用于RNA递送的可电离阳离子脂质的制作方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年5月8日提交的部分继续申请美国专利申请第14/707,796号和2015年5月8日提交的美国专利申请第14/707,876号以及2014年11月18日提交的美国专利申请第14/546,105号的优先权。

背景技术：

多种不同类型的核酸目前正被开发成用于治疗多种疾病的治疗剂。这些核酸包括基因疗法中的dna、质粒类干扰核酸、用于rna干扰(rnai)的小干扰核酸，包括sirna、mirna、反义分子、核酶和适体。由于正在开发这些分子，因此已出现以如下形式制造这些分子的需要，所述形式稳定、存放期长并且可易于合并到无水有机或无水极性非质子溶剂中，使得能够封装核酸而不存在可能在极性水溶液或非极性溶剂中发生的副反应。

本发明涉及新颖的脂质组合物，其有助于生物活性和治疗性分子的细胞内递送。本发明还涉及包含这类脂质组合物并用于将治疗有效量的生物活性分子递送至患者细胞中的医药组合物。

治疗性化合物向个体的递送对于其治疗作用是重要的，并且通常可能因所述化合物到达靶细胞和组织的能力有限而受到阻碍。通过各种递送方式改善这类化合物进入组织的靶细胞是至关重要的。本发明涉及有助于生物活性分子的靶向细胞内递送的组合物和制备方法中的新颖脂质。

通常未实现有效靶向患者组织的生物活性分子的实例包括：(1)许多蛋白质，包括免疫球蛋白；(2)聚核苷酸，如基因组dna、cdna或mrna；(3)反义聚核苷酸；和(4)许多低分子量化合物，不论是合成或是天然存在的，如肽激素和抗生素。

执业医生现在所面对的一个基本挑战是多种不同类型的核酸目前正被开发成用于治疗多种疾病的治疗剂。这些核酸包括基因疗法中的dna、质粒、小干扰核酸(sina)、用于rna干扰(rnai)的sirna和微rna(mirna)、反义分子、核酶、反义微rna和适体。由于正在开发这些核酸，因此需要制造容易制备并且可易于递送至目标组织的脂质配制品。

技术实现要素：

本文所描述的是式i、ii、iii、iv和v化合物。所描述的是式i化合物

其中

r1和r2各自由1至9个碳所组成的直链烷基、2至11个碳所组成的烯基或炔基组成；l1和l2各自由5至18个碳所组成的直链亚烷基或亚烯基组成，或与n一起形成杂环；x1和x3都由-co-o-组成；

x2由s或o组成；l3由键或1至6个碳所组成的直链亚烷基组成，或与n一起形成杂环；r3由1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基组成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由氢或1至6个碳所组成的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

本文还描述的是式ii化合物

其中

r1和r2都由1至12个碳所组成的直链烷基、2至12个碳所组成的烯基或炔基组成；l1和l2都由5至18个碳所组成的直链亚烷基或亚烯基组成，或与n一起形成杂环；x由s组成；l3由键或1至6个碳所组成的直链亚烷基组成，或与n一起形成杂环；r3由1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基组成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由氢或1至6个碳所组成的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

在式ii化合物的一个实施例中，l1和l2都由五个碳所组成的直链亚烷基组成。在式i化合物的另一个实施例中，r3是亚乙基或亚丙基。在式i化合物的另一个实施例中，r4和r5是相同或不同的，各自是氢、甲基或乙基。在式i化合物的另一个实施例中，l3是键。在式i化合物的另一个实施例中，r1和r2都由十个碳所组成的直链烯基组成。

本文还描述的是式iii或iv化合物

其中

r1由具有12至20个碳的支链烷基组成；r2由具有5至10个碳的直链烷基或具有12至20个碳的支链烷基组成；l1和l2各自由键或具有1至3个碳原子的直链烷基组成；x由s或o组成；l3由键或低碳烷基组成；r3是低碳烷基，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由低碳烷基组成；或其药学上可接受的盐。

在式iii或iv化合物的一个实施例中，l3由键组成。式iii或iv化合物的另一个实施例，x是s。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r3是亚乙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r3是亚正丙基或亚异丙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r4和r5分别是甲基、乙基或异丙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l1和l2各自由键组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l1和l2各自由亚甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由支链烷基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r2由烷基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由19或20个碳原子组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1或r2各自由13或14个碳原子组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由亚甲基组成，r3是亚乙基，x2是s，并且r4和r5各自是甲基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，其中l3由键组成，r3是亚乙基，x是s，并且r4和r5各自是甲基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由键组成，r3由亚正丙基组成，x由s组成，并且r4和r5各自由甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由键组成，r3由亚异丙基组成，x由s组成，并且r4和r5各自由甲基组成。

还描述的是式v化合物

其中

r1由1-18个碳所组成的直链或支链烷基、2至12个碳所组成的烯基或炔基、或胆固醇基组成；r2由1至18个碳所组成的直链或支链烷基或烯基组成；l1由5至9个碳所组成的直链烷基组成，或当r1由胆固醇基组成时，那么l1由3至4个碳所组成的直链亚烷基或烯基组成；x1由-o-(co)-或-(co)-o-组成；x2由s或o组成；l2由键或具有1至6个碳的直链亚烷基组成；r3由具有1至6个碳的直链或支链亚烷基组成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由1至6个碳的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

在式v化合物的一个实施例中，l2由键组成。在式v化合物的另一个实施例中，x2由s组成。在式v化合物的另一个实施例中，x1是-o-(co)-。在式v化合物的另一个实施例中，r3是亚乙基。在式v化合物的另一个实施例中，r3是亚正丙基或亚异丙基。在式v化合物的另一个实施例中，r4和r5分别是甲基、乙基或异丙基。在式v化合物的另一个实施例中，l2由亚甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由支链烷基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r2由烷基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由19或20个碳原子组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1或r2各自由13或14个碳原子组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由亚甲基组成，r3是亚乙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3是亚乙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3是亚正丙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3是亚异丙基，x1是-o-(co)-，x1是s，并且r4和r5都是甲基。

核酸优选地具有抑止目标基因表达的活性。目标基因优选地是与炎症相关联的基因。

本文还描述的是一种通过使用以上任一种组合物将核酸引入到哺乳动物细胞中的方法。细胞可在肝脏、肺、肾脏、脑、血液、脾脏或骨骼中。优选地，静脉内、皮下、腹膜内或鞘内投与组合物。优选地，在用于治疗癌症或炎性疾病的方法中使用本文所描述的组合物。疾病可为选自由以下组成的群组的疾病：免疫病症、癌症、肾脏疾病、纤维化疾病、遗传异常、炎症和心血管病症。

附图说明

图1示出了由不同阳离子脂质囊封的sirna的基因敲低活性。脂质包括mc3(0.3mg/kg)、nci(0.3mg/kg)、atx-547(0.3mg/kg)、atx-001(0.3和1.0mg/kg)、atx-002(0.3和1.0mg/kg)和atx-003(0.3和1.0mg/kg)。在向c57bl6小鼠投与sirna配制品之后，示出与仅注射媒剂相比小鼠血浆中基因敲低的因子vii的量。包括异常和正常人类血浆中因子vii的量作为对照。由星号(＊)示出因子vii水平的统计学上显著降低(p＜0.01)。

图2示出了sirna对于因子vii活性的作用的评估，其基于图2中所示的结果并且归一化成与仅媒剂相比的基因敲低百分比。

图3示出了由不同阳离子脂质囊封的sirna的基因敲低活性。脂质包括mc3(0.3和1.5mg/kg)、ncl(0.3mg/kg)、at547(0.1和0.3mg/kg)、at004(0.3)、at006(0.3和1.0mg/kg)、atx-010(0.3mg/kg)和at001(0.3和1.5mg/kg)。在向c57bl6小鼠投与sirna配制品之后，示出与仅注射媒剂相比小鼠血浆中基因敲低的因子vii的量。包括异常和正常人类血浆中因子vii的量作为对照。由星号(＊)示出因子vii水平的统计学上显著降低(p＜0.01)。

图4示出了sirna对于因子vii活性的作用的评估，其基于图2中所示的结果并且归一化成与仅媒剂相比的基因敲低百分比。

具体实施方式

“至少一个”意思指一个或多个(例如，1-3、1-2或1个)。

“组合物”包括包含规定量的规定成分的产物，以及由规定量的规定成分的组合直接或间接产生的任何产物。

“与......组合”在用于描述本发明的治疗方法中式1、i和ii化合物与其它药剂的投与时，意思指式1、i和ii化合物与其它药剂以分开的剂型依次或同时投与，或以同一剂型同时投与。

“哺乳动物”意思指人类或其它哺乳动物，或意思指人类。

“患者”包括人类和其它哺乳动物，优选地人类。

“烷基”意思指饱和或不饱和的直链或支链烃链。在各种实施例中，烷基具有1-18个碳原子，即是c1-c18基团，或是c1-c12基团、c1-c6基团或c1-c4基团。独立地，在各种实施例中，烷基具有零个分支(即，是直链)、一个分支、两个分支或大于两个分支。“烯基”意思指可具有一个双键、两个双键、大于两个双键的不饱和烷基。“炔基”意思指可具有一个三键、两个三键或大于两个三键的不饱和烷基。烷基链可任选地经1个取代基(即，烷基是经单取代的)、或1-2个取代基、或1-3个取代基、或1-4个取代基取代。取代基可选自由以下组成的群组：羟基、氨基、烷基氨基、硼基、羧基、硝基、氰基或卤基。当烷基并入一个或多个杂原子时，烷基在本文中被称为杂烷基。当烷基上的取代基是烃时，那么所得基团简称为经取代的烷基。在各种方面中，包括取代基的烷基具有小于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个碳。

“低碳烷基”意思指在链中具有一至六个碳原子的基团，所述链可为直链或支链。合适烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和己基。

“烷氧基”意思指烷基-o-基团，其中烷基如上文所定义。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和庚氧基。经由醚氧键结至母体部分。

“烷氧基烷基”意思指烷氧基-烷基-基团，其中烷氧基和烷基如先前所描述。优选的烷氧基烷基包含低碳烷基。经由烷基键结至母体部分。

“烷芳基”意思指烷基-芳基-基团，其中烷基和芳基如先前所描述。优选的烷芳基包含低碳烷基。经由芳基键结至母体部分。

“氨基烷基”意思指经由烷基键结至母体部分的nh2-烷基-基团，其中烷基如上文所定义。

“羧基烷基”意思指经由烷基键结至母体部分的hooc-烷基-基团，其中烷基如上文所定义。

“可商购的化学物质”和本文阐述的实例中所用的化学物质可从标准商业来源获得，其中这类来源包括例如acrosorganics(宾夕法尼亚州匹兹堡)、sigma-adrichchemical(威斯康星州密尔沃基)、avocadoresearch(英国兰开夏)、bionet(英国康沃尔)、boronmolecular(北卡罗莱纳州三角研究园)、combi-blocks(加利福尼亚州圣地亚哥)、eastmanorganicchemicals，eastmankodakcompany(纽约罗契斯特)、fisherscientificco.(宾夕法尼亚州匹兹堡)、frontierscientific(犹他州洛根)、icnbiomedicals，inc.(加利福尼亚州科斯塔梅沙)、lancastersynthesis(新罕布什尔州温德姆)、maybridgechemicalco.(英国康沃尔)、piercechemicalco.(伊利诺斯州罗克福德)、riedeldehaen(德国汉诺威)、spectrumqualityproduct，inc.(新泽西州新不伦瑞克)、tciamerica(俄勒冈州波特兰)和wakochemicalsusa，inc.(弗吉尼亚州里奇蒙)。

“化学文献中所描述的化合物”可如所属领域的一般技术人员已知经由关于化合物和化学反应的参考书和数据库鉴别。详述用于制备本文所公开的化合物的反应物的合成或对描述本文所公开的化合物的制备的文章提供参考的合适参考书和论文包括例如“合成有机化学(syntheticorganicchemistry)”，johnwileyandsons，inc.纽约；s.r-sandler等人，“有机官能团制备(organicfunctionalgrouppreparations)”第2版，academicpress，纽约，1983；h.o.house，“现代合成反应(modernsyntheticreactions)，”第2版，w.a.benjamin，inc.加利福尼亚州门洛帕克，1972；t.l.glichrist，“杂环化学(heterocyclicchemistry)，”第2版.johnwileyandsons，纽约，1992；j.march，“先进有机化学：反应、机制和结构(advancedorganicchemistry：reactions，mechanismsandstructure)，”第5版，wileyinterscience，纽约，2001；特定和类似反应物也可经由美国化学学会的化学文摘社(chemicalabstractserviceoftheamericanchemicalsociety)所制备的已知化学物质的索引来鉴别，所述索引可用于大部分公共图书馆和大学图书馆以及遍及在线数据库(例如华盛顿的美国化学学会)。已知但目录中不可商购的化学物质可由定制化学合成室制备，其中许多标准化学供应室(如上文所列的那些)提供定制合成服务。

“卤基”意思指氟基、氯基、溴基或碘基。优选的是氟基、氯基或溴基，并且更优选的是氟基和氯基。

“卤素”意思指氟、氯、溴或碘。优选的是氟、氯和溴。

“杂烷基”是含有碳和至少一个杂原子的饱和或不饱和直链或支链。在各种实施例中，杂烷基可具有一个杂原子、或1-2个杂原子、或1-3个杂原子、或1-4个杂原子。在一个方面，杂烷基链含有1至18(即，1-18)个成员原子(碳和杂原子)，并且在各种实施例中含有1-12、或1-6、或1-4个成员原子。独立地，在各种实施例中，杂烷基具有零个分支(即，是直链)、一个分支、两个分支或大于两个分支。独立地，在一个实施例中，杂烷基是饱和的。在另一个实施例中，杂烷基是不饱和的。在各种实施例中，不饱和杂烷基可具有一个双键、两个双键、大于两个双键，和/或一个三键、两个三键或大于两个三键。杂烷基链可经取代或未经取代。在一个实施例中，杂烷基链未经取代。在另一个实施例中，杂烷基链经取代。经取代的杂烷基链可具有1个取代基(即，通过单取代)，或可具有例如1-2个取代基、或1-3个取代基、或1-4个取代基。示例性杂烷基取代基包括酯(-c(o)-o-r)和羧基(-c(o)-)。

“羟基烷基”意思指ho-烷基-基团，其中烷基如先前所定义。优选的羟基烷基含有低碳烷基。合适的羟基烷基的非限制性实例包括羟甲基和2-羟乙基。

“水合物”是其中溶剂分子是h2o的溶剂合物。

“脂质”意思指包含脂肪酸酯并且特征在于不可溶于水、但可溶于许多有机溶剂中的有机化合物。脂质通常分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”，如类固醇。

“脂质粒子”意思指可用于递送治疗性核酸(例如，mrna)至所关注的目标位点(例如，细胞、组织、器官等等)的脂质配制品。在优选实施例中，脂质粒子是核酸-脂质粒子，其通常由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、防止粒子聚集的结合脂质(例如，peg-脂质)和任选地胆固醇形成。通常，治疗性核酸(例如，mrna)可囊封于粒子的脂质部分中，从而保护其免于酶降解。

脂质粒子的平均直径通常是30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm、70nm至100nm、80nm至100nm、90nm至100nm、70至90nm、80nm至90nm、70nm至80nm、或30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上是无毒的。另外，核酸，当存在于本发明的脂质粒子中时，在水溶液中抗核酸酶降解。

“溶剂合物”意思指本发明化合物与一个或多个溶剂分子的物理性缔合。此物理性缔合涉及不同程度的离子和共价键结，包括氢键结。在某些情况下，溶剂合物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂合物。合适溶剂合物的非限制性实例包括乙醇合物、甲醇合物等等。

“经脂质囊封”可意思指提供完全囊封、部分囊封或兼具的治疗性核酸(如mrna)的脂质粒子。在一优选实施例中，核酸(例如，mrna)完全囊封于脂质粒子中。

“脂质结合物”意思指抑制脂质粒子聚集的结合脂质。这类脂质结合物包括(但不限于)peg-脂质结合物，如偶合到二烷氧基丙基的peg(例如，peg-daa结合物)、偶合到二酰基甘油的peg(例如，peg-dag结合物)、偶合到胆固醇的peg、偶合到磷脂酰乙醇胺的peg和结合到神经酰胺的peg；阳离子peg脂质；聚噁唑啉(poz)-脂质结合物；聚酰胺寡聚物(例如，atta-脂质结合物)和其混合物。peg或poz可直接结合到脂质或可经由连接体部分连接到脂质。可使用适用于将peg或poz偶合到脂质的任何连接体部分，包括例如不含酯的连接体部分和含有酯的连接体部分。在某些优选实施例中，使用不含酯的连接体部分，如酰胺或氨基甲酸酯。

“两性脂质”意思指其中脂质物质的疏水性部分定向于疏水相，而亲水性部分定向于水相的物质。亲水性特征源自存在极性或带电荷基团，如碳水化合物、磷酸酯基、羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团。疏水性可通过包括非极性基团而赋予，非极性基团包括(但不限于)长链饱和与不饱和脂族烃基并且这类基团经一个或多个芳香族基团、环脂族基团或杂环基团取代。两性化合物的实例包括(但不限于)磷脂、氨基脂和鞘脂。

磷脂的代表性实例包括(但不限于)磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。缺少磷的其它化合物，如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在称为两性脂质的群组内。此外，上文所描述的两性脂质可与包括甘油三酯和固醇的其它脂质混合。

“中性脂质”意思指在所选ph下以不带电荷或中性两性离子形式存在的脂质种类。在生理ph下，这类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。

“非阳离子脂质”意思指两性脂质或中性脂质或阴离子脂质，并且更详细地描述于下文。

“阴离子脂质”意思指在生理ph下带负电荷的脂质。这些脂质包括(但不限于)磷脂酰甘油、心肌磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、n-十二酰基磷脂酰乙醇胺、n-丁二酰基磷脂酰乙醇胺、n-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(popg)和其它阴离子修饰基团接合到中性脂质。

术语“疏水性脂质”意思指具有非极性基团的化合物，非极性基团包括(但不限于)长链饱和与不饱和脂族烃基并且这类基团任选地经一个或多个芳香族基团、环脂族基团或杂环基团取代。合适实例包括(但不限于)二酰基甘油、二烷基甘油、n-n-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

术语“阳离子脂质”和“氨基脂”在本文中可互换用于包括那些具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和ph可滴定的氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的脂质和其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质pka的ph下质子化(即，带正电荷)并且在高于pka的ph下基本上是中性的。本发明的阳离子脂质也可称为可滴定的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质包含：可质子化叔胺(例如，ph可滴定)头部基团；c18烷基链，其中每一烷基链独立地具有0至3(例如，0、1、2或3)个双键；和头部基团与烷基链之间的醚、酯或缩酮键。这类阳离子脂质包括(但不限于)dsdma、dodma、dlindma、dlendma、γ-dlendma、dlin-k-dma、dlin-k-c2-dma(也称为dlin-c2k-dma、xtc2和c2k)、dlin-k-c3-dma、dlin-k-c4-dma、dlen-c2k-dma、y-dlen-c2k-dma、dlin-m-c2-dma(也称为mc2)、dlin-m-c3-dma(也称为mc3)和(dlin-mp-dma)(也称为1-b11)。

术语“经取代”意思指经除氢以外的规定基团或经一个或多个可能相同或不同的基团、部分或自由基(其中每一个例如是独立选择的)取代。

“反义核酸”意思指借助于rna-rna或rna-dna或rna-pna(蛋白质核酸；egholm等人，1993自然(nature)365，566)相互作用结合于目标rna并且改变目标rna的活性的非酶核酸分子(关于综述，参见stein和cheng，1993科学(science)261，1004和woolf等人，美国专利第5,849,902号)。通常，反义分子沿着反义分子的单个连续序列与目标序列互补。然而，在某些实施例中，反义分子可结合于底物以使得底物分子形成环，和/或反义分子可结合以使得反义分子形成环。因此，反义分子可与两个(或甚至更多)不连续底物序列互补，或反义分子的两个(或甚至更多)不连续序列部分可与目标序列互补，或两者都有。另外，反义dna可借助于dna-rna相互作用而用于靶向rna，从而活化rna酶h，分解双螺旋体形式的目标rna。反义寡核苷酸可包含一个或多个rna酶h活化区，其能够活化rna酶h裂解目标rna。反义dna可以化学方式合成或经由使用单链dna表达载体或其等效物表达。反义rna是序列与目标基因mrna互补的rna链。有义rna具有与反义rna互补的序列，并且粘接至其互补反义rna以形成ina。这些反义和有义rna已用rna合成仪常规合成。

“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，其是合成、天然存在和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与参考核苷酸类似的方式代谢。这类类似物的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2′-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。

“rna”意思指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意思指在β-d-呋喃核糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。所述术语包括双链rna、单链rna、经分离的rna(如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的rna不同的经改变的rna。这类改变可包括如向干扰rna的端部或内部(例如在rna的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸物质。本发明的rna分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的rna可称为类似物或天然存在的rna的类似物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“rna”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括sirna、反义rna、单链rna、微rna、mrna、非编码rna和多价rna。核糖核苷酸是在β-d-呋喃核糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。这些术语包括双链rna(dsrna)、单链rna(ssrna)、经分离的rna(如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna以及通过添加、缺失、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的rna不同的经修饰和改变的rna。rna的改变可包括如向干扰rna的端部或内部(例如在rna的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸物质，rna分子中的核苷酸包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的rna可称为类似物。

如本文所用，“核苷酸”如所属领域所公认包括天然碱基(标准)和所属领域中众所周知的修饰碱基。这类碱基一般位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸基。核苷酸可未经修饰或在糖、磷酸和/或碱基部分处经修饰(还可互换地称为核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸和其它；参见例如usman和mcswiggen，见上文；eckstein等人，国际pct公开案第wo92/07065号；usman等人，国际pct公开案第wo93/15187号；uhlman和peyman，见上文，全部特此以引用的方式并入本文中)。存在所属领域中已知经修饰的核酸碱基的数种实例，如由limbach等人，核酸研究(nucleicacidsres.)22：2183，1994所汇总。可引入到核酸分子中的碱基修饰的一些非限制性实例包括：肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(burgin等人，生物化学(biochemistry)35：14090，1996；uhlman和peyman，见上文)。在此方面中，“经修饰的碱基”意思指在1′位置处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸碱基或其等效物。

如本文所用，互补核苷酸碱基是彼此形成氢键的一对核苷酸碱基。腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)或与rna中的尿嘧啶(u)配对，并且鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)配对。核酸的互补区段或链彼此杂交(通过氢键结接合)。“互补”意思指核酸可通过传统沃森-克里克(watson-crick)结合模式或通过其它非传统结合模式与另一核酸序列形成氢键。

微rna(mirna)是调节基因表达的21-23个核苷酸长的单链rna分子，mirna是由从dna转录但不翻译成蛋白质的基因编码(非编码rna)；实际上，其是由称为原mirna的初级转录物加工成称为前mirna的短茎-环结构并且最后加工成功能性mirna。成熟mirna分子与一个或多个信使rna(mrna)分子部分互补，并且其主要功能是下调基因表达

如本文所用，术语“小干扰rna(sirna)”，有时称为短干扰rna或沉默rna，用以指一类16-40个核苷酸长的dsrna分子，其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，sirna参与rna干扰(rnai)途径，其中其干扰特定基因的表达。除了在rnai途径中的作用以外，sirnas还在rnai相关途径中起作用，例如充当抗病毒机制或用于塑造基因组的染色质结构；现在仅阐明这些途径的复杂性。

如本文所用，术语rnai是指受rna诱导的沉默复合物(risc)控制并且由细胞中的短dsrna分子引发的rna依赖性基因沉默过程，其中短dsrna分子与称为argonaute蛋白的催化性risc组分相互作用。当dsrna或rna样ina或sirna是外源性(来自受具有rna基因组的病毒感染或来自转染ina或sirna)时，rna或ina被直接导入到细胞质中并且由称为dicer的酶裂解成短片段。启动dsrna也可为内源性(起源于细胞中)，如在由基因组中的rna编码基因所表达的前mirna中。这类基因的初级转录物首先加工以形成细胞核中前mirna的特征性茎-环结构，随后导出至细胞质以待由dicer裂解。因此，两个dsrna途径(外源性和内源性)在risc复合物处会聚。risc的活性组分argonaute蛋白裂解与其结合的sirna或ina互补的目标mrna链。因为由dicer产生的片段是双链，所以其可能各自在理论上产生功能性sirna或ina。然而，两条链中仅称为引导链的一条链结合argonaute蛋白并且指导基因沉默。另一条反引导链或过客链在risc活化期间降解。

本文所描述的是式i、ii、iii、iv和v化合物。本文所描述的是式i化合物

其中

r1和r2都由1至9个碳所组成的直链烷基、2至11个碳所组成的烯基或炔基组成；

l1和l2都由5至18个碳所组成的直链亚烷基或亚烯基组成，或与n一起形成杂环；

x1和x3都由-co-o-组成；

x2是s或o；

l3由键或1至6个碳所组成的直链亚烷基组成，或与n一起形成杂环；

r3由1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基组成；以及

r4和r5是相同或不同的，由氢或1至6个碳所组成的直链或支链烷基组成，

或其药学上可接受的盐。

本文还描述的是下表1中列出的atx-001至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030中列出的任何化合物或其药学上可接受的盐。

本文还描述的是式ii化合物

其中

r1和r2都由1至12个碳所组成的直链烷基、2至12个碳所组成的烯基或炔基组成，

l1和l2都由5至18个碳所组成的直链亚烷基或亚烯基组成，或与n一起形成杂环，

x是s，

l3是键或1至6个碳所组成的直链亚烷基，或与n一起形成杂环，

r3是1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基，以及

r4和r5是相同或不同的，各自是氢或1至6个碳所组成的直链或支链烷基；或药学上可接受的盐。

在式ii化合物的一个实施例中，l1和l2都由五个碳所组成的直链亚烷基组成。在式i化合物的另一个实施例中，r3是亚乙基或亚丙基。在式i化合物的另一个实施例中，r4和r5是相同或不同的，各自是氢、甲基或乙基。在式i化合物的另一个实施例中，l3是键。在式i化合物的另一个实施例中，r1和r2都由十个碳所组成的直链烯基组成。

在式i和ii化合物的另一个实施例中，化合物由选自下表1中列出的atx-001至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030中列出的任何化合物、或式1)至12)或其药学上可接受的盐的化合物组成。

本文还描述的是式iii或iv化合物

其中

r1由具有12至20个碳的支链烷基组成，

r2由具有5至10个碳的直链烷基或具有12至20个碳的支链烷基组成，

l1和l2各自由键或具有1至3个碳原子的直链烷基组成，

x由s或o组成，

l3由键或低碳烷基组成，

r3由低碳烷基组成，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由低碳烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

在式iii或iv化合物的一个实施例中，l3由键组成。式iii或iv化合物的另一个实施例，x是s。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r3是亚乙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r3是亚正丙基或亚异丙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r4和r5分别是甲基、乙基或异丙基。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l1和l2都由键组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l1和l2都由亚甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1和r2都由支链烷基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r2由烷基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1和r2都由19或20个碳原子组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，r1和r2都由13或14个碳原子组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由亚甲基组成，r3由亚乙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，其中l3由键组成，r3由亚乙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由键组成，r3由亚正丙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，l3由键组成，r3由亚异丙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式iii或iv化合物的另一个实施例中，选自由如下式atx-b-1至atx-b-12化合物组成的群组。

还描述的是式v化合物

其中

r1由1-18个碳所组成的直链或支链烷基、2至12个碳所组成的烯基或炔基、或胆固醇基组成；

r2由1至18个碳所组成的直链或支链烷基或烯基组成；

l1由5至9个碳所组成的直链烷基组成，或当r1由胆固醇基组成时，那么l1由3至4个碳所组成的直链亚烷基或烯基组成；x1由-o-(co)-或-(co)-o-组成；

x2由s或o组成；

l2由键或具有1至6个碳的直链亚烷基组成；

r3由具有1至6个碳的直链或支链亚烷基组成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由具有1至6个碳的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐

在式v化合物的一个实施例中，l2由键组成。在式v化合物的另一个实施例中，x2由s组成。在式v化合物的另一个实施例中，x1是-o-(co)-。在式v化合物的另一个实施例中，r3由亚乙基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r3由亚正丙基或亚异丙基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r4和r5各自由甲基、乙基或异丙基组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由亚甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由支链烷基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r2由烷基组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1和r2各自由19或20个碳原子组成。在式v化合物的另一个实施例中，r1或r2各自由13或14个碳原子组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由亚甲基组成，r3由亚乙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3是亚乙基，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3由亚正丙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，l2由键组成，r3由亚异丙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。在式v化合物的另一个实施例中，化合物是选自式atx-a-1至atx-a-22的化合物

式i、ii、iii、iv和v化合物可为其药学上可接受的盐，在包含纳米粒子的脂质组合物或双层脂质分子中。脂质双层优选地另外包含中性脂质或聚合物。脂质组合物优选地包含液体介质。所述组合物优选地进一步囊封核酸。所述核酸优选地具有通过利用rna干扰(rnai)抑止目标基因表达的活性。脂质组合物优选地另外包含核酸和中性脂质或聚合物。脂质组合物优选地囊封核酸。

式i、ii、iii、iv和v化合物形成也在本发明范围内的盐。除非另外指明，否则在本文中提及式i、ii、iii、iv或v化合物理解为包括提及其盐。如本文所用的术语“盐”表示用无机和/或有机酸形成的酸式盐以及用无机和/或有机碱形成的碱式盐。另外，式i、ii、iii、iv或v化合物的这类盐可含有碱性部分，如(但不限于)吡啶或咪唑；或酸性部分，如(但不限于)羧酸；和两性离子(“内盐”)。盐可为药学上可接受的(即，无毒性、生理学上可接受的)盐，但是其它盐也是有用的。式i、ii、iii、iv或v化合物的盐可例如通过使式i、ii、iii、iv或v化合物与一定量(如等量)的酸或碱在介质(如其中盐沉淀的介质)中或在水性介质中反应，接着冷冻干燥来形成。

示例性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乙二酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、磺酸盐(如本文中所提及的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate/tosylate)十一烷酸盐等等。此外，一般视为适用于由碱性医药化合物形成药学上有用的盐的酸例如由s.berge等人，药物科学杂志(j.pharmaceuticalsciences)(1977)66(1)1-19；p.gould，国际药剂学杂志(internationalj.pharmaceutics)(1986)33201-217；anderson等人，医药化学的实践(thepracticeofmedicinalchemistry)(1996)，纽约学术出版社(academicpress，newyork)；以及橘皮书(在华盛顿食品药品监督管理局网站上)中论述。这些公开内容以引用的方式并入本文中。

示例性碱式盐包括铵盐；碱金属盐，如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；具有有机碱(例如，有机胺)的盐，如苯乍生(benzathine)、二环己基胺、哈胺(hydrabamine)(用n，n-双(去氢松香基)乙二胺形成)、n-甲基-d-葡糖胺、n-甲基-d-葡糖酰胺、叔丁胺；和具有如精氨酸或赖氨酸等氨基酸的盐。碱性含氮基团可用如低碳烷基卤化物(例如，甲基、乙基、丙基以及丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如，硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基卤化物(例如，苯甲基和苯乙基溴化物)等试剂季铵化。

所有这类酸盐和碱盐预期是在公开内容范围内的药学上可接受的盐，并且出于本公开内容的目的，所有酸盐和碱盐被视为等效于相应式i化合物的游离形式。

式i、ii、iii、iv和v化合物可以非溶剂化和溶剂化形式(包括水合形式)存在。一般来说，出于本公开内容的目的，具有药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等等)的溶剂化形式等效于非溶剂化形式。

式i、ii、iii、iv和v化合物和其盐、溶剂合物可以其互变异构形式(例如，呈酰胺或亚氨醚形式)存在。所有这类互变异构形式都作为本公开内容的一部分涵盖在本文中。

本公开内容的化合物的多晶型物也在本公开内容的范围内(即，式i化合物的多晶型物在本公开内容的范围内)。

本发明化合物(包括化合物的那些盐、溶剂合物和前药以及前药的盐和溶剂合物)的所有立体异构体(例如，几何异构体、光学异构体等等)，如可由于各种取代基上的不对称碳而存在的那些立体异构体，包括对映异构形式(其可甚至在不存在不对称碳的情况下存在)、旋转异构形式、阻转异构体和非对映异构形式，涵盖在本公开内容的范围内。本公开内容的化合物的个别立体异构体可例如基本上不含其它异构体，或可例如以外消旋体形式或与所有其它或其它所选立体异构体混合。本文中化合物的手性中心可具有如由iupac1974建议所定义的s或r构型。术语“盐”、“溶剂合物”等等的使用预期同样适用于所公开的化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、外消旋体或前药的盐和溶剂合物。

可用作化学治疗剂(抗肿瘤剂)的化合物的类别包括：烷基化剂、抗代谢物、天然产品和其衍生物、激素和类固醇(包括合成类似物)以及合成物。下文给出这些类别内的化合物的实例。

脂质粒子

本说明书提供包含囊封在脂质粒子内的一种或多种治疗性mrna分子的脂质粒子。

在一些实施例中，mrna完全囊封在脂质粒子的脂质部分内，以使得脂质粒子中的mrna在水溶液中抗核酸酶降解。在其它实施例中，本文所描述的脂质粒子对如人类等哺乳动物基本上无毒性。脂质粒子的平均直径通常为30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm或70至90nm。本发明的脂质粒子的脂质：rna比率(质量/质量比)还通常为1∶1至100∶1、1∶1至50∶1、2∶1至25∶1、3∶1至20∶1、5∶1至15∶1、或5∶1至10∶1、或10∶1至14∶1、或9∶1至20∶1。在一个实施例中，脂质粒子的脂质∶rna比率(质量/质量比)为12∶1。在另一个实施例中，脂质粒子的脂质∶mrna比率(质量/质量比)为13∶1。

在优选实施例中，脂质粒子包含mrna、阳离子脂质(例如，本文所描述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂和抑制粒子聚集的结合脂质(例如，一种或多种peg-脂质结合物)。脂质粒子还可包括胆固醇。脂质粒子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多表达一种或多种多肽的mrna。

在核酸-脂质粒子中，mrna可完全囊封在粒子的脂质部分内，从而保护核酸不被核酸酶降解。在优选实施例中，包含mrna的脂质粒子完全囊封在粒子的脂质部分内，从而保护核酸不被核酸酶降解。在某些情况下，粒子在37℃下暴露于核酸酶至少20、30、45或60分钟之后，脂质粒子中的mrna基本上并未降解。在某些其它情况下，粒子在血清中在37℃下培育至少30、45或60分钟或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时之后，脂质粒子中的mrna基本上并未降解。在其它实施例中，mrna与粒子的脂质部分复合。本发明配制品的一个益处是核酸-脂质粒子组合物对如人类等哺乳动物基本上无毒性。

“完全囊封”意味着核酸-脂质粒子中的核酸(例如，mrna)在暴露于将显著降解游离rna的血清或核酸酶分析法之后并未显著降解。当完全囊封时，粒子中优选地小于25％的核酸在通常将降解100％游离核酸的处理中被降解，粒子中更优选地小于10％并且最优选地小于5％的核酸被降解。“完全囊封”还意味着核酸-脂质粒子在活体内投与后不会快速分解成其组成部分。

在核酸的情形下，完全囊封可通过进行不可透过膜的荧光染料排阻分析法来测定，所述分析法使用当与核酸缔合时荧光增强的染料。囊封是通过添加染料至脂质体配制品，测量所得荧光并且比较其与在添加少量非离子型清洁剂后所观测到的萤光来测定。清洁剂介导的脂质体双层的破裂释放所囊封的核酸，从而使其与不可透过膜的染料相互作用。核酸囊封可如下计算：e＝(i0-i)/i0，其中i和i0是指清洁剂添加前后的荧光强度。

在其它实施例中，本发明提供包含多个核酸-脂质粒子的核酸-脂质粒子组合物。

脂质粒子包含完全囊封在粒子的脂质部分内的mrna，以使得30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％、30％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％、85％至95％、90％至95％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、60％至90％、70％至90％、80％至90％、或至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分数或其中的范围)的粒子其中囊封有mrna。

视脂质粒子的既定用途而定，可改变组分的比例并且可使用所属领域中已知分析法测量特定配制品的递送效率。

阳离子脂质

本说明书包括某些阳离子脂质化合物的合成。所述化合物特别适用于递送聚核苷酸至细胞和组织，如后续部分所展现。本文所描述的脂质大环化合物可用于其它目的以及例如受体和添加剂。

阳离子脂质化合物的合成方法可使用所属领域中的技能合成。所属领域的技术人员将发现其它方法以制造这些化合物以及制造本说明书的其它化合物。

阳离子脂质化合物可与药剂组合以形成微米粒子、纳米粒子、脂质体或胶束。有待通过粒子、脂质体或胶束递送的药剂可呈气体、液体或固体形式。并且药剂可为聚核苷酸、蛋白质、肽或小分子。脂质大环化合物可与其它阳离子脂质化合物、聚合物(合成或天然)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质或脂质组合以形成粒子。这些粒子可随后任选地与医药赋形剂组合以形成医药组合物。

本说明书提供新颖的阳离子脂质化合物和基于这类阳离子脂质化合物的使用的药物递送系统。所述系统可用于医药/药物递送技术中以递送聚核苷酸、蛋白质、小分子、肽、抗原或药物至患者、组织、器官或细胞。这些新颖化合物还可用作用于涂布、添加剂、赋形剂、材料或生物工程的材料。

本说明书的阳离子脂质化合物提供药物递送技术中的数种不同用途。阳离子脂质化合物的含胺部分可用于与聚核苷酸复合，从而增强聚核苷酸的递送并且防止其降解。阳离子脂质化合物还可用于形成含有有待递送的药剂的皮粒子、纳米粒子、微米粒子、脂质体和胶束。优选地，阳离子脂质化合物是生物相容和可生物降解的，并且所形成的粒子也是可生物降解和生物相容的并且可用于受控的持续释放有待递送的药剂。鉴于这些阳离子脂质化合物在较低ph下质子化，这些阳离子脂质化合物和其相应粒子也响应于ph变化。它们也可在药剂递送至细胞时充当质子海绵以引起内体溶解。

在某些实施例中，阳离子脂质化合物是相对无细胞毒性的。阳离子脂质化合物可为生物相容和可生物降解的。阳离子脂质的pka可在大致5.5至大致7.5范围内，更优选地在大致6.0与大致7.0之间。其可经设计以使得所期望的pka在大致3.0与大致9.0之间，或在大致5.0与大致8.0之间。本文所描述的阳离子脂质化合物出于以下若干原因而对药物递送特别具有吸引力：其含有氨基以便与dna、rna其它聚核苷酸和其它带负电荷药剂相互作用、缓冲ph、引起内渗透、保护有待递送的药剂，其可由可商购的起始物质合成；和/或其具有ph响应性并且可经工程改造以具有所期望的pka。

含有阳离子脂质化合物的组合物可为30-70％阳离子脂质化合物、0-60％胆固醇、0-30％磷脂和1-10％聚乙二醇(peg)。优选地，所述组合物是30-40％阳离子脂质化合物、40-50％胆固醇和10-20％peg。在其它优选实施例中，所述组合物是50-75％阳离子脂质化合物、20-40％胆固醇和5-10％磷脂和1-10％peg。所述组合物可含有60-70％阳离子脂质化合物、25-35％胆固醇和5-10％peg。所述组合物可含有多达90％阳离子脂质化合物和2-15％辅助脂质。

配制品可为脂质粒子配制品，例如含有8-30％化合物、5-30％辅助脂质和0-20％胆固醇；4-25％阳离子脂质、4-25％辅助脂质、2-25％胆固醇、10-35％胆固醇-peg和5％胆固醇-胺；或2-30％阳离子脂质、2-30％辅助脂质、1-15％胆固醇、2-35％胆固醇-peg和1-20％胆固醇-胺；或多达90％阳离子脂质和2-10％辅助脂质；或甚至100％阳离子脂质。

非阳离子脂质

脂质粒子中所用的非阳离子脂质可为各种能够制造稳定复合物的中性不带电脂质、两性离子脂质或阴离子脂质中的任一种。

非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡基磷酸酯、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(pope)、棕榈酰油酰基-磷脂酰甘油(popg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反式油酰基-磷脂酰乙醇胺(depe)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱和其混合物。还可使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选地是来源于具有c10-c24碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。

非阳离子脂质的额外实例包括固醇，如胆固醇和其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，如5α-胆甾烷醇、5α-粪甾醇、胆固醇基-(2′-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮和胆固醇基癸酸酯；和其混合物。在优选实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，如胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚。

在一些实施例中，脂质粒子中所存在的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物或由一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物组成。在其它实施例中，脂质粒子中所存在的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂或由一种或多种磷脂组成，例如无胆固醇的脂质粒子配制品。在又其它实施例中，脂质粒子中所存在的非阳离子脂质包含胆固醇或其衍生物或由胆固醇或其衍生物组成，例如无磷脂的脂质粒子配制品。

非阳离子脂质的其它实例包括不含磷的脂质，如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基-芳基硫酸聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。

在一些实施例中，非阳离子脂质占粒子中所存在的总脂质的10摩尔％至60摩尔％、20摩尔％至55摩尔％、20摩尔％至45摩尔％、20摩尔％至40摩尔％、25摩尔％至50摩尔％、25摩尔％至45摩尔％、30摩尔％至50摩尔％、30摩尔％至45摩尔％、30摩尔％至40摩尔％、35摩尔％至45摩尔％、37摩尔％至42摩尔％、或35摩尔％、36摩尔％、37摩尔％、38摩尔％、39摩尔％、40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％或45摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

在脂质粒子含有磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物的实施例中，混合物可占粒子中所存在的总脂质的多达40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％或60摩尔％。

在一些实施例中，混合物中的磷脂组分可占粒子中所存在的总脂质的2摩尔％至20摩尔％、2摩尔％至15摩尔％、2摩尔％至12摩尔％、4摩尔％至15摩尔％或4摩尔％至10摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。在某些优选实施例中，混合物中的磷脂组分占粒子中所存在的总脂质的5摩尔％至10摩尔％、5摩尔％至9摩尔％、5摩尔％至8摩尔％、6摩尔％至9摩尔％、6摩尔％至8摩尔％、或5摩尔％、6摩尔％、7摩尔％、8摩尔％、9摩尔％或10摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

在其它实施例中，混合物中的胆固醇组分可占粒子中所存在的总脂质的25摩尔％至45摩尔％、25摩尔％至40摩尔％、30摩尔％至45摩尔％、30摩尔％至40摩尔％、27摩尔％至37摩尔％、25摩尔％至30摩尔％或35摩尔％至40摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。在某些优选实施例中，混合物中的胆固醇组分占粒子中所存在的总脂质的25摩尔％至35摩尔％、27摩尔％至35摩尔％、29摩尔％至35摩尔％、30摩尔％至35摩尔％、30摩尔％至34摩尔％、31摩尔％至33摩尔％、或30摩尔％、31摩尔％、32摩尔％、33摩尔％、34摩尔％或35摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

在脂质粒子无磷脂的实施例中，胆固醇或其衍生物可占粒子中所存在的总脂质的多达25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％或60摩尔％。

在一些实施例中，无磷脂的脂质粒子配制品中的胆固醇或其衍生物可占粒子中所存在的总脂质的25摩尔％至45摩尔％、25摩尔％至40摩尔％、30摩尔％至45摩尔％、30摩尔％至40摩尔％、31摩尔％至39摩尔％、32摩尔％至38摩尔％、33摩尔％至37摩尔％、35摩尔％至45摩尔％、30摩尔％至35摩尔％、35摩尔％至40摩尔％、或30摩尔％、31摩尔％、32摩尔％、33摩尔％、34摩尔％、35摩尔％、36摩尔％、37摩尔％、38摩尔％、39摩尔％或40摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

在其它实施例中，非阳离子脂质占粒子中所存在的总脂质的5摩尔％至90摩尔％、10摩尔％至85摩尔％、20摩尔％至80摩尔％、10摩尔％(例如，仅磷脂)或60摩尔％(例如，磷脂和胆固醇或其衍生物)(或其任何分数或其中的范围)。

脂质粒子中所存在的非阳离子脂质的百分比是目标量，并且配制品中所存在的非阳离子脂质的实际量可变化例如±5摩尔％。

脂质结合物

除阳离子以外，本文所描述的脂质粒子可另外包含脂质结合物。结合脂质是有用的，因为其防止粒子聚集。合适的结合脂质包括(但不限于)peg-脂质结合物、阳离子-聚合物-脂质结合物和其混合物。

在一优选实施例中，脂质结合物是peg-脂质。peg-脂质的实例包括(但不限于)偶合到二烷氧基丙基的peg(peg-daa)、偶合到二酰基甘油的peg(peg-dag)、偶合到如磷脂酰乙醇胺等磷脂的peg(peg-pe)、结合到神经酰胺的peg、结合到胆固醇或其衍生物的peg和其混合物。

peg是具有两个末端羟基的亚乙基peg重复单元的水溶性线性聚合物。peg是通过其分子量分类；并且包括以下：单甲氧基聚乙二醇(mepeg-oh)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(mepeg-s)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酰亚胺基丁二酸酯(mepeg-s-nhs)、单甲氧基聚乙二醇-胺(mepeg-nh2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(mepeg-tres)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(mepeg-im)以及含有末端羟基而非末端甲氧基的这类化合物(例如，ho-peg-s、ho-peg-s-nhs、ho-peg-nh2)。

本文所描述的peg-脂质结合物的peg部分可包含范围介于550道尔顿至10,000道尔顿的平均分子量。在某些情况下，peg部分的平均分子量为750道尔顿至5,000道尔顿(例如，1,000道尔顿至5,000道尔顿、1,500道尔顿至3,000、750道尔顿至3,000道尔顿、750道尔顿至2,000道尔顿)。在优选实施例中，peg部分的平均分子量为2,000道尔顿或750道尔顿。

在某些情况下，peg可任选地经烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。peg可直接结合到脂质或可经由连接体部分连接到脂质。可使用适用于将peg偶合到脂质的任何连接体部分，包括例如不含酯的连接体部分和含有酯的连接体部分。在一优选实施例中，连接体部分是不含酯的连接体部分。合适的不含酯的连接体部分包括(但不限于)酰胺基(-c(o)nh-)、氨基(-nr-)、羰基(-c(o)-)、氨基甲酸酯基(-nhc(o)o-)、脲(-nhc(o)nh-)、二硫化物(-s-s-)、醚(-o-)、丁二酰基(-(o)cch2ch2c(o)-)、丁二酰胺基(-nhc(o)ch2ch2c(o)nh-)、醚、二硫化物以及其组合(如含有氨基甲酸酯基连接体部分和酰胺基连接体部分的连接体)。在一优选实施例中，使用氨基甲酸酯基连接体将peg偶合到脂质。

在其它实施例中，使用含有酯的连接体部分将peg偶合到脂质。合适的含有酯的连接体部分包括例如碳酸酯基(-oc(o)o-)、丁二酰基、磷酸酯(-o-(o)poh-o-)、磺酸酯和其组合。

具有各种不同链长度和饱和度的酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可结合到peg以形成脂质结合物。这类磷脂酰乙醇胺是可商购的，或可使用所属领域的技术人员已知的常规技术分离或合成。含有碳链长度在c10至c20范围内的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。还可使用具有单或二不饱和脂肪酸和饱和与不饱和脂肪酸的混合物的磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰乙醇胺包括(但不限于)二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(dope)和二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(dspe)。

术语“二酰基甘油”或“dag”包括具有2个脂肪酰基链r¹和r²的化合物，r¹和r²都独立地具有通过酯键键结于甘油的1-和2-位置的2至30个碳。酰基可为饱和的或具有不同的不饱和度。合适的酰基包括(但不限于)月桂酰基(c12)、肉豆蔻酰基(c14)、棕榈酰基(c16)、硬脂酰基(c18)和花生酰基(c20)。在优选实施例中，r¹和r²是相同的，即r¹和r²都是肉豆蔻酰基(即，二肉豆蔻酰基)，r¹和r²都是硬脂酰基(即，二硬脂酰基)。

术语“二烷氧基丙基”或“daa”包括具有2个烷基链r和r的化合物，r和r都独立地具有2至30个碳。烷基可为饱和的或具有不同的不饱和度。

优选地，peg-daa结合物是peg-二癸氧基丙基(c10)结合物、peg-二月桂基氧基丙基(c12)结合物、peg-二肉豆蔻氧基丙基(c14)结合物、peg-二棕榈氧基丙基(c16)结合物或peg-二硬脂氧基丙基(c18)结合物。在这些实施例中，peg的平均分子量优选地是750或2，000道尔顿。在特定实施例中，peg的末端羟基经甲基取代。

除上述以外，可使用其它亲水性聚合物代替peg。可用于代替peg的合适聚合物的实例包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

在一些实施例中，脂质结合物(例如，peg-脂质)占粒子中所存在的总脂质的0.1摩尔％至2摩尔％、0.5摩尔％至2摩尔％、1摩尔％至2摩尔％、0.6摩尔％至1.9摩尔％、0.7摩尔％至1.8摩尔％、0.8摩尔％至1.7摩尔％、0.9摩尔％至1.6摩尔％、0.9摩尔％至1.8摩尔％、1摩尔％至1.8摩尔％、1摩尔％至1.7摩尔％、1.2摩尔％至1.8摩尔％、1.2摩尔％至1.7摩尔％、1.3摩尔％至1.6摩尔％或1.4摩尔％至1.5摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。在其它实施例中，脂质结合物(例如，peg-脂质)占粒子中所存在的总脂质的0摩尔％至20摩尔％、0.5摩尔％至20摩尔％、2摩尔％至20摩尔％、1.5摩尔％至18摩尔％、2摩尔％至15摩尔％、4摩尔％至15摩尔％、2摩尔％至12摩尔％、5摩尔％至12摩尔％或2摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

在其它实施例中，脂质结合物(例如，peg-脂质)占粒子中所存在的总脂质的4摩尔％至10摩尔％、5摩尔％至10摩尔％、5摩尔％至9摩尔％、5摩尔％至8摩尔％、6摩尔％至9摩尔％、6摩尔％至8摩尔％、或5摩尔％、6摩尔％、7摩尔％、8摩尔％、9摩尔％或10摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。

本发明的脂质粒子中所存在的脂质结合物(例如，peg-脂质)的百分比是目标量，并且配制品中所存在的脂质结合物的实际量可变化例如±2摩尔％。所属领域的一般技术人员应了解，脂质结合物的浓度可根据所采用的脂质结合物和脂质粒子变得促融的速率而变化。

通过控制脂质结合物的组成和浓度，有人可控制脂质结合物从脂质粒子交换出的速率并且，继而可控制脂质粒子变得促融的速率。另外，可使用其它变量改变和/或控制脂质粒子变得促融的速率，包括例如ph、温度或离子强度。在阅读本公开内容后，可用于控制脂质粒子变得促融的速率的其它方法将变得对所属领域的技术人员显而易见。另外，通过控制脂质结合物的组成和浓度，有人可控制脂质粒度。

用于投与的组合物和配制品

本公开内容的核酸-脂质组合物可通过多种途径投与，例如经由静脉内、肠胃外、腹膜内或局部途径实现全身递送。在一些实施例中，可在细胞内，例如在如肺或肝脏等目标组织的细胞中或在发炎组织中递送sirna。在一些实施例中，本公开内容提供一种用于活体内递送sirna的方法。可将核酸-脂质组合物静脉内、皮下或腹膜内投与个体。在一些实施例中，本公开内容提供活体内递送干扰rna至哺乳动物个体的肺的方法。

在一些实施例中，本公开内容提供一种治疗哺乳动物个体的疾病或病症的方法。治疗有效量的本公开内容的含有核、阳离子脂质、两亲分子、磷脂、胆固醇和peg连接的胆固醇的组合物可投与患有与可通过所述组合物减少、降低、下调或沉默的基因的表达或过度表达相关联的疾病或病症的个体。

可通过多种粘膜投与模式，包括通过经口、经直肠、经阴道、鼻内、肺内或透皮或经皮递送，或通过局部递送至眼、耳、皮肤或其它粘膜表面而向个体投与本公开内容的组合物和方法。在本公开内容的一些方面中，粘膜组织层包括上皮细胞层。上皮细胞可为肺部、气管、支气管、肺泡、鼻、口腔、表皮或胃肠道上皮细胞。本公开内容的组合物可使用常规致动器(如机械喷雾装置)以及加压、电激活或其它类型的致动器投与。

本公开内容的组合物可在水溶液中以经鼻或肺部喷雾形式投与，并且可通过所属领域的技术人员已知的各种方法以喷雾形式分配。本公开内容的组合物的肺部递送是通过投与可例如经气溶胶化、雾化或喷雾而呈滴剂、粒子或喷雾形式的组合物来实现。组合物的粒子、喷雾或气溶胶可呈液体或固体形式。优选的用于以经鼻喷雾形式分配液体的系统公开在美国专利第4,511,069号中。这类配制品可便利地通过将根据本公开内容的组合物溶解于水中以制造水溶液并且使得所述溶液无菌而制备。配制品可存在于多剂量容器中，例如在美国专利第4,511,069号中所公开的密封分配系统中。其它合适的经鼻喷雾递送系统已描述于透皮全身性药物(transdermalsystemicmedication)，y.w.chien编，纽约爱思唯尔出版社(elsevierpublishers，newyork)，1985；和美国专利第4,778,810号中。额外气溶胶递送形式可包括例如压缩空气、喷射、超声和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮于医药溶剂(例如水、乙醇或其混合物)中的生物活性剂。

本公开内容的经鼻和经肺喷雾溶液通常包含药物或有待递送的药物，其任选地用表面活性剂，如非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯-80)和一种或多种缓冲液配制。在本公开内容的一些实施例中，经鼻喷雾溶液另外包含推进剂。经鼻喷雾溶液的ph可为ph6.8至7.2。所采用的医药溶剂也可为ph4-6的微酸性水性缓冲液。可添加其它组分以增强或维持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。

在一些实施例中，本公开内容是一种医药产品，其包括含有本公开内容的组合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻内喷雾或气溶胶的致动器。

本公开内容的组合物的剂型可为液体，呈滴剂或乳液形式或呈气溶胶形式。

本公开内容的组合物的剂型可为固体，其可在投与之前在液体中复原。固体可以粉末形式投与。固体可呈胶囊、片剂或凝胶形式。

为了配制在本公开内容内用于经肺递送的组合物，可将生物活性剂与多种药学上可接受的添加剂以及用于分散活性剂的基质或载剂组合。添加剂的实例包括ph控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸和其混合物。其它添加剂包括局部麻醉剂(例如，苯甲醇)、等张剂(例如，氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制剂(例如吐温80)、溶解度增强剂(例如，环糊精和其衍生物)、稳定剂(例如，血清白蛋白)和还原剂(例如，谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液体时，如参照视为单位的0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力所测量，配制品的张力通常调节至在投与位点处将基本上不诱发粘膜的不可逆组织损伤的值。一般来说，溶液的张力调节至1/3至3、更通常1/2至2并且最通常3/4至1.7的值。

生物活性剂可分散于基质或媒剂中，所述基质或媒剂可包含具有分散活性剂和任何所需添加剂的能力的亲水性化合物。基质可选自广泛范围的合适载剂，其包括(但不限于)聚羧酸或其盐、羧酸酐(例如，顺丁烯二酸酐)与其它单体(例如，(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物；亲水性乙烯聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；纤维素衍生物，如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等；和天然聚合物，如壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、透明质酸和其无毒性金属盐。通常，选择可生物降解的聚合物作为基质或载剂，例如聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙醇酸)共聚物和其混合物。或者或另外，可使用合成脂肪酸酯作为载剂，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。亲水性聚合物和其它载剂可单独或组合使用，并且可通过部分结晶、离子键结、交联等等赋予载剂增强的结构完整性。载剂可以各种形式提供，包括流体或粘稠溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球体和膜，以便直接施用于鼻粘膜。在此情形中使用所选载剂可促进生物活性剂的吸收。

用于粘膜、经鼻或经肺递送的配制品可含有亲水性低分子量化合物作为基质或赋形剂。这类亲水性低分子量化合物提供通过介质，经由其如生理学活性肽或蛋白质等水溶性活性剂可扩散穿过基质到活性剂所吸附的体表。亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或投与气氛吸收水分并且溶解水溶性活性肽。亲水性低分子量化合物的分子量一般不超过10,000并且优选地不超过3,000。亲水性低分子量化合物的实例包括多元醇化合物，如寡糖、二糖和单糖，包括蔗糖、甘露醇、乳糖、l-阿拉伯糖、d-赤藓糖、d-核糖、d-木糖、d-甘露糖、d-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油、聚乙二醇和其混合物。亲水性低分子量化合物的其它实例包括n-甲基吡咯烷酮、醇(例如，寡聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)和其混合物。

本公开内容的组合物或者可视需要含有药学上可接受的载剂物质以近似生理条件，如ph调节和缓冲剂、张力调节剂和湿润剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和其混合物。对于固体组合物，可使用常规无毒的药学上可接受的载剂，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。

在本公开内容的某些实施例中，生物活性剂可在延时释放配制品中，例如在包括缓慢释放聚合物的组合物中投与。活性剂可与将避免快速释放的载剂一起制备，例如控制释放媒剂，如聚合物、微囊封递送系统或生物粘附性凝胶。本公开内容的各种组合物中活性剂的延长递送可通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝水凝胶和明胶)而实现。

虽然已关于某些实施例描述本公开内容并且已出于说明的目的阐述许多详情，但是本公开内容包括额外实施例并且本文所描述的一些详情可在不脱离本公开内容的情况下显著改变将对所属领域的技术人员显而易见。本公开内容包括这类额外实施例、修改和等效物。具体来说，本公开内容包括各种说明性组分和实例的特征、术语或要素的任何组合。

实例

实例1.

示例性式i化合物提供于表1中。

表1

表1示出了每种化合物的名称和结构、其分子量、其pka和其在下文实例19中所述的分析法中的敲低生物活性(kd)。

示例性式ii和iii化合物提供于表2和3中。

表2

表3

示例性式v化合物提供于表4中。

表4

表1示出了每种化合物的名称和结构、其分子量、其pka和其在下文实例19中所述的分析法中的敲低生物活性(kd)。

实例2.8-溴辛酸甲酯的合成

在n2气氛下，将8-溴辛酸溶解于无水甲醇中。逐滴添加浓h2so4并且回流搅拌反应混合物三小时。

通过薄层色谱监测反应，直到完成为止。在真空下完全去除溶剂。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并且用水洗涤。用乙酸乙酯再萃取水层。用饱和nahco3溶液洗涤总有机层。有机层再用水洗涤并最后用盐水洗涤。产物经无水na2so4干燥并浓缩。

实例3.8，8′-(苯二基)二辛酸二甲酯的合成

获取无水k2co3并且在n2下添加至无水二甲基甲酰胺中。缓慢添加含苯甲胺的二甲基甲酰胺。随后在室温下添加溶解于二甲基甲酰胺中的8-溴辛酸甲酯。将反应混合物加热至80℃并在搅拌下维持反应36小时。

通过薄层色谱监测反应，直到完成为止。将反应产物冷却到室温并且添加水。用乙酸乙酯萃取化合物。用乙酸乙酯再萃取水层。总有机层用水洗涤并最后用盐水溶液洗涤。产物经无水na2so4干燥并浓缩。

通过硅胶柱色谱在3％甲醇/氯仿中纯化反应产物，回收44g纯产物。

使用10％甲醇/氯仿的tlc系统，通过在茚三酮中炭化观测产物以rf：0.8迁移。总产率为82％。化合物为浅棕色液体。通过¹h-nmr确认结构。

实例4.8，8′-氮烷二基二辛酸二甲酯的合成

将8，8′-(苯二基)二辛酸二甲酯转移至氢化玻璃容器，并添加乙醇，接着添加10％pd/c。将反应混合物在帕尔振荡器设备中在50磅/平方英寸[psi]h2气氛压力下在室温下振荡两小时。

反应产物经由硅藻土过滤并且用热乙酸乙酯洗涤。真空浓缩滤液。

实例5.8，8′-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯的合成

将8，8′-氮烷二基二辛酸二甲酯转移至dcm，将et3n添加至反应物质并冷却至0℃。将稀释于dcm中的boc酸酐滴加至以上反应物。在添加完成之后，在室温下搅拌反应混合物三小时。

用水淬灭反应物并分离dcm层。用dcm再萃取水相，合并的dcm层用盐水溶液洗涤并用na2so4干燥。在浓缩之后，收集40g粗化合物。

通过柱色谱使用0-12％乙酸乙酯/己烷纯化粗反应产物。回收产率为48％。在用茚三酮炭化的情况下，单一产物通过薄层色谱在20％乙酸乙酯/己烷中以0.5的rf迁移。

实例6.8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸的合成

将8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯转移至thf。在室温下添加6n氢氧化钠溶液。在室温下在搅拌下维持反应过夜。

在25℃下真空蒸发反应物质以去除thf。用5nhcl酸化反应产物。将乙酸乙酯添加至水层中。用水洗涤分离的有机层并用乙酸乙酯再萃取水层。合并的有机层用盐水溶液洗涤并经无水na2so4干燥。溶液浓缩得到18g粗物质。

实例7.8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯的合成

将8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸溶解于无水dcm中。将hatu添加至此溶液中。在室温下将二异丙基乙胺缓慢添加至反应混合物。内部温度升高至40℃并且形成浅黄色溶液。将dmap添加至反应混合物中，接着添加含顺式-2-壬烯-1-醇溶液的无水dcm。反应物变成棕色。在室温下搅拌反应物五小时。

通过薄层色谱检查反应完全。将水添加至反应产物中，用dcm萃取。dcm层用水洗涤，接着用盐水溶液洗涤。有机层经无水na2so4干燥并浓缩，获得35g粗化合物。

实例8.atx-001的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于无水二氯甲烷(dcm)(200ml)中。在0℃下添加三氟乙酸(tfa)以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将收集的粗产物(12g)溶解于无水dcm(85ml)中。添加三光气，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在n2下蒸馏从反应物质去除dcm溶剂。将反应产物冷却至0℃，用dcm(50ml)、2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫基)乙酸(0.039mol，6.4g)和碳化二亚胺(edc·hci)(0.054mol，10.4g)稀释。随后在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。用0.3mhcl溶液(75ml)稀释反应产物，并分离有机层。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液(75ml)洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到10g粗物质。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为10.5g(68％)。

实例9.atx-002的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(13.85mmol，9g)溶解于无水dcm(150ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将收集的粗产物溶解于无水dcm(85ml)中。添加三光气，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在n2下蒸馏从反应物质去除dcm溶剂。将反应产物冷却至0℃，用dcm(50ml)稀释并添加2-(二甲氨基)乙硫醇hcl(0.063mol，8.3g)，接着添加et3n(无水)。随后在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。用0.3mhcl溶液(75ml)稀释反应产物，并分离有机层。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液(75ml)洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到10g粗物质。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为3.1g。

实例10.atx-003的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.00337mol，2.2g)溶解于无水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并减压浓缩。在氮气下，将收集的粗产物溶解于无水dcm(10ml)中。添加三光气(0.0182mol，5.4g)，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在n2下蒸馏从反应物质去除dcm溶剂。将反应产物冷却至0℃，用dcm(15ml)稀释并添加2-(二甲氨基)丙硫醇hc1(0.0182mol，2.82g)，接着添加et3n(无水)。随后在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。用0.3mhcl水溶液(20ml)稀释反应产物，并分离有机层。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液(50ml)洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到5g粗物质。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为0.9g。

实例11.atx-004的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于dcm(200ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将收集的粗产物8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(5.853mmol，3.2g)溶解于无水二甲基甲酰胺(dmf)中，并添加2-((3-(二甲氨基)丙基)硫基)乙酸(10.48mmol，1.85g)和edc·hcl(14.56mmol，2.78g)。在室温下搅拌反应混合物过夜。将反应物用水(30ml)淬灭并用dcm(30ml)稀释，并且分离有机层。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液洗涤并经无水na2so4干燥。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为1g(24.2％)。

实例12.atx-005的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于无水dcm(200ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将粗反应产物8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(5.853mmol，3.2g)溶解于二甲基甲酰胺(dmf)中。添加2-((3-(二甲氨基)丙基)硫基)乙酸(10.48mmol，1.85g)和edc·hcl(14.56mmol，2.78g)并在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。将反应产物用水(30ml)淬灭并用dcm(30ml)稀释。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液(75ml)洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到5g粗物质。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为1g(24.2％)。

实例13.atx-006的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯溶解于无水dcm(150ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将收集的粗产物溶解于无水dcm(85ml)中。添加三光气，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。在氮气气氛下将粗反应产物溶解于无水dmf中，并添加2-((2-(二乙氨基)乙基)硫基)乙酸(3.93mmol，751mg)和edc·hci(5.45mmol，1.0g)。在室温下搅拌反应混合物过夜。用水(3ml)淬灭反应并在25℃下真空去除过量dmf。用水稀释反应产物并用dcm(20ml)萃取水层三次。合并的有机层用盐水溶液洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到2g粗物质。在通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化之后，产量为1.2g(76％)。

实例14.atx-009的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(13.85mmol，9g)溶解于无水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气气氛下，将8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.909mmol，500mg)溶解于无水dcm(20ml)中。添加三光气，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在氮气气氛下蒸馏从反应物质去除dcm溶剂。将2-(乙基(甲基)氨基)乙-1-硫醇盐酸盐(4.575mmol，715mg)溶解于dmf(7ml)中，并在0℃下将四氢呋喃(thf)(5ml)逐滴添加至含氢化钠悬浮液的thf中。随后在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。用乙酸乙酯和冷水稀释反应产物。用5％hcl(9ml)中和反应物并分离有机层。用乙酸乙酯(etoac)(20ml)再萃取水层，在冷水和盐水中洗涤，将合并的有机层洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到1g粗产物。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化化合物，得到100mg。

实例15.atx-010的合成

将8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(3.079mmol，2g)溶解于无水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引发反应。在搅拌下，使反应温度缓慢升温至室温持续30分钟。薄层色谱显示反应完成。在40℃下真空浓缩反应产物，粗残余物用dcm稀释并用10％nahco3溶液洗涤。用dcm再萃取水层，合并的有机层用盐水溶液洗涤，经na2so4干燥并浓缩。在氮气下，将收集的粗产物溶解于无水dcm(20ml)中。添加三光气(14.55mmol，4.32g)，将反应混合物冷却至0℃并逐滴添加et3n。在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在n2下蒸馏从反应物质去除dcm溶剂。将反应产物冷却至0℃，用dcm(20ml)稀释并添加2-(二甲氨基)乙硫醇hcl(0.063mol，8.3g)，接着添加et3n(无水)。随后在室温下搅拌反应混合物过夜。薄层色谱显示反应完成。用0.3mhcl溶液(20ml)稀释反应产物，并分离有机层。用dcm再萃取水层，合并的有机层用10％k2co3水溶液(20ml)洗涤并经无水na2so4干燥。浓缩溶剂得到10g粗物质。通过硅胶柱(100-200目)使用3％meoh/dcm纯化粗化合物。产量为1.4g(75％)。

实例16.atx-a-4(下文称为atx-031)的合成

实例17.来自表1的atx-011至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030以及表2、3和4的化合物的合成

atx-011至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030、atx-a-1至atx-a-22以及表2、3和4的化合物的合成按照实例1-15的合成，取代其中所描述的合成反应的适当起始成分。

实例18.活体内小鼠因子vii沉默

使用肝脏定向的脂质体文库的活体内筛选，测试促成肝细胞(所述细胞构成肝实质)中高水平sirna介导的基因沉默的一系列化合物。因子vii(一种凝血因子)是适用于分析功能性sirna递送至肝脏的目标基因。因为这种因子是在肝细胞中特定产生，所以基因沉默指示成功递送至实质，与递送至网状内皮系统的细胞(例如库普弗细胞(kupffercell))相反。此外，因子vii是可易于在血清中测量的分泌性蛋白，从而无需对动物进行安乐死。在mrna水平下的沉默可易于通过测量蛋白质水平来测定。这是因为蛋白质的半衰期短(2-5小时)。c57bl/6小鼠(查尔斯河实验室(charlesriverlabs))经由尾静脉注射接受0.006ml/g体积生理盐水或含sirna的脂质体配制品。在投与之后48小时，动物通过吸入异氟醚麻醉并通过眶后放血而将血液采集至血清分离管中。根据制造商的方案，使用生色分析法(biophenfvii，安尼亚拉公司(aniaracorporation))测定样品中因子vii蛋白的血清水平。使用从生理盐水处理的动物采集的血清生成标准曲线。

针对因子vii的具有sirna的组合物是用atx-001、atx-002、atx-003和atx-547以及比较样品nc1和mc3(alnylam)配制。将这些以0.3mg/kg和1mg/kg注射至动物中。在向c57bl6小鼠投与sirna配制品之后，测量由mc3(0.3mg/kg)、nc1(0.3mg/kg)、atx-547(0.3mg/kg)、atx-001(0.3和1.0mg/kg)、atx-002(0.3和1.0mg/kg)和atx-003(0.3和1.0mg/kg)囊封的sirna敲低小鼠血浆中的因子vii的能力。结果显示atx-001和atx-002与对照物相比在0.3mg/kg下最有效(图1和2)。

在向c57bl6小鼠投与sirna配制品之后，测量由mc3(0.3和1.5mg/kg)、nc1(0.3mg/kg)、atx-547(0.1和0.3mg/kg)、atx-004(0.3)、atx-006(0.3和1.0mg/kg)、atx-010(0.3mg/kg)和atx-001(0.3和1.5mg/kg)囊封的sirna敲低小鼠血浆中的因子vii。结果显示atx-001和atx-010最有效(图3和4)。0.3mg/kg或0.05mg/kgatx-018、atx-019和atx-020显示示例性化合物的敲低活性(表1)。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种式ii化合物，

其中

r1和r2都由1至14个碳所组成的直链烷基、或2至14个碳所组成的烯基或炔基组成；

l1和l2都由5至18个碳所组成的直链亚烷基或亚烯基组成，或与n一起形成杂环；

x是s；

l3由键或1至6个碳所组成的直链亚烷基组成，或与n一起形成杂环；

r3由1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基组成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由氢或1至6个碳所组成的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中r1和r2都是烯基。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中r1和r2都是烷基。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中l1和l2都是直链亚烷基。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中l1和l2都是亚烯基。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中l1和l2都由五个碳所组成的直链亚烷基组成。

7.根据权利要求1所述的化合物，其中r3由亚乙基或亚丙基组成。

8.根据权利要求1所述的化合物，其中r4和r5各自由氢、甲基或乙基组成。

9.根据权利要求1所述的化合物，其中l3由键组成。

10.根据权利要求1所述的化合物，其中l3由直链亚烷基组成。

11.根据权利要求1所述的化合物，其中r1和r2都由十个碳所组成的直链烯基组成。

12.根据权利要求1所述的化合物，其选自式1)至12)的化合物：

13.一种式iii或iv化合物，

其中

r1由具有12至20个碳的支链烷基组成，

r2由具有5至10个碳的直链烷基或具有12至20个碳的支链烷基组成，

l1和l2各自由键或具有1至3个碳原子的直链烷基组成，

x由s或o组成，

l3由键或1至6个碳所组成的亚烷基组成，

r3由1至6个碳所组成的直链或支链亚烷基组成，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由1至6个碳所组成的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

14.根据权利要求13所述的化合物，其中l3由键组成。

15.根据权利要求17所述的化合物，其中l3由亚烷基组成。

16.根据权利要求13所述的化合物，其中x由s组成。

17.根据权利要求13所述的化合物，其中r3由亚乙基组成。

18.根据权利要求13所述的化合物，其中r3由亚正丙基或亚异丙基组成。

19.根据权利要求13所述的化合物，其中r4和r5各自由甲基、乙基或异丙基组成。

20.根据权利要求13所述的化合物，其中l1和l2各自由键组成。

21.根据权利要求13所述的化合物，其中l1和l2各自由直链亚烷基组成。

22.根据权利要求13所述的化合物，其中l1和l2各自由亚甲基组成。

23.根据权利要求13所述的化合物，其中r2由直链烷基组成。

24.根据权利要求13所述的化合物，其中r2由支链烷基组成。

25.根据权利要求24所述的化合物，其中所述支链烷基由19或20个碳原子组成。

26.根据权利要求24所述的化合物，其中所述支链烷基由13或14个碳原子组成。

27.根据权利要求13所述的化合物，其中l3由亚甲基组成，r3由亚乙基组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

28.根据权利要求13所述的化合物，其中l3由键组成，r3由亚乙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

29.根据权利要求13所述的化合物，其中l3由键组成，r3由亚正丙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

30.根据权利要求13所述的化合物，其中l3由键组成，r3由亚异丙基组成，x由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

31.根据权利要求13所述的化合物，其选自式atx-b-1至atx-b-12的化合物：

32.一种式v化合物，

其中

r1由1至20个碳所组成的直链或支链烷基、或2至12个碳所组成的烯基或炔基、或胆固醇基组成；

r2由1至20个碳所组成的直链或支链烷基或2至20个碳所组成的烯基组成；

l1由3至9个碳所组成的直链烷基组成，或当r1由胆固醇基组成时，l1由3至4个碳所组成的直链亚烷基或烯基组成；

x1由-o-(co)-或-(co)-o-组成；

x2由s或o组成；

l2由键或具有1至6个碳的直链亚烷基组成；

r3由具有1至6个碳的直链或支链亚烷基组成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由具有1至6个碳的直链或支链烷基组成；

或其药学上可接受的盐。

33.根据权利要求32所述的化合物，其中x1由-o-(co)-组成。

34.根据权利要求32所述的化合物，其中x2由s组成。

35.根据权利要求32所述的化合物，其中r3由亚乙基组成。

36.根据权利要求32所述的化合物，其中r3由亚正丙基或亚异丙基组成。

37.根据权利要求32所述的化合物，其中r4和r5各自由甲基、乙基或异丙基组成。

38.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由键组成。

39.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由亚甲基组成。

40.根据权利要求32所述的化合物，其中r2由烷基组成。

41.根据权利要求32所述的化合物，其中r1和r2都由支链烷基组成。

42.根据权利要求41所述的化合物，其中所述支链烷基由19或20个碳原子组成。

43.根据权利要求41所述的化合物，其中所述支链烷基由13或14个碳原子组成。

44.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由亚甲基组成，r3由亚乙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2是s，并且r4和r5都由甲基组成。

45.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由键组成，r3由亚乙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

46.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由键组成，r3由亚正丙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

47.根据权利要求32所述的化合物，其中l2由键组成，r3由亚异丙基组成，x1由-o-(co)-组成，x2由s组成，并且r4和r5都由甲基组成。

48.根据权利要求32所述的化合物，其选自由式atx-a-1至atx-a-22的化合物组成的群组：