具有增强的抑制性质的抗TRKA抗体及其衍生物用于治疗骨相关疼痛的制作方法

发明领域本发明一般涉及抗trka受体抗体及其用途，包括人源化抗trka抗体，和使用抗trka抗体治疗的方法。一方面，本发明涉及具有增强的抑制性质的人源化抗trka抗体用于治疗神经瘤和/或骨相关疼痛的方法。再一方面，本发明涉及具有增强的抑制性质的人源化抗trka抗体，其包含重链可变区、轻链可变区、人轻链恒定区和人igg4重链恒定区变体，所述抗体表现出改变的交换性质。发明背景神经营养因子(neurotrophin)属于肽生长因子家族(bardeya(1994)j.neurobiol.25(11):1329-33)，结构上与ngf家族第一成员相关(levi-montalcinir(1987)emboj.6(5):1145-54)。神经营养因子调节外周神经元和中枢神经系统的神经元分化和存活、以及突触传递。此外，nfg在多种非神经元组织和细胞，例如免疫细胞上起作用。nfg通过存在于靶细胞中的两个膜受体起作用，低亲和力p75受体，和具有酪氨酸激酶活性的140kda高亲和力跨膜糖蛋白trka(kaplandretal.,(1991)science252(5005):554-8；kleinretal.,(1991)cell65(1):189-97)。trka在神经嵴的神经元中、在交感神经元中、以及在基底前脑和纹状体的胆碱能神经元中表达，在这些位置其是ngf活性的关键介质(holtzmandmetal.,(1992)neuron9(3):465-78；vergevmetal.,(1992)j.neurosci.12(10):4011-22)。trka也在一些非神经元组织和细胞，包括b淋巴细胞中表达(torciametal.,(1996)cell85(3):345-56)。神经生长因子(ngf)最初作为发育的神经系统中感觉和交感神经元的存活因子被鉴定(gorinpd&johnsonem(1979)pnasusa,76(10):5382-6)。在成体中，ngf不是生存所必需的，但在几种急性和慢性疼痛状态中对于疼痛和痛觉过敏的产生具有关键作用。ngf在损伤的和发炎的组织中高表达，并且伤害感受神经元上trka的激活可以通过多种机制触发和强化疼痛信号传导。在动物模型中炎症相关疼痛可以通过中和ngf生物活性而显著降低(woolfcjetal.,(1994)neuroscience62(2):327-31；mcmahonsbetal.,(1995)nat.med.1(8):774-80；koltzenburgmetal.,(1999)eur.j.neurosci.11(5):1698-704)，提示该神经营养因子水平的增加是产生该完全的痛觉过敏反应所必需的。值得注意的，其他神经营养因子的抑制不导致对该诱导的痛觉过敏的拮抗作用，提示该效应特异于ngf(mcmahonsbetal.,(1995)nat.med.1(8):774-80)；此外，ngf抑制也在不同的神经病理性相关疼痛过程中导致镇痛作用(koltzenburgmetal.,(1999)eur.j.neurosci.11(5):1698-704；rolsetal.,(1999)pain79(2-3):265-74；theodosioumetal.,(1999)pain,81(3):245-55；christensenmd&hulseboschce(1997)exp.neurol.147(2):463-75)。在疼痛治疗上存在尚未满足的巨大医学需求。主要的镇痛药类别，非类固醇抗炎药(nsaid)和阿片类药物，因其功效和耐受性而受限(heftiffetal.,(2006)trendspharmacol.sci.27(2):85-91)。不足30％的慢性疼痛患者可以使用目前的治疗获得充分的缓解，而且存在许多副作用，尤其是在长期施用的情况下(kalsoeetal.,(2004)pain112(3):372-80)。认识到ngf在成体的疼痛机制中具有中心作用，使得有机会开发一种全新的疼痛疗法。靶向trka而非ngf可以是一种更好的治疗选择，因为该受体不干扰由p75受体介导的ngf功能(p75受体在神经发育中具有广泛的功能)。本发明人评价了在深部躯体疼痛，尤其是骨相关疼痛的治疗方法中使用人源化抗trka抗体的功效和安全性，其中所述骨相关疼痛可以是例如由外部创伤所致的骨损伤引起的疼痛、或由累及骨的病变导致的疼痛(例如可以导致骨损伤的癌症)、或由导致骨相关疼痛的不适当神经支配和/或其他影响引起的疼痛。本发明人还评价了在治疗神经瘤引起的疼痛的方法中使用人源化抗trka抗体的功效和安全性，其中所述神经瘤因创伤或其他病变而不当形成。发明概述本公开一般地涉及人源化抗trka抗体、其制备和使用方法。一方面，本公开提供人源化抗trka抗体或其片段，其包含：a)包含选自seqidno:1-5的序列的重链可变结构域；和b)包含选自seqidno:6-13的序列的轻链可变结构域，其中重链可变结构域的cdr2包含至少一个氨基酸取代，和/或其中重链可变结构域的非cdr区在选自由37、42和89组成的组的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置利用kabat中所述的编号系统给出。在再一方面，本公开提供编码人源化抗trka抗体或其片段的分离核酸、包含该分离核酸的载体、和包含该分离的核酸或载体的宿主细胞。本公开还提供产生人源化抗trka抗体或其片段的方法。在其他方面，本公开提供包含人源化抗trka抗体或其片段的组合物和包含与治疗剂连接的人源化抗trka抗体或其片段的免疫缀合物。尤其是，本发明涉及与人trka结合的人源化抗trka抗体或其片段用于治疗骨相关疼痛，其中所述抗trka抗体或其片段包含重链可变结构域1、2和3以及轻链可变结构域1、2和3，且重链可变结构域包含选自seqidno:1-5的序列，轻链可变结构域包含选自seqidno:6-13的序列，其中重链可变结构域的非cdr区在选自由37、42和89组成的组的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置利用kabat中所述的编号系统给出。在其他方面，本公开提供人源化抗trka抗体或其片段、组合物或免疫缀合物，用于药物、用于治疗疼痛、用于治疗慢性疼痛、用于治疗急性疼痛、用于治疗与以下一项或多项相关的疼痛：胰腺炎、肾结石、子宫内膜异位、ibd、克罗恩氏病、术后粘连、胆囊结石、头疼、痛经、肌肉骨骼疼痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、术后疼痛、偏头疼、三叉神经痛、来自烧伤和/或伤口的疼痛、与创伤相关的疼痛、神经病理性疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、关节周围病变、肿瘤疼痛、来自骨转移的疼痛、hiv感染，用于治疗癌症、神经元病症、阿尔茨海默病、糖尿病、糖尿病性肾病、病毒病症、hiv介导的病症、麻疯、或炎症，以及用于诊断或预后。在再一方面，本公开涉及用于治疗深部躯体疼痛(deepsomaticpain)，尤其是骨相关疼痛的方法，其至少包括步骤：向有需要的个体施用有效量的本发明人源化抗trka抗体或其片段。根据本发明，骨相关疼痛旨在指，个体因与一个或多个骨相关的损伤、退化或任何病变而经历的任何疼痛感觉。疼痛可以表现为麻木感、麻刺感、蠕痛感、热感或冷感、或紧缩感、钝痛例如压迫或紧缩感、闷痛感、或麻刺感，锐痛例如戳、击、撕裂或穿刺疼痛，疼痛可以是持续的、跳动的、或时间间隔规则或不规则的间歇性的，或仅在该区域被触碰时出现。更特别地，骨相关疼痛可以是骨折(bonefrature)、骨裂(bonechip)、骨断(bonebreak)、或任何其他损失或炎症的后果。这可以因意外事件引起，或因过度使用或重复移动损伤处所致，或由骨衰弱引起，所述骨衰弱可以因激素缺乏、感染、骨癌、转移性恶性肿瘤、白血病、骨髓瘤或其他累及血液或骨相关细胞的癌症、或因骨供血中断导致。根据本发明，骨相关疼痛可以是累及骨的病变的后果。累及骨的病变是指，直接或间接地影响个体的一个或多个骨从而导致疼痛感觉的任何病变。病变的例子包括癌症、感染、和免疫系统功能障碍。尤其是，骨相关疼痛可以与骨癌，尤其是继发性骨癌和/或转移性癌细胞相关，或由其导致。备选地，骨相关疼痛可以由一个或多个神经瘤引起，尤其是由骨癌或任何其他病变导致的神经瘤。特别地，本发明方法包括，施用有效量的本发明人源化抗trka抗体或其片段，以最小化或减少异常神经萌芽和/或神经瘤的形成或大小。根据本发明，有效量的人源化抗trka抗体或其片段旨在指，当由临床医师或其他有资格的医药从业人员施用给个体时，在该有需要的个体中足以导致一种或多种疼痛感觉得以缓解或停止的量。再一方面，本公开涉及本发明人源化抗trka抗体或其片段用于治疗深部躯体疼痛，尤其是骨相关疼痛或神经瘤相关疼痛。更特别地，骨相关疼痛可以是骨折、骨裂、骨折断、或任何其他损失或炎症的后果。这可以因意外事件引起，或因过度使用或重复移动损伤处所致，或由激素缺乏、感染、骨癌、转移性恶性肿瘤、白血病、骨髓瘤或其他累及血液或骨相关细胞的癌症或骨供血中断导致的骨衰弱引起。根据本发明，骨相关疼痛可以由累及骨的病变引起。累及骨的病变是指，直接或间接地影响个体的一个或多个骨从而导致疼痛感觉的任何病变。病变的例子包括癌症、感染、和免疫系统功能障碍。尤其是，骨相关疼痛可以与骨癌，尤其是继发性骨癌和/或转移性癌细胞相关，或由其导致。备选地，骨相关疼痛可以由一个或多个神经瘤引起，尤其是由骨癌或任何其他病变导致的神经瘤。特别地，本发明涉及，在治疗中使用本发明人源化抗trka抗体或其片段，以最小化或降低异常神经萌芽和/或神经瘤的形成或大小。再一方面，本公开提供治疗炎性疼痛(inflammatorypain)、骨关节炎疼痛(osteoarthriticpain)和神经病理性疼痛(neuropathicpain)的方法。一方面，在体内急性炎性痛觉过敏模型中，以0.01mg/kg剂量施用人源化抗trka抗体导致了急性炎性痛觉过敏的显著逆转。另一方面，在体内慢性炎性痛觉过敏模型中，以0.01mg/kg剂量施用人源化抗trka抗体导致了慢性炎性痛觉过敏的显著和持续逆转。另一方面，在体内慢性骨关节炎痛觉过敏模型中，以0.01mg/kg剂量施用人源化抗trka抗体导致了慢性骨关节炎痛觉过敏的显著和持续逆转。再一方面，在体内神经病理性疼痛的慢性压迫性损伤模型中，以1.0mg/kg剂量施用人源化抗trka抗体导致了神经病理性疼痛的显著逆转。再一方面，本公开提供包含人源化抗trka抗体或其片段、组合物或缀合物的制品。再一方面，本公开提供包含人源化抗trka抗体或其片段、组合物或缀合物的药盒。由于蛋白质比传统的有机和无机药物更大且更复杂，这也引发了与生产稳定有效的含抗体药物制剂相关的特殊问题。为了使蛋白保留生物学活性，制剂必须完好地保存蛋白氨基酸的至少核心序列的构象完整性，并同时保护蛋白的多个功能基团不被降解。蛋白质降解途径可以涉及化学不稳定性(即，任何涉及到修饰蛋白质、通过键形成或断裂导致新化学实体的过程)或物理不稳定性(即，蛋白质高级结构的改变)。化学不稳定性可以因脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫键交换引起。物理不稳定性可以因变性、聚集、沉淀或吸附引起。根据本发明再一方面，提供稳定的水性药物制剂，其包含治疗有效量的抗trka抗体、缓冲剂、表面活性剂和张力调节剂(tonicifyingagent)，其中制剂ph为大约5至大约7。根据本发明此方面，抗trka抗体包含：a)包含选自seqidno:1-5的序列的重链可变结构域；和b)包含选自seqidno:6-13的序列的轻链可变结构域，其中重链可变结构域的cdr2包含至少一个氨基酸取代和/或其中重链可变结构域的非cdr区在选自由37、42和89组成的组的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出(kabateaetal.,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationn°91-3242)。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少0.1mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少0.2mg/ml至175mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少1mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少10mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少100mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，抗trka抗体以至少150mg/ml的浓度存在。根据本发明此方面，缓冲剂选自：柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸、磷酸盐、三(三(羟甲基)氨基甲烷)。根据本发明此方面，稳定剂/张力调节剂选自：乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钠、乙酸钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氯化钾、蔗糖、多元醇、糖类、氨基酸例如组氨酸、精氨酸和甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸，胺类和海藻糖。根据本发明此方面，表面活性剂选自：tween20/40/80、聚山梨酸酯20/80、泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠。根据本发明此方面，制剂的ph为5.75。根据本发明此方面，制剂的ph为6.0。根据本发明此方面，制剂还可以包含一种或多种赋形剂和填充剂。根据本发明的一个优选实施方案，提供调节至ph6.0的抗trka抗体的低浓度水性制剂，包含：10mg/ml抗trka抗体；25mm柠檬酸盐；150mmnacl；0.05％tween80。根据本发明的一个优选实施方案，提供调节至ph6.0的抗trka抗体的低浓度水性制剂，包含：至少10mg/ml抗trka抗体；50mm组氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。根据本发明的一个优选实施方案，提供调节至ph5.75或6.0的抗trka抗体的高浓度水性制剂，包含：100mg/ml抗trka抗体；50mm组氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。根据本发明的一个优选实施方案，提供调节至ph5.75或6.0的抗trka抗体的高浓度水性制剂，包含：150mg/ml抗trka抗体；50mm组氨酸；150mmnacl；0.05％tween80。本发明人在开发这些制剂时克服了与一般含蛋白(尤其是抗体)的水性液体制剂相关的问题。在该研究项目过程中尝试的几种备选制剂在5℃、25℃、或40℃缺乏长期稳定性，尤其是在不含上列特定组分组合的几种备选制剂中抗体出现了降解和明显的不稳定性。此外，就可以每剂施用的抗trka抗体量以及剂量数两个方面而言，该皮下施用制剂的开发也增加了可能的给药方案。此外，初步数据还表明，根据本发明的皮下施用制剂是一种通过先前测试的方法和制剂更为有效的施用抗trka抗体的方式。根据本发明的再一方面，以至少0.1mg/kg体重的剂量，尤其是至少0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、或30mg/kg剂量，将制剂施用给有需要的个体。根据本发明再一方面，向有需要的患者施用制剂一次。根据本发明再一方面，向有需要的患者施用制剂，其中两次给药之间间隔至少1小时，优选地两次给药之间间隔至少4小时/6小时/12小时/24小时。根据本发明再一方面，按需向有需要的患者施用制剂。根据本发明再一方面，制剂在5℃稳定至少1年，优选至少2年。根据本发明再一方面，制剂在25℃稳定至少3个月、优选6个月，最优选1年。根据本发明再一方面，制剂在40℃稳定至少1个月、优选3个月。其中稳定性可以使用选自以下的一种或多种方法测量：测定制剂的澄清度、着色度、乳浊度、和微粒杂质(可见颗粒)的变化；280nm波长光吸收测量以确定制剂中存在的蛋白质的浓度；sds-page凝胶显影以确定抗体的重量改变和/或降解；通过elisa确定抗体结合性质的任何变化；通过hplc-cex确定制剂中正/负抗体物质组成的变化；通过hplc-ief，利用毛细管电泳确定制剂中存在的抗体的等电聚焦谱的改变；通过hplc-sec分析，确定制剂中抗体的改变。根据本发明再一方面，制剂包含一定量的抗trka抗体，由此制剂可以以至少0.1mg/kg体重的剂量，尤其是至少0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg,10mg/kg或30mg/kg的剂量，施用给有需要的个体。根据本发明另一方面，还提供治疗个体疼痛的方法，包括施用包含治疗有效量的抗trka抗体的本发明制剂。附图简述图1：抗trka抗体的表面等离子体共振测量。数据表示为反应数(缩写为ru；y轴)vs.时间(x轴)(图1a)mnac13抗体。(图1b)bxhvh5vl1抗体。(图1c)gbrvh5(v37a)vl1抗体。(图1d)gbrvh5(k3q,v37a)vl1抗体。图2：使用差示扫描量热法测量的抗trka抗体热稳定性。数据表示为超额摩尔热容(excessmolarheatcapacity，缩写为cp[kcal/mol/℃]；y轴)vs.温度(x轴)。(图2a)mnac13抗体(fab片段tm是tm1，在74℃)。(图2b)bxhvh5vl1抗体(fab片段tm是tm3，在76.5℃)。(图2c)gbrvh5(v37a)vl1抗体(fab片段tm是tm1，在73.6℃)。(图2d)gbrvh5(k3q,v37a)vl1抗体(fab片段tm是tm1，在73℃)。(图2e)图2c和图2d的叠加。(图2f)图2b和图2d的叠加。(图2g)图2a和图2d的叠加。图3：抗trka抗体的功能生物活性。人源化抗trka抗体对ngf诱导的tf-1细胞增殖的影响；数据表示为％增殖反应(y轴)vs.抗体浓度(μg/ml；x轴)。(图3a)gbrvh5(v37a)vl1,gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.bxhvh5vl1。(图3b)gbrvh5(v37a)vl1,gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.mnac13。(图3c)gbrvh5(k3q,v37a)vl1vs.gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p。(图3d)bxhvh5vl1,bxhvh5vl3,gbrvh5(v37a)vl1vs.gbrvh5(v37a)vl3。(图3e)bxhvh5vl1,bxhvh3vl1,gbrvh5(v37a)vl1vs.gbrvh3(v37a)vl1。图4：人源化抗trka抗体逆转急性炎性爪疼。向amb1小鼠的一只后爪足底注射cfa，诱导急性炎性痛觉过敏，并测量为％同侧(注射的)和对侧(未注射的)爪上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在cfa注射(0hr)后23hr取承重读数，之后在cfa后24hr开始处理，单次i.p.注射0.0001(白色柱)、0.001(水平影线柱)、0.01(格纹柱)和0.1mg/kg(菱形影线柱)抗trka抗体、或0.1mg/kg同种型对照抗体(黑色柱)，之后在给药后4,8,24,48,72,96和120hr测量承重。作为阳性对照，用10mg/kg吲哚美辛(indomethacin)p.o.处理小鼠(垂直影线柱)。图5：人源化抗trka抗体逆转慢性炎性关节疼。通过向amb1小鼠的一个后肢膝关节中关节内注射cfa，诱导关节的慢性炎性痛觉过敏，并测量为％同侧(注射的)和对侧(未注射的)肢上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在临cfa注射前(初次用于实验(naive))和在cfa后第3、7和10天取承重读数，之后在cfa后第13天开始处理，单次i.p.注射0.01(空心正方，虚线)、1(实心三角)和10mg/ml(空心圆)抗trka抗体、或10mg/kg同种型对照抗体(实心圆)，之后在给药后4,8,24,48,72,96hr测量承重(括号中)。作为阳性对照，自第13天起用60mg/kg塞来昔布(celecoxib)一天两次处理小鼠(空心菱形)，在cfa后第13天在给药后1和8hr测量承重，然后在cfa后第14-17天在给药后1hr测量承重。图6：人源化抗trka抗体逆转慢性骨关节炎疼痛。向amb1小鼠的一个后肢膝关节中关节内注射mia，诱导慢性骨关节炎痛觉过敏，并测量为％同侧(注射的)和对侧(未注射的)肢上承受的重量比(％ipsi/contra,平均值±s.e.m.)。在临mia注射前和mia注射后第3、7和10天取基线(bl)承重读数，之后在mia后第14天开始处理，单次i.p.注射1(空心三角)、10(空心菱形)和100μg/kg(实心圆，虚线)抗trka抗体、或10mg/kg同种型对照抗体(实心正方)(图6a)。作为比对物对照，在mia后第14天用曲马多(tramadol)10mg/kg或普瑞巴林(pregabalin)30mg/kgp.o.处理动物，之后在mia后第16-22天每隔一天用曲马多30mg/kg或普瑞巴林100mg/kg处理动物(图6b)。在mia后第14天在给药后4、8和24小时，以及之后对于抗体处理组在每24小时，对于曲马多和普瑞巴林处理组在给药后1和24小时，使用承重评估了所有动物。图7：人源化抗trka抗体逆转神经病理性疼痛。通过慢性压迫性损伤amb1小鼠坐骨神经，诱导慢性神经病理性痛觉过敏和异常性痛觉，并分别测量为爪回缩所需的阈值力(g)和从冷却板缩回爪的延迟时间(sec)。在手术前以及在手术后7天在处理开始(0hr)前当天，取读数。然后单次i.p.注射1000μg/kg同种型对照抗体(实心三角)或10(实心圆),100(实心正方)和1000μg/kg(实心菱形)抗trka抗体，处理动物。在此7天的给药后时期中，每日一次施用普瑞巴林(实心倒三角)30mg/kg/10mlp.o.或盐水(空心圆)。在4h,24h和之后每隔一天直至给药后第7日，记录给药后读数。在所有的日子，在普瑞巴林或盐水给药后1h记录给药后读数。图8：形态度量分析经处理的新生amb1小鼠的右scg(4只小鼠/处理＝4神经节/处理)，所述小鼠自出生后第1日起用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(标记gbr)(三角),tanezumab(正方)或pbs(圆)处理4周。以单因素方差分析(one-wayanova)和dunnett事后检验，与pbs处理比较，进行统计学分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.图9：形态度量分析经处理的成年amb1小鼠的左和右scg(8-9只小鼠/处理＝15-18神经节/处理)，其中所述小鼠用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(标记gbr)(三角),tanezumab(正方)或pbs(圆)处理4周。以单因素方差分析(one-wayanova)和dunnett事后检验，与pbs处理比较，进行统计学分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图10：经处理的成年amb1小鼠的所有scg神经元细胞体的直径的频率曲线，其中所述小鼠用gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(标记gbr)(1904个神经元,圆),pbs(1547个神经元,正方)或tanezumab(1420个神经元,菱形)处理。使用graphpadprism和标准参数进行分箱(bining)。图11：来自pbs处理的成年动物的scg、来自tanezumab处理的动物的scg(最小)、来自gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(标记gbr)处理的动物的scg(最大)的代表性h&e染色切片。黑色箭头标记神经元细胞体。图12：通过慢性压迫性损伤amb1小鼠的坐骨神经诱导神经病理性疼痛。机械痛觉过敏(a)测量为爪回缩所需的阈值力，冷异常性痛觉(b)测量为从冷板回缩脚爪的延迟时间(sec)。处理开始(0h)当天，在手术前(-7d)以及在手术后7天在处理开始(0h)前当天取读数。然后，单次i.p.注射盐水对照(圆)或0.3(三角)和1mg/kg(倒三角)gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(标记gbr)或0.3(正方)和1mg/kg(菱形)tanezumab，处理动物。在4h,第1天以及之后每隔一天直至给药后第9天记录给药后读数，并在给药后第14天记录最终读数。图13：在amb1小鼠膝关节中多次关节内注射cfa，诱导慢性炎性关节疼痛。d0:第一次cfa注射日；d3,d10,d17,d24:第一次cfa注射后第3,10,17和24天。箭头指示在第0,7,14和21天关节内注射(pbs或cfa)。4h,8h,24h,48h,76h,96h和120h:在d24给药后4,8,24,48,76,96和120小时。*:p<0.05,相比于cfa+赋形剂组,单因素方差分析。假模(sham)+赋形剂组(菱形)，n＝6；cfa+赋形剂组(正方)，n＝8；cfa+gbrvh5(k3q,v37a)vl1ighg4s228p(三角)和cfa+tanezumab(交叉)组，n＝10。图14：在骨折后第2,5,7,14和20天，纵向体内监测小鼠。术后值与术前值相关。a)活性评估；b)手术肢的地面反作用力(grf)的分析。结果表示为平均值±sem；n＝5-7；星号表示p<0.05,抗-trkavs.pbs。图15：骨折的股骨以番红-o/快绿染色的代表性组织学切片和骨痂(callus)组成的评价。a-c:pbs-处理,d-f:抗-ngf抗体,g-i:抗-trka抗体；比例尺＝500μm。j-l:在第7(j),14(k)和25(l)天组织形态度量评价骨痂组成。结果表示为平均值±sem；n＝5-8；白色柱：pbs处理，浅灰色柱：抗ngf抗体；黑灰色柱：抗trka抗体。图16：在以pbs、抗ngf抗体或抗trka抗体处理的小鼠中在25天的愈合期后骨折骨痂的抗弯刚度。结果表示为平均值±sem；n＝6-8。图17：低浓度(10mg/ml)制剂在5℃的稳定性数据。图18：低浓度(10mg/ml)制剂在25℃的稳定性数据。图19：低浓度(10mg/ml)制剂在40℃的稳定性数据。图20：高浓度(100mg/ml)制剂a(ph5.75)在5℃的稳定性数据。图21：高浓度(100mg/ml)制剂a(ph5.75)在25℃的稳定性数据。图22：高浓度(100mg/ml)制剂a(ph5.75)在40℃的稳定性数据。图23：高浓度(100mg/ml)制剂b(ph6)在5℃的稳定性数据。图24：高浓度(100mg/ml)制剂b(ph6)在25℃的稳定性数据。图25：高浓度(100mg/ml)制剂b(ph6)在40℃的稳定性数据。图26：高浓度(150mg/ml)制剂a(ph5.75)在5℃的稳定性数据。图27：高浓度(150mg/ml)制剂a(ph5.75)在25℃的稳定性数据。图28：高浓度(150mg/ml)制剂a(ph5.75)在40℃的稳定性数据。图29：高浓度(150mg/ml)制剂b(ph6)在5℃的稳定性数据。图30：高浓度(150mg/ml)制剂b(ph6)在25℃的稳定性数据。图31：高浓度(150mg/ml)制剂b(ph6)在40℃的稳定性数据。发明详述本公开涉及人源化抗trka抗体或其片段、其制备和使用方法。术语"trka",“人trka”,"trka受体"或“人trka受体”在本文中等同使用，如无其它特别说明，意指"人trka"。人trka在本文中包括人trka的变体、同种型、和物种同源物。因此，本公开的抗体可以在一些情况下与来自非人的其它物种的trka交叉反应。在一些实施方案中，抗体可以完全特异于一种或多种人trka蛋白，并可以不显示物种的或其它类型的非人交叉反应性。trka也称作高亲和力神经生长因子受体或神经营养性酪氨酸激酶受体1型或trk1-转化性酪氨酸激酶蛋白或原肌球蛋白相关激酶a或酪氨酸激酶受体或酪氨酸激酶受体a或trk-a或gp140trk或p140-trka或mtc或trk。trka是受体酪氨酸激酶，通过调节交感神经元和神经神经元的增殖、分化和存活，参与中枢和外周神经系统的发育和成熟。trka是ngf(trka的主要配体)的高亲和力受体；其也可以结合ntf3/神经营养因子-3并被激活。四种已知的人trka同种型的完整氨基酸序列可以见于uniprot/swiss-prot登录号p04629(consortiumtu,(2012)nucleicacidsres.40(d1):d71-d5)。这四种同种型通过可变剪切产生：同种型trka-i存在于大多数非神经元组织中(uniprot/swiss-prot登录号p04629-2)，而同种型trka-ii主要在神经元细胞中表达(uniprot/swiss-prot登录号p04629-1)，同种型trka-iii特异地由多能神经干细胞和神经嵴祖先细胞表达(uniprot/swiss-prot登录号p04629-4)。第四同种型与同种型trka-ii在残基1-71位不同并缺失残基393-398，被称作同种型3(uniprot/swiss-prot登录号p04629-3)。第四同种型在残基1-71不同于同种型trka-ii并且缺少残基393至398，被称为同种型3(uniprot/swiss-prot登录号p04629-3)。trka-ii同种型是trka的主要已知同种型。同种型trka-i对ntf3神经营养因子具有增强的反应性，而同种型trka-iii具有组成型活性并且不结合ngf。在一个优选实施方案中，本文中所用trka同种型是具有seqidno:72的trka-ii同种型及包含seqidno:25序列的其胞外区。术语“抗trka抗体或其片段”或“人源化抗trka抗体或其片段”在本文中包括结合人trka，例如分离形式的人trka的抗体或其片段，尤其是结合trka-ii同种型(seqidno:72)的抗体或其片段，更特别地结合trka-ii同种型的人trka胞外区(seqidno:25)的单价形式的抗体或其片段，且亲和力(kd)值为500nm或更小，优选地350nm或更小，更优选地150nm或更小，甚至更优选地100nm或更小，最优选地50nm或更小，尤其是30nm或更小。通常，人源化抗trka抗体或其片段能够抑制trka的功能性激活和/或能够阻断或降低一种或多种由ngf与trka的结合诱导的生物活性。在本文中，“抗ngf抗体”是指能够结合ngf，优选人ngf的抗体。通常，抗ngf抗体能够抑制trka的功能性激活和/或能够阻断或降低trka的一种或多种生物活性。抗ngf抗体与ngf(例如hngf)的结合亲和力可以为500nm或更小，优选100nm或更小。通常，抗ngf抗体应当表现出以下特征中的任一或多个：(a)结合ngf并抑制ngf生物活性和/或由ngf信号传导功能介导的下游途径；(b)阻断或降低ngf受体激活(包括trka受体二聚化和/或自磷酸化)；(c)增加ngf清除；(d)抑制(减少)ngf合成、产生或释放。抗ngf抗体是本领域已知的，参见例如pct公布号wo01/78698,wo01/64247,us专利号5,844,092,5,877,016和6,153,189；hongo等，(2000)hybridoma,19:215-227；genbank登录号u39608,u39609,l17078或l17077。术语“能够抑制trka的功能性激活的人源化抗trka抗体或其片段”在本文中指，显示出以下特征之任一或多个的人源化抗trka抗体：(a)结合trka并抑制trka生物活性和/或由ngf结合或ntf3/神经营养因子3信号传导功能介导的下游途径；(b)防止、缓解或治疗任何疼痛方面；(c)阻断或减少trka的激活、或二聚体化和/或自磷酸化；(d)增加trka清除；(e)抑制或降低trka合成和/或细胞表面表达。术语“能够阻断或降低trka的一种或多种生物活性的人源化抗trka抗体或其片段”在本文中指，可以直接或间接地降低、抑制、中和或破坏trka生物活性的人源化抗trka抗体。术语“trka的生物活性”或“trka生物活性”在本文中涉及，但不限于，以下之任一或多项：能够结合ngf或其他神经营养因子；能够同源二聚化或异源二聚体化和/或自磷酸化；能够激活ngf诱导的信号传导途径；能够促进细胞分化、增殖、存活、生长、迁移和其他细胞生理学变化，包括(在神经元的情况下，包括外周和中枢神经元)神经元形态改变、突触形成、突触功能、神经递质和/或神经肽释放、和损伤后再生；以及能够介导疼痛和与骨转移相关的癌症疼痛。术语“ic50”在本文用于描述半最大抑制浓度(ic50)，其是化合物抑制生物学功能(例如人源化抗trka抗体抑制ngf诱导的tf-1细胞增殖)的有效性的量度。本文中使用的术语“抗体”包括全长抗体、及其任何抗原结合片段或单链。抗体，特别是天然存在的抗体，是以一或多拷贝的y形单元存在的糖蛋白，所述单元由四条多肽链组成。每个“y”形含有2个相同的重链(h)拷贝和2个相同的轻链(l)拷贝，重链和轻链因其相对分子量而得名。每条轻链与重链配对，而每条重链与另一条重链配对。共价的链间二硫键和非共价相互作用将这些链连接在一起。抗体，特别是天然存在的抗体，含有可变区，其是两个拷贝的抗原结合位点。木瓜蛋白酶(一种蛋白水解酶)将“y”形切割成3个独立的分子，2个被称为“fab”片段(fab＝抗原结合片段)，一个被称为“fc”片段或“fc区”(fc＝可结晶的片段)。fab片段由完整的轻链和部分重链组成。重链含有1个可变结构域(重链可变区或vh)和3或4个恒定结构域(ch1、ch2、ch3和ch4，取决于抗体类型或同种型)。在ch1和ch2结构域之间的区域被称为铰链区，其使得y形抗体分子的2个fab臂之间具有柔性，允许其打开和闭合以适应于结合相隔固定距离的2个抗原决定簇。iga、igd和igg的重链都具有4个结构域，即，1个可变结构域(vh)和3个恒定结构域(ch1-3)。ige和igm的重链具有1个可变结构域和4个恒定结构域(ch1-4)。抗体的恒定区可以介导与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统经典通路的第一成分(c1q)。每条轻链通常通过1个共价二硫键与重链连接。每条轻链含有1个可变结构域(轻链可变结构域或vl)和1个轻链恒定结构域。轻链恒定结构域可以是κ轻链恒定结构域，在本文中称为igkc，或者可以是λ轻链恒定结构域，在本文中称为iglc。igkc在本文中与cκ或ck等价使用，具有相同的含义。iglc在本文中与cλ或cl等价使用，具有相同的含义。本文中使用的术语“iglc结构域”指所有的λ轻链恒定结构域，例如，选自iglc1、iglc2、iglc3、iglc6和iglc7的所有λ轻链恒定结构域。vh和vl区可以进一步细分为命名为互补决定区(cdr)的超变区，其间散布了更保守的、命名为框架区(fr或fw或“非cdr区”)的区域。每个vh和vl都包括3个cdr和4个fr，按下列顺序从氨基端至羧基端排列：frl、cdrl、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。由恒定区的基因决定，抗体被分为不同类别，也称为同种型。人恒定轻链分为κ(ck)和λ(cλ)轻链。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)，分别定义了抗体的同种型igm、igd、igg、iga和ige。因此，本文中使用的“同种型”意指，由恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白类别和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是iggl(ighg1),igg2(ighg2),igg3(ighg3),igg4(ighg4),igal(igha1),iga2(igha2),igm(ighm),igd(ighd),和ige(ighe)。所谓的人免疫球蛋白假-γighgp基因代表了另外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，该基因已被测序，但由于改变的转换区(switchregion)而不编码蛋白质(bensmanam等人，(1988)nucleicacidsres.16(7):3108)。尽管具有改变的转换区，人免疫球蛋白假-γighgp基因仍具有所有的重链恒定区(ch1-ch3)和铰链的可读框。其重链恒定结构域的所有可读框编码的蛋白质结构域，可以与具有预测的结构特征的所有人免疫球蛋白恒定结构域，良好地对齐。该另外的假-γ同种型在本文中被称为iggp或ighgp。还报道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重链恒定结构域p1和p2假基因(ighep1和ighep2)。igg类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类iggl、igg2、igg3和igg4。在小鼠中，该类别包括亚类iggl、igg2a、igg2b、igg2c和igg3。术语“嵌合抗体”或“嵌合抗trka抗体”在本文中包括可变区序列源自一种物种而恒定区序列源自另一种物种的抗体，例如，可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。术语“人源化抗体”或“人源化抗trka抗体”在本文中包括，已在人框架序列上嫁接了源自另一哺乳动物物种例如小鼠种系的cdr序列的抗体。可以在人框架序列中以及在源自另一哺乳动物物种种系的cdr序列中进行额外的框架区修饰。本文使用的术语“fab”或“fab区”涵盖包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白结构域的多肽。fab可以指分离的这一区域，或位于全长抗体或抗体片段中的这一区域。本文使用的术语“fc”或“fc区”包括这样的多肽，所述多肽包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区。因此，fc指iga、igd和igg的最后2个恒定区免疫球蛋白结构域、以及ige和igm的最后3个恒定区免疫球蛋白结构域、和这些结构域n端的柔性铰链。对于iga和igm，fc可以包括j链。对于igg，fc包括免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3、和cγl与cγ2之间的铰链。虽然fc区的边界可以改变，但人igg重链fc区通常定义为包括残基c226或p230至其羧基端，其中根据eu编号系统(edelmangmetal.,(1969)pnasusa63(1):78-85)编号。对于人igg1，fc区在本文中定义为包括残基p232至其羧基端，其中根据eu编号系统编号。fc可以指分离的这一区域，或位于fc多肽(例如抗体)中的这一区域。本文中术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”涵盖包含抗体第一和第二恒定结构域之间氨基酸的柔性多肽。“铰链区”在本文中是长度为6-62个氨基酸的序列区，仅存在于iga、igd和igg中，包含了桥接2条重链的半胱氨酸残基。结构上，iggch1结构域终止于eu位置220，iggch2结构域始于残基eu位置237。因此，对于igg，抗体铰链在本文中被定义为包括位置221(在igg1中d221)至231(igg1中a231)，其中根据eu编号系统编号。术语“亲本抗体”、“亲本免疫球蛋白”、“亲代抗体”或“亲代免疫球蛋白”，在本文中可互换使用，包括随后可以被修饰以产生变体的未修饰抗体。所述亲本抗体可以是天然抗体、或天然抗体的变体或工程化形式。亲本抗体可以指抗体本身、包含亲本抗体的组合物、或编码其的氨基酸序列。“亲本鼠抗体”或“相应的亲本鼠抗体”在本文中意指，被修饰以产生变体的、结合人trka的抗体或免疫球蛋白，尤其是wo00/73344公开的鼠抗体mnac13。术语“变体抗体”或“抗体变体”在本文中包括与亲本相比由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体序列的抗体序列。变体抗体序列在本文中与亲本抗体序列优选具有至少约80％、最优选至少约90％、更优选至少约95％氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身、包含该抗体变体的组合物、或编码其的氨基酸序列。术语“氨基酸修饰”在本文中包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”在本文中是指，亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被另一氨基酸置换。例如，取代r94k是指变体多肽，在本案中重链可变框架区变体，其中位置94的精氨酸被赖氨酸置换。对于前例，94k是指以赖氨酸进行位置94的取代。出于本文的目的，多重取代典型地通过斜线分开。例如，r94k/l78v指，包含取代r94k和l78v的双重变体。“氨基酸插入”或“插入”在本文中是指，在亲本多肽序列中特定位置处添加氨基酸。例如，插入-94是指在位置94插入。“氨基酸缺失”或“缺失”在本文中是指，去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。例如，r94-是指缺失位置94的精氨酸。在本文中，术语“保守修饰”或“保守性序列修饰”旨在指，该氨基酸修饰不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征。保守性修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入本发明抗体，例如定点诱变和pcr介导的诱变。保守氨基酸取代是指，氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的cdr区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基可以替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并可以测试该改变的抗体(变体抗体)保留的功能。对于所有人免疫球蛋白重链恒定结构域，根据“eu编号系统”(edelmangm等,同上引文)编号。对于人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(igkc)，根据“eu编号系统”(edelmangm等,同上引文)编号。对于人λ免疫球蛋白轻链恒定结构域(iglc1,iglc2,iglc3,iglc6,和iglc7)，根据“kabat编号系统”编号(kabatea等,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationn°91-3242)，描述于dariavachp等,(1987)pnasusa84(24):9074-8和frangioneb等,(1985)pnasusa82(10):3415-9。术语“可变结构域”是指介导抗原结合并限定特定抗体对特定抗原的特异性的结构域。在天然抗体中，抗原结合位点由定义特异性的两个可变结构域组成：一个位于重链中，在本文中称作重链可变结构域(vh)，另一位于轻链中，在本文中称作轻链可变结构域(vl)。一些情况下，特异性可以仅存在于两个结构域的仅一个中，例如在来自驼科动物(camelids)的重链抗体的单域抗体中。v区通常大约110个氨基酸长度，由称作框架区(fr或“非cdr区”)的15-30个氨基酸的相对不变氨基酸序列链和称作“高变区”的7-17个氨基酸长度的极度可变的较短区域组成，其中框架区被高变区分隔开。天然重链和轻链的可变结构域包含4个fr,这些fr大部分采取β片层构型，通过形成环的三个高变区连接。每条链中的高变区通过fr而紧靠在一起，与来自另一链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabatea等，同上引文)。本文中术语“高变区”是指，负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基，后者具有最大的序列变异性和/或参与抗原识别。对于所有可变结构域，根据kabat(kabatea等，同上引文)进行编号。有多种cdr定义在使用，并包括在本文中。kabat定义基于序列的变异性，是最常使用的cdr定义(kabatea等，同上引文)。chothia则是指结构环的位置(chothia&leskj(1987)molbiol196:901-917)。abm定义是kabat和chothia定义的折衷，用于oxfordmolecular的abm抗体模建软件(martinacr等,(1989)pnasusa86:9268–9272；martinacr等,(1991)methodsenzymol.203:121–153；pedersenjt等,(1992)immunomethods1:126–136；reesar等,(1996)insternbergm.j.e.(ed.),proteinstructureprediction.oxforduniversitypress,oxford,141–172)。近来引入了接触定义(maccallumrm等,(1996)jmolbiol262:732-745)，其基于对蛋白数据库中可得的复合物结构的分析。(国际immunogenetics信息系统)的cdr定义(http://www.imgt.org)基于对所有物种的所有免疫球蛋白和t细胞受体v-regions的imgt编号(国际immunogenetics信息系统；lefrancmp等,(1999)nucleicacidsres.27(1):209-12；ruizm等,(2000)nucleicacidsres.28(1):219-21；lefrancmp(2001)nucleicacidsres.29(1):207-9；lefrancmp(2003)nucleicacidsres.31(1):307-10；lefrancmp等,(2005)dev.comp.immunol.29(3):185-203；kaasq等,(2007)briefingsinfunctionalgenomics&proteomics,6(4):253-64)。在本发明中提及的所有互补决定区(cdr)优选按如下进行定义(根据kabatea等人进行编号，同上引文)：lcdr1:24-34；lcdr2:50-56；lcdr3:89-98；hcdr1:26-35；hcdr2:50-65；hcdr3:95-102。可变结构域的“非cdr区”称作框架区(fr)。在本文中vl区的“非cdr区”包含氨基酸序列：1-23(frl),35-49(fr2),57-88(fr3),和99-107(fr4)。在本文中vh区的“非cdr区”包含氨基酸序列：1-25(frl),36-49(fr2),66-94(fr3),和103-113(fr4)。本文中使用的术语“全长抗体”包括，构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中，igg类的全长抗体是四聚体，由相同的2对组成，每对两条免疫球蛋白链，每一对具有1条轻链和1条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域vl和cl，每条重链包含免疫球蛋白结构域vh、ch1(cγ1)、ch2(cγ2)和ch3(cγ3)。在一些哺乳动物中，例如骆驼和羊驼，igg抗体可以仅由2条重链组成，每条重链包含与fc区连接的可变结构域。抗体片段在本文中是指抗原结合片段，包括，但不限于，(i)由vl、vh、cl和ch1结构域组成的fab片段，包括fab’和fab’-sh；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)由单个抗体的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)由单可变结构域组成的dab片段(wardetal(1989)nature341:544-546)；(v)f(ab')2片段——包含2个相连的fab片段的二价片段；(vi)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽接头相连，所述接头允许2个结构域缔合形成抗原结合位点(birdetal(1988)science242:423-426；hustonetal(1988)pnasusa85:5879-5883)；(vii)双特异性单链fv二聚体(pct/us92/09965)；(viii)“二体抗体(diabody)”或“三体抗体(triabodies)”——通过基因融合构建的多价或多特异性片段(tomlinsonietal.,(2000)methodsenzymol326:461-479；wo94/13804；holligeretal.,(1993)pnasusa90:6444-6448)；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scfv(coloma&morrison(1997)naturebiotech15:159-163)。术语“效应子功能”在本文中包括由抗体fc区与fc受体或配体相互作用引起的生物化学事件。效应子功能包括fcγr介导的效应子功能，例如adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和adcp(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用)，和补体介导的效应子功能例如cdc(补体介导的细胞毒性)。抗体的效应子功能可以通过如下方式改变：改变，即增强或降低，优选增强抗体对效应分子例如fc受体或补体成分的亲和力。结合亲和力通常可以通过修饰效应分子结合位点来改变，并且在该情况下适宜的是定位目的位点并以合适的方式修饰该位点的至少一部分。也可以考虑，改变抗体上的效应分子结合位点无需显著改变整体的结合亲和力，而是可以改变相互作用的几何学，从而使得效应机制在非有效结合中无效。还可以考虑，也可以通过修饰非直接参与效应分子结合而是参与效应子功能行使的位点，来改变效应子功能。通过改变抗体的效应子功能，可以控制免疫反应的多个方面，例如，增强或抑制免疫系统的各种反应，获得可能的诊断和治疗有效效果。在本文中，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如灵长类动物，绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。优选，受试者是人。本发明抗体本发明第一方面提供，人源化抗trka抗体或其片段，其包含：a)包含选自seqidnos:1-5的序列的重链可变结构域；和b)包含选自seqidnos:6-13的序列的轻链可变结构域；其中重链可变结构域的cdr2包含至少一个氨基酸取代，和/或其中重链可变结构域的非cdr区在选自由37、42和89组成的组的氨基酸位置包含氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，重链可变结构域的cdr2包含至少一个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，重链可变结构域的非cdr区在选自由37、42和89组成的组的氨基酸位置包含保守氨基酸取代。在一些实施方案中，重链可变结构域的cdr2包含序列seqidno:15。在一些实施方案中，重链可变结构域包含选自seqidnos:1,3和5的序列，轻链可变结构域包含选自seqidnos:6和8的序列。在一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域的组合，所述组合包含选自seqidno:1和seqidno:6、seqidno:3和seqidno:6、seqidno:3和seqidno:8、seqidno:5和seqidno:6、以及seqidno:5和seqidno:8的序列；优选seqidno:5和seqidno:6的序列或seqidno:5和seqidno:8的序列；更优选seqidno:5和seqidno:6的序列。在一些实施方案中，本公开提供的人源化抗trka抗体或其片段的重链可变结构域不包含seqidno:71的序列。在一些实施方案中，本公开提供的人源化抗trka抗体或其片段的重链可变结构域缺少位置87的丝氨酸，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，本公开提供的人源化抗trka抗体或其片段的重链可变结构域在位置87包含苏氨酸，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，重链可变结构域的cdr2的氨基酸取代包含在选自由50,60和62组成的组，优选选自由60和62组成的组、的氨基酸位置的氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，重链可变结构域的cdr2的氨基酸取代不包含选自由y50a、p60a和t62s组成的组的氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，如果人源化抗trka抗体或片段在重链可变结构域非cdr区中的氨基酸取代是a49s，则人源化抗trka抗体或片段在重链可变结构域cdr2中的氨基酸取代不是y50a。在一些实施方案中，人源化抗trka抗体或片段在重链可变结构域非cdr区中的氨基酸取代不是a49s，和/或人源化抗trka抗体或片段在重链可变结构域cdr2中的氨基酸取代不是y50a。在一些实施方案中，抗体或其片段的重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由v37a、g42e和v89l组成的组的氨基酸取代，优选v37a，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，抗体包含含有seqidno:3序列的重链可变结构域，其中重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由v37a、t40a、g42e、r44g、a49s和v89l组成的组的氨基酸取代，优选选自v37a、t40a、g42e、r44g和v89l，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域的组合，所述组合包含seqidno:3和seqidno:6序列或包含seqidno:3和seqidno:8序列，其中重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由v37a、t40a、g42e、r44g、a49s和v89l组成的组的氨基酸取代，优选选自v37a、t40a、g42e、r44g和v89l，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由k3q、v37a、g42e、a49s、v89l和r94k组成的组的氨基酸取代，优选选自k3q、v37a、g42e、v89l和r94k，更优选包含氨基酸取代k3q和v37a，最优选包含氨基酸取代v37a，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。等同最优选的是这样的实施方案，其中重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由v37a和k3q,v37a组成的组的氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。在一些实施方案中，抗体包含含有seqidno:5序列的重链可变结构域，其中重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由k3q、v37a、g42e、a49s、v89l和r94k组成的组的氨基酸取代，优选选自k3q、v37a、g42e、v89l和r94k，更优选包含氨基酸取代k3q和v37a，最优选包含氨基酸取代v37a，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。等同最优选的实施方案是，其中抗体包含含有seqidno:5序列的重链可变结构域，其中重链可变结构域非cdr区的氨基酸取代包含选自由v37a和k3q,v37a组成的组的氨基酸取代，其中每个组成员的氨基酸位置使用kabat中所示编号系统给出。再一方面，本发明提供人源化抗trka抗体或其片段，其包含：a)包含选自seqidnos:31-49的序列的重链可变结构域，和b)包含选自seqidnos:6-13的序列的轻链可变结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:32,36,39,43,48和49的序列的重链可变结构域，和b)包含选自seqidnos:6-13或选自seqidnos:6和8的序列的轻链可变结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:32,36,48和49的序列的重链可变结构域，和b)包含序列seqidno:6或seqidno:8的轻链可变结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:32和36的序列的重链可变结构域，和b)包含seqidno:6的序列的轻链可变结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含seqidno:36的序列的重链可变结构域，和b)包含seqidno:6的序列的轻链可变结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域的组合，所述组合选自序列组合seqidno:32和seqidno:6、seqidno:32和seqidno:8、seqidno:36和seqidno:6、seqidno:48和seqidno:6、seqidno:49和seqidno:6、以及seqidno:49和seqidno:8，优选选自序列组合seqidno:32和seqidno:6、seqidno:32和seqidno:8、seqidno:36和seqidno:6、seqidno:49和seqidno:6、以及seqidno:49和seqidno:8；最优选选自序列组合seqidno:36和seqidno：6。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区，优选重链和/或轻链恒定区和铰链区。优选，重链恒定区是人来源的，并可以是例如人igg1(ighg1),igg2(ighg2),igg3(ighg3),igg4(ighg4),iga1(igha1),iga2(igha2),igm(ighm),igd(ighd),或ige(ighe)同种型。更优选，重链恒定区是人ighg1同种型或人ighg4同种型。优选，轻链恒定区是人来源的，并可以是人κ(ck)或人λ(cλ)轻链恒定结构域，优选人κ轻链恒定结构域。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区和铰链区，其中重链恒定区和铰链区是人ighg1同种型的或人ighg4同种型的。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段还包含重链和/或轻链恒定区和铰链区，其中重链恒定区和铰链区是人ighg4同种型的，且其中铰链区包含氨基酸取代s228p，其中氨基酸位置使用eu编号系统给出。再一方面，本发明提供人源化抗trka抗体或其片段，其包含：a)包含选自seqidnos:50-70的序列的重链，和b)包含选自seqidnos:29和30的序列的轻链。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:51,52,56,57,60,64,69和70的序列的重链，和b)包含选自seqidnos:29和30，优选seqidno:29的序列的轻链。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:51,52,56,57,69和70的序列的重链，和b)包含选自seqidnos:29和30，优选seqidno:29的序列的轻链。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:51,52,56,57和70的序列的重链，和b)包含选自seqidnos:29和30，优选seqidno:29的序列的轻链。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含选自seqidnos:51,52,56和57的序列的重链，和b)包含选自seqidnos:29和30，优选seqidno:29的序列的轻链。在一个优选实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段包含：a)包含seqidno:57的序列的重链，和b)包含seqidno:29的序列的轻链。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段是全长抗体。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段是抗体片段，选自fab、fab′、fab′-sh、fd、fv、dab、f(ab')2、scfv、双特异性单链fv二聚体、二体抗体、三体抗体、和与相同或不同抗体遗传融合的scfv；优选scfv或fab；更优选scfv二聚体或二体抗体或f(ab')2。一些实施方案中，人源化trka抗体或其片段包含变体fc区，其相对于亲本抗体fc区包含至少一个氨基酸修饰，其中含有变体fc区的抗体表现出不同于亲本抗体的效应子功能。fc区中的氨基酸修饰典型地改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、与fc受体或配体结合相关的效应子功能、和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。下面列出的fc区修饰依据fc区残基的eu编号给出。一个实施方案中，修饰ch1的铰链区从而改变例如增加或降低铰链区中半胱氨酸残基的数量。该方法进一步描述在us专利号5,677,425(bodmer等)。改变ch1铰链区中半胱氨酸残基的数量可以例如促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。另一实施方案中，突变抗体fc铰链区以降低抗体的生物学半衰期。更特别地，向fc-铰链片段的ch2-ch3结构域界面区中引入一个或多个氨基酸突变，从而相对于天然fc-铰链结构域的spa结合，该抗体具有削弱的葡萄球菌蛋白a(spa)结合。该方法更详细地描述于美国专利号6,165,745(ward等)。另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。各种方案都是可以的。例如，可以引入下述突变中的一个或多个：t252l、t254s和t256f，如美国专利号6,277,375(ward)中所述。或者，为了增加生物学半衰期，可以在ch1或cl区中改变抗体，以包含取自iggfc区ch2结构域的两个环的挽救受体结合表位，参见美国专利号5,869,046和6,121,022(presta等)。再一实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基，改变fc区，从而改变抗体的(一种或多种)效应子功能。例如，可以将选自氨基酸残基234,235,236,237,297,318,320和322的一个或多个氨基酸取代为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的效应子配体亲和力但保留亲本抗体的抗原结合能力。待改变亲和力的效应子配体可以是，例如，fc受体或补体的c1成分。该方法描述于winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260。在另一例子中，可以将选自氨基酸残基329,331和332的一个或多个氨基酸取代为不同氨基酸残基，从而抗体具有改变的c1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(cdc)。该方法描述于idusogie等人的美国专利号6,194,551。在另一例子中，可以改变ch2结构域n端区域中氨基酸位置231至238中的一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。该方法描述于bodmer等人的pct公布wo94/29351。再一例子中，可以通过修饰位于以下位置的一个或多个氨基酸，修饰fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)的能力和/或增加抗体对fcγ受体的亲和力：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,309,312,315,320,322,324,326,327,329,330,331,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439。该方法描述于presta的pct公布wo00/42072。此外，可以化学修饰本发明抗体(例如，可以将一个或多个化学结构部分附着到抗体上)，或可以修饰本发明抗体以改变其糖基化。本发明抗体的性质一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段能够抑制trka的功能性激活。一些实施方案中，人源化抗trka抗体能够阻断或降低trka的一种或多种生物学活性。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段结合人trka，且亲和力(kd)值为500nm或更小，优选350nm或更小，更优选150nm或更小，甚至更优选100nm或更小，最优选50nm或更小，尤其是30nm或更小，所述亲和力值可以例如使用biacore2000仪器(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,switzerland)或本领域已知的等同仪器，通过将抗体捕获在仪器传感器芯片上，使用重组单价人trka胞外域(seqidno:25)作为分析物，通过表面等离子体共振(spr)测量。本文中，与使用trka受体的亲和力测量相关的表述“单价”是指这样的人trka受体结构域(如人trka胞外域)，(不同于例如在将该结构域氨基酸端融合至免疫球蛋白fc部分时发生的人为二聚体化或多聚体化)所述结构域不发生人为二聚体化或多聚体化，或(不同于例如该结构域与其天然配体ngf结合时发生的天然二聚体)所述结构域不发生天然二聚体化。评估抗体对例如人trka的结合亲和力的标准测定试验是本领域已知的，包括例如elisas,biacore,western印迹,ria,流式细胞术分析。适宜的测定试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力如kd)也可以通过本领域已知的标准测定试验，例如通过scatchard或系统分析来评估。相对结合亲和力ki可以通过本领域已知的标准竞争测定试验来评估。可以在tf-1细胞增殖试验中，评价工程化抗trka抗体抑制trka功能性激活的能力。半最大抑制浓度(ic50)，作为化合物抑制生物学功能的有效性的量度，可以用于选择优选的抗体。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段在tf-1细胞增殖试验中与相应的亲本鼠抗体相比具有至少相当或更低的ic50，其中所述ic50可以例如使用因子依赖性人红白血病细胞系tf-1，通过抗体阻断细胞表面trka/β-ngf介导的细胞增殖的能力来度量(kitamuratetal.,(1989)jcellularphysiology140(2):323-34)。优选地，人源化抗trka抗体或其片段在tf-1细胞增殖试验中具有1μg/ml或更低、更优选0.75μg/ml,甚至更优选0.5μg/ml或更低,最优选0.3μg/ml或更低,尤其是0.1μg/ml或更低的ic50。一些实施方案中，人源化抗trka抗体或其片段具有大于65℃，优选大于70℃的fab片段热稳定性温度。对于fab片段热稳定性的分析，可以使用差示扫描量热测量，其中鉴定在全长igg中的fab片段的中点熔解温度。该类量热测量是本领域技术人员已知的，可以根据例如garber&demarest(2007)bbrc355:751-7实施。令人惊讶的，已经发现，本发明人源化抗体的fab片段热稳定性温度与亲本鼠抗体的fab片段热稳定性温度相当，同时具有相当的亲和力(通过spr测量)和改善的效能(通过tf-1细胞增殖试验测量)。因此，本公开也提供人源化抗trka抗体，其具有与亲本鼠抗体相当的fab片段热稳定性温度、以及相当的人trka亲和力和改善的抑制性质。“与亲本鼠抗体具有相当的fab片段热稳定性温度”，在此上下文中使用时是指，人源化抗trka抗体或其片段的fab片段热稳定性温度在亲本鼠抗体的fab片段热稳定性温度的±20％范围内,优选在±15％范围内,更优选在±10％范围内,甚至更优选在±5％范围内。优选地，本发明人源化抗体的fab片段热稳定性温度比亲本鼠抗体的fab片段热稳定性温度低不超过15％。“相当的人trka亲和力”，在此上下文中使用时是指，人源化抗trka抗体或其片段的亲和力在亲本鼠抗体的±20％范围内,优选在±15％范围内,更优选在±10％范围内。优选地，本发明人源化抗体的kd比亲本鼠抗体的kd低至少5％，优选至少10％。本公开还提供可以用于治疗疼痛的人源化抗trka抗体或其片段。在急性炎性痛觉过敏小鼠中测试了人源化抗trka抗体的效力(见实施例2)，其中通过向后爪足底注射完全弗氏佐剂(cfa)诱导所述急性炎性痛觉过敏。以0.01mg/kg或以上剂量施用人源化抗trka抗体造成了显著的痛觉过敏逆转，这与使用nsaid吲哚美辛时观察到的类似。在慢性炎性痛觉过敏小鼠中测试了人源化抗trka抗体的效力(见实施例3)，其中通过向膝关节中关节内注射cfa诱导所述慢性炎性痛觉过敏。以0.01mg/kg或以上的单剂量施用人源化抗trka抗体产生了痛觉过敏的显著逆转，这与多次给药cox-2选择性nsaid塞来昔布时观察到的相当。在慢性骨关节炎性痛觉过敏小鼠中测试了人源化抗trka抗体的效果(参见实施例4)，其中通过关节内注射碘乙酸钠(mia)到膝关节中诱导所述慢性骨关节炎性痛觉过敏。以0.01mg/kg或以上的单剂量施用人源化抗-trka抗体产生痛觉过敏的显著逆转，这与通过多次给药阿片类药物曲马多和普瑞巴林所观察到的相当。在坐骨神经慢性压迫诱导的神经病理性疼痛小鼠中测试了人源化抗trka抗体的效果(cci模型；参见实施例5)。以0.01mg/kg或以上的单剂量施用人源化抗trka抗体产生机械性痛觉过敏和冷异常性疼痛的显著逆转，在测试的最高剂量1mg/kg时该逆转与多次给药普瑞巴林所观察到的相当。因此，本发明的一个优选实施方案提供人源化抗-trka抗体用于治疗患有急性炎性疼痛，慢性炎性疼痛，骨关节炎疼痛和/或神经病理性疼痛的患者。核酸，载体和宿主细胞本公开还提供编码抗trka抗体及其片段的分离核酸、载体和包含该核酸或载体的宿主细胞。核酸可以存在于全细胞，细胞裂解物中或可以是部分纯化的或基本上纯的形式。当通过标准技术(包括碱/sds处理，cscl条带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳及其他本领域已知的技术)将核酸从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来后，核酸是“分离的”或“成为基本上纯的”，所述技术参见例如ausubelf等人，编(1987)currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingandwileyinterscience，newyork。本发明的核酸可以是例如dna或rna，并且可以含有或可以不含有内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cdna分子。本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得，例如可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得编码抗体轻链和重链或编码vh和vl片段的cdna。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库回收编码抗体的一个或多个核酸。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域熟知的，并且将随所用的宿主细胞而变化。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，氯化钙处理，聚乙烯亚胺介导的转染，聚凝胺(polybrene)介导的转染，原生质体融合，电穿孔，病毒或噬菌体感染，脂质体包封多核苷酸，以及直接将dna显微注射入细胞核。在哺乳动物细胞的情况下，转染可以是瞬时的或稳定的。在一些实施方案中，编码抗-trka抗体及其片段的分离核酸包含选自seqidno：73-116的核酸序列，通常是选自seqidno：113,114,115和116的编码轻链可变区或轻链的核酸分子和/或选自seqidno：73-112的编码重链可变区或重链的核酸分子。本发明优选的核酸分子是选自seqidno：113和114的编码轻链可变区的核酸分子和/或选自seqidnos:74,78,81,85,90和91的编码重链可变区的核酸分子。更优选的是选自seqidno：74和78的编码重链可变区的核酸分子和/或选自seqidno：113和114的编码轻链可变区的核酸分子。最优选的是包含seqidno：74或78核酸序列的编码重链可变区的核酸分子和/或包含seqidno：113核酸序列的编码轻链可变区的核酸分子。本发明的其它优选的核酸分子是选自seqidno：115和116的编码轻链的核酸分子和/或选自seqidno：93,94,98,99,102,106,111和112的编码重链的核酸分子。更优选的是，包含seqidno：93,94,98和99核酸序列的编码重链的核酸分子和/或选自seqidno：115和116的编码轻链的核酸分子。最优选的是，包含seqidno：93,94,98和99核酸序列的编码重链的核酸分子和/或包含seqidno：115核酸序列的编码轻链的核酸分子。一旦获得了编码vh和vl区段的dna片段，则可以通过标准重组dna技术进一步操纵这些dna片段，例如将可变区基因转化成全长抗体链基因，或转化成与上述片段相对应的片段基因，像例如fab片段基因，或转化成scfv基因。在这些操作中，编码vl或vh的dna片段可操作地连接到编码另一蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一dna片段上。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示，连接两个dna片段，使得由两个dna片段编码的氨基酸序列保持符合读框。通过将编码vh的分离dna与编码重链恒定区(ch1，ch2和ch3)的另一dna分子可操作地连接，可以将编码vh区的分离dna转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat，ea等人，同上引文)，并且通过标准pcr扩增可以获得包含这些区域的dna片段。重链恒定区可以是igg1，igg2，igg3，igg4，iga，ige，igm或igd恒定区，但最优选是igg4恒定区，优选人ighg4恒定区，其中铰链区包含氨基酸取代s228p。对于fab片段重链基因，编码vh的dna可以可操作地连接到仅编码重链ch1恒定区的另一dna分子。通过将编码vl的dna与编码轻链恒定区cl的另一dna分子可操作地连接，可以将编码vl区的分离dna转化为全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabatea等人，同上引文)，并且通过标准pcr扩增可以获得包含这些区域的dna片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，优选κ恒定区。为了产生scfv基因，编码vh-和vl的dna片段可操作地连接到编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段，从而vh和vl序列可被表达为连续的单链蛋白，其中vl和vh区通过柔性接头连接(参见例如bird等人，同上；huston等人，同上；mccafferty等，(1990)nature348：552-554)。已经开发出用于产生抗体的抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如morimoto等，(1992)j.biochem.biophysicalmethods，24：107-117和brennan等，(1985)science，229：81)。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌中直接回收fab'-sh片段并化学偶联以形成f(ab')2片段(carter等，(1992)bio/technology，10：163-167)。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离f(ab')2片段。生产抗体片段的其他技术对于本领域技术人员将是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链fv片段(scfv)，参见例如，wo93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。抗体片段也可以是例如“美国专利号5,641,870”所述的“线性抗体”。编码本发明抗体的核酸可以并入载体，优选表达载体中以表达蛋白质。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可以包含自我复制性染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。构建表达载体以与宿主细胞类型相容。因此，在本发明中使用的载体，优选表达载体包括但不限于能够在哺乳动物细胞，细菌，昆虫细胞，酵母和体外系统中表达蛋白质的载体。如本领域已知的，各种表达载体可以通过商业途径或其他方式获得，并可用于本发明中表达抗体。表达载体通常包含与控制或调节序列、选择性标记、任何融合配偶体和/或其他元件可操作地连接的蛋白质。本文中“可操作地连接”是指，将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中。术语“调节序列”旨在包括，可以控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列描述于例如goeddel(geneexpressiontechnology，methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，ca(1990))中。通常，这些表达载体包括与编码抗体的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸，并且通常适用于用于表达蛋白质的宿主细胞。通常，转录和翻译调节序列可以包括启动子序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，以及增强子或激活剂序列。如本领域中也已知的，表达载体通常含有选择基因或标记，以允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域公知的，并且将随所用的宿主细胞而变化。例如，通常选择性标记基因可以对导入了载体的宿主细胞赋予药物(例如g418，潮霉素或氨甲喋呤)抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(与氨甲喋呤选择/扩增一起用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于g418选择)。用于克隆或表达本文载体中的dna的合适宿主细胞是原核细胞，酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(escherichia)，例如大肠杆菌(e.coli)，肠杆菌属(enterobacter)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，变形杆菌属(proteus)，沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)和志贺氏菌属(shigella)，以及芽孢杆菌属(bacilli)如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)，假单胞菌属(pseudomonas)如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)和链霉菌属(streptomyces)。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(atcc31,446)，大肠杆菌b，大肠杆菌x1776(atcc31,537)和大肠杆菌w3110(atcc27,325)。除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。用于表达本发明重组抗体的宿主细胞优选是哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)(包括在urlaub&chasin(1980)pnasusa77：4216-4220中描述的dhfr-cho细胞，其与dhfr可选择标记一起使用，参见例如，kaufman&sharp(1982)j.mol.biol.159：601-621中所述)，nso骨髓瘤细胞，cos细胞，sp2细胞和hek293-ebna1细胞(目录号：crl-10852)。特别是，为了与nso骨髓瘤细胞一起使用，另一个优选的表达系统是wo87/04462，wo89/01036和ep0338841中公开的gs基因表达系统。抗体的构建和制备抗trka多肽产生的抗体可以通过免疫动物获得，即通过使用众所周知的常规方案，向动物，优选非人动物施用该多肽，参见例如handbookofexperimentalimmunology，weirdm(编辑)，vol4，blackwellscientificpublishers，oxford，england(1986)。可以免疫许多温血动物，例如兔，小鼠，大鼠，绵羊，牛，骆驼或猪。然而，小鼠，兔，猪和大鼠，特别是小鼠，通常是最合适的。也可以通过本领域技术人员已知的重组dna技术来产生抗体。另外，还可以通过酶学或化学切割天然抗体来产生抗体。本发明的人源化抗体可以通过将来自非人动物(例如小鼠)vh和/或vl区的一个或多个cdr或其部分转移到来自人vh和/或vl区的一个或多个框架区上来构建。优选地，可以通过如下方式构建本发明的人源化抗体：将wo00/73344中公开的鼠mnac13抗体的vh和/或vl区的一个或多个cdr或其部分转移到来自人vh和/或vl区的一个或多个框架区上。任选地，当需要或期望降低抗体的免疫原性和/或保持结合亲和力时，可以将存在于vh和/或vl区中的人框架残基置换为相应的非人(例如小鼠)残基。任选地，存在于cdr中的非人氨基酸残基可以被置换为人残基。可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合或人源化抗体。可以从感兴趣的非人杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的dna，并使用标准分子生物学技术工程化改造成以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见例如cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠cdr区插入人框架中(参见例如，winter的美国专利no.5,225,539和queen等人的美国专利no.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。可以构建本发明的人源化抗体，其中基于潜在受体分子可变区和鼠抗体的重链可变区之间的同源性考虑，选择该重链可变区的人受体分子。优选种系候选人受体分子，以降低潜在的免疫原性。种系数据库由通读至重链fw3区末并部分地进入cdr3序列的抗体序列组成。为了选择fw4区域，可以搜索从所选种系分子生成的成熟抗体序列的数据库，或者可以使用来自人供体的从所选种系分子生成的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的重链类别，并具有与鼠供体分子的可变区相同的规范(canonical)结构类型。对于选择重链可变区的人受体分子，第二考虑因素包括鼠供体分子和人受体分子之间在cdr长度上的同源性。优选通过对v-base数据库进行同源物检索来选择人受体抗体分子，但也可以使用诸如kabat数据库和公共ncbi数据库的其它数据库。可以构建本发明的人源化抗体，其中基于潜在受体分子可变区和鼠抗体的轻链可变区之间的同源性考虑，选择该轻链可变区的人受体分子。优选种系候选人受体分子，以降低潜在的免疫原性。种系数据库由通读至重链fw3区末并部分地进入cdr3序列的抗体序列组成。为了选择fw4区域，可以搜索从所选种系分子生成的成熟抗体序列的数据库，或者可以使用来自人供体的从所选种系分子生成的抗体序列。人受体分子优选选自与鼠供体分子相同的轻链类别，并具有与鼠供体分子的可变区相同的规范结构类型。对于选择轻链可变区的人受体分子，第二考虑因素包括鼠供体分子和人受体分子之间在cdr长度上的同源性。优选通过对v-base数据库进行同源物检索来选择人受体抗体分子，但也可以使用诸如kabat数据库和公共ncbi数据库的其它数据库。当通过例如将基因导入哺乳动物宿主细胞中以重组抗体形式生产抗体时，可以将宿主细胞培养足够长时间，以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选地允许抗体分泌到生长宿主细胞的培养基中，由此产生抗体。用于产生结合人trka的抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如ham'sf10(sigma-aldrichchemiegmbh，buchs，瑞士)，极限基础培养基(mem；sigma-aldrichchemiegmbh)，rpmi-1640(sigma-aldrichchemiegmbh，basel，瑞士)，ex-cell293，hek293-无血清培养基(sigma，buchs，瑞士)和dulbecco改良的eagle培养基((dmem；sigma-aldrichchemiegmbh))适用于培养宿主细胞。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。抗体可以可操作地连接到融合配偶体以使得可以例如靶向、纯化、筛选、展示表达的蛋白质等。融合配偶体可以通过接头序列与抗体序列连接。接头序列通常包含少量氨基酸，通常少于10个氨基酸，但也可以使用更长的接头。典型地，选择柔性并且抗降解的接头序列。如本领域技术人员将理解的，可以使用各种各样的序列中的任何一种作为接头。例如，常见的接头序列包含氨基酸序列ggggs。融合配偶体可以是靶向序列或信号序列，其将抗体和任何相关联的融合配偶体定向至所需的细胞位置或细胞外介质。如本领域已知的，某些信号序列可以将蛋白质靶向分泌到生长培养基中，或者靶向至位于细胞的内膜和外膜之间的周质空间。融合配偶体也可以是编码肽或蛋白质的序列，其中所述肽或蛋白质使得纯化和/或筛选能够进行。这样的融合配偶体包括但不限于，聚组氨酸标签(his标签)(例如h6和h10或用于固定化金属亲和层析(imac)系统(例如ni2+亲和柱))的其他标签)，gst融合体，mbp融合体，strep-标签，细菌酶bira的bsp生物素化靶序列，和由抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签，flag标签等)。如本领域技术人员将理解的，这些标签可用于纯化，筛选或两者。抗trka抗体的表征和纯化可以使用测定试验测量与人trka的结合和/或测量阻断trka与其配体ngf结合的能力，来筛选抗体。结合测定试验的一个实例是elisa。另外，表面等离子体共振(spr)分析(如在实施例中使用的)可用于测量抗体结合动力学的结合和解离速率常数。阻断试验的一个实例是基于流式细胞术的测定试验，其测量对ngf与trka结合的阻断。对于评估抗trka抗体功能活性的测定试验，例如可以使用tf-1细胞增殖测定试验，其中使用因子依赖性人红白血病细胞系tf-1测定抗体阻断细胞表面trka/β-ngf介导的细胞增殖的能力(kitamuratetal.,(1989)j.cellularphysiology140(2):323-34)。本发明的抗体可以以本领域技术人员已知的各种方式分离或纯化。标准纯化方法包括，使用诸如fplc和hplc系统在大气压或高压下进行的色谱技术，包括离子交换，疏水相互作用，亲和，尺寸排阻或凝胶过滤和反相色谱。纯化方法还包括电泳，免疫学，沉淀，透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术，与蛋白质浓缩相结合，也是有用的。为了纯化trka抗体，可以在例如，转瓶中生长所选择的宿主细胞用于单克隆抗体纯化。可以过滤和浓缩上清液，之后用蛋白a-琼脂糖凝胶(pharmacia，piscataway，nj)进行亲和层析。洗脱的抗体可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查，以确保纯度。因此，本发明优选的抗体是与人trka结合的分离和/或纯化的抗体。免疫缀合物另一方面，本发明提供与治疗剂如细胞毒素，药物(例如免疫抑制剂)或放射毒素连接的、人trka结合性抗trka抗体或其片段。这种缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何药剂。例子包括紫杉醇(taxol)，细胞松弛素b(cytochalasinb)，短杆菌肽d(gramicidind)，溴化乙锭(ethidiumbromide)，依米丁(emetine)，丝裂霉素(mitomycin)，依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(tenoposide)，长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，秋水仙素(colchicin)，多柔比星(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，二羟基蒽环二酮(dihydroxyanthracindione)，米托蒽醌(mitoxantrone)，光神霉素(mithramycin)，放线菌素d(actinomycind)，1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosterone)，糖皮质激素(glucocorticoids)，普鲁卡因(procaine)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如，氨甲喋呤(methotrexate)，6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)，6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，达卡巴嗪(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)，噻替派(thioepa)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，美法仑(melphalan)，卡莫司汀(carmustine(bsnu))和洛莫司汀(lomustine(ccnu))，环磷酰胺(cyclothosphamide)，白消安(busulfan)，二溴甘露糖醇(dibromomannitol)，链脲霉素(streptozotocin)，丝裂霉素c(mitomycinc)和顺-二氯二胺铂(ii)(cis-dichlorodiamineplatinum(ii)(ddp))顺铂(cisplatin))，蒽环类(anthracyclines)(例如柔红霉素(daunorubicin)(原为：道诺霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin)))，抗生素(例如，更生菌素(dactinomycin)(原为：放线菌素(actinomycin))，博来霉素(bleomycin)，光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin(amc)))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。可以与本发明的抗体连接的治疗性细胞毒素的其它实例包括倍癌霉素(duocarmycins)，加利车霉素(calicheamicins)，美登素(maytansines)和奥里斯他汀(auristatins)及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的一个实例是可商购的(americanhomeproducts)。可以使用本领域可获得的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体连接。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙，硫醚，酯，二硫化物和含肽接头。可以选择接头，例如易于在溶酶体区室中通过低ph断裂的接头，或易被蛋白酶切割的接头，所述蛋白酶可以是例如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶b，c，d)。关于细胞毒素类型、接头和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，也参见saitog等,(2003)adv.drugdeliv.rev.55:199-215；trailpa等,(2003)cancerimmunol.immunother.52:328-337；payneg(2003)cancercell3:207-212；allentm(2002)nat.rev.cancer2:750-763；pastani&kreitmanrj(2002)curr.opin.investig.drugs3:1089-1091；senterpd&springercj(2001)adv.drugdeliv.rev.53:247-264。本发明的抗体也可以与放射性同位素连接以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射免疫缀合物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗用途的放射性同位素实例包括但不限于碘-131，铟-111，钇-90和镥-177。制备放射免疫缀合物的方法在本领域中已经建立。放射免疫缀合物的实例是可商购的，包括(edecpharmaceuticals)和(corixapharmaceuticals)，并且类似的方法可用于从本发明抗体制备放射免疫缀合物。本发明的抗体免疫缀合物可用于修饰给定的生物反应，并且药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素，蓖麻毒蛋白a，假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应调节剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(il-1)，白细胞介素-2(il-2)，白细胞介素-6(il-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，粒细胞集落刺激因子(g-csf)或其他生长因子。将这些治疗剂与抗体连接的技术是众所周知的，参见例如arnon等,"癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体",monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等,(编),pp.243-56(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等,"抗体用于药物递送",controlleddrugdelivery(第二版),robinson等.(编),pp.623-53(marceldekker,inc.1987)；thorpe,"癌症治疗中细胞毒性剂的抗体运载体:综述",monoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等.(编),pp.475-506(1985)；"有关癌症治疗中放射性标记抗体治疗性应用的分析、结果和未来前景",monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等.(编),pp.303-16(academicpress1985)和thorpe等,immunol.rev.62:119-58(1982)。另一方面，本发明提供与治疗剂如细胞毒素，药物(例如免疫抑制剂)或放射毒素一起施用的、与人trka结合的抗-trka抗体或其片段。药物组合物另一方面，本发明提供包含本发明的抗体或其片段和药学上可接受的载体的组合物，例如药物组合物。这样的组合物可以包括一种或组合的(例如两种或更多种不同的)本发明抗体和/或免疫缀合物、和/或如上所述的治疗剂如细胞毒素，药物(例如免疫抑制剂)或放射毒素。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物)的组合。本发明的药物组合物还可以在组合治疗(即，与其它药剂组合)中施用，见下文进一步的概述。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内，肌内，皮下，肠胃外，脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。取决于给药途径，活性化合物，即抗体或免疫缀合物可以包被在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其它天然条件的作用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。任何常规介质或试剂，除非与活性化合物不相容，否则均可以考虑用于本发明的药物组合物中。组合物中还可以并入增补的活性化合物。另一方面，本发明提供包含本发明的人源化抗-trka抗体或其片段和另外的药物活性剂的组合物。优选地，药物活性剂是以下中的一种或多种：a)镇痛剂，b)另一种抗trka抗体，c)ngf，d)抗癌剂，e)抗ngf抗体，如下文进一步概述。另一方面，本发明提供包含免疫缀合物和药学上可接受载体的组合物，其中所述免疫缀合物包含与治疗剂连接的与人trka结合的抗体或其片段。可以使用的免疫缀合物和治疗剂如上所述。本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基苯甲醚(bha)，丁基化羟基甲苯(bht)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(edta)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等。可用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。适当的流动性可以例如通过使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径，和通过使用表面活性剂，来保持。这些组合物还可以含有助剂，如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。为确保防止微生物存在，可以使用上述灭菌方法以及通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等来实现。此外，也可能期望在组合物中包括等渗剂如糖，氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。治疗用途和其他用途本发明的抗体可用于药物中治疗各种疾病/病症(如下面所列各种类别)。因此，本发明提供治疗下述病症的方法，其包括给有需要的受试者，适宜地哺乳动物受试者，特别是人类受试者，施用治疗有效量的本文所述抗体或衍生物，由此治疗该病症。本发明还提供本文所述的抗体或衍生物在制备用于治疗下述病症的药物中的用途。这里的术语“治疗”包括治疗现有的病症/病况。它也包括预防性治疗。它还包括改善一种或多种不良症状，即使患者的给定病症/病症没有获得治愈。例如，可以缓解或减轻疼痛。一个优选的医药用途是治疗疼痛。根据国际疼痛研究协会(“iasp”)，疼痛通常被定义为“与实际或潜在的组织损伤有关的或者根据该损伤描述的令人不愉快的感觉和情感体验，或两者兼而有之”。在所有形式的疼痛中，基本的要素是专化的高阈值受体和神经纤维的激活，以警告生物体潜在的组织损伤。炎性细胞和过程的参与是许多疼痛状态的常见因素。术语“急性疼痛”是指立即的、通常高阈值的疼痛，由例如割伤，压伤，烧伤等损伤引起或由化学刺激引起。本文所用的术语“慢性疼痛”是指，除了急性疼痛以外的、炎性和神经病理性来源的其他疼痛。慢性疼痛常被认为具有相对较长的持续时间，例如数月或数年，并且可以是连续的或间断的。本发明的抗体可用于治疗慢性疼痛或急性疼痛。优选治疗慢性疼痛。疼痛可以例如是以下任何一项或可以与之相关：炎性疼痛(inflammatorypain)，外科手术后疼痛(post-surgicalpain)，术后疼痛(post-operativepain)(包括牙痛(dentalpain))，神经病理性疼痛(neuropathicpain)，周围神经病变(peripheralneuropathy)，糖尿病性神经病变(diabeticneuropathy)，糖尿病性肾病(diabeticnephropathy)，骨折疼痛(fracturepain)，痛风关节疼痛(goutjointpain)，疱疹后神经痛(post-herpeticneuralgia)，癌症疼痛(cancerpain)，骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛，坐骨神经痛(sciatica)，与镰状细胞危象相关的疼痛(painsassociatedwithsicklecellcrises)，头痛(如偏头痛(migraines)，紧张性头痛(tensionheadache)，丛集性头痛(clusterheadache))，痛经(dysmenorrhea)，子宫内膜异位症(endometriosis)，子宫肌瘤(uterinefibroids)，肌肉骨骼疼痛(musculoskeletalpain)，慢性腰痛(chroniclowbackpain)，纤维肌痛(fibromyalgia)，扭伤(sprains)，内脏痛(visceralpain)，卵巢囊肿(ovariancysts)，前列腺炎(prostatitis)，慢性盆腔疼痛综合征(chronicpelvicpainsyndrome)，膀胱炎(cystitis)，间质性膀胱炎(interstitialcystitis)，疼痛性膀胱综合征(painfulbladdersyndrome)和/或膀胱疼痛综合征(bladderpainsyndrome)，与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛(painassociatedwithchronicabacterialprostatitis)，切口疼痛(incisionalpain)，偏头痛(migraine)，三叉神经痛(trigeminalneuralgia)，来自烧伤和/或伤口的疼痛，与创伤相关的疼痛，与肌肉骨骼疾病相关的疼痛，强直性脊柱炎(ankylosingspondilitis)，关节周围病变(periarticularpathologies)，骨转移疼痛(painfrombonemetastases)，hiv疼痛(painfromhiv)，红斑性肢痛病(erythromelalgia)或由胰腺炎或肾结石引起的疼痛，恶性黑素瘤(malignantmelanoma)，干燥综合征(sjogren'ssyndrome)，哮喘(asthma)(例如，不受控制的哮喘伴严重气道高反应性(uncontrolledasthmawithsevereairwayhyper-responsiveness))，顽固性咳嗽(intractablecough)，脱髓鞘疾病(demyelinatingdiseases)，慢性酒精中毒(chronicalcoholism)，中风(stroke)，丘脑疼痛综合征(thalamicpainsyndrome)，由毒素引起的疼痛，化疗疼痛，炎性肠病(inflammatoryboweldisorders)，肠易激综合征(irritablebowelsyndrome)，炎症性眼病(inflammatoryeyedisorders)，炎性或不稳定性膀胱病症(inflammatoryorunstablebladderdisorders)，牛皮癣(psoriasis)，具有炎症成分的皮肤不适(skincomplaints)，晒伤(sunburn)，心脏炎(carditis)，皮炎(dermatitis)，肌炎(myositis)，神经炎(neuritis)，胶原血管疾病(collagenvasculardiseases)，慢性炎性病症，炎性疼痛和相关的痛觉过敏和异常性疼痛，神经病理性疼痛和相关痛觉过敏或异常性疼痛，糖尿病性神经病疼痛(diabeticneuropathypain)，灼痛(causalgia)，通过交感神经维持的疼痛(sympatheticallymaintainedpain)，传入神经阻滞综合征(deafferentationsyndromes)，上皮组织损伤或功能障碍，呼吸、胃肠道、泌尿生殖器或血管区域的内脏运动性紊乱(disturbancesofvisceralmotility),，过敏性皮肤反应(allergicskinreactions)，瘙痒症(pruritis)，白癜风(vitiligo)，一般胃肠道疾病，结肠炎(colitis)，胃溃疡(gastriculceration)，十二指肠溃疡(duodenalulcers)，血管舒缩性(vasomotor)或过敏性鼻炎，支气管疾病，消化不良(dyspepsia)，胃食管反流(gastroesophagealreflux)，胰腺炎(pancreatitis)，内脏痛(visceralgia)和骨纤维结构发育不良(fibrousdysplasiaofbone)(fd)。疼痛可以例如是以下任何一种或与之相关：胰腺炎，肾结石，子宫内膜异位症，ibd，克罗恩病，手术后粘连，胆囊结石，头痛，痛经，肌肉骨骼疼痛，扭伤，内脏痛，卵巢囊肿，前列腺炎，膀胱炎，间质性膀胱炎，术后疼痛，偏头痛，三叉神经痛，烧伤和/或伤口疼痛，与创伤相关的疼痛，神经病理性疼痛，与肌肉骨骼疾病相关的疼痛，类风湿性关节炎，骨关节炎，强直性脊柱炎，关节周围病变，肿瘤疼痛，骨转移疼痛，hiv感染。已知有各种模型用于评估疼痛并且可用于筛选抗体/其衍生物。例如，可以使用伤害感受热板试验，例如在wo00/73344中所公开的。该实验可以根据mcmahon等人，1995(naturemed.1：774-780)，使用抗体/衍生物作为免疫粘附素进行。将抗体/衍生物皮下输注入成年大鼠的后爪为期三周或通过渗透微型泵输注。可以使用热板试验(eddy&leimbach(1953)j.pharm.exp.ther.107：385-393)——该试验模拟炎症或神经部分损伤后的痛觉过敏情况，间隔地评估伤害感受灵敏度。在这种情况下，伤害感受刺激诱发反应(舔爪和/或跳跃)，所述反应被认为比简单反射具有更高的综合协调性。根据该试验，将动物放入具有加热到所需温度(通常为56℃)的板作为基底的栏中。在对照动物(用非相关抗体处理)和用抗-trka抗体/衍生物处理的动物中测量两种反应(舔爪和跳跃)中任一种的延迟期。作为热板试验的备选方案，可以评估对福尔马林的伤害感受反应。该试验由porro&cavazzuti，1993(prog.neurobiol，41：565-607)公开，并用于wo06/137106。其涉及，在测试之前施用给定候选物，通过分析任何随后的舔爪减少来评估疼痛反应的减少。盐水通常用作阴性对照。痛觉过敏的评估可以使用承重方法来确定。小鼠通常在两肢之间均等地分配体重。在对肢体进行疼痛刺激之后，例如通过局部注射完全弗氏佐剂(cfa)或碘代乙酸钠(mia)到后爪(足底内，intraplantar)或膝关节(关节内)，重量会被重新分配以减少放置在注射肢体上的重量和增加放置在未注射的肢体上的重量。使用双足平衡测痛仪(incapacitancetester)测量承重，其中将后爪放置在分开的传感器上，并记录由两个后肢施加的平均力。承重可用于评估由足底内注射cfa引起的急性炎性痛觉过敏，由关节内注射cfa引起的慢性炎性痛觉过敏、或由关节内注射mia引起的慢性骨关节炎性痛觉过敏，如分别在实施例2,3和4中所述。机械痛觉过敏的评估可以通过多种方法进行，例如，vonfrey丝或randall-selitto痛觉计(analgesiometer)。响应于通过randall-selitto痛觉计的楔形探针施加到后爪足背表面或通过vonfrey丝施加到后爪足底表面的递增压力，测量爪回缩阈值。在对照动物和用抗-trka抗体/衍生物处理的动物中测量后爪回缩的延迟期。这些方法可用于评估慢性压迫损伤(cci)动物模型引起的机械痛觉过敏，见实施例5中详述。cci模型也是众所周知的动物模型。它涉及坐骨神经的慢性压迫，并且用于在啮齿动物例如小鼠或大鼠中诱导神经病理性性质的慢性疼痛。该模型由bennett&xie于1998年在pain33：87-107中描述。其已经在例如wo06/131592中使用。许多神经病理性疼痛状态的一个主要特征是，通常无害的冷刺激开始引起疼痛。对非疼痛刺激的反应增加被称为异常性疼痛。因此，可以用异常性疼痛的冷板试验来测量诱导的神经病理性疼痛状态的程度，见实施例5中详细描述。将动物放入具有冷却至所需温度的板的栏中，该温度可以在-5℃至15℃的范围内。在对照动物和用抗-trka抗体/衍生物处理的动物中测量后爪回缩的延迟期。通常，在5℃及以下的表面温度，回缩的延迟期变得与基线不同。本发明抗体可用于治疗癌症，神经元病症，阿尔茨海默氏病，糖尿病，糖尿病性肾病，病毒性疾病，hiv介导的病症，麻风或炎性疾病。此外，抗体还可用于治疗可能与增加的ngf水平相关的其它疾病，包括例如红斑狼疮，带状疱疹(shingles)，带状疱疹后神经痛(postherpeticneuralgia)和痛觉过敏。各种癌症表达trka。trka与ngf的相互作用可参与肿瘤发展(例如前列腺癌和胰腺癌的发展)。实际上在某些形式的癌症中，过量的ngf可以促进神经纤维的生长和浸润。通过阻断ngf的作用，可以显著减少神经瘤的形成。此外，作为简单提供阻断作用的备选方案，可以将抗体与细胞毒性剂偶联，并可用于靶向表达trka的癌细胞。然而，将抗体与毒素偶联并非必需的。adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)可以由免疫应答引起，其中抗体通过包被靶细胞可以使其易受免疫系统攻击(例如通过t细胞，通过补体激活等)。优选治疗的癌症是前列腺癌，甲状腺癌，肺癌，催乳素瘤(prolactinoma)，黑素瘤或骨癌疼痛，包括与骨转移相关的癌症疼痛。待治疗的优选癌症是骨癌疼痛，包括与骨转移相关的癌症疼痛。抗体也可用于治疗包括神经变性疾病的各种神经元病症，例如，抗体可用于减少神经瘤的形成。它们也可用于治疗阿尔茨海默病或用于神经再生治疗。本发明的抗体可用于这些治疗中，以减少不希望的ngf激动剂作用(另见下文的“组合疗法”部分)。此外，如上所述，抗体可用于治疗神经病理性疼痛。这可与神经系统的病变或功能障碍有关。ngf在糖尿病和麻风病治疗上具有潜在用途，但ngf具有不希望的激动剂性质，包括增加疼痛敏感性，而这可以通过使用本发明的抗体予以避免。另一个应用是治疗炎症。ngf在炎症过程发生的周围位置由肥大细胞，成纤维细胞和其他细胞类型释放。特别是，肥大细胞看起来发挥了重要作用。它们产生ngf，同时在其表面表达功能性trka受体。看起来，ngf/trka系统通过自分泌阳性反馈机制介导肥大细胞活化，从而允许疼痛产生性炎症信号被局部放大。可以治疗的炎症的实例包括尿道和盆腔区域的炎症形式，骨关节炎，多发性硬化，结肠炎，炎性肠病，膀胱炎，湿疹，接触性皮炎，关节炎，包括慢性关节炎和类风湿性关节炎，克罗恩病，牛皮癣和哮喘。本发明的抗体可用于如上所述的治疗中以减少ngf的不期望的激动剂作用。本发明的抗体或其衍生物可与一种或多种其它活性剂，例如药物活性剂在组合治疗中一起使用。它们可用于药物中同时，顺序或协调施用。例如，抗体或衍生物可以与镇痛药，如镇痛阿片类或非阿片类镇痛剂组合。在wo06/137106中公开了，少量的能够阻断trka生物活性的分子可以增强阿片类物质的镇痛作用。这类镇痛阿片类物质包括一种或多种选自以下的化合物：吗啡(morphine)，可待因(codeine)，二氢可待因二乙酰吗啡(dihydrocodeinediacetylmorphine)，氢可酮(hydrocodone)，氢吗啡酮(hydromorphone)，左啡诺(levorphanol)，羟吗啡酮(oxymorphone)，阿芬太尼(alfentanil)，丁丙诺啡(buprenorphine)，布托啡芬(butorphanol)，芬太尼(fentanyl)，舒芬太尼(sufentanyl)，哌替啶(meperidine)，美沙酮(methadone)，萘丁美酮(nabumetone)，丙氧芬(propoxyphene)，戊唑星(pentazocine)；及其药学上可接受的衍生物(例如其药学上可接受的盐)。合适的非阿片类镇痛剂包括非类固醇炎症药物(nsaid)以及其它镇痛药如对乙酰氨基酚(acetaminophen)。常用治疗急性炎性疼痛的nsaid包括阿司匹林(asprin)，布洛芬(ibuprofen)，吲哚美辛(indomethacin)，萘普生(naproxen)和酮洛芬(ketoprofen)，治疗慢性炎性疼痛的包括塞来昔布(celecoxib)和美洛昔康(meloxicam)。再一组合是本发明的一种或多种抗体与一种或多种其它抗体的组合。优选的组合是与一种或多种其它抗trka和/或抗ngf抗体的组合。相对于用单一抗体的治疗，这样的组合可以在一种或多种本文所述病症的治疗中提供增加的功效。例如，可以使用在本文所用的试验程序中发现最为有效的两种或更多种抗体的组合。再一组合是本发明的抗体与ngf的组合。如上所述，已经提出使用ngf治疗各种疾病，包括阿尔茨海默氏病，糖尿病，麻风病等，但已经注意到由于针对周围靶标的激动剂特性引起了疼痛敏感性的增加。再次，通过使用本发明的抗体或衍生物，可以降低疼痛敏感性，从而使得基于ngf的疗法更有吸引力。再一组合是本发明的抗体与抗癌剂如烷化剂，抗代谢物，拓扑异构酶ii抑制剂，拓扑异构酶i抑制剂，抗有丝分裂药物或铂衍生物的组合。本发明的抗体可以通过任何合适的途径施用。这包括(但不限于)腹膜内，肌内，静脉内，皮下，气管内，口服，肠内，胃肠外，鼻内或真皮给药。典型地可以通过注射(腹膜内或颅内——通常在脑室中——或心包内或囊内)液体制剂或通过吞咽固体制剂(以丸剂，片剂，胶囊剂的形式)或液体制剂(以乳液和溶液的形式)，施用抗体以局部应用。肠胃外给药的组合物通常包含溶解在相容的、优选水性的溶液中的免疫球蛋白溶液。这些制剂中抗体/衍生物的浓度可以从小于0.005％至15-20％w/v变化。这主要根据液体的体积、粘度等，以及根据所需的特定给药方式来选择。或者，可以制备抗体以固体形式施用。抗体可以与不同的惰性或赋形物质组合，其可以包括配体如微晶纤维素，明胶或阿拉伯胶；受体(recipient)如乳糖或淀粉；试剂诸如藻酸，primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁，胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷和水杨酸甲酯。其他药物施用系统包括水凝胶，羟甲基纤维素，脂质体，微囊，微乳液，微球等。如果病症是局域化的，则直接在病症累及部位/紧靠该部位进行局部注射是优选的施用方式。抗trka抗体适宜全身施用。全身施用可以通过注射进行，例如连续静脉输注，快速静脉浓注，皮下或肌内注射。备选地，也可以使用其它施用形式(例如经口，经粘膜，通过吸入，舌下等)。然而，如果需要，可以通过在受累组织附近局部给药(例如关节内注射或皮下、肌内注射)，递送抗体/衍生物。抗-trka抗体/衍生物可以适宜地配制成适合于预定给药途径的药物组合物。注射用溶液适宜地含有溶解或分散在水性介质(如注射用水)中的抗体/衍生物，所述介质酌情可以含有合适的缓冲液和摩尔浓度调节剂(例如磷酸盐，盐和/或葡萄糖)。治疗方案(即剂量，时间和重复)可以表示为，经由选择的给药途径、对产品的单次或重复施用(例如注射)。剂量施用的间隔可以根据临床反应的程度和持续时间、以及具体个体和个体临床史进行修改。适宜地，抗trka抗体/衍生物具有长的作用持续时间。特别地，如从动物研究确定的，抗体的临床效果可以在施用后延长至多达21天。此外，施用后，抗trka抗体表现出临床益处的时间可以，比在相关生物基质例如血清或血浆中可以检测到其存在的时间长。鉴于预期的长作用时间(即，效应适宜地持续至少一周，或优选至少两周，例如至少三周或至少四周)，合适地可以以不超过每周一次的频率，例如不超过每两周一次或每三周一次或每四周一次，将抗体/衍生物施用于受试者。抗trka抗体/衍生物的合适日剂量通常为0.1mg/kg至10mg/kg体重。用于治疗急性和慢性炎性疼痛的抗-trka抗体合适剂量为至少0.01mg/kg(参见实施例2和3)。用于治疗骨关节炎疼痛的抗-trka抗体合适剂量为至少0.01mg/kg(参见实施例4)。用于治疗神经病理性疼痛的抗-trka抗体合适剂量为至少0.01mg/kg，优选0.1mg/kg，最优选1mg/kg(参见实施例5)。这些剂量仅与小鼠的体内状况有关。本发明涉及人源化抗-trka抗体在治疗急性炎性疼痛中的用途，其中痛觉过敏可以被有效地逆转至与施用nsaid所观察到的程度相同的程度。本发明还涉及人源化抗-trka抗体在治疗慢性炎性疼痛中的用途，其中痛觉过敏可以被有效地逆转到与施用nsaid所观察到的程度相同的程度。本发明还涉及人源化抗trka抗体在治疗骨关节炎疼痛中的用途，其中痛觉过敏可以被有效地逆转到与施用普瑞巴林和阿片剂所观察到的程度相同的程度。本发明还涉及人源化抗-trka抗体在治疗神经病理性疼痛中的用途，其中痛觉过敏可以被有效地逆转到与施用普瑞巴林所观察到的程度相同的程度。现具体就肿瘤的给药而言，施用可以是直接和局部注射到肿瘤或肿瘤部位附近的组织中。对于全身给药，剂量可以从每天0.05mg/kg到每天500mg/kg，但在该范围的较低区域中的剂量是优选的，因为它们更易于施用。可以校准剂量，例如以保证抗体/衍生物在血浆中的特定水平(约5-30mg/ml，优选在10-15mg/ml之间)和保持该水平一段给定时间直到达到临床结果。用于测量或评估胰腺或前列腺肿瘤阶段的有效方法可以基于对血液中前列腺特异性抗原(psa)的测量，基于对生存时间的测量(对于胰腺肿瘤)，基于对减缓或抑制扩散的测量(对于两种肿瘤类型情况下的转移)。对于在肿瘤部位的直接注射，剂量取决于不同的因素，包括肿瘤的类型、阶段和体积以及许多其他变量。根据肿瘤体积，典型的治疗剂量可以从0.01mg/ml至10mg/ml注射剂量间变化，这些剂量可以以必要的频率施用。无论治疗的性质如何，与非人源化抗体相比，人源化抗体的清除可以缓慢得多，并需要更低的剂量来维持血浆中的有效水平。此外，使用高亲和力抗体时，与具有较低亲和力的抗体相比，施用可以以较低的频率和较少的量进行。每种抗体/衍生物的治疗有效剂量可以由熟练医师在治疗期间确定。如果需要，可以减少剂量(例如以降低副作用)或增加剂量(以增加治疗效果)。在施用前，本发明抗体的制剂可通过冷冻或冻干来储存。然后，可以在临使用前在合适的缓冲液中重构。鉴于冻干和重构可能导致活性丧失，可以通过对抗体的施用水平进行校准来作出补偿。(对于常规免疫球蛋白，igm抗体倾向于比igg抗体具有更大的活性损失。)也可以指定保存期限，以避免使用经过一定储存时间后的抗体。本发明的抗体或其衍生物可以用于上述就医药用途所讨论的任何疾病/病症的诊断或预后。例如，可以用于促进trka阳性肿瘤标志物的检测(作为阿尔茨海默病等爆发的早熟标志)。也可用于诊断cipa(“先天性痛觉不敏感合并无汗症”)。cipa是一种遗传性隐性常染色体综合征，其特征为复发性间歇发热，脱水，缺乏对伤害感受性刺激的反应，智力低下和自残倾向。该疾病由trka基因突变引起。实际上，本发明的抗体或衍生物可用于涉及trka异常表达(与健康个体或健康组织样品中的trka表达相比)或trka相关异常活性的、范围宽泛的各种病症的诊断或预后。因此，本发明在其范围内包括方法，所述方法包括获得来自患者的生物样品并使样品与本发明的抗体或衍生物接触。如果需要，可以固定抗体/衍生物。该方法然后可以包括以定量或定性的方式测定抗体/衍生物与所述样品的结合。如果需要，这可以参考和/或相对于阳性对照(指示健康状态)或阴性对照(指示病症的存在/可能性)进行。为了诊断目的，抗体可以用可检测的标记物标记，或者可以不标记。(本文中使用的术语“标记物”包括标记、或任何其它可检测部分/可触发可检测变化的部分。)制品和药盒在本公开的另一个实施方案中，包含本发明的抗体或其片段、组合物或免疫缀合物的制品，用于治疗一种或多种上述疾病/病症。所述制品可以包括容器和在容器上或与容器结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶或注射器。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳可以有效治疗病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂可以是本文所述的抗体。标签或包装插页可以指明组合物可用于治疗所选的状况。此外，制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文的抗体，和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含该抗体之外的治疗剂。本公开的该实施方案中制品可以进一步包括指明第一和第二组合物可以组合使用的包装插页。这样的治疗剂可以是前面章节中描述的任何辅助治疗(例如，溶血栓剂，抗血小板剂，化学治疗剂，抗血管生成剂，抗激素化合物，心脏保护剂和/或哺乳动物免疫功能的调节剂，包括细胞因子)。或者或另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的观点期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针头和注射器。包含本发明的抗体、组合物或免疫缀合物和使用说明书的药盒也在本发明的范围内。该药盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或本发明的一种或多种另外的抗体(例如，与第一抗体结合trka抗原上不同表位、具有互补活性的抗体)。在不进一步描述的情况下，相信本领域普通技术人员已经可以使用前述描述和以下举例说明性示例，制备和利用本公开的试剂和实施所要求保护的方法。提供以下实施例以便于本公开的实施，但是这些实施例不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。实施例本文描述的人源化抗trka抗体代表一个新的抗trka抗体亚组，其在抑制trka的功能性激活方面高度有效。在wo00/73344中公开的称为mnac13的抗-trka小鼠单克隆抗体、及在wo09/098238中公开的其人源化变体，不能达到相同的抑制水平，而在某些情况下这是期望的，例如对于治疗疼痛和相关的癌症疼痛，其中高水平的抑制可导致治疗效果的提高。因此，需要开发可以高度抑制trka的人源化抗trka抗体。针对抗体介导的对trka功能性激活的抑制作用，其评估方法是本领域众所周知的，包括tf-1细胞增殖测定试验，其中使用因子依赖性人红白血病细胞系tf-1，测定抗体阻断细胞表面trka/β-ngf介导的细胞增殖的能力(kitamurat等人，(1989)j.cellularphysiology140(2)：323-34)。在wo09/098238中公开的人源化抗体已经在tf-1增殖测定中表现出抑制活性，其中在mnac13小鼠抗体的人源化变体中bxhvh5vl1候选物具有最高抑制程度。此外，使用表面等离子体共振(spr)技术，已经证明，wo09/098238中公开的人源化抗体与trka的细胞外区域直接结合。因此，为了设计小鼠mnac13抗体的新人源化变体，使所述变体与bxhvh5vl1人源化变体相比具有改善的人trka结合亲和力以及更重要地在tf-1细胞增殖测定中具有提高的抑制效力，使用了wo09/098238中公开的人源化抗体的一个选定子集作为工程化的起点。“bxh”之后的字母是vh或vl或两者。vh或vl分别表示具有特定重链可变结构域(由具体数字指示)的ighg1同种型重链，例如bxhvh5，或具有特定轻链可变结构域(由具体数字指示)的κ同种型轻链，bxhvl1。当在“bxh”之后给出带具体数字的vh以及带具体数字的vl时，例如bxhvh5vl1，其表示由特定重链和轻链组合组成的特定抗体分子，例如，bxhvh5vl1抗体是指具有bxhvh5重链和bxhvl1轻链的抗体。基于wo09/098238中描述的vh和vl可变结构域的选定子集新工程化构建的人源化变体，称为“gbr”抗体。相同的命名系统对于gbr抗体是有效的。在本文所用的可变重链结构域中实施的具体取代在括号中进一步指出。除非另有说明，所有gbr抗体均为ighg1重链同种型，具有κ同种型轻链。实施例1：抗体工程化从wo09/098238中公开的40种抗体中，选择5种人源化抗体作为工程的输入：具有重链可变结构域vh1(seqidno：1)和轻链可变区vl1(seqidno：6)的bxhvh1vl1，具有重链可变结构域vh3(seqidno：3)和轻链可变结构域vl1的bxhvh3vl1，具有重链可变结构域vh3和轻链可变结构域vl3(seqidno：8)的bxhvh3vl3，具有重链可变结构域vh5(seqidno：5)和轻链可变区vl1的bxhvh5vl1，以及具有重链可变结构域vh5和轻链可变区vl1的bxhvh5vl3。本文所用的mnac13小鼠抗体具有seqidno：20的重链可变结构域mnac13vh、seqidno：21的重链和seqidno：22的轻链。令人惊讶的是，所有工程化抗体均受益于重链可变结构域中37位缬氨酸至丙氨酸的简单改变(小鼠回复突变)(kabat编号(kabatea等人，同上引文))。如通过spr测量的，该取代具有在所有工程化抗体中广泛增强对人trka的亲和力的独特性质。更重要的是，对于大多数变体，该相同取代导致在tf-1细胞增殖测定中效力的增加，而且出乎意料地，当引入到与vl1结构域配对的vh5结构域中(gbrvh5(v37a)vl1抗体)时，与bxhvh5vl1人源化抗体相比，这是十倍的增加。值得注意的是，相同的gbrvh5(v37a)vl1抗体，与mnac13小鼠抗体相比，在tf-1细胞增殖测定中也显示出了三倍的效力增加。由于人源化抗体中小鼠来源的残基数量的增加可以引起其免疫原性风险增加(hardingfa等，(2010)mabs2(3)：256-65)，因此进一步研究以减少工程化抗体中的小鼠残基数量。在gbrvh5(v37a)vl1抗体中3位小鼠残基赖氨酸变化为谷氨酰胺，导致gbrvh5(k3q，v37a)vl1抗体，其与bxhvh5vl1人源化抗体相比具有相同数目的小鼠残基，但结合亲和力增加，并具有与亲代小鼠mnac13抗体相当的fab热稳定性，以及增加的抑制效力。最后，由于抗体介导的效应子功能可能不利于其中仅需要trka阻断的治疗，所以希望开发出可抑制trka、但不介导免疫细胞杀伤trka表达细胞的抗trka抗体。人ighg4同种型不携带效应子功能如adcc或cdc，因此当不需要效应子功能或效应子功能不利于治疗时，它是特别合适的抗体形式。然而，天然存在的人ighg4同种型有一个缺点，被称为“fab交换”现象，其中天然存在的人ighg4抗体已知在体内可以交换重链(labrijnaf等，(2009)nat.biotechnol.27(8)：767-71)。阻断重组和内源人ighg4之间重链交换的方法是本领域已知的，并且已知交换可以通过如下方式有效地阻断：将铰链区中位置228处的丝氨酸残基取代为脯氨酸残基(eu编号，edelmangm等人，同上引文)，从而模拟人ighg1同种型中的构象铰链结构(lewiskb等，(2009)mol.immunol.46(16)：3488-94)。gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1被格式化为ighg4s228p免疫球蛋白形式用于上述治疗目的，并显示出与其ighg1同种型对应物相当的效力，从而使得gbrvh5(v37a)vl1ighg4s228p和gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p抗体适用于其中仅需要阻断trka的人类治疗。方法设计工程化变体使用结构同源物建模服务器swiss-model(arnoldk等人，(2006)bioinformatics22(2)：195-201；http：//swissmodel.expasy.org)，设置为自动化模式,计算了vh5-vl1可变结构域对的3d模型。检索到的模型模板是实验解析的mnac13fab3d结构(pdb代码1seq，www.pdb.org，bermanhm等人，(2000)nucleicacidsres.28(1)：235-42，covaceuszachs等，(2005)proteins58(3)：717-27)。mnac13vh，vh1，vh3，vh5和种系vh3-023*01(seqidno：23)结构域的序列比对显示，在位置3、5、19、37、40、42、44、49、50、52a、53、60、62、74、82a、83、84、89和94(kabat编号)不同的氨基酸内容。模型分析使得可以基于位置对cdr区和/或重链-轻链可变结构域组装(packing)的推定影响来选择位置的子集。该位置子集为：3，37，40，42，44，49，50，60，62，89和94(kabat编号)。由此，工程化抗体具有在上述可变结构域序列(分别具有seqidno：1,3,5的vh1，vh3和vh5)中在单个或多个位置包含取代的重链可变结构域，其中所述位置选自上述位置子集。更具体地，工程化抗体由与两个先前提及的轻链可变结构域vl1或vl3(seqidno6和8)之一配对的上述取代的重链可变结构域组成。分子生物学使用wo09/098238中描述的bxhvh1，bxhvh3和bxhvh5的载体dna作为pcr模板，通过标准诱变技术，产生了工程化重链可变结构域编码dna序列(cdna)。类似地，从wo09/098238中描述的bxhvl1和bxhvl3的载体dna，直接扩增了轻链可变结构域cdna。使用pcr装配技术，将可变结构域cdna进一步组装在其相应恒定结构域cdna序列的上游。最后，将完整的重链和轻链cdna分别连接至基于修饰的pcdna3.1载体(invitrogen，ca，usa)的独立载体中，所述载体携带cmv启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号。对于轻链特异性载体，通过使用bamhi和bsiwi限制酶位点将目的轻链可变结构域cdna连接在κ轻链恒定结构域cdna前，从而允许κ同种型轻链表达；而对重链特异性载体进行工程化，使用bamhi和sali限制酶位点将目的重链可变结构域cdna连接到编码ighg1ch1，ighg1铰链区，ighg1ch2和ighg1ch3恒定结构域的cdna序列前面。在重链和轻链表达载体两者中，由含有bamhi位点的鼠vj2c前导肽驱动分泌。bsiwi限制酶位点位于κ恒定结构域中；而sali限制酶位点位于ighg1ch1结构域中。通过在上述重链特异载体中将编码ighg1ch1，ighg1铰链区，ighg1ch2和ighg1ch3恒定结构域的cdna序列替换为编码ighg4ch1、具有s228p取代的ighg4铰链区、ighg4ch2和ighg4ch3恒定结构域的cdna序列，获得具有取代s228p的ighg4免疫球蛋白形式。取代s228p通过标准pcr诱变技术，引入人ighg4重链cdna模板中。抗体生产对于抗体的瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(polyplus转染，illkirchcedex，france)，将等量的重链和轻链载体共转染入悬浮适应化的hek293-ebna1细胞(目录号：crl-10852)中。典型地，用含有50μg编码重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体的dna-混合物，转染密度为0.8-1.2百万细胞/ml的100ml悬浮细胞。在将编码抗体基因的重组表达载体导入宿主细胞后，通过进一步培养细胞4至5天，产生抗体，以允许抗体分泌到培养基(ex-cell293，hek293-无血清培养基；sigma，buchs，switzerland)中，所述培养基补充有0.1％pluronicacid，4mm谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素)。使用重组蛋白astreamline介质(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)从无细胞上清液中纯化抗体，并在测定之前缓冲交换成磷酸盐缓冲盐水。使用差示扫描量热法进行稳定性测试在vp-dsc差示扫描微量热计(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)上进行量热测量。细胞体积为0.128ml，加热速率为200℃/h，过压保持在65p.s.i。所有抗体在pbs(ph7.4)中以1mg/ml的浓度使用。通过与省略了蛋白质的含有相同缓冲液的重复样品进行比较，估计了每种蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析偏摩尔热容和熔融曲线。在origin软件(v7.0，gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)中使用非二态(non-twostate)模型进一步分析之前，对温谱图进行基线校正和浓度归一化。spr的亲和力测量使用spr分析，测量不同抗体(小鼠和人源化抗体)的结合动力学的结合和解离速率常数。在室温下，在biacore2000仪器(gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)上测量小鼠抗体和人源化变体的结合动力学，并用biaevaluation软件(v4.1，gehealthcareeuropegmbh，glattbrugg，switzerland)进行分析。由于抗体是二价分子，因此最好将抗体固定在传感器芯片上。如果使用抗体作为分析物，除了亲和力之外，spr测量值还将带有效价因素。虽然biacore评估软件可以模建二价性并提取亲和力常数，但优选尽可能地使用单价分析物来规避任何价性偏差。为此目的，消化在hek293-ebna1细胞中制备的重组人trka-fc融合蛋白(seqidno：24)，产生单价形式的人trka胞外区。该融合蛋白由融合到ighg1fc区的人trka胞外区(seqidno：25)组成，其中在两个区之间包含蛋白酶特异性切割序列(tev切割蛋白酶氨基酸序列：enlyfqs)。蛋白酶切割后，使用标准色谱技术，包括蛋白质-a步骤以去除fc片段，将单价形式的人trka胞外区进一步纯化至均质。最后，将单价人trka胞外区蛋白质的缓冲液交换为pbs，然后在biacore运行缓冲液中稀释用于亲和力测定。样品纯度、均质性和分子量通过sds-page和大小排阻分析证实。抗体通过捕获其fc部分来固定，以允许在传感器芯片表面上正确取向。使用单克隆小鼠抗人igg(fc)抗体传感器芯片捕获所有人源化抗体(无论其同种型)(人抗体捕获试剂盒，目录号br-1008-39，gehealthcareeuropegmbh)，并且使用多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白传感器芯片捕获mnac13小鼠抗体(小鼠抗体捕获试剂盒，目录号br-1008-38，gehealthcareeuropegmbh)。数据(传感图：fc2-fc1)拟合1:1langmuir模型(具有传质，尽管传质试验中传质限制很小)。考虑每次测量开始时在捕获的抗体上的实验变异，在所有拟合中，将rmax值设置为局部的。解离时间至少为350秒。进行一式三份重复测量，并包括零浓度样品用于参考。使用chi2和残差值来评估实验数据和各结合模型之间拟合的质量。tf-1细胞增殖测定将悬浮适应化的tf-1细胞(号：crl-2003)培养在含有10％fcs和5ng/mlrhuβngf(重组人β-ngf，r&dsystemseuropeltd，abingdon，uk)的完全rpmi培养基中。对于测定，将tf-1细胞在没有人β-ngf的完全rpmi中孵育5小时。在该饥饿步骤之后，将细胞离心并接种在具有各种浓度的各种抗体和固定浓度的重组β-ngf的平底96孔板中。将tf-1细胞以7000个细胞/孔的密度接种，并且总抗体-细胞混合物体积为200μl，具有5ng/ml人β-ngf(终浓度)。在37℃加上co2补充，孵育该混合物4天。在第3天，将比色染料alamarblue(abdserotec，morphosysabdgmbh，düsseldorf，germany)加入到每个孔中，孵育条件没有任何变化。在第4天，在bio-teksynergytm2分光光度计/微板读数仪(biotekinstrumentsgmbh，luzern，switzerland)上，使用530至560nm激发波长和590nm发射波长，读取荧光。进行实验至少两次，并且针对每个抗体浓度进行一式三份重复测量。结果工程化构建基于bxhvh5vl1的新人源化抗trka抗体基于vh5-vl1可变结构域对的3d模型，选择了在不同重链可变结构域(vh1，vh3和vh5)中共同的一组3d位置，用于小鼠到人以及人到小鼠突变；该组位置由以下位置组成：3，37，40，42，44，49，50，60，62，89和94(kabat编号)。关于本文使用的取代组合，其工程化策略所基于的是不同取代的互补性(就取代在cdr区和/或可变结构域组装(packing)和/或免疫原性上的推定影响而言)。在第一种方法中，在ighg1同种型形式中，在bxhvh5vl1候选物中工程化了小鼠到人和人到小鼠的突变。进行的小鼠到人突变包括以下取代：k3q，t40a，r44g，a49s，y50a，p60a，t62s和r94k。基于这些单取代或取代组合的一些工程化抗trka抗体的生产产量和亲和力分别显示在表1和2中。组合大多数或所有小鼠到人突变，导致了生产产量差，完全丧失与trka的结合。例如，小鼠到人取代a49s与y50a的组合诱导了结合的完全丧失，而且该结合丧失不能被其他小鼠到人取代拯救；而且小鼠到人取代k3q、t40a、r44g、和r94k，单独或与其他小鼠到人取代组合，不导致亲和力的任何改善。进行的人到小鼠突变包括以下取代：v37a，g42e和v89l。人到小鼠取代v37a具有最积极的影响，导致亲和力增加至少两倍(kd降低至少两倍)(表2和图1)；对于gbrvh5(v37a)vl1ighg1抗体，记录到2.5倍的亲和力增加。当将人到小鼠取代v37a与小鼠到人取代p60a和t62s组合时，亲和力的这种增加被消除，但是当与小鼠到人取代k3q和/或r44g进行组合时亲和力的这种增加得以维持。总之，这些结果确定了位置49和50的重要性(在允许结合方面)以及人到小鼠取代v37a的独特性质(将bxhvh5vl1的亲和力提高至少两倍)。由于抗体介导的效应子功能可能不利于仅需要阻断trka的治疗，所以将gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1重新格式化为具有s228p取代的上述ighg4同种型。两个工程化抗体都显示出与其ighg1同种型对应物相似的亲和力，表明v37a取代引起的亲和力改善不受同种型转换的影响。基于bxhvh1vl1，bxhvh3vl1,bxhvh3vl1和bxhvh5vl3构建新人源化抗trka抗体在第二种方法中，将v37a取代引入源自wo09/098238的其他选择的候选物中，并且以bxhvh5vl1和mnac13抗体为基准，通过spr检测了工程化抗trka抗体的亲和力。表3和4分别显示了v37a取代抗体的产量和亲和力。虽然工程化抗体在其生产产量方面存在差异，但所有工程化抗体在引入v37a取代后都表现出了亲和力的提高。对于bxhvh3vl1，bxhvh1vl1，bxhvh3vl3和bxhvh5vl3，亲和力分别提高了8％，20％，30％和55％。因此，人到小鼠取代v37a不仅在bxhvh5vl1中引入时导致了亲和力增加，而且最出乎意料地也在所有人源化变体中导致了亲和力增加。值得注意的是，gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1，以ighg1或ighg4s228p同种型形式，具有与mnac13小鼠抗体的测定亲和力相匹配的亲和力(表2和表4)；与bxhvh5vl1抗体相比，两者均增加至少两倍(kd分别降低2.5至2.7倍)。表3和图2包括在工程化抗体中测量的fab部分的熔解温度。单克隆抗体熔解曲线是其同种型所特征性，但是fab片段的中点熔解温度(tm)甚至在全长免疫球蛋白中也可以容易地鉴定(garbere和demarestsj(2007)biochem.biophys。res。commun。355(3)：751-7)。使用fab部分的中点熔解来监测工程化候选物的稳定性。gbrvh5(v37a)vl1和gbrvh5(k3q，v37a)vl1fab片段分别展示了在73.6和73℃的单个过渡，两者具有相当的热稳定性，并且该fab过渡的形状和幅度与通常针对紧凑折叠的fab片段所观察到的协同解折叠一致，表明该工程化方法在保持fab稳定性方面是成功的。当比较gbrvh5(v37a)vl1或gbrvh5(k3q，v37a)vl1的fabtm与mnac13fabtm(74℃)时，这进一步得到举例证明，tm差异在1℃或以下。工程化抗trka抗体的功能测试测定工程化抗trka抗体在tf-1细胞增殖测定中抑制trka功能性激活的能力(图3)。计算每个曲线的半最大抑制浓度(ic50)——化合物抑制生物学功能的有效性的量度，结果列于表5。注意，gbrvh1(v37a)vl1由于其通过srp测量具有较低的亲和力而未测定。发现gbrvh5(v37a)vl1是最佳表现者，之后是具有相同ic50的gbrvh5(k3q，v37a)vl1，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p和gbrvh3(v37a)vl1。gbrvh3(v37a)vl3和gbrvh5(v37a)vl3抗体具有略高的ic50，但是所有测试的工程化抗体的表现均优于bxhvh5vl1，其中gbrvh5(v37a)vl1十倍优于bxhvh5vl1。值得注意的是，与mnac13小鼠抗体相比，gbrvh5(v37a)vl1抗体在tf-1细胞增殖测定中也显示出了三倍的效力增加。当与该小鼠亲本抗体相比时，所有v37a变体具有相当或更好的ic50。表1：来自选择的基于bxhvh5vl1的工程化抗-trka抗体的产量；除非另有说明，所有抗体均为ighg1同种型。(*)具有s228p取代的ighg4同种型。+包括如实施例1所述的小鼠到人和人到小鼠突变。表2：选择的基于bxhvh5vl1的工程化抗trka抗体的亲和力；除非另有说明，所有抗体均为ighg1同种型。(*)具有s228p取代的ighg4同种型。n.b.表示无结合。表3：来自选择的工程化抗trka抗体的生产产量和fab热稳定性数据；所有抗体均为ighg1同种型。表4：v37a工程化抗trka抗体的亲和力；所有抗体均为ighg1同种型。抗-trka抗体kon(1/ms)koff(1/s)kd(nm)mnac136.02x1041.09x10-318bxhvh1vl13.13x1041.33x10-2426gbrvh1(v37a)vl11.96x1046.63x10-3338bxhvh3vl14.65x1046.19x10-3133gbrvh3(v37a)vl13.82x1044.71x10-3123bxhvh3vl33.14x1044.59x10-3134gbrvh3(v37a)vl33.1x1042.95x10-395bxhvh5vl11.04x1054.26x10-340.9gbrvh5(v37a)vl11.4x1052.25x10-316gbrvh5(k3q，v37a)vl11.7x1052.62x10-315.4gbrvh5vl36.23x1043.95x10-363gbrvh5(v37a)vl37.45x1042.05x10-328表5：v37a工程化抗trka抗体的tf-1细胞增殖测定ic50；除非另有说明，所有抗体均为ighg1同种型。(＊)具有s228p取代的ighg4同种型。n.d.表示未测定。抗-trka抗体ic50(μg/ml)mnac130.23bxhvh5vl10.73gbrvh1(v37a)vl1n.d.gbrvh3(v37a)vl10.15gbrvh3(v37a)vl30.29gbrvh5(v37a)vl10.075gbrvh5(k3q，v37a)vl10.15gbrvh5(k3q，v37a)vl1(*)0.15gbrvh5(v37a)vl30.22实施例2：人源化抗trka抗体逆转通过足底内注射cfa诱发的爪急性炎性痛觉过敏。将完全弗氏佐剂(cfa)足底内注射入小鼠的一只后爪，引起急性炎性痛觉过敏，其可以使用承重方法进行评估。初次用于实验的(naive)小鼠通常将体重均等地分配在两只后爪之间。然而，当cfa注射的后爪发炎和疼痛时，重量被重新分配，以减轻放置在注射的爪(同侧)上的重量，并增加在非注射(对侧)后爪上的重量。方法使用双足平衡测痛仪(incapacitancetester)(lintoninstruments，uk)测量通过每个后肢承受的重量。将小鼠放置在平衡测痛仪中，后爪分开放置在单独的传感器上，并且记录两秒钟内由两个后肢施加的平均力。使初次用于实验的(naive)amb1小鼠在其饲养笼中适应操作室，随意取食和饮水。通过将小鼠trka的外显子1替换为其人对应物的外显子1而产生amb1小鼠，由此该小鼠仅表达人trka蛋白。经几天适应平衡测痛仪。在诱导损伤之前取基线承重记录。炎性痛觉过敏通过足底内注射cfa(20ul的1.5mg/ml溶液)到左后爪来诱导。采取处理前承重读数来评估cfa后23小时的痛觉过敏。然后在拉丁方设计中根据cfa窗口对动物进行排序和随机化分组。cfa后24小时，通过单次腹膜内注射0.1mg/kg同种型对照或0.0001,0.001,0.01和0.1mg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228pi.p.(10ml/kg剂量体积)，处理动物。非选择性nsaid吲哚美辛以10mg/kgp.o用作阳性对照(5ml/kg剂量体积)。在抗体/药物处理后第4、8、24、48、72、96和120小时读取承重读数。盲法进行行为评估。对于同侧和对侧后爪采集承重(g)读数，并表示为％承重差异(％ipsi/contra)。通过在每个时间点比较处理组与同种型对照组，分析数据。以重复测量方差分析(repeatedmeasuresanova)进行统计学分析，然后使用invivostat进行planned比较检验(p<0.05被认为显著)。结果cfa足底内注射引起了显著的痛觉过敏，如cfa后23小时检测,承重从同侧向对侧后爪迁移，导致％ipsi/contra比值下降(图4)。在cfa后24小时开始的同种型对照处理，显示对痛觉过敏没有影响。与同种型对照相比，使用0.01和0.1mg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在给药后4-48小时，观察到痛觉过敏的显著逆转。0.001mg/kg或以下剂量的抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p在逆转痛觉过敏方面无效。吲哚美辛(10mg/kg)在测试的所有时间点显示了对痛觉过敏的显著逆转。总之，抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，类似于吲哚美辛，导致了爪急性炎性痛觉过敏的显著逆转。此外，施用的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的有效剂量(0.01和0.1mg/kg)，比吲哚美辛的有效剂量(10mg/kg)，低许多倍，表明抗trka抗体可以以比该病症的标准治疗低得多的剂量施用。实施例3：人源化抗trka抗体逆转由关节内注射cfa引起的膝关节慢性炎性痛觉过敏关节内注射cfa到小鼠后肢膝关节之一，诱导慢性炎性痛觉过敏，其可以使用承重方法进行评估。当cfa注射的关节发炎和疼痛时，重量被重新分配，以减轻放置在注射(同侧)关节肢体上的重量，以及增加未注射(对侧)关节肢体上的重量。在此动物模型中这些迹象的出现被认为是临床相关的，因为它们反映了慢性炎性关节疼痛(所述疼痛与诸如骨关节炎和类风湿性关节炎之类的潜在病症相关)患者所显示的症状。方法使初次用于实验的amb1小鼠在饲养笼中适应操作室，随意取食和饮水。通过将小鼠trka的外显子1替换为人对应物的外显子1而产生amb1小鼠，由此这些小鼠仅表达人trka蛋白。习惯平衡测痛仪。临在cfa注射前取基线承重读数。使用在无菌条件下3:1混合的异氟烷和氧气麻醉动物。剃刮膝盖区域并用稀释的hibiscrub溶液清洁。左膝注射10μl10mg/mlcfa。允许动物在温暖的环境中恢复，然后返回饲养笼。在cfa后第4,7和10天使用承重方法评估动物的炎性痛觉过敏发展。根据cfa后第10天的测量，根据动物的cfa窗，对动物进行排序并随机分配至处理组。在cfa后13天，当痛觉过敏已经确立时，单次注射同种型对照抗体(10mg/kg，腹膜内)或抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p(0.01、1和10mg/kg，腹膜内)，处理动物。cox-2选择性nsaid塞来昔布以60mg/kgp.o作为阳性对照，每天两次。对于抗体处理组，在给药后4,8,24和96小时测量承重。对于塞来昔布处理组，在cfa后第13天在给药后1和8小时测量承重，然后在cfa后14-17天在给药后1小时测量承重。盲法进行行为评估。对于同侧和对侧后肢，取承重(g)读数，并表示为％承重差异(％ipsi/contra)。通过在每个时间点比较处理组与同种型对照组，分析数据。以重复测量方差分析进行统计分析，然后使用invivostat进行planned比较检验(p<0.05认为是显著的)。结果如通过同侧向对侧后肢的承重转移(导致％ipsi/contra比值下降)所检测到的，从第3天开始，cfa注射膝关节引起了明显且持久的痛觉过敏(图5)。同种型对照抗体处理对痛觉过敏无影响。使用塞来昔布(60mg/kg)，在处理过程中，在给药后1小时观察到痛觉过敏的显著逆转。单次注射0.01,1和10mg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在给药后4-72小时观察到痛觉过敏的显著逆转，在96小时与同种型对照相比，只有最高的两个剂量是显著的。总之，单剂0.01mg/kg或以上的抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，类似于多剂塞来昔布，导致了膝关节慢性炎性痛觉过敏的显著且持久的逆转。而且，与多剂60mg/kg的塞来昔布相比，只需要单剂0.01mg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p即可达到效果，这表明抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p可以以比nsaid塞来昔布(目前的标准护理)低得多的剂量和低的频率施用。实施例4：人源化抗trka抗体逆转由关节内注射mia引起的膝关节慢性骨关节炎痛觉过敏关节内注射碘乙酸钠(mia)至小鼠膝关节，导致出现与局部关节炎症相关的慢性痛觉过敏伴软骨退化。因此，在mia模型中测量的痛觉过敏非常类似于骨关节炎相关疼痛。此外，软骨退化导致具有神经病理样特征的慢性神经元损伤。普瑞巴林(一种抗惊厥药物)是推荐的治疗神经病理性疼痛的一线药物，因此在此用作比较化合物。曲马多(一种弱μ-阿片样受体激动剂)越来越多地用于治疗oa，这是因为与nsaid不同，曲马多不引起胃肠道出血或肾脏问题，也不影响关节软骨。为此，与普瑞巴林一起，使用曲马多作为抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的比较物。方法使初次用于实验的amb1小鼠在饲养笼中适应操作室，随意取食和饮水。通过将小鼠trka的外显子1替换为人对应物的外显子1，产生amb1小鼠，由此这些小鼠仅表达人trka蛋白。经几天习惯平衡测痛仪。取基线承重读数。使用在无菌条件下3:1混合的异氟烷和氧气麻醉动物。剃刮膝盖区域并用稀释的hibiscrub溶液清洁。将5μl100mg/ml(500μg)mia或盐水(假模)注射到左后腿的膝关节中。允许动物在温暖的环境中恢复，然后返回饲养笼。在mia后第3-23天，使用承重，定期间隔评估动物膝关节痛觉过敏的发展。在mia后第14天，进行承重测量，动物按照其mia反应窗口进行排序并随机分配至处理组，然后单次腹膜内注射1、10、100μg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p或100μg/kg同种型对照抗体(5ml/kg剂量体积)进行处理。作为比较物对照，动物在mia后第14天用10mg/kg曲马多或30mg/kg普瑞巴林p.o.(5ml/kg剂量体积)进行处理，然后在mia后第16-22天每隔一天以30mg/kg曲马多或100mg/kg普瑞巴林(5ml/kg剂量体积)处理。在mia后第14天在给药后4、8和24小时使用承重评估所有动物，之后抗体处理组每24小时评估，曲马多和普瑞巴林处理组在给药后1和24小时评估。盲法进行行为评估。对于同侧和对侧后肢采集承重(g)读数，并表示为％承重差异(％ipsi/contra)。通过在每个时间点(mia后第3-14天)比较处理组与假模组，分析数据，了解mia对痛觉过敏的影响。通过在每个时间点比较处理组与同种型对照组，分析给药后数据。以重复测量方差分析进行统计分析，然后使用invivostat进行planned比较检验(p<0.05认为显著)。结果如通过同侧向对侧后肢的承重转移(导致％ipsi/contra比值下降)所检测到的，将500μg的mia注射到膝关节中，从第3天开始，引起了明显的痛觉过敏。在每个时间点与同种型对照相比，单次注射10和100μg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，在给药后4小时至7天，观察到痛觉过敏的显著逆转(图6a)。1μg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p对痛觉过敏无影响。曲马多(10mg/kg)和普瑞巴林(30mg/kg)在mia后第14天在给药后1小时没有作用，但在给药后4小时显示出显著逆转痛觉过敏(图6b)。由于在mia后第14天在给药后1小时缺乏效果，故将曲马多增加至30mg/kg，普瑞巴林增加至100mg/kg，两者在mia后第16，18和20天在给药后1小时均表现出显著逆转痛觉过敏。总之，单剂10μg/kg或以上剂量的抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，类似于多剂曲马多和普瑞巴林，导致了膝关节慢性骨关节炎性痛觉过敏的显著和持久逆转。此外，与在远高得多的剂量(分别30mg/kg和100mg/kg)使用的两种药物(曲马多和普瑞巴林)的多剂给药相比，只需单剂10μg/kg抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p即可达到效果。因此，抗trka抗体可以以比曲马多和普瑞巴林低得多的剂量和低的给药频率施用。实施例5：人源化抗trka抗体逆转坐骨神经慢性压迫性损伤引起的外周神经病理性痛觉过敏和异常性疼痛外周神经病理性疼痛是由周围神经系统的损伤，功能障碍或疾病引起的慢性疼痛形式。它通常包括痛觉过敏(对疼痛刺激的反应增加)以及异常性疼痛(对非疼痛刺激的疼痛反应)。神经病理性疼痛可以通过外周神经的实验性损伤在动物中诱发，这通常可以通过松散结扎由坐骨神经的慢性压迫性损伤(cci)来实现(bennett&xie(1998)pain，33：87-107)。由于普瑞巴林是推荐的一线神经病理性疼痛治疗药物，因此在此将其用作比较化合物。方法在氯胺酮-赛拉嗪(100和10mg/kg/10ml，i.p.)麻醉下，在雄性和雌性amb1小鼠中进行cci手术。通过将小鼠trka的外显子1替换为人对应物的外显子1，产生amb1小鼠，由此这些小鼠仅表达人trka蛋白。在剃去毛发后，在股中段水平无菌暴露左坐骨神经。在神经分支前1-2毫米处围绕坐骨神经放置三根松散结扎线(使用4-0黑色丝线)。皮肤缝合后，用聚乙烯吡咯酮碘溶液处理手术部位。动物被允许在接下来的七天进行恢复。在实验前一天，使动物适应测量装置(冷板)，并记录给药前的爪回缩阈值(0小时)。然后将动物重新分成六组。第二天，单次腹膜内注射同种型对照抗体(1000μg/kg/10ml)或不同剂量的抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p(10、100和1000μg/kg/10ml)，处理动物。在7天的给药后时期，每天一次施用普瑞巴林(30mg/kg/10ml，p.o.)或盐水。在4h、24h，然后每隔一天记录给药后读数，直至给药后第7天。在所有日子在普瑞巴林或盐水施用后1小时记录给药后读数。首先记录机械性痛觉过敏的给药后读数，5分钟后记录冷异常性疼痛的读数。使用动态足底触觉测量器(plantarvonfreyinstrument；ugobasilesrl，意大利),将机械性痛觉过敏测量为引发爪回缩所需的阈值力(g)。冷异常性疼痛测量为以秒计从冷板回缩爪所花的时间(iitclifescienceinc.，usa)。结果cci手术后7天，分别通过爪回缩阈值和爪回缩延迟时间的急剧下降，观察到小鼠表现出了显著的机械痛觉过敏(图7a)和冷异常性疼痛(图7b)。抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的所有剂量都导致了机械痛觉过敏的逆转(如通过爪回缩阈值的增加所见)(图7a)、和冷异常性疼痛的逆转(如通过爪回缩延迟期的增加所见)(图7b)。逆转的程度和持续时间明显是剂量依赖性的，并且对于两个读数，与1mg/kg(1000μg/kg)最高剂量的普瑞巴林相当。与多剂30mg/kg普瑞巴林相比，1mg/kg剂量的抗体gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p当以单剂施用时是有效的，再次说明与普瑞巴林标准治疗相比，抗trka抗体可以以较低的剂量和较低的给药频率施用。实施例6：抗trka抗体对新生儿发育过程中感觉和交感神经元的影响ngf/trka信号传导是发育过程中感觉和交感神经元存活所关键必需的(bibel和barde，2000genesdev14(23)：2919-37)。相应地，在胚胎期或新生儿期间通过主动或被动免疫阻断ngf，可以导致这些神经元的显著损失以及神经元细胞体和相关神经元结构如交感神经节的明显萎缩(cattaneo，(2013)procnatlacadsciusa.2013年3月26日；110(13)：4877-85)。相反，用ngf处理新生儿动物导致交感神经元的肥大和增生，导致交感神经节增大(levi-montalciniandbooker,1960aprocnatlacadsciusa.mar；46(3):373-84.；levi-montalciniandcohen,1960annnyacadsci.1960mar29；85:324-41；banksetal.,1975jphysiol.may；247(2):289-98)。为了确定与抗ngf抗体相比，新生儿期间抗trka抗体处理对交感神经元的存活和形态的影响，在对人trka敲入(amb1)小鼠4周处理后，进行了位于颈上神经节(scg)中的交感神经元的详细定量和形态度量分析。人trka敲入小鼠被需要是因为gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p与啮齿动物trka具有弱交叉反应性。新生儿小鼠自出生后第1天起，用100mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p、一种基于tanezumab序列的抗ngf(该抗体与小鼠ngf具有完全交叉反应)(cattaneo，2010curropinmolther，12,94-106)或pbs，每周一次腹膜内(i.p.)处理4周。在处理结束时，将小鼠用氯胺酮[(parke-davis)75mg/kg体重]和赛拉嗪[(streuli)10mg/kg体重]的混合物麻醉，然后灌注0.9％nacl、及之后在0.1m磷酸盐缓冲液(ph7.3)中新鲜制备的4％多聚甲醛。解剖颈部右颈上神经节(superiorcervicalganglion,scg)，在塑料包埋盒中用泡沫保护，并在4℃下相同的固定剂中后固定24小时。解剖scg的周围动脉，以便允许在组织学过程中更好地识别。然后将其包埋在石蜡(tca44-720mediteautomate)中，并用徕卡切片机(3μm薄切片；leicarm2135)切片。制备连续切片带，将每第10个(成年)或第20个(新生儿)切片封固在“superfrostplus”(menzel)玻片上，并用苏木精和伊红(h&e)染色。用hamamatsu(nanozoomer)载玻片扫描系统扫描切片，并用40x物镜放大。图片(.ndpi)在ndp-viewer2软件中以10x或20x物镜放大，然后以jpeg格式导出，用于体积确定。神经节的体积根据cavalieri方法(生物结构中的体积估计；coldspringharbprotoc2012nov1；2012(11)：1129-39；doi：10.1101/pdb.top071787)确定。使用具有适当插件(“网格”和“细胞计数器”)的imagej软件进行体积测定。选择网格尺寸以获得每个神经节约100点或更多。体积计算如下：神经节体积＝神经节组织上的点数x网格面积×厚度×切片之间的距离。根据成核剂原理(thenucleator，jmicrosc。1988jul；151(pt1)：3-21)，确定细胞的平均体积。物体的面积(a)和半径(r)与其体积(v)相关，这也适用于诸如细胞的不规则物体。因此，通过测量大量细胞的面积，可以获得神经节中平均细胞体积的非常好的近似值。测量每个神经节的100个或更多个随机选择的细胞的面积。对于每个区域(a)，计算半径(r＝√(a/π))，然后计算体积(体积＝(4/3)π*r3)。所有体积的平均值被取为神经节的平均细胞体积。根据以下公式计算一个神经节中的细胞数：神经节的总细胞体积/神经节的平均细胞体积。细胞密度按照下列公式计算：神经节细胞数/神经节体积。与pbs处理相比，用tanezumab处理新生小鼠导致scg神经元细胞直径显著减少，整个scg的萎缩和每个神经节的神经元细胞数量的显著减少(图8)。相比之下，与pbs处理相比，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p处理导致scg神经元细胞直径显著增加，整个scg的肥大，以及每个神经节的神经元细胞数量的显著增加。实施例7：抗trka抗体对成年期的交感神经元存活的影响新生儿期后，感觉神经元存活与ngf无关。然而，对于交感神经元，ngf在成年期继续调节其形态。在成年啮齿动物中，通过主动或被动免疫阻断ngf可以导致交感神经元细胞体萎缩，总体上促成交感神经节的萎缩(levi-montalciniandbooker,1960bprocnatlacadsciusa.mar；46(3):384-91；angelettietal.,1971a.brainres.apr2；27(2):343-55；bjerreetal.,1975brainres.jul11；92(2):257-78；goedertetal,1978brainres.jun9；148(1):264-8；ottenetal.,1979brainres.oct26；176(1):79-90.；gorinandjohnson,1980brainres.1980sep29；198(1):27-42.；johnsonetal.,1982；ruitetal.,1990jneurosci.jul；10(7):2412-9.)另一方面，用ngf处理成年啮齿类动物导致交感神经元肥大，但与新生儿的处理不同，不导致增生(levi-montalciniandbooker,1960bprocnatlacadsciusa.mar；46(3):384-91；angelettietal.,1971bjultrastructres.1971bjul；36(1):24-36.；buekerandschenkein,1964annnyacadsci.oct9；118:183-205.)。为了确定成年期间gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p处理与抗ngf相比对交感神经元存活和形态的影响，用100mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p，tanezumab或pbs腹膜内处理成年(2.5月龄)小鼠，每周一次，进行4周，并且如实施例6所述分析左和右scg。用tanezumab处理成年小鼠导致scg神经元细胞直径显著减少、整体scg的萎缩，但与新生儿不同，不影响每个神经节的神经元细胞数(图9)。gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p处理导致scg神经元细胞直径显著增加、整体scg的肥大、但是再次，每个神经节的神经元细胞数不受影响。tanezumab的萎缩作用在新生儿和成年中达到相似的程度，而gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的肥大效应在新生儿中比在成体中要明显得多(比较图8和9)。尽管gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p对scg神经元细胞直径的影响在成年小鼠中是显著的，但gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p处理的小鼠的细胞直径范围与pbs处理的动物完全重叠，而tanezumab处理的动物中显著比例的scg神经元细胞直径位于pbs处理的动物的范围之外并且低于该范围(图10)。视觉上，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p处理的动物的scg神经元细胞体看上去与pbs处理的动物相似，而tanezumab处理的动物的scg神经元细胞体出现皱缩和凝缩的细胞质(图11)。用tanezumab获得的结果与以前的研究一致，证明ngf阻断可以导致新生儿中交感神经元细胞的损失以及在新生儿和成年中交感神经元细胞体和神经节的萎缩。gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p对scg的肥大效应以及在新生儿中对scg的增生效应，与针对ngf处理所报道的类似。因此，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p和tanezumab明显地在新生儿和成年动物两者中对交感神经元产生相反的作用，但gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的作用在成年动物中减小。实施例8：抗-trka抗体对外周神经病理性疼痛的作用外周神经病理性疼痛是由周围神经系统的损伤/功能障碍/疾病引起的慢性疼痛形式(bridges等人，(2001)brjanaesth.ul；87(1)：12-26)。它通常包括痛觉过敏(对疼痛刺激的反应增加)以及异常性疼痛(对非疼痛刺激的疼痛反应)。神经病理性疼痛可以通过实验性损伤外周神经在动物中诱发，这通常可以通过松散结扎由坐骨神经的慢性压迫性损伤(cci)来实现。在雄性和雌性amb1小鼠中，将机械性痛觉过敏测量为引起爪回缩所需的阈值力(g)，将冷异常性疼痛测量为从冷板缩回爪的时间(秒)。然后在氯胺酮-赛拉嗪(100和10mg/kg/10ml，i.p.)麻醉下进行cci手术。在剃去毛发后，在股中段水平无菌暴露左坐骨神经。在神经分支前1-2毫米处围绕坐骨神经放置三根松散结扎线(使用4-0黑丝)。皮肤缝合后，用聚乙烯吡咯酮碘溶液处理手术部位。动物被允许在接下来的七天恢复。使动物适应测量装置(冷板)，并记录给药前的爪回缩阈值(0小时)。然后，单次腹膜内注射0.3和1mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p、tanezumab或盐水，处理动物。在第4h、第1天、然后每隔一天直到给药后第9天，记录给药后的读数，并在给药后14d获取最后读数。首先记录机械性痛觉过敏的给药后读数，5分钟后记录冷异常性疼痛的读数。cci手术(0h)后7天，小鼠显示出明显的机械性异常性疼痛(图12a)和冷异常性疼痛(图12b)，分别表现为其爪回缩阈值和爪回缩延迟时间的急剧下降。两种剂量的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p都导致了机械性痛觉过敏的持久逆转(如通过爪回缩阈值的增加所见)和冷异常性疼痛的持久逆转(如通过爪回缩延迟期的增加所见)。在相当的剂量下，gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p明显地，比基于tanezumab的抗ngf抗体，造成了机械痛觉过敏和冷异常性疼痛的更高逆转。实施例9：抗trka抗体对异常感觉和交感神经萌芽的影响在小鼠中数周多次关节内注射完全弗氏佐剂(cfa)引起持久膝关节炎症，导致关节内的异位感觉和交感神经元萌芽以及伤害感受行为(ghilardietal.,2012arthritisrheum.jul；64(7):2223-32)。类似的异位萌芽在骨癌疼痛的小鼠模型中也被观察到，并且已经被提出参与疼痛的维持(jimenez-andradeetal.,2011pain.nov；152(11):2564-74)。在两个模型中，抗ngf治疗减少异位神经元萌芽和伤害感受行为，表明ngf在该过程中的作用(jimenez-andradeetal.,2011pain.nov；152(11):2564-74；ghilardietal.,2012arthritisrheum.jul；64(7):2223-32)。为了在多重cfa膝关节疼痛模型中与基于tanezumab的抗ngf抗体比较来评估gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p的作用，用3％异氟烷混合95％氧气轻度麻醉成年雌性amb1小鼠。向左膝关节注射10μlcfa(h37ra；difcolaboratories，usa，2.5mg/ml，在矿物油中，sigma)。注射cfa后，将动物返回饲养笼。进行定期观察以监测注射后动物的状况。在第7、14和21天重复cfa注射。一组动物(n＝6)用10μl磷酸盐缓冲溶液(pbs)进行关节内注射，以用作为假模对照。通过训练小鼠直立在incapacitancemeter(承重仪器，linton)的垫片上2-3分钟，使小鼠适应实验环境三天。记录左侧(同侧)和右侧(对侧)后爪在5秒内施加的重量负荷的平均值。进行三次测量，并计算每个时间点的平均值。在第一次注射cfa前当天(第0天)检查放置在垫片上的体重的基线值，并在第3、10、17和24天每次后续注射后3天再次评估，并在第24天在化合物给药后4、8、24、48、72、96和120小时再次评估。将行为实验得到的数据计算为承重比的平均值±s.e.m(wbr＝同侧承重/对侧承重×100)。随机选择一组6只小鼠作为假模对照，每7天接受1次pbs注射至左膝关节，为期21天，共4次注射(假模cfa组)，并在第一次膝关节注射后的第24天接受i.p.赋形剂。其他小鼠在第0、7、14和21天接受共4次cfa注射。在第24天，承重比小于70％的小鼠随机分到赋形剂对照组，1mg/kggbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p组和1mg/kgtanezumab组。所有赋形剂/化合物均腹膜内给药，单剂5ml/kg。如通过承重自同侧向对侧后爪的迁移所检测到的，多次关节内注射cfa引起持久的痛觉过敏，导致％ipsi/contra比值下降到约50％(图13)。在第24天当痛觉过敏已经良好建立时，单次i.p.注射后，与赋形剂对照相比，1mg/kg的gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p造成了显著的痛觉过敏逆转，而基于tanezumab的抗ngf抗体以相同的剂量没有显著效果。实施例10：抗trka抗体对骨愈合的影响介绍充分的骨折相关疼痛治疗对患者的健康是很重要的。然而，目前可用的镇痛药可能会产生相当大的副作用。用于治疗中度至重度疼痛的阿片样物质通常会导致恶心、镇静作用和嗜睡以及呼吸抑制。此外，可能发生阿片样物质成瘾，并且不清楚该类物质是否会影响骨折愈合。相对地，经常处方用于治疗轻度至中度肌肉骨骼疼痛的非类固醇抗炎药(nsaid)已被证明具有相当大的胃肠道副作用(dibetal.(2014),scandjgastroenterol,49,785-9)。nsaid的抗炎作用基于对环加氧酶(cox)-2的选择性或非选择性抑制，从而阻断从花生四烯酸合成前列腺素(pg)。然而，pge-2对骨骼具有多效性，而且cox-2功能对于骨愈合是必需的(blackwell等(2010)trendsendocrinolmetab，21,294-301；simon等，(2002)jboneminerres，17，963-76)。在啮齿动物中，有很强的证据表明，在愈合期间应用nsaid会干扰骨折愈合(spiroetal.,(2010)jorthopres,28,785-791；krischaketal.,(2007a)archorthoptraumasurg,127,453-8:krischaketal.,(2007b)archorthoptraumasurg,127,3-9)。此外，nsaid在人体中也被认为对骨愈合具有负面影响。治疗骨折相关疼痛的另一种方法可以是阻断神经生长因子(ngf)/神经营养性酪氨酸激酶受体1型(trka)信号传导。使用抗ngf单克隆抗体阻断该信号传导途径被证明对于治疗慢性腰痛和关节病有效(katz等，(2011)pain，152,2248-2258；mckelvey等，(2013)jneurochem，124,276-89)。ngf与trka的结合导致受体二聚化和通过受体自身磷酸化的受体激活。可以通过应用选择性结合并中和ngf的特异性抗体或通过应用trk受体激酶活性的小分子量抑制剂来破坏配体-受体相互作用(kumarandmahal,(2012)jpainres,5,279-87:watsonetal.,(2008).biodrugs,22,349-359)。ngf/trka信号传导对骨折修复的影响尚未得到充分阐释。最近，两项研究报道了，通过应用中和性抗ngf单克隆抗体或小分子量trk激酶抑制剂阻断ngf/trka信号传导后，疼痛相关行为的显著减少(koewleretal.,(2007)jboneminerres,22,1732-42.:,ghilardietal.,(2011)bone,48,389-98)。然而，两项研究均报告了骨痂大小的增加，并且在一份报告中还指出愈合后的骨的生物力学性质的轻微降低(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42)，可能说明对骨折愈合过程的干扰。由于两项研究观察到的影响相对微小，因此需要进一步澄清。因此，我们通过在机械定义的骨干骨折-愈合小鼠模型中分别应用靶向ngf和trka的中和性单克隆抗体，来解决这个问题。方法抗体中和性抗ngf单克隆抗体是基于tanezumab的人igg2，并且与小鼠ngf完全交叉反应(cattaneo,(2010)curropinmolther,12,94-106)。中和性抗trka抗体为gbrvh5(k3q，v37a)vl1ighg4s228p。动物模型与饲养动物实验根据国家和国际实验动物护理和使用指南进行，并得到当地伦理委员会(tübingen，第1144号)的批准。雄性amb1小鼠在小鼠trka基因座处敲入人trka，并从charlesriver(charlesriveritalia，calco，italy)获得。将小鼠以每组最多四只动物分组笼养，在23℃和55±10％湿度下，14小时光照和10小时暗周期。标准的啮齿动物食物和水可以随意取得。在无菌条件下进行外科手术。研究设计为了研究ngf-trka信号阻断对骨折愈合的影响，如前详述(等，(2010)jorthopres，28,1456-62)，对13周龄小鼠的右股骨进行标准化的截骨术。简言之，在全身麻醉(2vol％异氟烷，abbott，wiesbaden，germany)下，使用gigli线锯(risystem，达沃斯，瑞士)在右股骨的中骨体中产生截骨缺口。使用外部固定器(刚度3n×mm-1；risystem，达沃斯，瑞士)稳定截骨。在手术前，小鼠接受单剂抗生素(克林霉素-2-二氢磷酸盐，45mg×kg-1；克林霉素，ratiopharm,ulm,germany)。对于镇痛，手术前后1天通过饮用水提供盐酸曲马多(25mg×l-1,grünenthal,aachen,germany)。在手术前，将小鼠随机分配至三个组，以施用磷酸盐缓冲盐水(pbs，paalaboratories，linz，austria)(对照组，n＝24)、抗ngf抗体(n＝25)或抗-trka抗体(n＝24)(两种抗体均由glenmarkpharmaceuticalsltd，switzerland提供)。以10mg×kg-1体重的浓度腹膜内给予抗体。这些物质在手术后第1、6和11天施用。手术后7、14或25天对小鼠进行安乐死，取出手术的和对侧的股骨。活动和地面反作用力的测量为了确定施用的抗体的镇痛作用，评估了手术后小鼠的活动和手术肢体的垂直地面反作用力(grf)，这是因为疼痛会导致活动减少以及推测的截骨肢体的负荷减少。在手术后第2、5、7、14和20天进行分析。为了评估垂直grf，允许小鼠自由移动通过在地板(he6x6，amti，watertown，ma，usa)中含有力板的丙烯酸玻璃通道。由盲法观察者记录手术肢体在直立期的峰值垂直grf，按每个时间点每只小鼠最少四次测量来平均。使用装配到专用笼的红外线束系统(actimot，tsesystemsgmbh，badhomburg，germany)，过夜记录小鼠的活动。术后测量值与术前测量值相关。生物力学测试为了研究机械性能，在第25天取出的完好股骨和截骨的股骨上进行了如前所述的无损三点弯曲试验(等，(2010)jorthopres，28,1456-62；wehrle等人，(2014)jorthopres，32,1006-13)。简而言之，股骨的近端固定在铝圆柱体上，铝柱体又固定在三点弯曲装置(z10，zwickroell，ulm，germany)的铰链接头上。股骨髁不加固定地放置在弯曲支架上。在矢状面上向股骨中骨体施加轴向负荷。根据力偏转曲线(force-deflectioncurve)的线性区域的斜率(k)，计算弯曲刚度。当骨折骨痂不正好位于支架之间的中点时，考虑负荷矢量(loadvector)与近端(a)和远端(b)支架之间的距离(l/2)。弯曲刚度(ei)根据不对称弯曲公式计算：ei＝k((a2b2)×3l-1)。微计算机断层扫描(μct)使用μct装置(skyscan1172，skyscan，kontich，belgium)扫描第14天和第25天收获的股骨，以50kv电压和200μa，以每像素8μm的分辨率进行扫描。在每次扫描中，扫描具有规定的羟基磷灰石(ha)密度(250和750mg×cm-3)的两个模体(phantom)，以确定骨矿物质密度(bmd)。在第14天，对整个骨痂进行了总体积(tv)，骨体积(bv)，骨体积分数(bv/tv)和bmd的分析。在第25天，对两个感兴趣的区域，整个骨痂和之前的截骨缺口，进行了上述参数的分析。为了区分矿化组织和非矿化组织，应用了对应于641.9mgha×cm-3的全局阈值(morgan等，(2009)bone，44,335-44)。组织形态测定在4％福尔马林中固定股骨24小时，在20％乙二胺四乙酸(ph7.2-7.4)中脱钙10-12天，并将其包埋在石蜡(paraplast，leicabiosystems，wetzlar，germany)中。切割厚度为6μm的纵切片，并使用番红-o和快绿进行染色。使用光学显微镜(leicadmi6000b；softwaremetamorph，leicamicrosystems，mannheim，germany)以50倍放大率进行组织组成的评估。在所有时间点，分析由骨膜骨痂和截骨缺口组成的整个骨痂的纤维组织、软骨和骨的相对量。统计分析结果表示为平均值±标准误差(sem)。使用shapiro-wilk检验，检验数据的正态分布。对于数据分析，使用spss统计软件(版本21，ibmcorp，chicago，il，usa)。使用方差分析，进行组的比较。使用fisher的lsd检验，进行事后分析。p≤0.05，视为显著。结果活动和grf评估在手术前天和手术后2、5、7、14和20天评估小鼠的活动和垂直grf。正如预期的那样，所有组在手术后活动都有所下降。在第2天，与pbs处理的动物相比，抗-trka抗体处理的小鼠显示出显著更高的活动度(图14a)，表明抗体处理的小鼠遭受较少的疼痛。pbs与抗ngf抗体或抗ngf抗体和抗-trka抗体处理之间无显著性差异。在稍后的时间点，没有检测到显著的组间差异(图14a)。在第2天，在所有处理组中，垂直grf的分析显示降低到术前值的83-90％(图14b)。垂直grf到第5天进一步下降，然后缓慢升高直至第20天，在此时grf达到手术前值的90-100％。在任何给定时间点，组之间没有显著差异(图14b)。ngf-trka信号传导阻断对骨折愈合的影响骨痂组成的组织形态度量评估在第7、14和25天进行。代表性的切片如图15a-i所示。在任何时间点，我们均没有检测到处理组之间骨痂组成的任何统计学显著性差异(图15j-l)。使用μct对第14天的骨痂进行三维评估，显示骨痂大小、bv、bv/tv或bmd无显著性差异(表6)。在分析截骨或整个骨痂时，在第25天发现同样的情况(表7)。与pbs施用相比，抗ngf抗体或抗-trka抗体不显著影响骨痂的弯曲刚度(使用无损三点弯曲试验确定)(图16)。表6：截骨术后第14天骨折骨痂的μct分析。tv,总骨痂体积；bv,骨体积；bv/tv,骨体积/骨痂体积；bmd,骨矿物质密度。数据表示为平均值±sem；n＝7-8.表7：在25天的愈合期后用pbs、抗ngf抗体或抗-trka抗体处理的小鼠的截骨和全骨折骨痂的μct分析。tv，总骨痴体积；bv，骨体积；bv/tv，骨体积/骨痴体积；bmd，骨矿物质密度。数据表示为平均值±sem；n＝78总之，数据表明阻断ngf/trka信号并没有负面影响骨折愈合。讨论与结论减少骨折相关疼痛是患者治疗中的一个重要问题。然而，使用nsaid的常见处理似乎不利于骨折愈合。在这里，调查了是否阻断ngf/trka信号传导用于镇痛会影响骨折愈合。我们的结果表明，使用选择性抗体，骨再生不受ngf/trka信号传导阻断的影响，骨痂形成和成熟在用中和性抗ngf或抗-trka抗体处理的动物中正常发生。在第7、14和25天通过组织学或在第14和25天通过μct分析评估，观察到在用pbs、抗ngf或抗-trka抗体处理的动物中骨痂组成没有显著差异。此外，弯曲刚度不受影响，表明通过ngf/trka阻断的镇痛作用就骨愈合而言可能是安全的。有证据表明，ngf/trka信号传导可以调节骨形成和愈合，因为ngf及其受体trka都被骨细胞表达(asaumi等，(2000)bone，26,625-33)。体外数据提示ngf/trka在前成骨细胞mc3t3-e1中的抗凋亡作用(mogi等，(2000)lifesci，67,1197-206)和ngf-处理后这些细胞中碱性磷酸酶的诱导，由此促进成骨细胞分化(yada等人，(1994)biochembiophysrescommun，205,1187-93)。小鼠中的研究表明，骨折愈合期间trka在增生的、成熟的和肥大的软骨细胞以及成骨细胞中表达(asaumi等，(2000)bone，26,625-33)。此外，证实了在骨化前沿(ossificationfront)附近ngf在增生的、成熟的和肥大的软骨细胞和成骨细胞中表达。虽然这些发现意味着在骨折愈合期间ngf/trka信号传导的功能，但确切的作用尚未阐明。已经证明，局部ngf应用改善了大鼠肋骨骨折模型中的骨折愈合(grills等，(1997)jorthopres，15,25-42)。虽然潜在的机制尚未得到广泛的研究，但作者推测交感神经支配的增加刺激了骨祖先细胞向软骨细胞的分化(grillsetal，(1997)jorthopres，15,25-42)。在骨折愈合期间通过应用中和性抗ngf单克隆抗体或小分子量trk激酶抑制剂进行ngf信号传导阻断后，报道了显著更大骨痂的形成(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42：ghilardi等，(2011)bone，48,389-98)。这些发现意味着愈合过程的轻微延迟。然而，我们的发现与其他研究结果(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42：ghilardietal。(2011)bone，48,389-98)一起提示，该信号传导途径在骨折愈合期间在骨细胞及其前体中具有次要作用(如果有作用的话)。为了评估抗体处理的镇痛作用，我们纵向确定了小鼠的活动和手术肢体的grf。在手术后第2天，与pbs处理的动物相比，抗trka抗体处理的小鼠被发现具有显著更高的活动度。在用抗ngf抗体处理的小鼠中也存在更大活动度的趋势，但是没有达到统计学显著性。相比之下，当比较两种抗体时，我们没有发现统计学上的显著性差异，因此说明至少相当的镇痛效果。这些活动结果得到koewler等人jboneminerres，22,1732-42的观察结果的确认，他们报告了施用中和抗ngf抗体后疼痛相关行为的显著减少(koewler等，2007jboneminerres，22,1732-42)。一般地，发现在愈合期间用抗-trka抗体处理的小鼠，与pbs处理相比，具有更大活动度的趋势。这可能表明，接受pbs的小鼠受到手术和手术后疼痛的影响比接受了镇痛抗体之一的动物大，表明在整个愈合过程中充分的早期疼痛控制对小鼠的健康具有积极作用。由垂直grf表示的手术肢体负载在任何时间点均没有显示出显著的组间差异。这也与其他人的报告一致(koewler等，(2007)jboneminerres，22,1732-42)。我们提出，grf的轻微减少可能与骨折相关的疼痛无关。我们推测，在手术期间肌肉的解剖改变了功能，从而导致该减少的负载。总之，结果表明，使用特异性抗体阻断ngf/trka信号传导对啮齿动物的骨折愈合没有负面影响，因为抗体处理不改变生物力学性质和骨痂组成。实施例11-低浓度水性制剂的稳定性数据本发明人已经生产并测试了调节至ph6.0的抗trka抗体的第一低浓度液体制剂，其包含：10mg/ml抗trka抗体，其包含含有seqidno：5的轻链可变序列和含有seqidno：7的重链可变区；25mm柠檬酸盐；150mmnacl；0.05％吐温80。本发明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的时间点(以月计)，在5℃，25℃和40℃下使用多个标准，表征了该抗trka抗体的稳定性。具体地，在相关时间点通过如下方式表征了制剂中存在的抗体：确定制剂或其部分的澄清度，着色程度，乳浊度和颗粒污染(可见颗粒)；通过波长280nm的光吸收测量，确定制剂中存在的蛋白质的浓度；通过sds-page凝胶可视化，确定抗体的重量变化和/或降解；通过elisa，确定抗体的结合特性的任何变化；通过hplc-cex，确定制剂中正/负抗体物质组成的变化；通过hplc-ief，借组毛细管电泳确定制剂中存在的抗体的等电聚焦谱的变化；通过hplc-sec分析，确定制剂中抗体的变化。使用标准技术对制剂的性质和其中的抗体进行评估。在每种情况下，至少在一个或多个时间点和t0值和/或针对用作标准材料(为了质量保证和质量控制目的)的抗体先前建立的标准之间进行比较。图17中针对5℃，图18针对25℃，图19针对40℃，提供了稳定性数据。实施例12-高浓度水性制剂的稳定性数据本发明人已经生产并测试了调节至ph5.75或6.0的抗trka抗体的液体制剂，其包含：100mg/ml抗trka抗体，其包含含有seqidno：5的轻链可变序列和含有seqidno：7的重链可变区；50mm组氨酸；150mmnacl；0.05％吐温80。本发明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的时间点(以月计)，在5℃，25℃和40℃下使用多个标准，表征了该抗trka抗体的稳定性。具体地，在一个或多个时间点通过如下方式表征了制剂中存在的抗体：确定制剂的澄清度，着色程度，乳浊度和颗粒污染(可见颗粒)的变化；通过波长280nm的光吸收测量，确定制剂中存在的蛋白质的浓度；通过sds-page凝胶可视化，确定抗体的重量变化和/或降解；通过elisa，确定抗体的结合特性的任何变化；通过hplc-cex，确定制剂中正/负抗体物质组成的变化；通过hplc-ief，借组毛细管电泳，确定制剂中存在的抗体的等电聚焦谱的变化；通过hplc-sec分析，确定制剂中抗体的变化。在每种情况下，在每个时间点和t0值以及针对用作标准材料(为了质量保证和质量控制目的)的抗体先前建立的标准之间进行比较。提供调整至ph5.75的制剂的稳定性数据，图20中为5℃，图21中为25℃和图22中为40℃。提供调节至ph6的制剂的稳定性数据，图23中为5℃，图24为25℃，图25中为40℃。实施例13-高浓度水性制剂的稳定性数据本发明人已经生产并测试了抗trka抗体的第一低浓度液体制剂，其包含：150mg/ml抗trka抗体，其包含含有seqidno：5的轻链可变序列和含有seqidno：7的重链可变区；50mm组氨酸；150mmnacl；0.05％吐温80。本发明人在t0，t1，t2，t3，t6，t9，t12，t18，t24，t30的时间点(以月计)，在5℃，25℃和40℃下使用多个标准，表征了该抗trka抗体的稳定性。具体地，在一个或多个时间点通过如下方式表征了制剂中存在的抗体：确定制剂的澄清度，着色程度，乳浊度和颗粒污染(可见颗粒)的变化；通过波长280nm的光吸收测量，确定制剂中存在的蛋白质的浓度；通过sds-page凝胶可视化，确定抗体的重量变化和/或降解；通过elisa，确定抗体的结合特性的任何变化；通过hplc-cex，确定制剂中正/负抗体物质组成的变化；通过hplc-ief，借组毛细管电泳，确定制剂中存在的抗体的等电聚焦谱的变化；通过hplc-sec分析，确定制剂中抗体的变化。在每种情况下，在每个时间点和t0值以及针对用作标准材料(为了质量保证和质量控制目的)的抗体先前建立的标准之间进行比较。提供调整至ph5.75的制剂的稳定性数据，图26中为5℃，图27中为25℃和图28中为40℃。提供调节至ph6的制剂的稳定性数据，图29中为5℃，图30中为25℃，图31中为40℃。实施例14：100mg/ml和150mg/ml制剂的亚可见颗粒(sub-visibleparticle)，粘度和可注射性为了进一步表征本发明的高浓度液体制剂的性质，进行另一系列实验以确定亚可见颗粒的存在以及制剂的粘度和可注射性。对在5℃下储存9至12个月的样品进行实验。-亚可见颗粒损害治疗性蛋白质功效的一个方式是诱导不想要的免疫应答，导致抗体介导的蛋白质活性中和或生物利用度变化。众所周知，治疗性蛋白质产品中的蛋白质聚集体可以增强免疫原性，因此，在评估产品质量时，这种影响是考虑的重要危险因素。这样的聚集体在制剂中表现为亚可见颗粒。蛋白质通常从部分解折叠的分子聚集，所述部分解折叠分子可以是分子的天然状态集合的一部分。尽管产品制剂被开发以最大化和保持以天然状态存在的蛋白质分子的比例，但仍可能形成显著量的聚集体，特别是在药学上相关的时间尺度上和压力条件下。存在于给定产品中的蛋白质颗粒的水平和尺寸可以因与治疗性蛋白质的商业生产相关的许多因素而改变。已知具有重复抗原阵列的大蛋白组装体(其中蛋白质分子具有天然构象)在诱导免疫应答时通常是最强效的。而且，开发更有效的疫苗的努力已经表明，将抗原蛋白质吸附到由其它材料(例如胶态铝盐或聚苯乙烯)组成的纳米或微粒上，可以大大增加免疫原性。将这些应用于治疗性蛋白质产品，一直存在这样的争议：含有天然样构象的蛋白质分子的大聚集体会成为在患者中引起不利免疫反应的最大风险。亚可见颗粒分析的标准试验规定，尺寸>10μm的颗粒被控制在或低于6000个颗粒/ml，>25μm的颗粒被限制在等于或小于600个颗粒/ml。使用制造商提供的方案，使用hiac系统(beckmancoulterlifesciences)进行亚可见颗粒分析。测量基于光阻(lightobscuration)进行，并且涉及基于颗粒的几何形状的颗粒测量。表6hiac亚可见分析所有制剂都充分地处于亚可见颗粒的接受水平之下，观察到的颗粒缺乏良好地指示了配制抗体的高水平蛋白质稳定性。-粘度使用单克隆抗体作为治疗剂通常需要递送大剂量的蛋白质。这种浓溶液与许多问题相关，包括溶液粘度。虽然对于注射溶液的可接受粘度没有行业标准，但通常将25-30mpa.s之间的值视为软上限，粘度大于50mpa·s通常需要非标准的施用技术/设备以允许执行注射。使用haakereostress1(thermoscientific)使用制造商提供的方案进行粘度分析。表7粘度令人惊讶的是，150mg/ml制剂a(50mm组氨酸，150mmnacl，吐温80-0.05％，ph5.75,150mg/ml)显示出优越的特性，其粘度接近测试的100mg/ml制剂的粘度。第二测试的150mg/ml制剂(50mm组氨酸，150mmnacl，吐温80-0.05％，ph6,150mg/ml)也显示出良好的性能，并且好于可比较的市售150mg/ml治疗性抗体制剂。-可注射性可注射性是任何肠胃外剂型的关键产品性能参数。这是指注射治疗剂从注射前小瓶易于通过皮下注射针进行转移的能力。可注射性包括诸如抽取的容易性，堵塞和发泡趋势、以及剂量量测的准确性等因素。可以通过针的几何形状，即内径，长度，开口形状以及注射器(4)的表面光洁度来影响可注射性。这对于自注射装置(例如装有非常细针的笔和自动注射器)尤其重要。事实上，患者可以使用采用29-31-g针的笔式注射器。就预装注射器而言，用于皮下给药的常规针头配置为27g和25g(4,5)。在减少注射疼痛的同时，细针需要增加注射药物的力。目前，在药典中没有规定任何药典检测程序，但一般来说，对于人类注射来说，低于5-8n的力被认为是可以接受的。使用ta-xtplus(stablemicrosystems)使用制造商提供的方案进行可注射性分析。表8可注射性27g针的可注射性数据良好，30g针的可注射性优异。当前第1页12当前第1页12