激酶抑制剂的阳离子脂质体，其与siRNA构成组合物以及制备方法与流程

本发明属于肿瘤基因治疗药物领域，具体涉及aurora-a激酶抑制剂xy-4阳离子脂质体，以及该脂质体和bcl-xlsirna联合组成组合物，以及应用于抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物制备方面的用途。

背景技术：

在化学治疗药物的应用方面，药物的水溶性差对一个药物来说是一个很棘手的问题。近年来，有不少科研工作者为解决这一问题进行了大量的研究工作，脂质体作为给药载体可以有效的实现药物的靶向，提高药物的局部浓度，延长药物作用时间，增强对肿瘤的杀伤力，减少对正常细胞的毒副作用，被用于传递化疗药物和诊断材料的载体，以此来增加药物的溶解度、减小系统的毒性并增加药物循环时间。而阳离子脂质体可以解决脂质体进入普通脂质体进入细胞的量少的问题。

基因传递(genedelivery)是一种将外源性的小干扰rna(sirna)导入癌细胞中沉默其抗凋亡基因的表达从而促进肿瘤细胞凋亡达到治疗癌症的方法。一般来说，基因传递系统载体可以分为两类，分别是病毒载体和非病毒载体。非病毒载体与病毒载体相比表现出生物可降解性、低毒性、易转染等优点。在所有非病毒载体中，阳离子脂质体又被认为是最高效的基因传递载体之一。

靶向药物和基因的联合转运治疗是一种利用载体将目的基因和药物高效传递到靶细胞或把组织中适时释放出药物和基因以达到协同治疗目标的生物学治疗方法。在同一载体系统中联合转运药物和sirna作用于癌细胞比单独转运sirna或药物进行治疗更有效。目前联合转运的想法已被提出，在同一个输送系统中联合转运药物和sirna有望解决癌细胞容易产生的多重耐药性的问题。目前，构建一种安全高效的用于联合转运的载体已成为研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中化学治疗药物水溶性差、毒副作用大、容易产生耐药性的不足，提供一种阳离子脂质体。特别可以是激酶抑制剂的阳离子脂质体。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种药物阳离子脂质体，其组成包括阳离子类脂和脂溶性药物，其中所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为100:1～1:1。

抗肿瘤的化学药物单独使用经常会出现药物的耐药性以至于达不到想要的治疗效果，本发明提供的阳离子脂质体很好的解决了药物的水不溶性问题，且制备简单、方便，具有缓释的作用，在物理学表征和体外生物学研究中针对该方法协同抗肿瘤效果的实验已得到良好的评价效果。具体的研究表明阳离子脂质体对药物的具有非常高的包封率，复合载体对化合物xy-4(下述aurora-a激酶抑制剂化合物，变化xy-4)的包封率均大于80％，经过脂质体包封，药物利用率提高，用量减少，耐药性的产生可以得到减少/降低。

进一步，所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为20:1～10:1，更优选20:1。

进一步的，所述阳离子类脂为dotap，阳离子脂质体用磷脂，cas号132172-61-3，其结构如下：

进一步，所述脂溶性药物为抗肿瘤药物或抗肿瘤化合物。优选为aurora-a激酶抑制剂。更优选，所述抗肿瘤药物/抗肿瘤化合物结构式如下：

进一步，所述阳离子脂质体的粒径小于200nm，最小可达到100nm以下。并且，在水中呈单分散状态，能有效提高药物的转运效率，是现代技术未能达到的效果。

本发明的另一目的是提供制备上述激酶抑制剂阳离子脂质体的方法。

一种制备上述药物阳离子脂质体的方法，包括如下步骤：

(1)称取阳离子类脂和脂溶性药物，优选为脂溶性抗肿瘤药物，加入有机溶剂溶解。所述阳离子类脂优选为dotap。所述有机溶剂优选为氯仿。

(2)40-70℃蒸发干燥得到脂质体膜，优选为旋转蒸发干燥。氯仿沸点为61.2℃，优选45-61℃旋转蒸发得到脂质体膜。最好是，55±2℃水浴真空旋转蒸发1h得脂质体膜，并干燥。

(3)在脂质体膜中加入50-60℃水，旋转水化，得到药物阳离子脂质体溶液。优选加入超纯水55±2℃水浴旋转水化20-40min，优选30min，得药物阳离子脂质体溶液。

上述制备过程中，按配比将阳离子脂质体和脂溶性药物在脂溶性有机溶剂中混合完全溶解后，旋转蒸发完全除去有机溶剂后，瓶壁上形成一层薄膜，再加水水化得药物脂质体。制备方法简单易行，可以将脂溶性药物包封到脂质体中，完成药物和脂质体的完美复合，实现新的具有脂溶性易进入细胞组织的缓释药物。

本发明的另一目的是提供一种上述激酶抑制剂阳离子脂质体和sirna构成组合物。

一种组合物，包括上述药物阳离子脂质体和sirna；药物阳离子脂质体中的药物和sirna的摩尔比为1000:1～25：1。

其中，药物阳离子脂质体的组成包括阳离子类脂和脂溶性药物，所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为100:1～1:1。

具有抗肿瘤药物的阳离子脂质体与sirna构成组合物，实现了高效率的联合转运复合载体，解决了抗肿瘤化合物的水不溶的问题，使得药物的利用率提高，且毒性低、转染效率高，且因为在同一个系统中联合转运药物和sirna有效克服肿瘤细胞的耐受性，包括癌细胞容易产生的多重耐药性。可以在极低的药物浓度范围内实现高效的治疗效果，并兼具缓释功效，延长药物作用时间，增强治疗效果。

上述组合物中药物阳离子脂质体与sirna联合使用在制备抗癌药物中，脂质体和sirna联合应用或在输送抗癌药物和肿瘤治疗基因药物中，制备得到的是复方复合制剂。将具有抗癌活性的脂溶性药物按照本发明的方法制备成阳离子脂质体并与sirna联合使用，用于癌症的治疗，不仅可以克服脂溶性药物的溶解性问题，还可以使抗癌药物与sirna达到联合治疗癌症的效果，更有效克服肿瘤细胞的耐受性包括联合转运可以有效克服癌细胞容易产生的多重耐药性。

优选的，所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为20:1～10:1，更优选20:1。

优选的，所述的药物脂质体中的药物和sirna的摩尔比为800:1～25:1，更优选400:1。

进一步的，所述阳离子类脂为dotap，阳离子脂质体用磷脂，cas号132172-61-3，其结构如下：

进一步，所述阳离子脂质体的粒径小于200nm，最小可达到100nm以下。并且，在水中呈单分散状态，与sirna联用能有效提高药物和基因的转运效率，能够有效的吸附承载sirna成为复合药物制剂，是现代技术未能达到的效果。

进一步，所述脂溶性药物优选为抗肿瘤化合物。

进一步，所选抗肿瘤药物为自主合成aurora-a激酶抑制剂，编号xy-4。本发明的阳离子脂质体具有对药物的高包封率，复合载体对化合物xy-4的包封率均大于80％。

进一步，所述抗肿瘤化合物结构式如下：

进一步，上述技术方案中，sirna为bcl-xlsirna。阳离子脂质体的粒径小，在水中呈单分散状态，与sirna联用后，借助于静电吸附作用，能有效实现对于小干扰rna基因的转运效率。

本发明的另一目的是提供制备上述组合物的方法，对于上述技术方案中所述的组合物的制备方法。

一种制备上述组合物的方法，包括如下步骤：

(1)称取阳离子类脂和脂溶性药物，优选为脂溶性抗肿瘤药物，加入有机溶剂溶解。所述阳离子类脂优选为dotap。所述有机溶剂优选为氯仿。

(2)40-70℃蒸发干燥得到脂质体膜，优选为旋转蒸发干燥。氯仿沸点为61.2℃，优选45-61℃旋转蒸发得到脂质体膜。最好是，55±2℃水浴真空旋转蒸发1h得脂质体膜，并干燥。

(3)在脂质体膜中加入50-60℃水，旋转水化，得到药物阳离子脂质体溶液。优选加入超纯水55±2℃水浴旋转水化20-40min，优选30min，得药物阳离子脂质体溶液。

(4)将上述制得的药物阳离子脂质体与sirna按配比混合，室温孵育10-30min，优选15～20min，得到联合使用的复合载体。

单独的抗肿瘤药物容易产生耐药性，不能很好的发挥治疗作用。而采用小干扰rna(sirna)将肿瘤相关基因(抗凋亡基因)沉默的方法，能够避免了药物的耐药性，但单独使用的sirna面临一个如何导入细胞的问题。本发明将药物阳离子脂质体与sirna联合在一起，制成抗肿瘤的组合物(复方制剂)，既解决了抗肿瘤的化学药物单独使用经常会出现药物的耐药性，sirna难以导入细胞的问题。通过两者治疗效果的协同配合达到理想的治疗效果。

原理如下：抗肿瘤药物的阳离子药物被制备成表面带正电荷的阳离子脂质体，其表面的正电荷通过静电作用与sirna结合形成一种复合物。这种复合物与带负电荷的细胞膜结合进入细胞，同时释放药物和sirna，二者达到完美的协同抗肿瘤的作用。

本发明将有望成功开发出一种药物和sirna联合使用协同抗肿瘤的新的肿瘤治疗方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的有益效果：本发明提供了一种药物阳离子脂质体与sirna联合使用抗肿瘤的方法。抗肿瘤的化学药物单独使用经常会出现药物的耐药性以致于达不到想要的治疗效果，而采用小干扰rna(sirna)将肿瘤相关基因沉默的方法则很好地避免了药物的耐药性，但单独使用的sirna面临一个如何导入细胞的问题。

本发明将抗肿瘤的阳离子药物制备成一种表面带正电荷的阳离子脂质体，其表面的正电荷通过静电作用与sirna结合形成一种复合物，再与带负电荷的细胞膜结合进入细胞，释放药物和sirna，二者达到协同抗肿瘤的作用。

此外，本发明提供的阳离子脂质体很好的解决了药物的水不溶性问题，且制备简单、方便，具有缓释的作用，在物理学表征和体外生物学研究中针对该方法协同抗肿瘤效果的实验已得到良好的评价效果。

本发明将有望成功开发出一种药物和sirna联合使用协同抗肿瘤的新的肿瘤治疗方法。

附图说明：

图1a为xy-4阳离子脂质体的粒径检测图；

图1b是xy-4阳离子脂质体的zeta电位检测图。

图2为游离xy-4和xy-4阳离子脂质体的体外释放曲线。

图3为游离香豆素-6、香豆素-6阳离子脂质体和香豆素-6中性脂质体药物组合被b16细胞摄取的情况。

图4为阳离子脂质体、空白脂质体以及游离xy-4对b16细胞的体外生长抑制曲线。

图5为不同比例的xy-4与sirna对b16细胞的生长的抑制效果。

图6为xy-4与sirna比例为400:1，xy-4的药物浓度为2.5～80μmsirna的浓度为6.25～200nm对b16细胞的生长抑制效果。

图7为xy-4与sirna联合使用协同抗肿瘤的凋亡流式图。

图8为xy-4与sirna联合使用协同抗肿瘤的周期流式图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明中未特别说明的比例一般为重量比例。

实施例1xy-4阳离子脂质体的制备

称取40mgdotap和2mgxy-4溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后转移至梨形瓶中，55℃水浴下旋转蒸发1h，将溶剂完全除尽，在瓶壁形成一层薄膜。加入4ml超纯水55℃水浴下水化半小时，最终超纯水定容制得xy-4的阳离子脂质体(0.5mg/ml)。

称取40mgdotap和溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后转移至梨形瓶中，55℃水浴下旋转蒸发1h，将溶剂完全除尽，在瓶壁形成一层薄膜。加入4ml超纯水55℃水浴下水化半小时，最终超纯水定容制得空白的阳离子脂质体。

实施例2xy-4阳离子脂质体的粒径和zeta电位检测

采用激光散射粒度仪(马尔文zen-3600)在25℃，光散射角度90°条件下测定xy-4阳离子脂质体的粒径及zeta电位。用移液枪取20ml实施例1中制备的xy-4阳离子脂质体用超纯水稀释100倍后分别进行粒径和zeta电位检测。

图1a为xy-4阳离子脂质体的粒径检测图，图1b为xy-4阳离子脂质体的zeta电位检测图。结果显示，本发明实施例1制备的xy-4阳离子脂质体的平均粒径在91.3nm，电位为38.5mv。

实施例3xy-4阳离子脂质体体外释放度实验

采用透析法检测xy-4阳离子脂质体的释放情况。将xy-4阳离子脂质体和等浓度游离xy-4溶液装入用pbs浸泡处理过的透析袋(截留分子量mn＝3kda)中并将两端扎紧，放入30ml含0.5％吐温-80的pbs(磷酸盐缓冲液)透析液中。在固定的时间点(2、4、6、8、12、24、48、72h)进行取样并及时补充等量的新鲜透析液，所取样品进高效液相进行分析xy-4的含量。

图2为xy-4阳离子脂质体和游离xy-4的体外释放曲线。结果显示，释放4天后，游离组和脂质体组分别有70％和64％释放出来，且很明显游离组释放更快更多，说明该xy-4阳离子脂质体具有相较于游离xy-4溶液更加缓释的作用。

实施例4xy-4阳离子脂质体包封率检测

采用高效液相色谱法检测xy-4脂质体包封率。

第一步，绘制xy-4标准曲线，色谱条件如下：采用phenomenexgemini5μmc18110a色谱柱子，紫外检测波长设置为230nm，柱温为37℃，流动相为75:25(v/v)甲醇和水。在此条件下将用色谱甲醇配置的一系列浓度梯度xy-4标准品(浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.1μg/μl)依次进样，每个浓度重复进样3次，记录色谱峰并对其进行积分和分析，以峰面积(y)和质量浓度(x)做标准曲线，进行线性回归得出标准曲线方程：y＝7185.4x-11819，r²＝0.9999。

第二步，检测xy-4阳离子脂质体中xy-4的包封率。取500μlxy-4阳离子脂质体加入2ml甲醇充分溶解后过滤在同上述标准曲线相同色谱条件下进样记录色谱峰图并对其进行积分和分析通过标准曲线方程计算，得到脂质体中药物的总量；取100μl超滤离心管离心下的液体，加入甲醇400μl，过滤并按照上述条件进样，记录色谱图进行积分分析并通过标准曲线方程计算得到脂质体中的游离xy-4量，包封率的计算方法为：包封率＝(药物总量-游离药量)/药物总量×100％。实施例1中制备的xy-4阳离子脂质体的包封率为84.6％。

实施例5体外细胞实验

①细胞摄取实验

称取40mgdotap和2mg香豆素-6溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后转移至梨形瓶中，55℃水浴下旋转蒸发1h，将溶剂完全除尽，在瓶壁形成一层薄膜。加入4ml超纯水55℃水浴下水化半小时，最终超纯水定容制得香豆素-6的阳离子脂质体(0.5mg/ml)。

称取40mg大豆卵磷脂(spc)和2mg香豆素-6溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后转移至梨形瓶中，55℃水浴下旋转蒸发1h，将溶剂完全除尽，在瓶壁形成一层薄膜。加入4ml超纯水55℃水浴下水化半小时，最终超纯水定容制得香豆素-6中性脂质体(0.5mg/ml)。

将b16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)按照60000个每孔的密度接种于24孔板，每孔添加0.5ml含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基。37℃、5％co2条件孵箱培养24h后，每孔加入相应的游离香豆素-6及香豆素-6脂质体处理，40min后每孔滴入hoechst染色20min，弃培养基加入1ml生理盐水在荧光显微镜(olympusix73；olympuscorporation,tokyo,japan)下观察并拍照。

图3为香豆素-6的阳离子脂质体和中性脂质体与游离香豆素比较背b16细胞摄取的情况。如图所示，b16细胞被处理后，阳离子香豆素-6脂质体处理组的细胞中的荧光强度明显强于同剂量下游离香豆素-6和中性香豆素-6脂质体处理组的细胞。由此说明，肿瘤细胞对于阳离子脂质体具有更好的摄取作用。

②毒性研究(mtt比色法)

将b16细胞按照每孔4000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs(胎牛血清)和1％双抗的rpmi1640培养基。24h后，将游离xy-4溶液用培养基稀释成不同浓度(40、20、10、5、2.5、1.25μm)的溶液加入孔中，每孔100ml每孔设置3个复孔，空白培养基作为阴性对照组，处理48h后每孔加入10％体积5mg/mlmtt溶液并继续放入培养箱中孵育4h。吸取96孔板中的旧培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)后置于摇床上使蓝紫色甲瓒充分溶解，570nm波长下测定吸光度。

基于mtt比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能是外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞的数量。细胞存活的百分比率(％)的计算公式为：

细胞存活率(％)＝a实验组/a对照×100％

a实验组为测试孔的吸光度值，a对照为阴性对照的吸光度值。

图4为游离xy-4对b16细胞处理后的生长曲线。结果显示游离xy-4对b16细胞的生长具有较明显的抑制作用。

将b16细胞按照每孔4000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs和1％双抗的rpmi1640培养基。24h后，将50nm的bcl-xlsirna分别与40、20、10、5、2.5、1.25μm的xy-4溶液(bcl-xlsirna与xy-4的比例为：1:800、1:400、1:200、1:100、1：50、1:25)在室温下混匀孵育20min后加入96孔板中，每孔100μl，每个浓度设置3个复孔。处理72h后每孔加入10％体积5mg/mlmtt溶液并继续放入培养箱中孵育4h。吸取96孔板中的旧培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)后置于摇床上使蓝紫色甲瓒充分溶解，570nm波长下测定吸光度，计算细胞存活率。

图5为bcl-xlsirna与xy-4在不同比例下联合使用对于b16细胞生长抑制作用的比较。当联合使用的比例为800:1和400:1时，二者对b16黑色素瘤细胞具有明显的协同抗增殖作用。在该比例下，二者联合使用的细胞存活率要比单独使用xy-4或单独使用sirna时要低。并且随着xy-4的量的增加，所显示的协同效应也增加。

将b16细胞按照每孔4000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs和1％双抗的rpmi1640培养基。24h后，sirna的浓度为6.25～200nmxy-4的药物浓度为2.5～80μm，二者比例为1:400，分别用bcl-xlsirna、游离xy-4、bcl-xlsirna+空白阳离子脂质体、bcl-xlsirna+空白阳离子脂质体+xy-4处理细胞。72h后，每孔加入10％体积5mg/mlmtt溶液并继续放入培养箱中孵育4h。吸取96孔板中的旧培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)后置于摇床上使蓝紫色甲瓒充分溶解，570nm波长下测定吸光度，计算细胞存活率。

图6为bcl-xlsirna联合xy-4抑制b16细胞的生长状况。

③细胞周期和凋亡检测实验

将b16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)种植于24孔板中，每孔加入500μl含6×10⁴个细胞的包含10％fbs和1％双抗的rpmi1640培养基。细胞密度达到80-90％时，移去旧培养基，用等量无血清rpmi1640培养基清洗并替换。依次加入本发明制备的xy-4阳离子脂质体(40μm)、游离xy-4(40μm)、xy-4阳离子脂质体+sirna(40μm+100nm)转染48h，以加等量培养基作为空白对照。收集细胞1500r/min离心5min，弃培养液。用pbs洗涤1次并离心去pbs后加入预冷的70％乙醇4℃固定过夜。次日1500r/min离心5min弃固定液后再用预冷pbs洗2遍。每个流式管加入200μlpi染液震荡均匀，避光染色30min。pi用氩离子激发荧光，产生红色荧光分析pi荧光强度的直方图和前散射光对侧散射光的散点图。碘化丙啶(propidiumiodide,pi)是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞能够穿透，并使细胞核染红。用流式细胞分析仪可以定量分析细胞凋亡的情况。

图7是用流式细胞仪检测细胞凋亡的结果，具体为xy-4与sirna联合使用协同抗肿瘤的凋亡流式图。图7a是荧光散射强度直方图，显示xy-4、sibcl-xl-clp、xy-4/sibcl-xl-clp试验组的细胞凋亡率相对于对照组有明显增高，特别是xy-4/sibcl-xl-clp试验组杀死瘤细胞的比率最高。图7b是各个试验组的总细胞凋亡率数据对照图表，显示xy-4/sibcl-xl-clp试验组瘤细胞凋亡率最高。

图8具体为xy-4与sirna联合使用协同抗肿瘤的周期流式图。图8a是瘤细胞停留在不同的细胞周期的荧光测试结果，xy-4试验组的测试结构荧光分析强度显著的低于对照组的情况。图8b是对照组和xy-4试验组的细胞周期分布对比，显示xy-4能够很好的将瘤细胞分裂停留在g2-m，进而达到对于瘤细胞的凋亡杀灭作用。