用于疫苗及诊断开发的重组登革病毒的方法及组合物与流程

优先权声明

根据35u.s.c.§119(e)，本申请要求保护2014年11月2日提交的美国临时申请系列号62/074,053的权益，所述申请案的全部内容通过引用结合到本文中。

政府支持声明

本发明使用美国国立卫生研究院授予的基金号ai057157、ai097560、ai107731和ai109761下的政府支持进行。美国政府对本发明具有一定权利。

发明领域

本发明涉及这样的登革病毒疫苗，其诱导针对来自单个来源的多于一种登革病毒血清型的中和抗体。

发明背景

登革病毒(denv)为一种蚊媒黄病毒，其以空前的速度传播并已在50多个国家形成较大的健康及经济负担。现有的防御全部四种denv血清型的denv疫苗必须作为四种病毒或者四种重组蛋白的“四价”制剂递送，意图其各自提供针对所述血清型的防御。近期在泰国的大型2b期试验中，提供临床上有意义保护的最先进的四价减活嵌合病毒的失败，强调了在所述四价混合物中适当混合血清型以实现均衡的抗体应答仍为未知的(sabchareon等，2012)。认为病毒干扰导致失败，因为一种或多种病毒血清型在竞争中胜过其他血清型。

本发明通过提供以下嵌合登革病毒来克服本领域中的前述缺陷，所述嵌合登革病毒诱导针对来自单个来源的多于一种登革病毒血清型的中和抗体。

发明概述

在一方面，本发明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被与以下登革病毒血清型反应的抗体识别，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型4，和所述抗体与登革病毒血清型3反应。

在又一方面，本发明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入来自以下登革病毒血清型的蛋白质结构域的氨基酸取代，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型4，和所述蛋白质结构域来自登革病毒血清型2。

在另一方面，本发明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被与以下登革病毒血清型反应的抗体识别，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型2，和所述抗体与登革病毒血清型1反应。

本文亦提供在受试者(例如，有需要的受试者)中产生对登革病毒的免疫反应的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

本文另外提供在受试者(例如，有需要的受试者)中治疗登革病毒感染的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

本文进一步提供在受试者(例如，有需要的受试者)中预防与登革病毒感染相关的病症的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

作为另一方面，本发明提供保护受试者免受登革病毒感染影响的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

在另外的方面，本发明提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对特定登革病毒血清型或其组合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含本发明的特定e糖蛋白的组合物；b)在黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含上述特定e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；和c)检测步骤(b)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体的存在。

本发明另外提供了在来自受试者的生物样品中鉴定针对特定的登革病毒血清型或其组合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗体的存在的方法，其包括：a)在黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自已给予本发明的特定e糖蛋白的受试者的生物样品与包含所述e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；和b)检测步骤(a)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体的存在。

在其它实施方案中，本发明提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对特定登革病毒血清型或其组合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗体，所述方法包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予受试者包含本发明的特定e糖蛋白的免疫原性组合物；b)在黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；c)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和d)如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对所述特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体。

本文进一步提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对特定登革病毒血清型或其组合(例如4/3、4/2、2/1)的中和抗体，所述方法包括：a)在黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自已给予包含本发明的特定e糖蛋白的免疫原性组合物的受试者的生物样品与包含所述e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；b)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和c)如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对所述特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体。

本发明亦提供在样品中检测针对特定登革病毒血清型或其组合的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使所述样品与本发明的特定e糖蛋白接触；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在所述样品中检测针对所述特定登革病毒血清型或其组合的抗体。

本文另外提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对特定登革病毒血清型或其组合的抗体的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含本发明的特定e糖蛋白的组合物；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本发明的又一方面提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对特定登革病毒血清型或其组合的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予包含本发明的特定e糖蛋白的免疫原性组合物的受试者的生物样品与所述e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本发明另外提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对特定登革病毒血清型或其组合的抗体，所述方法包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予包含本发明的特定e糖蛋白的免疫原性组合物的受试者的生物样品与所述e糖蛋白接触；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定以下免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对所述特定登革病毒血清型或其组合的抗体。

本发明的又一个实施方案为鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体，所述方法包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予受试者包含特定e糖蛋白的免疫原性组合物；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定以下免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对所述特定登革病毒血清型或其组合的中和抗体。

本文另外提供包含本发明的e糖蛋白的登革病毒颗粒、黄病毒颗粒和/或病毒样颗粒(vlp)。

本文亦提供编码本发明的e糖蛋白的分离的核酸分子，以及编码本发明的登革病毒颗粒、黄病毒颗粒或vlp的分离的核酸分子。

本发明亦提供包含在药学上可接受的载体中的本发明的e糖蛋白的组合物，以及亦提供包含在药学上可接受载体中的本发明的核酸分子、本发明的载体(vector)、本发明的颗粒和/或本发明的群体的组合物。

本发明另外提供本发明的e糖蛋白、本发明的登革病毒颗粒、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的群体和/或本发明的组合物，其单独或以任何组合用于制备在受试者中产生对登革病毒的免疫反应的药剂、用于在有需要的受试者中治疗登革病毒感染、用于在受试者中预防登革病毒感染和/或保护受试者免受登革病毒感染的影响。

本文亦提供本发明的e糖蛋白、本发明的登革病毒颗粒、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的群体和/或本发明的组合物的用途，其单独或以任何组合用于在受试者中产生对登革病毒的免疫反应、在有需要的受试者中治疗登革病毒感染、在受试者中预防登革病毒感染和/或保护受试者免受登革病毒感染的影响。

附图简述

图1.denv3和4的感染性cdna克隆的设计以及重组denv4/3病毒的产生。(a)包含用于生成次基因组片段(subgenomicfragment)的限制酶的denv3和denv4感染性克隆设计的基因组示意图。次基因组片段的大小指出在denv基因组中进行切断以避开细菌不稳定性和毒性的位置。(b)通过移植denv3序列分别产生denv4m12、m14和m16在denv4e蛋白中改变的氨基酸。氨基酸编号代表距离denv4的e蛋白起始位置的残基。指出aa转入denv4m12(c；绿色残基)、denv4m14(d；绿色+蓝绿色残基)和denv4m16(e；绿色+蓝绿色+橙色残基)中的denv3e蛋白二聚体的缎带结构。颜色对应于(b)中突显的aa残基。

图2.rdenv4/3在哺乳动物细胞上的生长特性。(a)使denv3、denv4、denv4m12、denv4m14和denv4m16在c6/36细胞上增殖至观察到最大细胞病理(通常在接种后4天)，并将其收集用于vero-81细胞滴定。感染滴度表示成ffu/ml细胞培养上清液。(b)wt和rdenv病毒在vero-81细胞上的感染斑大小和形态。

图3.rdenv4/3在节肢动物细胞上的生长特性。(a)以moi=0.01接种到c6/36细胞上的denv3、denv4、denv4m12、denv4m14和denv4m16的多步生长曲线分析。如所述的对c6/36细胞滴定细胞培养上清液。(b)wt和rdenv在c6/36细胞上的感染斑大小和形态。

图4.hmab5j7对rdenv4/3的结合和中和。(a)denv3特异性hmab5j7对denv3、denv4、denv4m14和denv4m16的elisaod值。5j7不结合denv4m12且显示与wtdenv4相同的曲线(未显示数据)。在vero-81(b)和u937-dc-sign(c)上对denv3、denv4、denv4m12、m14和m16的中和试验。数据显示为中和50%的病毒感染性所需的μg/ml。

图5.多克隆denv3血清中和。(a-d)在vero-81细胞上针对denv3、denv4、denv4m12和denv4m14测定从初次denv3感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv3体液免疫反应的敏感性。(e-g)在u937-dc-sign细胞上针对denv3、denv4、denv4m14和denv4m16测定从初次denv3感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv3体液免疫反应的敏感性。

图6.多克隆denv4血清中和。(a)在vero-81细胞上针对denv3、denv4、denv4m12和denv4m14测定从初次denv4感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv4体液免疫反应的敏感性。(b-d)在u937-dc-sign细胞上针对denv3、denv4、denv4m14和denv4m16测定从初次denv4感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv4体液免疫反应的敏感性。

图7.异型血清中和。(a、b)在vero-81细胞上针对denv1、denv3、denv4m12和denv4m14测定从初次denv1感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对非特异性体液免疫反应的敏感性。(c、d)在vero-81细胞上针对denv2、denv3、denv4m12和denv4m14测定从初次denv2感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv4体液免疫反应的敏感性。

图8.denv1和2的感染性cdna克隆的设计及重组denv2/1病毒的产生。(a)包含用于生成次基因组片段的限制酶的denv1和denv2感染性克隆设计的基因组示意图。次基因组片段的大小指出在denv基因组中进行切断以避开细菌不稳定性和毒性的位置。(b)通过移植denv1序列产生denv2-1f4e在denv2e蛋白中改变的氨基酸。氨基酸编号代表距离denv2的e蛋白起始位置的残基。(c)aa转入denv2-1f4e的denv2e蛋白二聚体的缎带结构。

图9.rdenv2/1的生长特性。使denv1、denv2和denv2-1f4e在c6/36细胞上增殖至观察到最大细胞病理(通常在接种后4天)，并将其收集用于使用vero-81(a)或c6/36(b)细胞滴定。感染滴度表示成ffu/ml细胞培养上清液。(c)以moi=0.01接种到c6/36细胞上的denv1、denv2和denv2-1f4e的多步生长曲线分析。如所述的对c6/36细胞滴定细胞培养上清液。(d)wt和denv2-1f4e病毒在c6/36细胞上的感染斑大小和形态。

图10.hmab1f4对rdenv2/1的结合和中和。(a)denv1特异性hmab1f4对denv1、denv2和denv2-1f4e的elisaod值。在c6/36(b)和u937-dc-sign(c)上对denv1、denv2和denv2-1f4e的中和试验。数据显示成中和50%的病毒感染性所需的μg/ml。

图11.多克隆denv1和denv2血清中和。(a和b)在u937-dc-sign细胞上针对denv1、denv2和denv2-1f4e测定从初次denv1感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv1体液免疫反应的敏感性。(c-e)在u937-dc-sign细胞上针对denv1、denv2和denv2-1f4e测定从初次denv2感染恢复的人类供者收集的血清，以评价对denv2体液免疫反应的敏感性。

图12.鼠科动物存活率。使用3.3x10⁶ffudenv1、denv2或denv2-1f4e腹膜内接种c57bl/6背景下的干扰素α/β/γ缺陷型小鼠。对小鼠监测体重减轻和临床疾病达56天。

图13.dv4-ediii-dv2病毒的设计和构建。(a)denv2和denv4线性包膜蛋白结构域iii(ediii)序列(整个e序列的第296-395个残基，总计99个aa)的氨基酸比对。denv2和denv4之间不同的残基以灰色突显。含有来自denv3的ediii的重组denv4病毒rdenv4/2，将来自denv4的不同残基替换成来自denv2的残基，以浅灰色突显。(b)denv2e蛋白二聚体的草图(左)和空间填充(右)晶体结构模型，将交换的残基着色。(c)用于处理denv基因组的反求遗传学系统，上图=denv2，下图=denv4。将denv基因组分成四个质粒盒(plasmidcassette)，其可独立突变、连接在一起并电穿孔进入细胞以产生重组病毒。denv4-a盒含有包膜蛋白基因，用灰色突显ediii。在denv4主链中将ediii残基替换成来自denv2的残基，产生dv4-ediii-dv2病毒。

图14.具有类似成熟特性的denv4和dv4-ediii-dv2病毒体。使病毒在c6/36细胞中生长，收集培养上清液并离心去除任何细胞碎片。使样品在12%sds-page凝胶上跑胶并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗体探测印迹。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或者prm分解。在denv4或dv4-ediii-dv2样品中均未检出prm条带。

图15.dv4-ediii-dv2相对于亲代病毒在vero细胞中具有2个对数生长衰减。(a)以moi=0.01感染vero-81细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后对vero-81细胞滴定。(b)denv在vero-8细胞中形成感染斑(denv2、denv4和dv4-ediii-dv2分别在感染后5天、4天和6天进行固定)。dv4-ediii-dv2空斑小于两种亲代病毒。

图16.dv4-ediii-dv2在c6/c36细胞中没有生长衰减。(a)以moi=0.01感染c6/c36细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后用c6/c36细胞滴定。(b)denv在c6/c36细胞中形成感染斑(denv2、denv4和dv4-ediii-dv2分别在感染后4天、3天和5天进行固定)。在生长更多天的情况下，dv4-ediii-dv2空斑达到与亲代病毒相当的大小。

图17.通过型特异性denv2人mab结合和中和dv4-ediii-dv2的转移。(a)与四价表位结合的强中和性dv2mab(人mab2d22)的概述表。(b)先前产生的2d22逃逸突变体导致位于ediii的一个逃逸突变r323g。(c)elisa测定显示转移了部分2d22与dv4-ediii-dv2的结合，其高于亲代dv4的水平，但不及dv2水平。(d)交叉反应的对照抗体2j20的elisa结合，显示相当水平的病毒存在并维持病毒结构完整性。(e)使用2d22进行基于vero-81的空斑减少中和试验(frnt)并计算frnt50(中和50%的感染所需的抗体浓度)值。(f)使用2d22进行基于u937+dc-sign的中和试验(neut)并计算neut50值。在两个试验(e、f)中，dv4-ediii-dv2获得水平高于dv2的对2d22的中和。dv4在任一试验中均未被最大浓度的2d22中和。

图18.dv4-ediii-dv2获得对许多额外的dv2型特异性mab的中和。(a、b、e)具有逃逸突变体或丙氨酸扫描突变残基(来自表2)的denve蛋白二聚体晶体结构，分别指出为dvc3.7的第382位残基、dvc10.16的第311位残基、以及dvc13.6的第101和108位残基。(c、d、f-i)对各mab的vero-81frnt试验。例外的是3f9，dv4-ediii-dv2与给定mab的中和以与亲代dv2病毒相等或更高的水平转移。3f9不结合dv4-ediii-dv2(未显示elisa结合数据)。

图19.dv4-ediii-dv2未被dv型特异性ediiimab中和。(a)具有在第331和361位残基指出的丙氨酸扫描突变残基(来自表2)的denve蛋白二聚体晶体结构。(b)vero-81frnt试验显示dv-e88不能中和dv4-ediii-dv2或dv2，但是可中和亲代dv4。

图20.dv4-ediii-dv2获得对多克隆denv2免疫血清的中和。(a-l)vero-81frnt试验显示获得对dv4-ediii-dv2的多克隆免疫血清中和，其与dv2中和的水平相当，表明将ediii从dv2转移到dv4中足以转移大部分的denv2中和。*=fnrt50<20

图21.dv$-ediii-dv2保持对多克隆denv4免疫血清的中和。(a-f)vero-81frnt试验显示dv4-ediii-dv2保持大部分中和，表明从dv2转移ediii不会干扰dv4中和表位。*=fnrt50<20

图22.dv4-ediii-dv2获得dv2血清中和并保留dv4血清中和。(a)在图19中显示的dv2多克隆中和数据的概述。(b)在图20中显示的dv4多克隆中和数据的概述。fnrt50<20的样品以19的血清稀释因子作图。

图23.dv4-ediii-dv2未获得对异型多克隆免疫血清的中和。vero-81frnt试验显示未获得高于亲代dv2或dv4中和滴度的对异型(a)denv1或(b)denv3多克隆免疫血清的中和。fnrt50<20的样品以19的血清稀释因子作图。

图24.rdenv4/2病毒的设计和构建。(a)可将来自denv2(右)的残基移入denv4主链，产生重组denv4/2病毒(rdenv4/2)。(b)用于处理denv基因组的反求遗传学系统。上图=denv2，下图=denv4。将denv基因组分成四个质粒盒，其可独立突变、连接在一起并电穿孔进入细胞以产生重组病毒。denv4-a盒含有进行突变的包膜蛋白基因。将denv4残基替换成来自denv2的残基，产生rdenv4/2病毒，其完全在denv4基因主链上构建。

图25.用于通过rt-pcr的血清型鉴定的新方法及denv4主链重组病毒的验证。(a)用于血清型特异性rt-pcr的rt-pcr引物的设计。引物使用靶向高度保守的3’端ns1基因的通用正义寡核苷酸。血清型特异性反义引物靶定高度差异的ns2a基因。(b)使病毒在c6/36细胞中生长，收集培养上清液并离心去除任何细胞碎片。使用qiagenqiamp病毒rna小量制备试剂盒分离病毒rna。将pcr运行35个循环，并在1.5%超纯琼脂糖凝胶上分析pcr产物。将对照rna(dv1/dv2/dv3/dv4)和水作为阳性和阴性对照跑胶。预期产物大小：dv1=205bp，dv2=539bp，dv3=455bp，dv4=401bp。

图26.限制性片段长度多态性区分rdenv4/2与亲代denv4。(a)设计用以区分rdenv4/2(下)与亲代denv4(上)的限制性片段长度多态性(rflp)。引入denv4e基因组中以产生rdenv4/2的突变(以星号表示)破坏denv4中存在的xmni限制酶位点。(b)对pcr产物进行凝胶纯化并用xmni消化。在1.5%超纯琼脂糖凝胶上分析消化产物。预期产物大小：未消化全长=1031bp，消化产物=931bp和113bp。

图27.denv4和rdenv4/2病毒体具有类似的成熟特性。使病毒在c6/36细胞中生长，收集培养上清液并离心去除任何细胞碎片。使样品在12%sds-page凝胶上跑胶并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗体探测印迹。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或者prm分解。在denv4或rdenv4/2样品中均未检出prm条带。

图28.rdenv4/2相对于亲代病毒在vero细胞中具有2个对数生长衰减。(a)以moi=0.01感染vero-81细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后用vero-81细胞滴定。(b)denv在vero-81细胞中形成感染斑(denv2、denv4和rdenv4/2分别在感染后5天、4天和6天进行固定)。rdenv4/2空斑小于两种亲代病毒。

图29.rdenv4/2在c6/c36细胞中无生长衰减且形成与亲代病毒类似的感染斑。(a)以moi=0.01感染c6/c36细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后对c6/c36细胞滴定。(b)denv在c6/c36细胞上形成感染斑(denv2、denv4和rdenv4/2分别在感染后4天、3天和5天进行固定)。在生长更多天的情况下，rdenv4/2空斑达到与亲代病毒相当的大小。

图30.通过型特异性denv2人mab结合和中和rdenv4/2的转移。(a)与四价表位结合的强中和性dv2mab(人mab2d22)的概述表。(b)elisa测定显示转移了部分2d22与rdenv4/2的结合，其高于亲代dv4的水平，但不及dv2水平。(c)交叉反应的对照抗体2j20的elisa结合，显示相当水平的病毒存在和保持病毒完整性。(d)使用2d22进行基于vero-81的空斑减少中和试验(frnt)并计算frnt50(中和50%的感染所需的抗体浓度)值。(e)使用2d22进行基于u937+dc-sign的中和试验(neut)并计算neut50值。在两个试验(e、f)中，rdenv4/2得到水平高于dv2的对2d22的中和。dv4在任一试验中均未被最大浓度的2d22中和。

图31.rdenv4/2获得对denv2多克隆免疫血清的中和，同时保留对denv4多克隆血清的中和。vero-81frnt试验显示rdenv4/2(a)获得水平与亲代denv2相当的对denv2多克隆免疫血清的中和。(b)rdenv4/2未显示丧失通过denv4多克隆免疫血清的中和。rdenv4/2显示未获得高于亲代denv2或denv4中和滴度的对异型(c)denv1和(d)denv3多克隆免疫血清的中和。如所指示的将来自具有自然感染或实验疫苗接种的个体的血清编码。fnrt50<20的样品以19的血清稀释因子作图。

图32a.重组denv4/2序列的比对。显示了野生型denv2、重组dv4-ediii-dv2和野生型denv4的氨基酸序列，连同共有序列和氨基酸保守百分比。

图32b.重组denv2/1序列的比对。显示了野生型denv1、重组denv2-1f4e和野生型denv2的氨基酸序列，连同共有序列和氨基酸保守百分比。

图32c.重组denv4/3序列的比对。显示了野生型denv3、重组denv4m12、denv4m14、denv4m16和野生型denv4的氨基酸序列，连同共有序列和氨基酸保守百分数。

发明详述

本发明是基于以下意外发现：可将定义一种或多种denv血清型的一个或多个表位区转移到不同denv血清型的蛋白质主链中，以产生含有靶向多种血清型的抗体的嵌合分子，从而作为多价(例如二价、三价或四价)疫苗起作用，所述多价疫苗可诱导针对来自单个来源或少于四种来源的两种、三种或四种不同denv血清型的中和抗体。因此，本发明提供用于构建包含氨基酸取代的嵌合登革病毒e糖蛋白主链的平台，所述取代引入被各自的抗体识别的一个或多个表位(epitome)，所述抗体与一种或多于一种登革病毒血清型反应，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同。

在一些实施方案中，所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型1。在一些实施方案中，所述登革病毒e糖蛋白主链可来自登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。

在一些实施方案中，所述与登革病毒血清型反应的抗体(所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同)，为与登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4反应的抗体。

在一些实施方案中，可将来自一种或多种各自的登革病毒血清型的一个或多个登革病毒蛋白质结构域引入不同登革病毒血清型的登革病毒e糖蛋白主链中。

应理解的是，均可使用用于所述登革病毒e糖蛋白主链的第一登革病毒血清型与如分别在第二、第三和/或第四登革病毒血清型中所鉴定的登革病毒表位或登革病毒蛋白质结构域的任何组合，前提是所述第一登革病毒血清型和所述第二、第三和/或第四登革病毒血清型为不同的(即，所述第二、第三和/或第四血清型不为与所述第一登革病毒血清型相同的血清型，和/或所述第二、第三和/或第四登革病毒血清型彼此为不同的)。

因此，在一些实施方案中，本发明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被与以下登革病毒血清型反应的抗体识别，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型4，和所述抗体与登革病毒血清型3反应。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体5j7，而在一些实施方案中，所述e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成、或者由以下氨基酸序列组成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(wt_denv4，seqidno:1)，

其中所述氨基酸序列包含全部或者并非全部的任意组合的下列氨基酸取代：

t49e、k51t、e52q、v53l、l55t、t58k、y59l、s122l、g123e、k124p、t126e、n128k、l129v、i132y、m199l、k200t、t205a、l207m、k210r、l214f、a222s、v270i、d271q、s272n、g273s、d274g、n276t、h277s和m278i，且其中所述氨基酸序列可进一步包含任意组合的一个或多个下列氨基酸取代：a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q和v362p。

在一些实施方案中，上文描述为4/3登革病毒糖蛋白的嵌合登革病毒e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成、或者由以下氨基酸序列组成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m12，seqidno:2)，

或者氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkteatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfsclepiegkvvqyenleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m14，seqidno:3)，

或者氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkteatqlatlrklcieasisnittdtrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfsclepiegkvvqyenleytvvvtvhngdqhavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgattsephwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsikkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsptnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(denv4_m16，seqidno:4)。

在一些实施方案中，本发明提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入来自以下登革病毒血清型的蛋白质结构域的氨基酸取代，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型4，和所述蛋白质结构域来自登革病毒血清型2。

在一些实施方案中，登革病毒血清型4的登革病毒e糖蛋白主链包含引入被抗体识别的表位的氨基酸取代，所述抗体与登革病毒血清型2反应。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体2d22。

在一些实施方案中，所述蛋白质结构域为e糖蛋白结构域iii，而在一些实施方案中，上文描述为4/2的嵌合登革病毒e糖蛋白可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成、或者由以下氨基酸序列组成：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(dv4-ediii-dv2，seqidno:5)。

在一些实施方案中，所述嵌合登革病毒e糖蛋白可包含氨基酸序列：

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttakevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsgdgnhmfaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(wt_denv4，seqidno:1)，

其中所述氨基酸序列可包含全部或者并非全部的任意组合的下列氨基酸取代：

t300s、s303t、s307k、d309v、m312i、t320i、v322i、k323r、k325q、a329d、a331s、v335i、i337f、r340t、v342l、n343e、e345r、k346h、v348l、v351l、s353t、s354v、t355n、l357i、a358v、e359t、n360e、t361k、n362d、v364p、t365v、l369a、v379i、g383e、n384p、s385g、a386q、t388k、h390n和r393k。

本发明另外的实施方案包括互换病毒(reciprocalexchangevirus)，即，具有引入来自登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域(例如结构域iii)的氨基酸取代的登革病毒血清型2的登革病毒e糖蛋白。登革病毒血清型主链和来自不同登革病毒血清型的取代登革病毒蛋白质结构域的任何其他组合均被纳入为本发明的实施方案，其包括例如组合1/2、1/3、1/4、1/2/3、1/2/4、1/3/4、1/2/3/4、2/1、2/3、2/4、2/1/3、2/1/4、2/3/4、2/1/3/4、3/1、3/2、3/4、3/1/2、3/1/4、3/2/4、3/1/2/4、4/1、4/2、4/3、4/1/3、4/1/2、4/3/2或4/3/2/1(其中各组合的第一个数字定义所述主链的血清型，和各组合的第二、三或四个数字定义引入所述主链中的表位或结构域的血清型)。

本发明的一些实施方案提供包含以下登革病毒e糖蛋白主链的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述主链包含引入表位的氨基酸取代，所述表位被与以下登革病毒血清型反应的抗体识别，所述登革病毒血清型与所述登革病毒e糖蛋白主链的登革病毒血清型不同，其中所述登革病毒e糖蛋白主链来自登革病毒血清型2，和所述抗体与登革病毒血清型1反应。在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体1f4，而在一些实施方案中，所述嵌合登革病毒e糖蛋白包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成、或者由以下氨基酸序列组成：

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtnpavlrkycieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfickhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckknmegkvvqpenlkysvivtvhsgeehavgndttehgttatitpqaptseiqltdygaltlecsprtgldfnemvllqmedkawlvhrqwfldlplpwlpgadtqesnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttlftghlkcrlrmdklqlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(denv2-1f4e，seqidno:6)。

在本发明的一些实施方案中，所述嵌合e糖蛋白可包含登革病毒血清型1、登革病毒血清型2或登革病毒血清型3的登革病毒e糖蛋白主链，其包含任意组合的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或全部15个)下列氨基酸取代，以引入与单克隆抗体5h2反应的来自登革病毒血清型4的表位：第155位残基上的a、第160位残基上的v、第161位残基上的t、第162位残基上的a、第163位残基上的m、第168位残基上的s、第170位残基上的s、第171位残基上的v、第173位残基上的v、第174位残基上的k、第176位残基上的p、第177位残基上的d、第180位残基上的e、第291位残基上的k和第293位残基上的r。氨基酸编号是基于本文提供的wt_denv4的氨基酸序列。

本发明提供本发明的嵌合登革病毒e糖蛋白的另外的非限制性实例，其可用于本文提供的序列章节中的本文所述的组合物和方法。

本发明亦提供各种治疗方法，包括例如在受试者中产生对登革病毒的免疫反应的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

本文另外提供的是在受试者中治疗登革病毒感染的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

在另外的实施方案中，本发明提供在受试者中预防与登革病毒感染相关的病症的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

本文亦提供的是保护受试者免受登革病毒感染影响的方法，其包括给予所述受试者有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的vlp、本发明的核酸分子、本发明的群体和/或本发明的组合物及其任何组合。

本发明亦提供各种诊断方法，包括例如在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含上文步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；和c)检测步骤(b)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体的存在。

本文进一步提供的是在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含上文步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；和c)检测步骤(b)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体的存在。

本发明亦提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含上文步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；和c)检测步骤(b)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体的存在。

本文亦提供的是在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测步骤(a)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体的存在。

此外，本发明提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测步骤(a)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体的存在。

在另外的实施方案中，本发明提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体的存在的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测步骤(a)中的中和，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体的存在。

本发明进一步提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体，所述方法包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；c)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和d如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体。

此外，本发明提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体，所述方法包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；c)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和d如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体。

本发明进一步提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体，所述方法包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；b)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自所述受试者的生物样品与包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒接触；c)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和d如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体。

在另外的实施方案中，本发明提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体，所述方法包括：a)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与包含e糖蛋白的黄病毒颗粒接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和c)如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体。

此外，本发明提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体，所述方法包括：a在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与包含e糖蛋白的黄病毒颗粒接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和c)如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体。

本文另外提供的是鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体，所述方法包括：a)在所述黄病毒颗粒的中和可被检测的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与包含e糖蛋白的黄病毒颗粒接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；b)确定所述生物样品是否包含这样的抗体，其中和包含步骤(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒；和c)如果所述生物样品包含这样的抗体，其中和包含(a)的e糖蛋白的黄病毒颗粒，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体。

本发明进一步提供在样品中检测针对登革病毒血清型3和/或4的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使所述样品与下列组合物接触：包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在所述样品中检测针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本发明亦提供在样品中检测针对登革病毒血清型2和/或4的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使所述样品与下列组合物接触：包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在所述样品中检测针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本文亦提供的是在样品中检测针对登革病毒血清型1和/或2的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使所述样品与下列组合物接触：包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在所述样品中检测针对登革病毒血清型1和/或2的抗体。

本文进一步提供的是在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本文另外提供的是在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的抗体的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的抗体。

在又另外的实施方案中，本发明提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的抗体的方法，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的抗体。

本文另外提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与e糖蛋白接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本发明进一步提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与e糖蛋白接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型2和/或4的抗体。

本发明进一步提供在来自受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的抗体的方法，其包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与e糖蛋白接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而在来自所述受试者的生物样品中鉴定针对登革病毒血清型1和/或2的抗体。

本发明进一步提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的抗体，所述方法包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与e糖蛋白接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的抗体。

本文进一步提供的是鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的抗体，所述方法包括：a在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予包含权利要求6-8中任一项的e糖蛋白的免疫原性组合物的受试者的生物样品与所述e糖蛋白接触；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的抗体。

本文亦提供的是鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的抗体，所述方法包括：a)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自已给予下列免疫原性组合物的受试者的生物样品与e糖蛋白接触：包含e糖蛋白的免疫原性组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；和b)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的抗体。

在本发明的一些实施方案中，提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型3反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型3的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型3的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b)在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型3和/或4的中和抗体。

本发明另外提供鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型4反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型4的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型4的登革病毒蛋白质结构域；b在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型2和/或4的中和抗体。

本文亦提供的是鉴定免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物在受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体，其包括：a)以有效诱导对e糖蛋白的抗体反应的量给予所述受试者包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型1反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入被抗体识别的表位，所述抗体与登革病毒血清型2反应，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型2的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型1的登革病毒蛋白质结构域，和/或包含e糖蛋白的组合物，所述e糖蛋白包含含有氨基酸取代的血清型1的e糖蛋白主链，所述氨基酸取代引入登革病毒血清型2的登革病毒蛋白质结构域；b在抗原/抗体复合物可形成的条件下，使来自所述受试者的生物样品与(a)的e糖蛋白接触；和c)检测抗原/抗体复合物的形成，从而鉴定这样的免疫原性组合物，其在所述受试者中诱导针对登革病毒血清型1和/或2的中和抗体。

在一些实施方案中，本发明提供确定针对移植表位或结构域产生的抗体的量的方法。例如，可通过比较denv4m14与亲代denv4的中和来测定靶定5j7区的denv3抗体，预期的是，denv3抗体可中和某部分denv4m14，但不可中和亲代denv4。

本发明亦提供包含本发明的嵌合e糖蛋白的登革病毒颗粒、黄病毒颗粒和病毒样颗粒(vlp)。本发明的登革病毒e糖蛋白可存在于完整病毒颗粒(例如死病毒颗粒或减活病毒颗粒或者重组登革病毒载体)或病毒样颗粒(vlp)中，其可任选为完整的登革病毒颗粒或登革病毒vlp。

亦提供的是编码本发明的e糖蛋白的分离的核酸分子，编码本发明的登革病毒颗粒、黄病毒颗粒或vlp的分离的核酸分子，包含本发明的核酸分子的载体和包含本发明的登革病毒颗粒和/或黄病毒颗粒的登革病毒颗粒和/或黄病毒颗粒的群体。

本文进一步提供的是包含在药学上可接受的载体中的本发明e糖蛋白的组合物、包含在药学上可接受的载体中的本发明核酸分子的组合物、包含本发明病毒颗粒的组合物、包含在药学上可接受的载体中的本发明群体的组合物以及包含在药学上可接受的载体中的本发明vlp的组合物。

在一些实施方案中，可通过将鉴定为登革病毒表位和/或登革病毒蛋白质结构域的部分的某些(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等)或全部氨基酸取代引入登革病毒e糖蛋白主链或黄病毒e糖蛋白主链中，来进行本发明的嵌合体的生成。并非需要取代每个鉴定为登革病毒表位或登革病毒蛋白质结构域的部分的氨基酸来产生本发明的嵌合蛋白。例如，在一些实施方案中，可在本发明嵌合体的生成中，在鉴定为登革病毒表位或登革病毒结构域的部分的连续氨基酸序列的任一端，包含另外的取代和/或省去约1、2、3、4或5个氨基酸的取代。根据本文的教导且根据本领域众所周知的方案，本领域普通技术人员可容易地确定产生所需构象表位或结构域所必需的取代数量。在本文所述氨基酸序列中提供的氨基酸残基编号，是基于各自的denv血清型的各个未修饰的(即野生型)e糖蛋白氨基酸序列，如在本文中所提供。然而本领域普通技术人员应容易理解的是，可在其他登革病毒e糖蛋白氨基酸序列或其他黄病毒e糖蛋白氨基酸序列中容易地鉴定等同的氨基酸位置并将其用于产生本发明的嵌合蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供这样的嵌合黄病毒e糖蛋白，其中进行氨基酸取代以将一个或多个登革病毒表位引入来自并非为登革病毒的黄病毒的黄病毒e糖蛋白中。因此，在一些实施方案中，本发明提供包含嵌合e糖蛋白的黄病毒e糖蛋白，所述嵌合e糖蛋白包含并非为登革病毒e糖蛋白主链的黄病毒e糖蛋白主链，其中所述黄病毒e糖蛋白主链包含引入一个或多个表位的氨基酸取代，所述表位被与登革病毒反应的各自的抗体识别。

可使用的黄病毒的非限制性实例包括黄热病病毒(yfv)(例如genbank^®数据库登录号jx503529)、日本脑炎病毒(jev)(例如genbank^®数据库登录号u14163)、西尼罗病毒(wnv)(例如genbank^®数据库登录号dq211652)以及目前已知或后续鉴定的任何其他黄病毒。

本领域已知的是，产生登革病毒疫苗的许多尝试导致非中和抗体的产生，在后续暴露给自然感染或疫苗时，其可增加病理的可能性。提供工程改造表位的另一种方式为递送掺入另一种黄病毒颗粒或vlp中的全部或一部分登革病毒e蛋白。在代表性的实施方案中，所述异源黄病毒为西尼罗病毒或黄热病病毒。可将所述e蛋白的部分植入所述异源黄病毒主链的e蛋白中，例如以减少针对存在于所述登革病毒e蛋白和/或其他登革病毒结构蛋白中的非中和表位的非中和性登革病毒抗体的产生。

因此，嵌合黄病毒或嵌合黄病毒vlp可以适当的构象呈现所述四价登革病毒表位，同时减少针对所述登革病毒e蛋白的其他部分和/或在所述嵌合黄病毒或黄病毒vlp中不存在的其他结构蛋白的非中和抗体的产生。

在本发明的一些实施方案中，所述黄病毒e糖蛋白或登革病毒e糖蛋白的个体和构象表位可存在于合成的主链或支持结构上，由此在所述合成的主链或支持结构内的表位模拟所述e糖蛋白、病毒颗粒或vlp内的表位的构象和排列。

在本发明的再其他的实施方案中，本发明提供模拟本发明的e糖蛋白的个体和构象表位的肽mimitopes(参见meloen等，(2000)j.mol.recognit.13，352-359)。可使用本领域已知的任何技术以及针对本发明的e糖蛋白的个体和构象表位的一种或多种抗体来鉴定mimitopes，所述技术包括但不限于表面刺激、随机肽文库或噬菌体展示文库。

本发明进一步提供编码本发明的登革病毒肽、登革病毒蛋白质结构域、登革病毒多肽或黄病毒多肽的核酸分子(例如分离的核酸分子)。

本发明进一步提供编码本发明的嵌合黄病毒颗粒或嵌合黄病毒病毒样颗粒(vlp)(例如所述黄病毒颗粒的病毒外壳)的核酸分子(例如分离的核酸分子)。

亦提供的是包含本发明的核酸分子的核酸载体。

亦提供的是包含单独的或任何组合的本发明的载体、核酸分子、登革病毒蛋白、登革病毒肽、登革病毒蛋白质结构域、黄病毒蛋白、黄病毒肽、黄病毒蛋白质结构域、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp和/或嵌合黄病毒颗粒。

本发明亦提供包含单独的或任何组合的本发明的细胞、载体、核酸分子、登革病毒蛋白、嵌合登革病毒vlp、嵌合登革病毒颗粒、嵌合黄病毒vlp和/或嵌合黄病毒颗粒的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物是单价体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物为多价体(例如二价体、三价体或四价体)，用于任意组合的登革病毒血清型den1、den2、den3和/或den4。可将本发明的登革病毒嵌合e糖蛋白单独或以任何组合给予受试者，包括根据本领域已知的这类免疫方案的初免和加强的任何组合。本发明的登革病毒嵌合e糖蛋白可以是1/2、1/3、1/4、1/2/3、1/2/4、1/3/4、1/2/3/4、2/1、2/3、2/4、2/1/3、2/1/4、2/3/4、2/1/3/4、3/1、3/2、3/4、3/1/2、3/1/4、3/2/4、3/1/2/4、4/1、4/2、4/3、4/1/3、4/1/2、4/3/2或4/3/2/1(其中各组合的第一个数字定义所述主链的血清型，和各组合的第二、三或四个数字定义引入所述主链中的表位或结构域的血清型)。在一些实施方案中，使用初免/加强组合，其导致给予代表全部四种登革病毒血清型的抗原。所述初免/加强方案可包括以任何顺序给予抗原的任何组合以实现该结果。初免/加强方案的非限制性实例可包括在第0天初免，且分别在3个月和6个月加强，或者在6个月和1年加强。亦可对该方案进行修改以包含仅在3个月、6个月或1年的一次加强。

本发明包括在受试者中产生对登革病毒的免疫反应的方法，其包括单独或以任何组合给予所述受试者有效量的本发明的登革病毒蛋白、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp、嵌合黄病毒颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或免疫原性组合物。

在一些实施方案中，可有利地实施本发明以诱导对den1、den2、den3和den4血清型中的一种、两种、三种或全部四种的免疫反应。在一些实施方案中，可单独或以任何组合和/或顺序给予受试者本发明的登革病毒嵌合e糖蛋白和/或编码本发明的登革病毒嵌合e糖蛋白的核酸分子，以诱导对全部四种denv血清型的免疫反应(例如均衡的免疫反应，其中测定的登革热免疫的参数对于全部四种denv血清型而言几乎为等同的)。本领域众所周知的是，因血清型之间的干扰问题，设计有效且安全的多价登革热疫苗具有挑战性。例如，免疫反应可能仅主要针对靶标血清型中的某些。然后需要多次疫苗接种以尝试实现对所有血清型的反应；然而，在登革病毒的情况下，该方式可能有危险，因为向受试者重复给予预先存在的抗体可导致更严重的并发症和/或疾病，例如登革出血热。

本发明的又一方面为治疗登革病毒感染的方法，其包括单独或以任何组合或任何组合顺序给予所述受试者有效量的本发明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白质结构域、登革病毒肽、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp、嵌合黄病毒颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或免疫原性组合物。

本发明的又一方面为预防登革病毒感染的方法，其包括单独或以任何组合或任何组合顺序给予所述受试者有效量的本发明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白质结构域、登革病毒肽、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp、嵌合黄病毒颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或免疫原性组合物。

本发明的又一方面为保护受试者免受登革病毒感染影响的方法，其包括单独或以任何组合或任何组合顺序给予所述受试者有效量的本发明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白质结构域、登革病毒肽、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp、嵌合黄病毒颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或免疫原性组合物。

对于“保护受试者免受登革病毒感染的影响”，其意指所述受试者不会形成由登革病毒感染导致的疾病或病症，或者即便所述受试者的确形成由登革病毒感染导致的疾病或病症，与未给予本发明的登革病毒蛋白、登革病毒蛋白质结构域、登革病毒肽、嵌合登革病毒颗粒、嵌合登革病毒vlp、嵌合黄病毒vlp、嵌合黄病毒颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或免疫原性组合物的受试者在登革病毒感染时将经历的相比，所述疾病或病症在所述受试者中严重性更小和/或症状减少和/或更不严重。

存在登革病毒的四种血清型(denv-1、denv-2、denv-3和denv-4)。在各血清型中均存在许多不同的毒株或基因型。本发明的登革病毒表位和蛋白质结构域可来源于任何登革病毒，包括目前已知或者后续鉴定的所有血清型、毒株和基因型。

在本发明的实施方案中，所述登革病毒为unc1017株(den1)、西太平洋74株(den1)、s16803株(den2)、unc2005株(den2)、s16803株(den2)、unc3001株(den3)、unc3043(来自菲律宾的den3059.ap-2株，1984年)、unc3009株(den3，d2863，斯里兰卡1989年)、unc3066(den3，1977年来自波多黎各的1342株)、ch53489株(den3)、unc4019株(den4)或tvp-360(den4)。

在本发明的实施方案中，登革病毒多肽(例如所述e蛋白)的“免疫原活性片段”包括下列氨基酸、基本上由下列氨基酸组成或者由下列氨基酸组成：至少约6、8、10、12、15、20、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450个或更多个氨基酸，任选连续的氨基酸，和/或少于约495、475、450、425、400、350、300、250、200、150、100、75或50个氨基酸，任选连续的氨基酸，其包括前述氨基酸的任何组合，只要下限小于上限便可，且所述“免疫原活性的片段”在宿主中诱导针对登革病毒的免疫反应(例如与所述天然抗原反应的igg和/或iga)，任选保护性免疫反应，以及诱导与本文所述的四价登革病毒表位特异性结合的抗体(例如中和抗体)的产生。

本文使用的术语“表位”意指氨基酸序列中的氨基酸残基的特定组合，在以适当的构象存在时，其给抗体(例如b细胞表位)或t细胞受体(例如t细胞表位)提供反应部位。

可使用本领域已知的许多表位作图技术来鉴定包含b细胞表位的给定多肽的部分(参见例如分子生物学方法中的表位作图方案(epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology)，第66卷，glenne.morris编辑，1996，humanapress，totowa，n.j.)。例如，可通过例如在固体支持物上同时合成大量的肽(所述肽对应于所述蛋白质分子的部分)并在所述肽仍与所述支持物结合的同时使所述肽与抗体反应，来鉴定线性表位。所述技术为本领域已知的且描述于例如美国专利号4,708,871；geysen等，(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:3998-4002；geysen等(1986)molec.immunol.23:709-715。

类似地，诸如通过如x射线晶体学和2维核磁共振确定氨基酸的空间构象，可容易地鉴定构象表位。使用标准抗原性及亲水性图，例如使用如可获自牛津大学分子组的omiga版本1.0软件程序计算的标准抗原性及亲水性图，亦可鉴定蛋白质的抗原区。该计算机程序使用hopp/woods法(hopp等，proc.natl.acad.sciusa(1981)78:3824-3828)用于确定抗原性概况和kyte-doolittle技术(kyte等，j.mol.biol.(1982)157:105-132)用于亲水性图。

通常，涉及刺激受试者免疫系统的细胞臂的t细胞表位为约8-25个氨基酸的短肽。鉴定t细胞表位的常见方式为使用重叠合成肽，并使用例如酶联免疫斑点试验(elispot)分析这些肽的集合或单个肽，其被来自对目标抗原有免疫性的动物的t细胞识别。这些重叠肽亦可用于诸如刺激细胞因子释放或分泌的其他试验中，或者通过构建包含所述肽的主要组织相容性(mhc)四聚体来评价。亦可基于其响应通过来自目标抗原的不同片段的刺激而刺激淋巴细胞增殖的能力来鉴定所述免疫原活性片段。

可实施本发明以用于预防、治疗和/或诊断目的。此外，可实施本发明以产生用于任何目的的抗体，例如诊断或研究目的，或者用于通过转移给另一受试者进行被动免疫。

本发明进一步提供包含本发明的一种或多种组合物的试剂盒。本领域普通技术人员应充分理解的是，本发明的试剂盒可包含一个或多个容器和/或贮器以容纳所述试剂盒的试剂(例如抗体、抗原、核酸)，连同适当的缓冲液和/或稀释剂和/或其他溶液以及用于使用所述试剂盒的说明书，如在本领域应是众所周知的。所述试剂盒可进一步包含佐剂和/或其他免疫刺激剂或免疫调节剂，如在本领域中为众所周知的。

本发明的组合物和试剂盒亦可包含其他的医学试剂、药学试剂、载体、稀释剂、免疫刺激细胞因子等。制备所述剂型的实际方法对于本领域技术人员而言为已知的，或者将是显而易见的。

给予受试者可通过本领域已知的任何途径进行。作为非限制性实例，所述给予途径可以是经吸入(例如口和/或鼻吸入)、经口、颊(例如舌下)、直肠、阴道、局部(包括给予气道)、眼内、透皮、经胃肠外(例如肌内[例如给予骨骼肌]、静脉内、动脉内、腹膜内等)、皮下(包括给予足垫)、真皮内、胸膜内、脑内和/或鞘内途径。

本发明的表位、多肽、vlp和病毒载体可以其本身递送或通过递送编码所述表位、多肽、vlp和病毒载体的核酸(例如dna)来递送。

可将诸如免疫调节趋化因子和细胞因子(优选ctl诱导细胞因子)等免疫调节化合物同时给予受试者。

细胞因子可通过本领域已知的任何方法给予。可将外源细胞因子给予所述受试者，或者使用适当的载体将编码细胞因子的核酸递送给所述受试者，以及给予体内产生的细胞因子。在具体的实施方案中，病毒佐剂表达所述细胞因子。

在本发明的实施方案中，可给予本发明的组合物的多次剂量(例如两次、三次或更多次)而不具有可检测的致病性(例如登革休克综合征/登革出血热)。

在本发明的实施方案中，本发明的多价疫苗不会导致免疫干扰，例如诱导了针对存在的所有抗原的均衡免疫反应。在本发明的实施方案中，所述均衡反应导致针对denv-1、denv-2、denv-3和denv-4的保护性免疫。

在本发明的实施方案中，可将所述多价疫苗给予已存在抗登革热母体抗体的受试者。

应理解的是，本发明可以不同的形式实施，且不应理解为受限于本文所述的实施方案。相反，提供这些实施方案以使本公开内容将是充分且完整的，并向本领域技术人员充分表达本发明的范围。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。本文中用于本发明的描述的术语，仅以描述具体实施方案为目的，且并非意图其为本发明的限制。

本文使用的不定冠词或定冠词"a"、"an"或"the"可意指一个或多于一个。例如“a”细胞可意指单个细胞或多个细胞。

本文使用的“和/或”是指且包括一个或多个相关列举项目的任何及所有可能的组合，以及当以择一方式理解时(“或”)，是指不含所述组合。

本文使用的术语“约”，当涉及诸如剂量的量(例如脂肪酸的量)等可测量值时，意指包括规定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%乃至±0.1%的变差。

本文使用的连接词“基本上由……组成”意指权利要求的范围要理解为包括在所述权利要求中记载的规定物质或步骤，“以及并未实质上影响要求保护的发明的基本特征和新特征的物质或步骤”。参见inreherz，537f.2d549，551-52，190u.s.p.q.461，463(ccpa1976)(在原文中强调)；亦参见mpep§2111.03。因此，当用于本发明的权利要求中时，不意图将术语“基本上由……组成”理解成等同于“包括”。

本文使用的术语“核酸”包括rna和dna二者，包括cdna、基因组dna、合成的(例如化学合成的)dna以及rna和dna的嵌合体。所述核酸可以是双链的或单链的。所述核酸可使用核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成。所述核苷酸可用于例如制备改变了碱基配对能力或增加了核酸酶抗性的核酸。

除非另外指明，否则本文使用的术语“多肽”包括肽和蛋白质(包括融合蛋白)二者。

“融合蛋白”为在以下情况下产生多肽：未发现自然融合在一起的编码两种(或更多种)不同多肽的两个异源核苷酸序列或其片段以正确的翻译可读框被融合在一起。

“重组”核酸、多核苷酸或核苷酸序列为通过基因工程技术产生的核酸、多核苷酸或核苷酸序列。

“重组”多肽产生自重组核酸、多肽或核苷酸序列。

本文使用的“分离的”多核苷酸(例如“分离的核酸”或“分离的核苷酸序列”)意指与天然存在的生物或病毒的至少某些其他组分至少部分分离的多核苷酸，例如通常发现与所述多核苷酸结合的细胞或病毒结构组分或者其他多肽或核酸。任选但并非必要的是，与起始材料相比，所述“分离的”多核苷酸以更大的浓度存在(例如为富集的)(例如至少约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更大浓度)。在代表性实施方案中，所述分离的多核苷酸为至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%纯化的或更纯。

“分离的”多肽意指与天然存在的生物或病毒的至少某些其他组分至少部分分离的多肽，例如通常发现与所述多肽结合的细胞或病毒结构组分或者其他多肽或核酸。任选但并非必要的是，与起始材料相比，所述“分离的”多肽以更大的浓度存在(例如为富集的)(例如至少约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更大浓度)。在代表性实施方案中，所述分离的多肽为至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%纯化的或更纯。

此外，“分离的”细胞为通常与其天然结合的其他组分部分地或完全地分离的细胞。例如，分离的细胞可以是培养基中的细胞和/或药学上可接受的载体中的细胞。

术语“免疫原”和“抗原”在本文中可交换使用，且意指细胞和/或体液免疫反应可涉及的任何化合物(包括多肽)。在具体的实施方案中，免疫原或抗原可诱导针对登革病毒感染影响的保护性免疫反应。

本文使用的“有效量”是指足以产生所需效果的本发明的载体、核酸、表位、多肽、细胞、颗粒、vlp、组合物或制剂的量，所述效果可以是治疗效果和/或有益效果。所述有效量将随着受试者的年龄、总体状况、待治疗病况的严重性、给予的具体药物、治疗的持续时间、任何共存治疗的性质、使用的药学上可接受的载体以及在本领域技术人员的知识和专业知识内的类似因素而不同。适当时，本领域普通技术人员可通过参考相关文本及文献和/或通过使用例行试验来确定任何个案中的“有效量”。

除非另外指明，否则本文使用的术语“致免疫量”或“有效免疫剂量”意指足以在治疗的受试者中诱导比未免疫受试者的固有免疫更强的免疫反应(其可任选为保护性反应)的量或剂量。任何具体情况下的致免疫量或有效免疫剂量，通常可使用本领域已知的方法确定。

术语“疫苗”、“疫苗接种”和“免疫接种”在本领域中为充分理解的，且在本文中可交换使用。例如，术语疫苗、疫苗接种或免疫接种可理解为增加受试者对免疫原的免疫反应(例如通过提供主动免疫反应)并从而增强其抵抗、战胜感染和/或从感染恢复的能力(即保护性免疫反应)的过程或组合物。

对于术语“治疗”("treat"、"treating"或"treatmentof")(及其语法变化)，其意指受试者病况的严重性得到减轻、至少部分改进或改善和/或实现在至少一项临床症状上的某种缓解、减轻或减少和/或延缓疾病或病症的进展。在代表性实施方案中，术语“治疗”(及其语法变化)是指在存在或不存在其他临床疾病体征的情况下，病毒血症严重性的减轻和/或病毒血症进展的延缓。

本文使用的“治疗有效的”量为足以治疗(如本文所定义的)所述受试者的量。本领域技术人员将理解的是，所述治疗效果无需是完全的或治愈的，只要给所述受试者提供某些益处便可。

术语“防止”、“预防”或“……的预防”(及其语法变化)是指在受试者中预防和/或延迟疾病、病症和/或临床症状的发生和/或进展，和/或相对于未使用本发明的方法所发生的情况，减轻所述疾病、病症和/或临床症状的发生和/或进展的严重性。在代表性实施方案中，术语“防止”、“预防”或“……的预防”(及其语法变化)是指在存在或不存在其他临床疾病体征的情况下，在受试者中预防和/或延迟病毒血症的发生和/或进展。所述预防可以是完全的，例如完全不存在所述疾病、病症和/或临床症状。所述预防亦可以是部分的，例如与未使用本发明所发生的情况相比，所述疾病、病症和/或临床症状在所述受试者中更少发生和/或发生的严重性和/或进展更小。

本文使用的“预防有效的”量为足以在所述受试者中预防(如本文所定义的)所述疾病、病症和/或临床症状的量。本领域技术人员将理解的是，预防的水平无需为完全的，只要向所述受试者提供某些益处便可。

通过本发明的方法治疗和/或预防登革病毒感染的功效，可通过检测临床改善来确定，如通过在所述受试者的症状和/或临床参数(例如病毒血症)上的改变来指示的临床改善，如本领域技术人员众所周知。

除非另外指明，否则术语“保护”、“保护的”、“防护”和“保护性的”(及其语法变化)包括在受试者中预防和治疗登革病毒感染的方法二者，而不论其针对登革病毒的一种或多种毒株、基因型或血清型。

本文使用的术语“保护性”免疫反应或“保护性”免疫是指给所述受试者提供某些益处的免疫反应，所述益处在于其预防或减少疾病的发生率和/或严重性和/或持续时间或感染的任何其他表现。例如，在代表性实施方案中，保护性免疫反应或保护性免疫导致减少的病毒血症，而不论是否伴随临床疾病。或者，保护性免疫反应或保护性免疫可用于存在疾病的治疗性治疗。

“主动免疫反应”或“主动免疫”特征在于“在遇到免疫原之后宿主组织和细胞的参与。其包括淋巴网状内皮细胞组织中免疫活性细胞的分化和增殖，其导致抗体合成或细胞介导的反应性的发展，或二者。”herbertb.herscowitz，免疫生理学：抗体形成中的细胞功能和细胞相互作用(immunophysiology:cellfunctionandcellularinteractionsinantibodyformation)，immunology:basicprocesses117(josepha.bellanti编辑，1985)。或者规定的是，主动免疫反应是在经由感染或经由疫苗接种暴露给免疫原之后由宿主引发。可将主动免疫与被动免疫进行对比，所述被动免疫通过“将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)从主动免疫的宿主中转移给未免疫宿主”来获得。同上。

本发明的“受试者”包括易受登革病毒感染的任何动物。所述受试者一般为哺乳动物受试者(例如实验动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、灵长类等)、驯养或商品动物(例如奶牛、马、山羊、驴、绵羊等)或者家畜(例如猫、狗、雪貂等)。在具体实施方案中，所述受试者为灵长类受试者、非人灵长类受试者(例如黑猩猩、狒狒、猴、大猩猩等)或者人。本发明的受试者可以是已知或认为其处于登革病毒感染的风险中的受试者。或者，根据本发明的受试者亦可包括未预先知晓或未疑似受登革病毒感染或者并非需要针对登革病毒感染的治疗的受试者。

可对受试者进行处理以用于任何目的，例如用于引发保护性免疫反应或者用于在所述受试者中引发抗体的产生，可将所述抗体收集并用于诸如研究或诊断目的等其他目的，或者用于给予其他受试者以产生其中的被动免疫等。

受试者包括任何年龄的雄性和/或雌性，包括新生儿、幼年、成年和老年受试者。对于人受试者，在代表性实施方案中，所述受试者可以是婴儿(例如小于约12个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月或更小)、幼童(例如至少约12、18或24个月和/或小于约36、30或24个月)或儿童(例如至少约1、2、3、4或5岁和/或小于约14、12、10、8、7、6、5或4岁)。在本发明的实施方案中，所述受试者为从约0至3、4、5、6、9、12、15、18、24、30、36、48或60月龄、从约3至6、9、12、15、18、24、30、36、48或60月龄、从约6至9、12、15、18、24、30、36、48或60月龄、从约9至12、15、18、24、30、36、48或60月龄、从约12至18、24、36、48或60月龄、从约18至24、30、36、48或60月龄或者从约24至30、36、48或60月龄的受试人。

在本发明的实施方案中，所述受试者具有针对登革病毒的母体抗体。

“需要本发明的方法的受试者”可以是已知或疑似受登革病毒感染或者处于受登革病毒感染的风险中的受试者。

亦提供包含本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或组合物及药学上可接受的载体的药物制剂(例如免疫原性制剂)，并且可根据已知技术进行配制，用于在药物载体中给予。参见例如remington，药学科学及实践(remington、thescienceandpracticeofpharmacy)(最新版)。在制备根据本发明的实施方案的药物组合物中，除其他物质之外，通常将本发明的组合物与药学上可接受的载体混合。对于“药学上可接受的载体”，意指与所述药物组合物中的其他成分相容且对所述受试者无害或无毒的载体。所述载体可以是固体或液体，或二者，且优选与本发明的组合物一起配制成单位剂量制剂，例如片剂，其可占所述组合物重量的约0.01或0.5%-约95%或99%。所述药物组合物通过任何众所周知的药学技术制备，包括但不限于混合所述组分，任选包含一种或多种配合剂。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体为无菌的，且根据用于包含所述载体的药物组合物的管理指导方针，其被视为适于给予受试人。

此外，根据本发明的组合物的“药学上可接受的”组分，例如盐、载体、赋形剂或稀释剂，为这样的组分，其(i)与所述组合物的其他成分相容，因为其可与本发明的组合物组合，而不会致使所述组合物不适于其预期目的，和(ii)适于本文所提供的受试者使用而没有过度的不利副作用(例如毒性、刺激性和变应性反应)。当其风险超过所述组合物提供的益处时，副作用为“过度的”。药学上可接受的组分的非限制性实例包括任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水、诸如油/水乳剂等乳剂、微乳剂和各种类型的湿润剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物可进一步包含一种或多于一种佐剂。本发明的佐剂可以是氨基酸序列的形式，和/或编码佐剂的核酸序列的形式。当为核酸形式时，所述佐剂可以是编码本发明的多肽或片段或表位的核酸的组分和/或包含编码本发明的多肽或片段或表位的组合物的单独组分。根据本发明，所述佐剂亦可以是作为佐剂起作用的肽、蛋白质片段或完整蛋白质的氨基酸序列，和/或所述佐剂可以是编码作为佐剂起作用的肽、蛋白质片段或完整蛋白质的核酸。本文使用的“佐剂”描述了这样的物质，其可以是能够与本发明的组合物组合以在受试者中增强、改进或以其他方式调节免疫反应的任何免疫调节物质。

在另外的实施方案中，所述佐剂可以是但不限于免疫调节细胞因子(包括但不限于gm/csf、白介素-2、白介素-12、干扰素-γ、白介素-4、肿瘤坏死因子-α、白介素-1、血细胞生成因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子)、由含5%(重量/体积)角鲨烯(dasf，parsippany，n.j.)、2.5%普郎尼克l121聚合物(aldrichchemical，milwaukee)和0.2%聚山梨酯(吐温80，sigma)的磷酸缓冲盐水组成的syntex佐剂制剂1(saf-1)。合适的佐剂亦可包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)、磷酸铝或algannmulin，但亦可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生多糖或聚膦腈的不溶性混悬剂。

其他佐剂为本领域众所周知的，且包括但不限于mf59、lt-k63、lt-r72(pal等，vaccine24(6):766-75(2005))、qs-21、弗氏佐剂(完全和不完全)、氢氧化铝、n-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-去甲胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(cgp11637，称为nor-mdp)、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺基-l-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基膦酰氧基)-乙胺(cgp19835a，称为mtp-pe)和ribi，其在2%角鲨烯/吐温80乳剂中含有从细菌中提取的三个组分，单磷酰脂质a、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(mpl+tdm+cws)。

另外的佐剂可包括例如单磷酰脂质a(优选3-脱氧-酰化单磷酰脂质a，3d-mpl)连同铝盐的组合。强化的佐剂系统包括单磷酰脂质a和皂苷衍生物的组合，特别是如在pct公布号wo94/00153中所公开的qs21和3d-mpl的组合，或者如在pct公布号wo96/33739中所公开的其中使用胆固醇淬灭qs21的更不致反应的组合物。在水包油乳剂中包含qs213d-mpl&生育酚的特别有效的佐剂制剂，描述于pct公布号wo95/17210。此外，本发明的核酸组合物可通过包含编码所述抗原的核苷酸序列和提供佐剂功能的核苷酸序列(例如cpg序列)来包含佐剂。所述cpg序列或基序，为本领域众所周知的。

用于与本发明一起使用的佐剂，例如免疫调节细胞因子，可在给予受试者本发明的组合物之前给予、同时给予和/或在给予本发明的组合物之前和/或之后的数小时内、几小时内、和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天内给予。

此外，诸如免疫调节细胞因子等佐剂的任何组合，可在给予本发明的免疫原性组合物之前、之后和/或与之同时共同给予所述受试者。例如，免疫调节细胞因子的组合可由两种或更多种免疫调节细胞因子组成，例如gm/csf、白介素-2、白介素-12、干扰素-γ、白介素-4、肿瘤坏死因子-α、白介素-1、血细胞生成因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子。佐剂或佐剂组合的效果，可使用如本文所述及本领域所已知的标准程序，在存在和不存在所述佐剂或佐剂组合的情况下，通过测定响应给予受试者本发明的组合物而产生的免疫反应来确定。

在本发明的实施方案中，所述佐剂包括如描述于例如美国专利号7,862,829的甲病毒属佐剂。

可在数天、数周、数月或数年的时程内进一步给予加强剂量。在慢性感染中，起始高剂量接着加强剂量可以是有利的。

本发明的药物制剂可任选包含其他医学试剂、药学试剂、稳定剂、缓冲剂、载体、稀释剂、盐、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

对于注射，所述载体通常将是液体。对于其他给予方法，所述载体可以是固体或液体。对于吸入给予，所述载体将是可呼吸的，且通常呈固体或液体微粒形式。

根据已知技术，可对本发明的组合物进行配制以在药物载体中给予。参见例如remington，药学科学和实践(remington、thescienceandpracticeofpharmacy)(第9版，1995)。在制备根据本发明的药物组合物中，通常将所述vlp与除其他之外的可接受的载体混合。所述载体可以是固体或液体、或二者，且任选与所述化合物一起配制成单位剂量制剂，例如片剂。可使用各种药学上可接受的水性载体，例如水、缓冲的水、0.9%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸、无热原水、无热原磷酸缓冲盐水溶液、抑菌水或cremophorel[r](basf，parsippany、n.j.)等。这些组合物可通过常规技术灭菌。本发明的制剂可通过任何众所周知的药学技术制备。

所述药物制剂可进行包装以直接使用，或者进行冻干，所述冻干制剂通常在给予之前与无菌水溶液组合。可将所述组合物进一步包装到单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶。

根据常规药学技术，可对所述药物制剂进行配制以用于通过本领域已知的任何方法给予。例如，可对所述组合物进行配制以鼻内给予、经吸入(例如口腔吸入)给予、经口给予、经颊(例如舌下)给予、直肠给予、阴道给予、局部给予、鞘内给予、眼内给予、透皮给予、经胃肠外给予(例如肌内[例如骨骼肌]、静脉内、皮下、真皮内、胸膜内、脑内和动脉内、鞘内给予)或局部给予(例如给予皮肤和黏膜表面二者，包括气道表面)。

对于鼻内或吸入给予，可将所述药物制剂配制成气雾剂(该术语包括液体和干粉气雾剂二者)。例如，所述药物制剂可连同表面活性剂和推进剂以细碎形式提供。所述组合物的常见百分比为0.01-20%重量，优选1-10%。所述表面活性剂一般为无毒的且溶于所述推进剂。代表所述物质的有含6-22个碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯。可使用混合酯，例如混合或天然的甘油酯。所述表面活性剂可组成所述化合物重量的0.1-20%，优选0.25-5%。所述组合物的剩余物质一般为推进剂。需要时，载体亦可包含在内，如使用卵磷脂用于鼻内递送。液体颗粒的气雾剂可通过任何合适的方式产生，例如使用压力驱动的气雾剂雾化器或者超声雾化器，如本领域技术人员所已知的。参见例如美国专利号4,501,729。固体颗粒的气雾剂同样可通过制药领域已知的技术，使用任何固体微粒药剂气雾发生器来产生。鼻内给予亦可通过滴加给予鼻面进行。

注射用制剂可以常规形式制备，任选作为液体溶液或混悬剂、适于在注射之前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者作为乳剂。或者，可以局部方式而不是全身方式给予所述药物制剂，例如以长效或持续释放制剂的方式。

即用的注射溶液和混悬剂可制备自前文所述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂。例如，可提供在密封容器中的单位剂型的本发明的注射用稳定无菌制剂。所述制剂可以冻干物的形式提供，其可使用合适的药学上可接受的载体复溶以形成适于注射到受试者中的液体组合物。所述单位剂型可以是约1μg-约10克的所述制剂。当所述制剂基本上不溶于水时，可将足以在水性载体中乳化所述制剂的量的足量的乳化剂包含在内，所述乳化剂为药学上可接受的。磷脂酰胆碱为一种所述有用的乳化剂。

适于口服给予的药物制剂可以独立单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂，作为粉剂或颗粒剂；作为水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或者作为水包油或油包水乳剂。口服递送可通过将本发明的化合物与能够承受动物肠道中的消化酶降解的载体复合来进行。所述载体的实例包括塑料胶囊或片剂，如本领域所已知的。所述制剂通过任何合适的药学方法制备，其包括使所述蛋白质与合适载体(其可含有如上所述的一种或多种配合剂)开始结合的步骤。一般而言，通过将所述化合物与液体或细碎的固体载体或二者均匀且充分地混合，并随后在需要时对所得混合物塑型来制备所述药物制剂。例如，任选使用一种或多种配合剂，通过压制粉剂或颗粒剂并塑型来制备片剂。压制片剂通过在合适机器中压制呈自由流动形式的制剂来制备，例如粉剂或颗粒剂，任选与粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合。模制片剂通过在合适机器中对使用惰性液体粘合剂湿润的粉状蛋白质塑型来制备。

适于经颊(舌下)给予的药物制剂包括将所述化合物包含在矫味基底(通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的锭剂；和诸如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶等惰性基底中的软锭剂。

适于胃肠外给予的药物制剂可包括无菌水性和非水性注射液，所述制剂优选与预期受者的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其致使所述组合物与预期受者的血液等渗。水性和非水性无菌混悬剂、溶液剂和乳剂可含有助悬剂和增稠剂。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油等植物油以及诸如油酸乙酯等注射用有机酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液或不挥发油。静脉内溶媒包括流体和营养补充物、电解质补充物(例如基于林格右旋糖的电解质补充物)等。亦可存在防腐剂及其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

适于直肠给予的药物制剂任选作为单位剂量栓剂存在。这些制剂可通过将所述活性药物与一种或多种常见固体载体(例如可可脂)混合并随后对所得混合物塑型来制备。

适于局部施用给皮肤的药物制剂优选采用软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可使用的载体包括但不限于石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如局部递送可通过将本发明的药物制剂与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如dmso)混合来进行。

适于透皮给予的药物制剂可以是适于与所述受试者的表皮长时间保持紧密接触的独立贴片(patch)的形式。适于透皮给予的制剂亦可通过离子电渗疗法递送(参见例如pharmaceuticalresearch3:318(1986))并通常采用所述化合物的缓冲水溶液的形式。合适的制剂可包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液(ph6)或者乙醇/水，并且可含有0.1-0.2m有效成分。

在本发明的实施方案中，本发明的病毒颗粒的剂量可以是约10³-约10⁸空斑形成单位/空斑形成单位(pfu/ffu)的范围。在本发明的实施方案中，本发明的vlp的剂量可以是约500微克-约500毫克的范围。在本发明的实施方案中，本发明的蛋白质的剂量可以是约10⁰-约10⁴微生物+/-佐剂的范围。

此外，所述组合物可配制成脂质体制剂。使用的脂质层可以是任何常见组合物的脂质层，且可任选含胆固醇或者可不含胆固醇。例如通过使用标准超声处理和匀浆技术，可在大小上减小产生的脂质体。

可将所述脂质体制剂冻干以产生冻干剂，其可使用药学上可接受的载体(例如水)复溶，以重新产生脂质体混悬液。

本发明的免疫原性制剂可任选为无菌的，且可进一步在密闭的病原体不可渗透的容器中提供。

实施例

实施例1.复合四价血清型特异性中和抗体表位在登革热3和4之间的移植揭示多克隆中和反应的决定子。

登革病毒(denv)为全世界范围内最显著的人类虫媒病毒疾病，每年有超过3亿例感染；然而对denv感染的人类免疫反应的决定子很大程度上仍为未知的。因此，我们着手开发用以表征对于人类的denv感染的抗体(ab)反应的工具。使用反求遗传学，我们开发了用于4种denv血清型的感染克隆(ic)，其允许我们研究ab-病毒相互作用。一组单克隆ab(mab)的表征鉴定了denv3的强效的型特异性中和ab。使用结构导向法，鉴定了包含导致逃脱中和反应的突变的包膜(e)蛋白结构域i/ii(edi/ii)铰链区的12å区，并将其从denv4移植到denv3中(rdenv3/4)以评价该表位对人类的多克隆免疫反应的作用。有趣的是，该rdenv3/4获得对通过人denv4免疫血清中和的完全敏感性，但变得耐受denv3血清，表明该edi/ii铰链区含有型特异性中和反应的主要决定子。对denv4进行所述互换移植时，未保留mab结合且在中和特性上没有明显变化，表明受者denv血清型中的邻接残基在所述病毒体表面的表位展示中起作用。尽管向denv4中添加来自denv3的5个氨基酸残基能够恢复mab结合和中和，但是多克隆血清中和在很大程度上仍未改变。最后，我们将包含跨越多个e二聚体的复合四价表位移入denv4中(rdenv4/3)。该denv4/3为有活性的且生长至高感染滴度，以及表现出对denv3免疫血清的敏感性，而对denv4的中和反应在很大程度上仍未改变。这些结果提供对型特异性中和反应的决定子的理解，其可引导进一步开发合理设计的denv疫苗平台。

实施例2.获得登革热3和登革热4二者的型特异性中和决定子的重组登革病毒4的开发和表征

用于重组denv4生成的反求遗传学平台的开发

我们先前已阐述了用于产生重组denv3(rdenv3)的反求遗传学系统的生成和表征(图1，图a)。利用类似的技术，我们开发了用于1989年在斯里兰卡分离且属于基因组i的denv4的临床隔离群的cdna感染性克隆(ic)系统。为了防止在大肠杆菌(ecoli)中的细菌质粒扩增期间产生不稳定性和毒性，将所述denv基因组亚克隆成4个不同的片段(图1，图a)。利用位于所述denv4基因组中的核苷酸(nt)位置3216(pflmi；识别序列：ccaaacagtgg，seqidno:7)、5482(draiii；caccaggtg)和8855(pflmi；ccagattttgg，seqidno:8)上的天然存在的ii类限制酶位点来裂解所述基因组cdna。此外，使用所述细菌载体中在t7启动子序列上游的ecorv位点来生成所述基因组的5’端，同时将所述载体中的bsmbi位点用于3’基因组末端(图1，图a)。在细菌扩增含基因组cdna片段的质粒之后，使用适当的限制酶消化质粒，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用t4dna连接酶连接，并使用含5’帽类似物的t7rna聚合酶转录。然后使体外转录的rna电穿孔进入vero-81或bhk-21细胞中。将细胞培养4-6天，在所述时间收集上清液，通过离心使其澄清，并传代到c6/36(白纹伊蚊(aedesalbopictus))细胞上达另外4天。再次收集上清液且使其澄清，并进行滴定以用作工作病毒贮液。rdenv4显示与亲代天然隔离群相同的表型特性(生长动力学、峰值感染滴度和感染斑形态/大小)。

将型特异性中和denv3mab表位移植到denv4中

先前研究已鉴定了对denv3特异的强效的型特异性人单克隆抗体(hmab)(5j7)。然而，这些研究仅鉴定了来自该hmab的导致逃脱denv3中和的单点突变。为了进一步表征该hmab表位，我们试图使用我们的新反求遗传学平台，将包含该表位的氨基酸(aa)残基从denv3移植到denv4中。使用已公布和未公布的逃逸突变二者作为向导，将包含所述包膜蛋白结构域i/ii(edi/ii)铰链区的约12埃圆周在所述denv3e蛋白晶体结构上重叠成接近抗体表位:互补位结合区的覆盖面积。在denv3和denv4之间进行aa和nt比对之后，鉴定出血清型内变体aa并选择将其从denv3移植到denv4中。对所述denv4ic中的nt序列进行修饰以促使aa变化匹配denv3，并合成获得这些变化的次基因组cdna(biobasic；amherst，ny)。如上所述生成rdenv，并回收病毒用于表型表征。为了使成功移植表位的概率达到最大，生成以下3种不同的rdenv，其各自含有序贯添加的denv3残基并因此移植更大的理论表位覆盖面积。这些rdenv命名为denv4m12、denv4m14和denv4m16，分别具有渐增大小的移植的denv3序列(图1，图b-c)。值得注意的是，denv3移植到denv4m16中，包含5j7的假定复合四价表位，且据我们所知代表首次将该性质的表位在不同病毒之间移植。

rdenv4/3为有活性的且在体外表现出不同的适合度特征

在电穿孔并随后在c6/36细胞上传代之后，成功回收了全部3种rdenv4/3病毒(denv4m12、m14和m16)。发现来自c6/36细胞的峰值感染滴度(且通过对vero-81细胞的空斑形成试验来测定)与亲代wtdenv3和denv4ic的峰值感染滴度相当(图2，图a)。denv4m12和m14显示与wtdenv3类似的峰值滴度，其均比该系统中wtdenv4的峰值滴度低约1log10。然而，denv4m16显示更大衰减的生长表型，峰值滴度达到约2x10⁶ffu/ml，其约为wtdenv3的1/50以及wtdenv4的1/300(图2，图a)。相应地，rdenv中的感染斑大小亦小于其wt亲代。denv4m12和m14空斑小于wt，但仍显著大于denv4m16，其在vero-81细胞上形成非常小的针尖空斑(图2，图b)。

亦在c6/36蚊细胞上进行类似的适合度分析。对denvm12、m14、m16以及亲代wtdenv3和denv4进行多步生长曲线法(moi=0.01)(图3，图a)。一般而言，在早期时间点(<接种后96小时(hrpost-inoculation,hpi))未见显著的适合度缺陷，然而在96和120hpi，denv4m14落后于wt，然后在144hpi剧增。此外，denv4m16在120hpi显示减小的生长动力学，以及随后具有比其他毒株低约2log10的感染滴度。在各种情况下，细胞健康可在此衰减中起作用，并因此需要进一步研究。然而，这些数据的确指出，至少在感染的早期时间点，与wtdenv相比，所述rdenv未在节肢动物细胞中表现出显著的生长衰减。有趣的是，与vero细胞相比，denv4m12、m14和m16的感染斑(图3，图b)未显示与wtdenv3或4相比或相互之间的在大小或形态上的实质差异。这与生长曲线数据较好地相关，并表明rdenv衰减的决定子一般可能是对vero-81和/或哺乳动物细胞特异的细胞类型。这些数据指出，含有移植的denv3区的rdenv4病毒有活性且表现出适于进一步表征的生长特征。

rdenv4/3显示对hmab5j7的不同程度的反应性

进行试验以确定所述3种rdenv中针对hmab5j7的表位从denv3移植到denv4中的水平。进行elisa以评价所述denv3特异性hmab5j7与wt和rdenv病毒二者的结合。这些结果显示5j7结合wtdenv3，但不结合denv4，其与先前数据一致。有趣的是，5j7完全不能结合denv4m12，而denv4m14和m16二者均显示足以利于以接近或超过wtdenv3的水平结合5j7的denv3表位(图4，图a)。这些数据指出，不超过4种aa(在denv4m12和m14之间移植aa上的差别)负责提供5j7与denv4m14的结合。作为对这些结合研究的推论，使用5j7进行病毒中和试验，以评价对rdenv4组的中和的敏感性。与elisa结合数据相一致，denv4m12未能用5j7中和，而denv4m14和m16二者均在与wtdenv3相当的ab浓度下被5j7中和(图4b和c)。值得注意的是，这些结果在认为是获得对高度不同的(成熟对比不成熟)病毒颗粒的中和敏感性的2种不同细胞系(vero-81和表达dc-sign的u937)中为一致的(对于denv4m14)，表明这些rdenv的颗粒成熟状态可能不影响5j7中和。

rdenv4/3具有对多克隆血清中和的二价敏感性

为了评价对我们的rdenv4/3组对多克隆抗体中和的敏感性，将收集自初次denv感染之后的恢复期患者的供者血清用于空斑减少试验(vero-81)和基于流式细胞术的试验(u937-dc-sign)。正如elisa结合和5j7hmab中和试验一样，denv4m12在vero细胞中未显示对通过denv3特异性血清进行中和的增加的敏感性(图5，图d)。然而，denv4m14在vero细胞中显示几乎与wtdenv3相同且显著高于wtdenv4的中和表型(图5，图a-c)，表明该rdenv4/3病毒已获得对通过人的自然denv3感染产生的多克隆抗体反应进行中和的敏感性。此外，该表型在u937-dc-sign细胞中得到证实，并扩展至denv4m16(图5，图e-g)，其中通过denv3抗血清的两种rdenv多克隆中和均与wtdenv3相当，而wtdenv4即便在最低血清稀释度(1:20)的情况下亦未被中和。因denv4m16在vero细胞上较小的空斑表型所致，在该细胞类型中的中和试验在技术上具挑战性并因此对于该rdenv的中和数据仅限于u937-dc-sign，因为基于流式细胞术的试验即便在减毒病毒上亦可容易地进行。总结这些数据，表明denv4m14和m16已获得denv3型特异性中和的多克隆决定子并在中和敏感性上表现出二价。

除获得对我们的rdenv对denv3多克隆中和的敏感性之外，我们亦关注确定denv4m12、m14和m16对denv4中和敏感性的保留和/或丧失。为此，使用收集自恢复期的初次denv4患者的血清在vero(图6，图a)和u937-dc-sign(图6，图b-d)中进行中和试验。当denv4m12在vero细胞中显示略低于wtdenv4的中和滴度时(图6，图a)，denv4m14和m16在两种细胞类型中均具有与wtdenv4相等或超过其的中和滴度(图6，图a-d)。该重大发现表明，用于denv3和denv4的型特异性中和的决定子为所述e糖蛋白上不起眼(discreet)的成分，且二者的决定子aa序列可进行组合而不会彼此改变。因此，denv4m14和m16具有用作用于疫苗诊断或引导开发新型和/或改良的候选疫苗二者的重要试剂的潜力。

rdenv4/3多克隆中和敏感性为特异的

为排除用所述方式改良的该组rdenv4/3病毒以非特异性方式增加其对中和的敏感性的可能性，使用收集自恢复期的人类患者的初次denv1和denv2血清进行中和试验。初次denv1血清在vero细胞中完全不能中和denv4m12或m14，与高水平中和的wtdenv1形成直观对比(图7，图a-b)。此外，denv2血清亦不能中和denv4m14，尽管一个试样的确以远低于wtdenv2的水平中和denv4m12(图7，图c-d)。总结这些结果，表明在denv4背景下获得的denv3中和敏感性对于denv3而言为特异的，且并非为使所述rdenv组对异型血清中和更敏感的总体结构变化所致。

实施例3.获得登革热1和登革热2的型特异性中和决定子的重组登革病毒2的开发和表征

用于重组denv1和denv2生成的反求遗传学平台的开发

我们先前已阐述了用于产生重组denv3(rdenv3)的反求遗传学系统的生成和表征(图1，图a)。利用类似的技术，我们开发了用于denv1西太平洋1974(westpac74)连同2007年在尼加拉瓜分离自流行病的denv2的临床隔离群(v1210)的cdna感染性克隆(ic)系统。为了防止在大肠杆菌中的细菌质粒扩增期间产生不稳定性和毒性，将两个基因组亚克隆成4个不同片段(图8，图a)。利用位于所述denv1基因组中的核苷酸(nt)位置2052(pflmi；识别序列：ccaccttttgg，seqidno:9)、4215(pflmi；ccactagctgg，seqidno:10)和8563(pflmi；ccaaaccatgg，seqidno:11)的天然存在的ii类限制酶位点来裂解所述基因组cdna。此外，使用所述细菌载体中在t7启动子序列上游的ecorv位点来生成所述基因组的5’端，同时将所述载体中的sapi位点用于3’基因组末端(图8，图a)。对于denv2，在位置2340(片段a和载体之间的draiii；识别序列：cactgtgtg)产生第一次基因组裂解。为了保持基因组序列，将draiii位点(cacnnngtg)用于a片段的3’端，同时将alwni(cagnnnctg)位点用于b片段的5’端。通过使所述识别位点的载体区中的内切核酸酶识别序列(且并非所述denv基因组序列)产生突变，这两种限制酶消化物的连接产物保持天然denv基因组序列而未向所述denv基因组中引入突变，以利于消化。将nt4662(draiii；cacgtggtg)和7414(draiii；cacactgtg)上另外的基因组连接处用于裂解所述基因组cdna。此外，使用所述细菌载体中在t7启动子序列上游的spei位点来生成所述基因组的5’端，同时将所述载体中的ecii位点用于3’基因组末端(图8，图a)。在细菌扩增含基因组cdna片段的质粒之后，使用适当的限制酶消化质粒，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用t4dna连接酶连接，并使用含5’帽类似物的t7rna聚合酶转录。然后将体外转录的rna电穿孔进入vero-81或bhk-21细胞中。将细胞培养4-6天，在所述时间收集上清液，通过离心使其澄清，并传代到c6/36(白纹伊蚊)细胞上达另外4天。再次收集上清液且使其澄清，并进行滴定以用作工作病毒贮液。rdenv1和rdenv2显示与亲代天然隔离群相同的表型特性(生长动力学、峰值感染滴度和感染斑形态/大小)(未显示数据)。

将强效的中和性denv1mab表位移植到denv2ic中

先前研究已鉴定了对denv1特异的强效的型特异性人单克隆抗体(hmab)(1f4)。利用与denv1结合的该mab的晶体结构，以及鉴定的接触氨基酸(aa)残基，我们试图使用我们的新反求遗传学平台，将包含该表位的aa残基从denv1移植到denv2中。在denv1和denv2之间进行aa和nt比对之后，鉴定了血清型内变体aa并选择将其从denv1移植到denv2中。对所述denv2ic中的nt序列进行修饰以促使aa变化匹配denv1(图8，图b-c)，并合成获得这些变化的次基因组cdna(biobasic；amherst，ny)。如上所述生成rdenv，并回收病毒用于表型表征。将该rdenv命名为denv2-1f4e(图8，图b-c)。

rdenv2/1病毒为有活性的且在体外表现出不同的适合度特征

在电穿孔并随后在c6/36细胞上传代之后，成功回收了rdenv2/1。对来自c6/36细胞的峰值感染滴度进行测定并发现其与亲代wtdenv1和denv2ic在c6/36细胞上的峰值感染滴度相当(图9，图a)，但是在vero细胞上高度衰减(约3log10)(图9，图a)。使用多步生长曲线(moi=0.01)在c6/36蚊细胞上进行适合度分析(图9，图c)。一般而言，在早期时间点(<接种后96小时(hpi))未见显著的适合度缺陷。denv2-1f4e在96hpi显示滴度下降，但这只是独立的落后，因为在120hpi及之后，滴度与wtdenv1和2相当(图9，图c)。细胞健康可在此独立的衰减时间点起作用，并因此需要进一步研究。然而，这些数据的确指出，与wtdenv1和2相比，denv2-1f4e未在节肢动物细胞中表现出显著的生长衰减。与生长动力学数据相对应的是，与wtdenv1或2相比，denv2-1f4e(图9d)的确但图未显示在感染斑的大小或形态上的实质差异。这些数据指出，含有移植的denv1的区的rdenv2-1f4e为有活性的且表现出适于进一步表征的生长特征。

hmab1f4结合rdenv2/1

进行测定以确定所述denv2-1f4e中从denv1移植到denv2中的用于hmab1f4的表位的水平。进行elisa以评价所述denv1特异性hmab1f4与wt和rdenv病毒二者的结合。这些结果显示1f4结合wtdenv1，但不结合denv2，其与先前数据一致。有趣的是，1f4以与wtdenv1相当的水平结合denv2-1f4e(图10，图a)。这些数据指出，在与denv1结合的1f4的晶体结构中鉴定的残基，足以在denv1和2之间移植单克隆ab结合。作为对这些结合研究的推论，使用1f4和denv2-1f4e进行病毒中和试验。与elisa结合数据相一致，denv2-1f4e被与wtdenv1相当的ab浓度的1f4中和(图10，图b-c)。值得注意的是，这些结果在2种不同的细胞系(c6/36和表达dc-sign的u937)中为一致的。

rdenv2/1具有对多克隆血清中和的二价敏感性

为了评价对我们的rdenv2/1病毒对多克隆抗体中和的敏感性，将收集自初次denv1感染之后的恢复期患者的供者血清用于基于流式细胞术(u937-dc-sign)的试验。因denv2-1f4e在vero细胞上较小的空斑表型所致，在此细胞类型中的中和试验在技术上具挑战性并因此对于该rdenv的中和数据仅限于u937-dc-sign，因为基于流式细胞术的试验即便在减毒病毒上亦可容易地进行。正如elisa结合和1f4hmab中和试验一样，denv2-1f4e在u937-dc-sign细胞中显示与wtdenv1几乎相同且显著高于wtdenv2的中和表型(图11，图a-b)，表明该rdenv2/1病毒已获得对通过人的自然denv1感染产生的多克隆抗体反应进行中和的敏感性。这些数据连同hmab1f4数据，表明denv2-1f4e已获得denv1型特异性中和的多克隆决定子并在中和敏感性上表现出二价。

除获得我们的rdenv对denv1多克隆中和的敏感性之外，我们亦关注确定denv2-1f4e对denv2中和敏感性的保留和/或丧失。为此，使用收集自恢复期的初次denv2患者的血清在u937-dc-sign(图11，图c-e)中进行中和试验。值得注意的是，denv2-1f4e在所有情况下均具有与wtdenv2相等或超过其的中和滴度。该发现表明，用于denv1和denv2的型特异性中和的决定子为所述e糖蛋白上不起眼的成分，且二者的决定子aa序列可进行组合而不会彼此改变。因此，denv2-1f4e具有用作用于疫苗诊断或引导开发新型和/或改良的候选疫苗二者的重要试剂的潜力。

rdenv2/1在denv发病机制的鼠模型中为衰减的

为了评价我们的嵌合rdenv的衰减水平，我们在denv疾病的无免疫应答小鼠模型中将denv2-1f4e的致死率与其亲代wtdenv1和denv1进行比较。对缺少干扰素α/β受体和干扰素γ受体二者的c57bl/6腹膜内接种3.3x10⁶ffu(c6/36滴度)的denv1、denv2或denv2-1f4e。对小鼠称重并监测56dpi直至研究结束。如在图12中所示，尽管接种wtdenv1和denv2的小鼠显示>80%死亡率，但接受等同剂量的denv2-1f4e的小鼠并未死于感染(p=0.0076)，表明该rdenv的高度衰减。这些数据表明生成二价病毒的denv的嵌合引发了可适于疫苗开发的体内衰减水平。

实施例4.使用嵌合重组登革病毒定位血清型2中和性人抗体反应

登革病毒(denv；dv)为全世界范围内最显著的人类虫媒病毒病原体，每年预计3.9亿例感染和9600万例有症状病例。几乎半数世界人口处于疾病风险中，但仍没有获准用以治疗或预防登革热病的疫苗或治疗法。登革热感染可表现为登革热，其为以严重的骨和关节痛为特征的一种自限性发热疾病，或者更严重的形式已知为登革出血热和登革休克综合征，其强调不适当的凝血、血管渗漏，以及在最严重的情况下为通常致命的多器官衰竭。登革病毒以四种不同的血清型存在，并且一种血清型感染不会提供免受其它血清型的后续感染的保护。事实上，对单个登革病毒血清型的免疫与在受另一种血清型感染之后增加的严重疾病风险相关，其为疫苗设计的致混淆因素。传统的疫苗接种策略利用四种不同病毒的混合物来引发对各血清型的等同的免疫反应，然而迄今为止未能始终如一地实现此目标。因此，迫切需要用于辅助我们理解对登革热感染的复杂免疫反应的诊断工具，以及指导和产生新疫苗设计的新技术。本发明报道阐述了含有异种血清型的关键抗原组分的一组新型重组嵌合登革病毒，其可用于表征对多种血清型的人抗体反应，以及亦用于生成能够在单个病毒接种物的情况下引发对多种血清型的免疫反应的新型多价候选疫苗。我们相信该抗原移植策略与用于其它人类和动物病原体的多种疫苗平台相容，且重要的是，其代表在登革病毒疫苗开发中的重要突破。

rdenv4/2病毒的生成

为了鉴定denv2和denv4之间不同的氨基酸残基，将包膜蛋白结构域iii(ediii)区的氨基酸序列(第296-395位氨基酸)进行比对(图13，图a)。突显denv2和denv4之间不同的残基，总共40个，并通过进行尽可能小的核苷酸变化将来自denv4的所述残基替换成来自denv2的所述残基。所述40个不同的氨基酸跨越整个ediii，包括表面暴露残基、内部残基和所述结构域边缘上的残基，其有可能与其它单体和二聚体相互作用(图13，图b)。重组病毒的生成利用了用于产生亲代野生型病毒的四片段克隆策略。denv-4a质粒盒含有包膜糖蛋白，用灰色突显ediii(图13，图c)。与重组denv-4a一起使用denv-4b、c和d质粒盒，可生成dv4-ediii-dv2病毒。向所述重组病毒中引入40个氨基酸变化，所述氨基酸中的14个引入电荷变化(表1)。六个残基增加负电荷，八个残基引入更多的正电荷。

重组病毒具有与亲代denv4类似的成熟特性

对病毒进行免疫印迹法以测定病毒上存在的e和prm蛋白的比率(图14)。denv2显示与e相比高水平的prm，表明其为高度未成熟病毒，这是因为不完全弗林蛋白酶加工或prm分解所致。denv4和dv4-ediii-dv2二者均不可检出prm，表明这些病毒为高度成熟的。然而，因在denv2和所述2种denv4主链病毒之间测得的在e蛋白的量上的显著差异，我们不能排除在这些病毒体的表面上存在某些prm。

重组病毒在vero细胞中衰减，但在蚊细胞中不衰减

根据使用多步生长曲线的检验，与denv2和denv4亲代病毒相比，dv4-ediii-dv2在vero细胞中具有2log10生长衰减(图15，图a)。dv4-ediii-dv2在vero细胞中形成感染斑，形态介于两种亲代病毒之间(图1，图5b)。尽管在vero细胞中感染另外的1-2天，但dv4-ediii-dv2空斑仍未达到亲代病毒空斑的大小。

尽管在vero细胞中存在生长衰减，但dv4-ediii-dv2在c6/36细胞中未显示衰减(图16，图a)。如在vero细胞中所观察到的，dv4-ediii-dv2c6/36感染斑显示介于两种亲代病毒之间的形态。在感染另外的1-2天后，这些空斑达到与两种野生型病毒相当的大小。

denv2ediii的移植，足以转移2d22结合和中和

2d22为对denv2具高度型特异性的人单克隆抗体(mab)(图17，图a)。先前通过在2d22存在下在vero细胞中进行denv2传代来产生逃逸突变。该逃逸突变在ediii中间具有一个点突变r323g(图17，图b)，表明denve的该区可能包含在所述2d22表位中。elisa结合显示dv4-ediii-dv2已获得与2d22的部分结合，其高于dv4水平但不及dv2水平(图17，图c)。与交叉反应denvmab2j20的结合(图17，图d)，显示在结合试验中存在相当水平的病毒，以及dv4-ediii-dv2形态得到保持。

使用两种细胞类型和两个试验来分析通过2d22的中和。在2d22存在下感染vero-81细胞，并计算中和50%的空斑所需的抗体的量(frnt50)。denv2需要约0.1ng/ul的2d22来中和50%的病毒，而denv4在所用抗体的最大浓度(5ng/ul)下仍未被中和(图17，图e)。移植ediii足以转移对通过2d22的中和的敏感性，如可见于约0.01ng/ulfrnt50值。使用基于u937+dc-sign流式细胞术的中和试验证实了这些结果(图17，图f)，其测定了在抗体存在下通过数量减少的感染细胞的中和。这些数据进一步表明2d22含有作为其表位的部分的ediii。

dv4-ediii-dv2获得对通过另外的denv2mab的中和的敏感性

使用另外6个denv2mab的组进一步表征dv4-ediii-dv2(表2)。这些mab中的许多不结合重组ediii(rediii)，包括我们已显示含有ediii作为其表位的部分的2d22(图17)。很可能2d22使用仅存在于整个e单体、e二聚体或完整病毒结构中的复合表位，这解释了仅不与rediii结合的原因。很可能该组中的其它mab具有相同的要求。诸如对于结合而言重要的残基等另外的信息亦包含在表格中，所述残基通过生成逃逸突变或者通过扫描丙氨酸突变来确定。

对于dvc3.7产生一个点突变v382g，其位于ediii的侧脊(图18，图a)。dv4-ediii-dv2对通过dvc3.7的中和敏感，其类似于denv2，但亲代denv4并不敏感(图18，图c)。对于dvc10.16产生一个点突变e311k，其位于ediii的a链(图18，图b)。如对于dvc3.7所见，dv4-ediii-dv2从亲代denv4获得对dvc10.16的中和，其低于denv2中和所需的水平。丙氨酸扫描突变发生显示dvc13.6结合所需的edii中的融合环的第101和108位(图18，图e)。dv4-ediii-dv2通过dvc13.6中和(图18，图f)。这些数据表明，dvc13.6denv2表位可从ediii跨越到edii的融合环区中。另两个mab中和dv4-ediii-dv2，其类似于denv2但与denv4不同(图18，图g-h)。出人意料的是，结合rediii的3f9(表2)，不论移植的结构域，均不结合或中和dv4-ediii-dv2(图18，图i)。这表明3f9的表位需要ediii，但也可能是仅存在于denv2中却不存在于dv4-ediii-dv2中的ediii之外的另外的残基。

dv4-ediii-dv2丧失对denv4ediii特异性mab的中和

dv4-e88为具有已知ediii表位和通过逃逸突变定位的特异性残基331和361的小鼠dv4型特异性mab(表2和图19，图a)。正如预期的，dv4-e88中和dv4但不中和dv2。因为denv4的ediii已替换成来自denv2的ediii，所以丧失了通过dv4-e88中和dv4-ediii-dv2。

dv4-ediii-dv2获得对denv2多克隆免疫血清的中和

为了测试存在于多克隆免疫血清中的抗体是否识别ediii，针对dv4-ediii-dv2测试了12个denv2多克隆免疫血清(图20，图a-l)。dv4-ediii-dv2获得对通过denv2血清的中和的敏感性，其与denv2相当。denv4未被最高测试浓度的任何血清中和。不论使用不同血清的中和滴度的范围(范围从约50至约3,000)，平均dv4-ediii-dv2中和滴度高于denv2(图22，图a)。

dv4-ediii-dv2保留对denv4多克隆免疫血清的中和

denv4多克隆免疫血清以类似于denv4的中和滴度中和dv4-ediii-dv2(图21，图a-f)。这些数据表明主要的denv4中和表位与denv2不同，且在将denv2ediii引入denv4中时未受干扰。如对于denv2多克隆免疫血清所见，dv4-ediii-dv2平均中和滴度与denv4的相当(图22，图b)。

dv4-ediii-dv2未获得对异型多克隆免疫血清的中和

为了测试dv4-ediii-dv2是否被异型denv1或denv3多克隆免疫血清中和，使用来自恢复期的denv1和denv3供者的血清进行相同的frnt试验。尽管在某些情况下dv4-ediii-dv2获得水平高于亲代denv4中和滴度的对中和的轻微敏感性，但其不超过denv2中和的水平，且在任何情况下基本上均低于同型中和(图23，图a-b)。

dv4-ediii-dv2似乎将主要的denv2型特异性中和表位鉴定为含ediii的四价表位。该重组病毒获得对denv2多克隆免疫血清的中和，而没有丧失对denv4血清的敏感性，表明denv4具有不同的中和表位。该病毒可用作用于denv2或denv4抗体的探针的诊断工具。具体而言，因在异源denv4背景中分离denv2ediii所致，可测定来自自然感染或经疫苗接种的个体的ediii特异性ab的相对丰度。根据denv2的ediii似乎对于感染之后的型特异性中和反应而言极其关键的发现，这很重要。该病毒含有来自denv2和denv4二者的结构域，且对通过denv2和denv4抗体二者的中和均敏感，表明该病毒可用作能够引发针对两种血清型的抗体反应的二价疫苗。此外，如果与denv1/3或denv3/1重组病毒配合使用，四价疫苗制品为可实现的，这表明在登革热疫苗领域的重大进步。

病毒构建

重组病毒使用四片段克隆策略来构建，其为用于产生野生型denv感染性克隆的相同策略。将denv-4基因组亚克隆成四个独立的dna质粒。向a片段的5’端引入t7启动子，并向各片段的5’和3’端引入独特的iis型限制位点。这些限制位点确保质粒将仅以正确的方向装配以产生denv基因组序列。

通过将denv4a片段中的核苷酸替换成编码denv2氨基酸的核苷酸，向denv4中引入来自denv2的ediii残基。合成具有来自denv2的核苷酸的新a片段并将其插入平puc-57质粒(biobasic)中。使除denv4b、c和d质粒之外的新a质粒在大肠杆菌中生长、纯化、用相应的iis型限制酶消化、使用t4dna连接酶连接以产生全长cdna登革病毒基因组。使用t7聚合酶转录cdna。使重组rna电穿孔进入bhk-21细胞中并收集含活病毒的细胞培养上清液。然后在c6/36细胞上将病毒传代两次，离心去除细胞碎片，并储存于-80℃。

细胞

使白纹伊蚊(ae.albopictus)c6/36细胞于32℃在mem(gibco)培养基中生长。于37℃将vero-81细胞维持在dmem中。于37℃将经由反转录病毒转导稳定表达dc-sign的人单核细胞淋巴瘤细胞系u937(u937+dc-sign)维持在rpmi-1640(gibco)中并补充50mmβ-巯基乙醇。对培养基补充fbs(对于vero-81和u937+dc-sign细胞为10%，对于c6/36为5%)，将其降至2%以制备感染培养基。所有培养基均额外补充100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素。u937+dc-sign额外补充0.1mm非必需氨基酸和2mm谷氨酰胺。所有细胞均在5%co2中培养。

结合elisa

使用抗e抗体捕获等量的病毒(如前述通过elisa滴定)。将第一抗体2d22和2j20稀释四倍，开始生成稀释系列。使用碱性磷酸酶缀合的第二抗体检测第一抗体与磷酸对硝基苯酯底物的结合，并使用分光光度计定量反应颜色变化。

denv免疫血清

从证实先前有自然denv感染的个体收集人denv免疫血清。从给予denv疫苗的个体收集另外的人免疫血清。在denv感染之后收集非人灵长类免疫血清。

病毒滴定和空斑减少中和试验(frnt)

在感染前一天，用5x10⁴个vero-81或1x10⁵个c6/36细胞接种24孔板。感染之前，去除生长培养基。通过以10倍连续稀释病毒贮液来进行病毒滴定，然后于37℃孵育1小时。孵育之后，于37℃向细胞中添加病毒稀释物达1小时，然后覆盖以1ml1%含甲基纤维素的optimem(gibco)，补充2%fbs、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素。于37℃孵育3-6天之后，去除覆盖物，用pbs洗涤细胞并用80%甲醇固定。使用以pbs制备的5%速溶乳粉封闭培养板，然后使用抗emab4g2和抗prmmab2h2孵育，二者均用封闭缓冲液1:500稀释。然后洗涤培养板，用hrp缀合的羊抗鼠ab(sigma)孵育，用封闭缓冲液1:2500稀释。然后洗涤培养板，使用truebluehrp底物(kpl)使空斑显影，并计数空斑。

对于frnt试验，将mab或血清稀释四倍并与约40ffu病毒混合，然后于37℃孵育1小时。孵育之后，于37℃向细胞中加入病毒和mab/血清稀释物达1小时，然后加入覆盖物并如上处理。

生长曲线

以0.01的感染复数(moi)感染vero或c6/36细胞。每24个小时收集培养上清液，并离心去除细胞碎片。将样品于-80℃冷冻直至使用。每天更换新鲜培养基。如上所述用其增值细胞类型滴定病毒。

u937+dc-sign中和试验

如在frnt试验中，用u937+dc-sign感染培养基稀释病毒并与mab的四倍稀释系列混合。于37℃将病毒和mab混合物孵育1小时。然后向96孔圆底培养板的每孔5x10⁴个u937+dc-sign细胞中加入病毒和mab混合物，并于37℃孵育2小时。孵育之后，将细胞离心并用感染培养基洗涤两次，然后用生长培养基重悬浮。感染后一天，将细胞离心以收集，用pbs洗涤并用4%多聚甲醛固定。然后将细胞透化处理并用1%标准小鼠血清封闭。使用以alexfluor488直接标记的抗e2h2的1:400稀释物将细胞染色。用guavaeasycyte流式细胞仪(millipore)测定阳性染色细胞的百分数。

免疫印迹

用pbs稀释病毒贮液，与4xlaemmli样品缓冲液(bio-rad)混合并于50℃加热10分钟。使样品在12%proteantgx凝胶(bio-rad)上跑胶，转移至pvdf膜并于4℃用含5%速溶乳粉的pbs+0.05%吐温封闭过夜。于37℃用含0.5ug/ml抗e4g2、0.5ug/ml抗prm2h12和5l20的封闭缓冲液将膜探测2小时。洗涤之后，用封闭缓冲液1:10,000稀释hrp缀合的抗鼠和抗人第二抗体，并于室温孵育1小时。将膜暴露给化学发光底物并在膜上显影。

实施例5.使用嵌合重组登革病毒定位血清型2中和性人抗体反应

受四种登革病毒(denv)血清型(denv1-4)之一的初次感染得到中和感染血清型但不中和其它血清型的抗体。我们团队先前已对从暴露给自然denv感染的人分离血清型特异性强效中和单克隆抗体(hmab)进行报道。我们已证实的是，这些hmab与仅在完整病毒颗粒上表达的复合四价结构表位结合。近来我们报道的是，有可能产生其中在血清型之间移植这些复合表位的活性重组denv。通过使用denv3/4嵌合体，我们观察到所述包膜(e)蛋白的结构域i/ii之间的铰链区含有其为中和血清型3和4的型特异性抗体的主要靶标的表位。在目前研究中，我们已使用类似的方法定位通过中和hmab和初次denv2人免疫血清识别的denv2的位点。我们的研究得到新型四价结构依赖性denv2表位的鉴定，其与先前对血清型3和4定义的edi/ii铰链区表位不同。重要的是，我们使用功能得失研究证实，denv1-4e糖蛋白中的不同位置编码独特的长效中和表位，其在血清型之间为可移植的。检验了denv2表位的位置及其作为暴露给自然感染的人中的中和抗体的靶标的相对重要性。

rdenv4/2病毒的设计和构建

将来自denv2(右)的残基移入denv4主链中，以产生重组denv4/2病毒(rdenv4/2，图24，图a)。使用用于处理所述denv基因组的反求遗传学系统(图24，图b)。上图=denv2，下图=denv4。将所述denv基因组分成四个质粒盒，其可独立突变、连接在一起并电穿孔进入细胞以产生重组病毒。所述denv4-a盒含有其中进行突变的包膜蛋白基因。将denv4残基替换成来自denv2的残基产生rdenv4/2病毒，其完全在denv4基因主链上建立。

用于通过rt-pcr的血清型鉴定和denv4主链重组病毒验证的新方法

针对血清型特异性rt-pcr设计rt-pcr引物(图25，图a)。所用引物包含靶向高度保守的3’端ns1基因的通用正义寡核苷酸和靶定高度差异的ns2a基因的血清型特异性反义引物。使病毒在c6/36细胞中生长，收集培养上清液并离心去除任何细胞碎片。使用qiagenqiamp病毒rna小量制备试剂盒分离病毒rna。使pcr运行35个循环，并在1.5%超纯琼脂糖凝胶上分析pcr产物。使对照rna(dv1/dv2/dv3/dv4)和水跑胶作为阳性和阴性对照(图25，图b)。预期产物大小：dv1=205bp，dv2=539bp，dv3=455bp，dv4=401bp。

限制性片段长度多态性区分rdenv4/2与亲代denv4

将限制性片段长度多态性(rflp)分析用于区分rdenv4/2(下图)与亲代denv4(上图)。引入denv4e基因组中以产生rdenv4/2的突变(以星号表示)破坏denv4中存在的xmni限制酶位点(图26，图a)。将pcr产物进行凝胶纯化并用xmni消化。在1.5%超纯琼脂糖凝胶上分析消化产物(图26，图b)。预期产物大小：未消化全长=1031bp，消化产物=931bp和113bp。

具有类似成熟特性的denv4和rdenv4/2病毒体

使病毒在c6/36细胞中生长，收集培养上清液并离心去除任何细胞碎片。使样品在12%sds-page凝胶上跑胶并使用抗e(4g2)和抗prm(2h12和5l20)抗体探测印迹(图27)。denv2具有大量水平的prm存在，表明不完全的弗林蛋白酶加工或prm分解。在denv4或rdenv4/2样品中未检出prm条带。

rdenv4/2相对于亲代病毒在vero细胞中具有2log生长衰减

使用denv2、denv4和rdenv4/2以moi=0.01感染vero-81细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后用vero-81细胞滴定(图28，图a)。denv在vero-81细胞中形成感染斑。denv2、denv4和rdenv4/2分别在感染后5天、4天和6天进行固定(图28，图b)。rdenv4/2显示小于两种亲代病毒的空斑。

rdenv4/2在c6/36细胞中无生长衰减且形成与亲代病毒类似的感染斑

使用denv2、denv4和rdenv4/2以moi=0.01感染c6/36细胞。每24个小时收集病毒上清液并随后用c6/36细胞滴定(图29，图a)。denv在c6/36细胞上形成感染斑。denv2、denv4和rdenv4/2分别在感染后4天、3天和5天进行固定(图29，图b)。生长另外的天数之后，rdenv4/2空斑达到与亲代病毒相当的大小。

图30.转移通过型特异性denv2人mab结合和中和rdenv4/2

在图30，图a中显示与四价表位结合的人mab2d22(强效的中和性dv2mab)的结合的概述。2d22显示对中和denv2的极大特异性。elisa试验显示2d22与rdenv4/2的部分结合的转移，其高于亲代dv4的水平但不及dv2水平(图30，图b)。交叉反应的对照抗体2j20的elisa结合，显示相当水平的病毒存在并维持病毒完整性(图20，图c)。使用2d22进行基于vero-81的空斑减少中和试验(frnt)并计算frnt50(中和50%的感染所需的抗体浓度)值(图30，图d)。使用2d22进行基于u937+dc-sign的中和试验(neut)并计算neut50值(图30，图e)。在两个试验中(图30，图d-e)，rdenv4/2均获得水平高于dv2的对2d22的中和。在任一试验中，dv4均未被最大浓度的2d22中和。

rdenv4/2获得对denv2多克隆免疫血清的中和，同时保留对denv4多克隆血清的中和

vero-81frnt试验显示，rdenv4/2获得水平与亲代denv2相当的对denv2多克隆免疫血清的中和(图31，图a)。rdenv4/2未显示丧失通过denv4多克隆免疫血清的中和(图31，图b)。rdenv4/2未显示获得高于亲代denv2或denv4中和滴度的对异型denv1(图31，图c)和denv3(图31，图d)多克隆免疫血清的中和。如所指示的对来自具有自然感染或实验疫苗接种的个体的血清进行编码。frnt50<20的样品以19的血清稀释因子作图。

在本研究中，生成由来自两种denv血清型(denv2和denv4)的包膜蛋白残基组成的重组denv病毒，且在表征该病毒时鉴定了数个重要发现：可通过将来自一种denv血清型的区域移植到另一种血清型中来产生活性的重组病毒；rdenv4/2生长在哺乳动物细胞中衰减，但在昆虫细胞中不衰减；rdenv4/2未检出prm蛋白存在，表明其为完全加工和高度成熟的；在两种不同的细胞类型和中和试验中将结合和中和转移给人denv2型特异性mab2d22；rdenv4/2获得对denv2多克隆免疫血清的中和而不会丧失对denv4多克隆免疫血清的中和；rdenv4/2未获得对异型多克隆免疫血清的中和；和可将rdenv4/2开发成引发对denv2和denv4二者的保护性抗体反应的二价疫苗。

实施例6.重组denv与野生型denv序列的氨基酸比对

dv4-ediii-dv2与野生型denv4和denv2的氨基酸序列比对显示于图32a。denv2-1f4e与野生型denv2和denv1的氨基酸比对显示于图32b。最后，denv4m12、denv4m14和denv4m16与野生型denv4和denv3的氨基酸比对显示于图32b。

上文为本发明的阐述，且并非理解为其限制。本发明通过下列权利要求限定，所述权利要求的等同物包含在本文中。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献，通过引用以其整体结合，用于与其中显示所述引用的语句和/或段落相关的教导。

序列

>亲代wt_denv3:115-773e[登革病毒3，seqidno:12]

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>denv4_m12:115-775e(seqidno:2)

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>denv4_m14:115-775e(seqidno:3)

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>denv4_m16:115-775e(seqidno:4)

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>亲代wt_denv4:115-775e[登革病毒4，seqidno:1]

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>亲代wt_denv2:115-775[登革病毒2，seqidno:13]

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>dv4-ediii-dv2:115-775[登革病毒4/2，seqidno:5]

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>亲代wt_denv1:115-775e[登革病毒1，seqidno:14]

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>denv2-1f4e:115-775(seqidno:6)

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denv1/4(5h2)

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denv2/4(5h2)

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denv2-1f4e(16803株)

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亦可进行下列变化以产生具有更小的移植到denv2中的denv1区域的2种病毒：

1.n52q、v55t、s138t、v139i

2.a168s、p169s、a180t、l181v、l183m(除在1中列举的变化之外)

denv4-1f4e

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亦可进行下列变化以产生具有更小的移植到denv2中的denv1区域的2种病毒：

1.n52e、p53v、v55l、s138t

2.a168s、a180e(除在1中列举的变化之外)

denv1-3m14

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亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv3区域的病毒(称为denv1-3m16)：

1.s225t、e229p、e307k

denv2/3m12(16803株)

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亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv2中的denv3区域的2种病毒(称为denv2-m14(#1)anddenv2-m16(#2))：

1.k122l、k123e、p132y

2.e71d、e148q、d225t、s229p、v307k(除在1中列举的变化之外)

denv3/4(5h2)

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dv4-ediii-dv2)

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亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv4中的denv2区域的2种病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列举的变化之外)

dv1-ediii-dv2

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亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv2区域的2种病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列举的变化之外)

dv3-ediii-dv2

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgnetqgvtaeitpqastteailpeygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklelkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:24)

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv3中的denv2区域的2种病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列举的变化之外)

denv2/1/3(16803株)

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注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv2中的denv1和/或denv3区域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列举的变化之外)

3.k122l、k123e、p132y

4.e71d、e148q、d225t、s227p、v307k(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何或全部组合(即1+3、1+4、2+3、2+4)

denv2/1/4

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注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv2中的denv1区域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列举的变化之外)

denv2/3/4(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelikteatqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckepiegkvvqpenleytivvtphsgeehavgndagkhgvtamvtpqsssvevklpdygevtmecsprtgldfnemvlltmknkawmvhrqwffdlplpwtstadtqgpnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgivtlylgvmvqa(seqidno:27)

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv2中的denv3区域的2种病毒：

1.k122l、k123e、p132y

2.e71d、e148q、d225t、s229p、v307k(除在1中列举的变化之外)

denv2/1/3/4(16803株)

mrcigisnrdfvegvsggswvdivlehgscvttmaknkptldfelfktevtqlatlrklcieakltntttesrcptqgepslneeqdkrfvckhsmvdrgwgngcglfgkggivtcamftckkpiegkvvqpenlkytiivtvhsgeehavgndatehgvtamvtpqassvevklpdygevtmecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgadtqgsnwiqketlvtfknphakkqdvvvlgsqegamhtaltgateiqtsstttifaghlkcrlrmdklrlkgmsysmctgkfkvvkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeimdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvdpgqlklnwfkkgssigqmfettmrgakrmailgdtawdfgslggvftsigkalhqvfgaiygaafsgvswtmkiligviitwigmnsrstslsvslvlvgvvtlylgavvqa(seqidno:28)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv2中的denv1和/或denv3区域的病毒：

1.q52n、t55v、t138s、i139v

2.s168a、s169p、t180a、v181l、m183l(除在1中列举的变化之外)

3.k122l、k123e、p132y

4.e71d、e148q、d225t、s227p、v307k(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv1/3/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsyvmctgsfklekevaetqhgtvlvqvkyegtdapckipfssqdekgvtqngrlitanpivtdkekpvnieaeppfgesyivvgagekalklswfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:29)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv3区域的病毒：

1.v122l、t123e、k124p、l214f

2.s225t、e229p、e307k(除在1中列举的变化之外)

denv1/2/3

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqaptseiqltdygaltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdkltlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:30)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv2和/或denv3区域的病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列举的变化之外)

3.v122l、t123e、k124p、l214f

4.s225t、e229p、e307k(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv1/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellktevtnpavlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtklegkivqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemvlltmekkswlvhkqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:31)

注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv2区域的2种病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列举的变化之外)

denv1/2/3/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellkteatqlatlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtkiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqspsvevklpdygeltldcsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsiggvftsvgklihqifgtaygvlfsgvswtmkigigilltwlglnsrstslsmtciavgmvtlylgvmvqa(seqidno:32)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv1中的denv2和/或denv3区域的2种病毒：

1.i68t、d71e、a80p、t81s、v83n、t242n、a243p、e249d

2.r93k、r94h、t95s、f96m、s112g、l113i、i114v(除在1中列举的变化之外)

3.v122l、t123e、k124p、l214f

4.s225t、e229p、e307k(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv3/1/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkysviitvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsgttsifaghlkcrlkmdklrlkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:33)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv3中的denv1区域的病毒：

1.s169p、t180a

2.q52n、l53p、t55v(除在1中列举的变化之外)

denv3/1/2

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqastseiqltdygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklelkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:34)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv3中的denv2和/或denv1区域的2种病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列举的变化之外)

3.s169p、t180a

4.q52n、l53p、t55v(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv3/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgneaqgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:35)

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv3中的denv2区域的2种病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列举的变化之外)

denv3/1/2/4

mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytvivtvhtgdqhqvgneatehgvtamitpqsssvevklpdygelglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwykkgssigkmfeatargarrmailgdtawdfgsvggvlnslgkmvhqifgsaytalfsgvswvmkigigvlltwiglnskntsmsfsciaigiitlylgavvqa(seqidno:36)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv3中的denv2和/或denv1区域的2种病毒：

1.d71e、a80p、v81s、p83n、a243p、e249d

2.i68t、t95s、y96m、s112g、l113i(除在1中列举的变化之外)

3.s169p、t180a

4.q52n、l53p、t55v(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv4/1/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprsptseiqltdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrikgmsytmcsgkfsidkemaetqhgttvvkvkyegagapckvpieirdvnkekvvgrvisstplaentnsvtnieleppfgdsyivigvgnsaltlhwfrkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:37)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv4中的denv1和/或denv3区域的病毒：

1.t49e、s122l、g123e、i132y

2.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在1中列举的变化之外)

3.s168a、e180a

4.e52n、v53p、l55v、t138s(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv4/1/2

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtevallrtycieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgkitgnlvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprsptseiqltdygeltldceprsgidfnemilmkmkkktwlvhkqwfldlplpwtagadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagatevdsggtttmfaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:38)

注：第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv4中的denv1和/或denv2区域的2种病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列举的变化之外)

3.s168a、e180a

4.e52n、v53p、l55v、t138s(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv4/2/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfeltkttatqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienleytvvvtvhngdthavgndtsnhgvtatitprspsvevklpdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmirili

gflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:39)

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv4中的denv2和/或denv3区域的2种病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列举的变化之外)

3.t49e、s122l、g123e、i132y

4.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在3中列举的变化之外)

5.1、2、3、4和原始序列的任何和全部组合

denv4/1/2/3

mrcvgvgnrdfvegvsggawvdlvlehggcvttmaqgkptldfelfkttvtqlatlrklcieasisnittatrcptqgepylkeeqdqqyicrrdvvdrgwgngcglfgkggvvtcakfscsgpiegkvvqienlkytvivtvhngdthavgndttehgttatitprspsvevkltdygeltldceprsgidfnemilltmkkkawmvhrqwffdlplpwtsgadtsevhwnykermvtfkvphakrqdvtvlgsqegamhsalagateiqnsggtsifaghlkckvrmeklrlkgmsysmctgkfkivkeiaetqhgtivirvqyegdgspckipfeitdlekrhvlgrlitvnpivtekdspvnieaeppfgdsyiiigvepgqlklnwfkkgssigkmfestyrgakrmailgetawdfgsvgglftslgkavhqvfgsvyttmfggvswmiriligflvlwigtnsrntsmamtciavggitlflgftvqa(seqidno:40)

注：第50位aa可以是v或a，第52位aa可以是q或n，第55位aa可以是t或v，第160位aa可以是t或v，第163位aa可以是t或m，第168位aa可以是s或a，第170位aa可以是t或s，第171位aa可以是s或v，第173位aa可以是v或i，第174位aa可以是q或k，第176位aa可以是p或t，第180位aa可以是e或a，第272位aa可以是t或n，第275位aa可以是t或g，第276位aa可以是t或n，第277位aa可以是t或l

亦可进行下列变化以产生具有更大的移植到denv4中的denv1、denv2和/或denv3区域的2种病毒：

1.y81s、k83s、v242n、r247k

2.i68t、a71e、t72s、r93k、r94h、d95s、v96m、v113i(除在1中列举的变化之外)

3.t49e、s122l、g123e、i132y

4.a71d、t148q、d225t、v229p、d307k、k321q、v362p(除在3中列举的变化之外)

5.s168a、e180a

6.e52n、v53p、l55v、t138s

7.1、2、3、4、5、6和原始序列的任何和全部组合。