而是通过权利要求书所示。并且，权利要求书以及与其同等的发明的意义范围内实施的各种变形，均属于本发明范围内。

工业上的利用可能性

本发明适用于用于对血液细胞导入遗传基因的病毒载体以及构建体。因此，期待本发明在免疫疗法、尤其是对t细胞疗法的应用。另外，由于本发明也适用于功能性干细胞的制备，除了使用通过分化诱导得到的组织细胞的再生医疗之外，还能够应用于从来源于疑难杂症患者的细胞所建立的ips细胞的疾病解析以及创新药研究。进一步，还可能应用于以血液细胞为对象的基因组编辑技术。

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<110>国立大学法人九州大学

<120>病毒载体、细胞及构建体

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<223>pcrprimerforendosox2,s1430

<400>5

gggaaatgggaggggtgcaaaagagg26

<210>6

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforendosox2,as1555

<400>6

ttgcgtgagtgtggatgggattggtg26

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforendoklf4,s1128

<400>7

acgatcgtggccccggaaaaggacc25

<210>8

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforendoklf4,as1826

<400>8

tgattgtagtgctttctggctgggctcc28

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforendomyc,s253

<400>9

gcgtcctgggaagggagatccggagc26

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforendomyc,as555

<400>10

ttgaggggcatcgtcgcgggaggctg26

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerfornanog,968s

<400>11

cagccccgattcttccaccagtccc25

<210>12

<211>25

<212>dna

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<220>

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<400>12

cggaagattcccagtcgggttcacc25

<210>13

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

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<400>13

cctgctcaagctgactcgacaccgtg26

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<212>dna

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<400>14

ggaaaagctggccctggggtggagc25

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<220>

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tgctgctcacagggcccgatacttc25

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

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tcctttcgagctcagtgcaccacaaaac28

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<212>dna

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<220>

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<210>18

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

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<400>18

tcctggtagctcattctc18

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<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerformv-lprotein,fw

<400>19

cacggtattacatcttcacg20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerformv-lprotein,rv

<400>20

gcatctctgtcaattaaagg20

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

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<400>21

gcaagagatggccacggctgc21

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pcrprimerforbeta-actin,as1033

<400>22

tctccttctgcatcctgtcggc22