一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒。
背景技术：
：猪的附红细胞体病(eperythrozoonosis)是由附红细胞体(Mycoplasmaspp.)寄生于红细胞表面、血浆及骨髓内引起的一种传染性疾病。临床上以发热、贫血、黄疸为主要特征。该病分布范围广泛、感染宿主多，给人的健康和畜牧业的发展造成了巨大的危害。猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)是其中危害最为严重的一种，可引起猪溶血性贫血，甚至危及生命，亦可引起慢性贫血，表现为仔猪生长缓慢、母猪不孕不育与免疫抑制。迄今附红细胞体无法进行体外培养，加之体积较小，形态多样，限制了对其特性和防控技术研究的深入开展。目前，主要采用猪血液涂片镜检、以全细胞可溶性蛋白为抗原建立的血清学方法，以及分子生物学方法对猪的附红细胞体病进行诊断，而这些诊断方法在临床应用时均存在一些缺点和不足。由于猪附红细胞体体积较小，直接用显微镜观察非常困难，而猪附红细胞体对红细胞具有亲嗜性，可以引起严重的红细胞损伤和变形，这常被用来进行诊断，然而，其他因素也可以引起红细胞的变形，比如涂片技术、渗透压改变等，因此血液镜检技术具有很大的片面性。分子生物学方法不仅费用高、检测周期较长，而且，由于一些引物特异性差，经常出现假阳性。目前已报道的猪附红细胞体血清抗体检测方法主要有补体结合试验(complementfixationtest,CFT)、间接血凝试验(indirecthemagglutinationassay,IHA)和酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，其中ELISA法具有操作简便、灵敏性高、快速、易标准化等特点，已成为首选的常规诊断方法，所用抗原大多为常规的附红细胞体菌体可溶性抗原。然而，由于目前尚无附红细胞体的体外培养技术，难以获得大量抗原，使得ELISA检测方法受到极大的限制。热休克蛋白(heatshockproteins，Hsps)是生物界普遍存在的一类高度保守的蛋白质，其基因在进化过程中具有高度保守性，近年来不少学者应用其序列研究生物的基因型、进行疾病的分子流行病学调查和病原的系统进化关系分析。此外，该类蛋白还可作为主要的抗原蛋白，诱导宿主产生抗体，杀伤入侵的病原微生物。Hoelzle等(2007)运用血清蛋白组学(serologicalproteome)结合质谱分析技术，鉴定出6个猪附红细胞体功能蛋白，其中一个为Dnak样蛋白热休克蛋白A1(heatshockproteinsA1，HspA1)，HspA1是具有免疫原性的功能蛋白。HspA1属于热休克蛋白HSP70家族，分子大小为67ku，定位在猪附红细胞体胞浆及胞膜上，具有表面可接触性(surfaceaccessibility)、ATP酶(ATPase)活性及抗原性，可能参与对宿主红细胞的黏附。作者继而构建了猪附红细胞体DNA文库，对文库部分克隆进行鸟枪法测序，获得了全长为1830bp的HspA1蛋白编码基因序列，命名为猪附红细胞体a1基因。由于在猪附红细胞体中，密码子UGA编码色氨酸，而在大肠埃希菌(E.coli)中，UGA是终止密码子，如果进行原核重组表达HspA1蛋白，需要按照E.coli的密码子偏嗜性，克服翻译时UGA编码色氨酸的障碍，需按密码子的兼并性对a1基因核苷酸序列进行改造，然后进行全基因合成才可进行后续的研究。Hoelzle等(2007)对a1基因核苷酸序列改造后进行全基因合成，并利用原核表达的重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技术，其敏感性和特异性等于或高于利用猪附红细胞体全细胞建立的ELISA技术。由于上述步骤不仅繁琐复杂，而且费用较高。此外，猪附红细胞体a1基因长达1830bp，不仅表达比较困难而且极易发生突变。因此，目前对a1基因进行克隆表达、用于免疫诊断的研究机构还非常少。抗原以抗原决定簇与相应抗体或淋巴细胞表面相应的受体特异性结合而激活特异的免疫应答。因此，抗原决定簇是免疫应答和免疫反应(反应原性)的物质基础。近年来，国内外开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原的表位预测，构建多表位抗原(multi-epitopeantigen)，即同时携带多个与目标抗原相关的表位及辅助性表位的抗原，来作为诊断抗原，目前在日本血吸虫、弓形虫等寄生虫，结核分枝杆菌、副猪嗜血杆菌等细菌，腺病毒等病毒中均已开始应用，取得了良好的效果。但迄今在附红细胞体上尚未见应用报道。目前，在附红细胞体方面，仅有一个基因所编码蛋白的B细胞抗原表位报道用生物信息学软件进行了预测一个基因所编码蛋白的B细胞抗原表位，而且没有进行后续的研究，这是由于在猪附红细胞体的基因组中，绝大部分编码蛋白的功能未知，即为假定蛋白，仅少数蛋白根据其序列同源性，预测出了其功能，比如：猪附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1(M.suisglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-likeprotein1，MSG1)、DnaK样热休克蛋白A1(HeatShockProteinA1,HspA1)、GroEL、α-烯醇酶(α-Enolase)、丙酮酸脱氢酶(PyruvateDehydrogenase)和RNA解螺旋酶等，而且多数缺乏实验验证。目前研究最多的蛋白是HspA1、MSG1和α-Enolase。由于在猪附红细胞体中，密码子UGA编码色氨酸，而在大肠埃希菌(E.coli)中，UGA是终止密码子。因此，原核表达或真核表达时，国外均采用全基因合成，国内g1基因(MSG1的编码基因)采用全基因合成，a1基因和α-Enolase编码基因是避开TGA后选择了一个开放阅读框。由于上述现状，抗原表位预测相关技术迄今没有应用到附红细胞体上。国外，Hoelzle等(2007)对a1基因核苷酸序列改造后进行全基因合成，并利用原核表达的重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立了检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技术(HspA1整个蛋白)。国内，虽然，于龙政等(2012)利用原核表达系统表达了部分重组HspA1蛋白，但是其HspA1蛋白的编码序列仅仅是为了避免在大肠杆菌中终止，而选择了一个开放阅读框(0RF)，并没有考虑这一段序列所编码的蛋白是否为B细胞的抗原表位。目前，国内还没有学者运用重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白建立检测猪附红细胞体病的ELISA诊断技术。所以现有技术中，只要是基于HspA1的酶联免疫检测，均是采用其整个蛋白，很难想到采用HspA1的部分片段做包被原，存在严重的技术偏见。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种附红细胞体重组表位抗原及其免疫检测试剂盒。本发明对猪附红细胞体HspA1蛋白进行了B细胞抗原表位的预测，筛选并截取HspA1蛋白的B细胞抗原表位富集区(简称HspA1表位区)，通过原核表达获得重组HspA1表位区蛋白，用纯化后的重组HspA1表位区蛋白作为包被抗原，建立了检测猪附红细胞体的间接ELISA方法，构建了诊断试剂盒，为检测人和动物的猪附红细胞体感染、以及猪附红细胞体的流行病学调查提供有效手段。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种附红细胞体重组表位抗原rHspA1，序列如SEQIDNo.1所示。第二方面，本发明提供一种附红细胞体重组表位抗原的制备方法，包括如下步骤：从猪附红细胞体HspA1蛋白氨基酸序列中筛选B细胞抗原表位富集区，记为HspA1表位区；根据HspA1表位区的氨基酸序列从猪附红细胞体HspA1蛋白编码基因中筛选其编码序列，记为a1-epi；扩增a1-epi序列，并将回收产物与pMD18-T载体连接，得重组质粒pMD18-T-a1-epi；对所述重组质粒pMD18-T-a1-epi质粒和pColdⅠ质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定、胶回收，将a1-epi的胶回收产物与酶切pColdⅠ的胶回收产物进行连接，得重组质粒pColdⅠ-a1-epi；用所述重组质粒pColdⅠ-a1-epi转化大肠杆菌BL21菌株，得pColdI-a1-epi-E.coliBL21菌株；将pColdI-a1-epi-E.coliBL21菌株接种于LB液体培养基，于IPTG条件下诱导培养，收集菌体并裂解，收集上清，即得附红细胞体重组表位抗原rHspA1。优选地，所述猪附红细胞体具体指德国54/96分离株；本发明只是以GenBank中德国54/96分离株的a1基因核苷酸序列进行设计特异性引物。优选地，所述扩增用引物如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示。引物特异性较强，没有杂带，梯度PCR时均能扩增出目的条带，并且条带亮度基本一致。优选地，所述B细胞抗原表位富集区的筛选是基于猪附红细胞体HspA1蛋白氨基酸序列生物信息学分析基础上进行的。优选地，所述B细胞抗原表位富集区具体是亲水性、柔韧性、抗原指数、表面可及性等参数数值较高且含有功能结构域的区域。优选地，所述制备方法还包括对所得附红细胞体重组表位抗原进行纯化的步骤。第三方面，本发明提供一种附红细胞体免疫检测试剂盒，具体是以所述附红细胞体重组表位抗原为包被抗原。优选地，所述检测试剂盒的抗原包被浓度为0.5～4μg/mL；特别优选地，所述抗原包被浓度为0.5μg/mL。优选地，所述检测试剂盒的血清稀释度为1：(50～400)；特别优选地，所述血清稀释度为1：400。优选地，所述检测试剂盒的封闭时间为1～3h；特别优选地，所述封闭时间为2h。优选地，所述检测试剂盒的待检血清作用时间为0.5～2h；特别优选地，所述待检血清作用时间为1.5h。优选地，所述检测试剂盒的酶标抗体工作浓度为1：(2000～5000)；特别优选地，所述酶标抗体工作浓度为1：5000。优选地，所述检测试剂盒的酶标抗体作用时间为0.5～1.5h；特别优选地，所述酶标抗体作用时间为1h。优选地，所述检测试剂盒的底物显色时间为10～20min；所述底物显色时间为15min。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、本研究的包被抗原是原核表达的重组HspA1表位区蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化重组HspA1表位区蛋白，从而使抗原来源不再受约束，因此这些包被抗原在体外不仅是可生产的而且是标准化的；此外，使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒不仅可以排除猪源性成分而且可以显著提高不同批次间抗原的稳定性和准确性。2、由于原核表达的重组蛋白即使经过纯化回收也难以完全排除大肠杆菌菌体蛋白成分的干扰，而且在生长过程中猪群可能多次感染大肠杆菌，其血清样本中可能含有大肠杆菌成分的抗体，很可能造成假阳性结果而降低间接ELISA检测方法的特异性，为避免这一影响，本试验在血清样品与包被抗原反应前，先采用大肠杆菌裂解物和血清样品在37℃作用1h。3、本研究所建立的间接ELISA方法与种特异性PCR和MSA荧光定量PCR的阳性符合率分别为64.81％、62.96％，阴性符合率分别为66.67％、100％。提示本研究所建立的间接ELISA与种特异性PCR和MSA荧光定量PCR具有较高的阴阳性符合率。此外，该间接ELISA方法具有较好的特异性、灵敏性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1：HspA1蛋白的跨膜区生物信息学分析；图2：HspA1蛋白的信号肽生物信息学分析；图3：HspA1蛋白的疏水性生物信息学分析；图4：HspA1蛋白的功能结构域生物信息学分析；图5：HspA1蛋白二级结构预测；图6：HspA1蛋白B细胞抗原表位预测；图7：a1-epi基因的PCR扩增；其中，M：DL2000DNA分子质量标准；1-7：a1-epi基因片段扩增产物；N：阴性对照；图8：含a1-epi基因原核表达质粒转化菌的PCR鉴定；其中，M：DL2000DNA分子质量标准；1-9：pColdⅠ-a1-epi转化菌PCR产物；P：阳性对照；N：阴性对照；图9：rHspA1蛋白的SDS-PAGE检测；其中，1：pColdⅠ空表达载体诱导前；2：pColdⅠ空表达载体诱导后；3：pColdⅠ-a1-epi空表达载体诱导前；4：pColdⅠ-a1-epi空表达载体诱导后；5：50mM咪唑洗脱；6：100mM咪唑洗脱；7：100mM咪唑洗脱；8：150mM咪唑洗脱；9：200mM咪唑洗脱；图10：rHspA1蛋白的Westernblot分析；其中，M：预染蛋白标准分子量；1、2：rHspA1重组蛋白；3：pColdⅠ空表达载体。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。1.材料及方法1.1血清和菌株猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)阳性血清采自田间育肥猪，经种特异性PCR检测为猪附红细胞体感染，间接ELISA检测抗体阳性；所涉血清为常规技术手段获得的弓形虫(Toxoplasmagondii)感染猪血清、猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)感染猪血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)感染猪血清、隐孢子虫感染猪血清。猪田间血清采自上海市长宁区、松江区和嘉定区某屠宰场成年育肥猪；猪附红细胞体CN126株DNA来自中国农业科学院上海兽医研究所(保藏号RA-SH-CN-ZX-13-126，王向佩等，中国兽医科学，2014)。1.2主要试剂PrimeSTARGXLDNAPolymerase、DL2000DNA分子质量标准、6×LoadingBuffer、pMD18-TVector、T4DNALigase、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ均购自宝生物工程(大连)有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒(树脂型)购于上海赛百盛基因技术有限公司；AxyPrepDNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司；2×TaqPCRMasterMix购于天根生化科技(北京)有限公司；蛋白分子量标准、BCAProteinAssayKit购自Thermo公司；6×ProteinLoadingBuffer购自上海康稳生物科技有限公司；Ni-NTAHisBindResin层析柱、PVDF膜购自德国Merck公司；胰蛋白胨、酵母提取物、脱脂奶粉购自英国OXOID公司；硫酸卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；TMB购自天根生化科技(北京)有限公司；过硫酸铵、丙烯酰胺、TEMED购自Sigma公司；His-Tag(27E8)MousemAb(HRPConjugate)购自CellSignalingTechnology；兔抗猪IgG-HRP购自Abcam公司；ELISA酶标板为美国CoringCostar公司产品；其他试剂均为国产分析纯。1.3猪附红细胞体HspA1氨基酸序列的生物信息学分析从GenBank下载猪附红细胞体德国54/96分离株HspA1蛋白的氨基酸全长序列(登录号AM265536)，利用TMpredServer(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)软件对HspA1蛋白进行跨膜区预测；利用SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件对蛋白的信号肽进行预测；利用Protscale软件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)对蛋白进行疏水性预测；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件对蛋白进行功能结构域分析。运用DNAStar软件预测蛋白的二级结构及其特性：采用Gamier-Robson和Chou-Fasman法预测蛋白的二级结构；Kyte-Doolittle法预测蛋白的亲水性区域；Karplus-Schulz法预测蛋白骨架区的柔韧性区域；Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数；Emini法预测特定区域位于蛋白分子表面的可及性。结果：TMpredServer软件分析结果表明，HspA1有6个跨膜螺旋(图1)；SignalP4.1Server软件分析结果表明，HspA1无信号肽(图2)；Protscale软件分析结果表明，HspA1最大疏水性为+2.278，最小疏水性为-2.933(图3)；SMART软件分析表明，HspA1具有典型的HSP70样结构(图4)。在二级结构方面，Gamier-Robson和Chou-Fasma法预测结果显示，α-螺旋、β-折叠区段重合率相对较高，β-转角区域差异性较大；Kyte-Doolittle法预测结果显示，亲水区段较多，呈不均匀分布，在羧基端分布比较密集；Karplus-Schulz法预测结果显示，柔韧性区段较多，分布不均匀，在羧基端分布比较集中；Emini法预测结果显示，表面可及性区段较多，呈不均匀分布，氨基端和羧基端分布均较密集；Jameson-Wolf法预测结果显示，高抗原指数区段较多，分布相对均匀，在羧基端分布尤其比较集中(图5)。1.4HspA1B细胞抗原表位的预测根据http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb-input网址中AntibodyEpitopePrediction软件对HspA1进行平均抗原表位指数预测，并采用Kolaskar-Tongaonkar法计算出HspA1的平均抗原表位指数数值。结果，Kolaskar-Tongaonkar法预测结果显示，HspA1蛋白平均抗原表位指数为1.017(图6)。1.5HspA1表位富集区片段筛选对HspA1蛋白功能结构域、二级结构和B细胞抗原表位预测结果进行分析，选取HspA1蛋白的亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可及性等参数数值较高且含有功能结构域的区域为优势B细胞抗原表位富集区(简称HspA1表位区)。根据GenBank中登录的猪附红细胞体德国54/96分离株HspA1蛋白编码基因a1的序列(登录号AM265536)，筛选表位区片段的编码序列(简称a1表位区，a1-epi)。结果，通过对HspA1蛋白功能结构域、二级结构、亲水性指数、柔韧性参数、抗原指数、表面可及性等进行分析，筛选出羧基端第388位-609位区段作为HspA1表位区，其序列见SEQIDNo.1。相应的表位区基因片段a1-epi序列见SEQIDNo.2。HspA1表位区氨基酸序列(SEQIDNo.1)：RNSTIPIDKKQLFSTAVDNQPSVDIHVVQGERPMANQNKSLGTFTLQGIKQAPKGMPKIEVSFSIDANGILTVKAEDKDTGKQNNITINQASGLSEEEINKIIREAEENLEQDKKVKEEIEIKNEAESWISMLENQMKDDSSKIPEASIEETKKLIEEFKKLLEEKKYDELKAKMNQLKEMSQKMMQEVYQQQQAAGGQAASEEKGPEGEDIKEVELNEESNHspA1表位区编码序列a1-epi(SEQIDNo.2)：AGAAATAGTACTATTCCAATTGATAAGAAGCAATTGTTCTCAACTGCTGTAGACAATCAACCTAGTGTTGATATTCACGTAGTACAAGGTGAAAGACCTATGGCTAACCAAAACAAATCCCTAGGTACTTTCACCCTTCAAGGAATTAAGCAAGCTCCTAAGGGAATGCCAAAAATAGAAGTATCCTTCTCTATTGACGCTAACGGTATTCTTACCGTTAAAGCAGAAGATAAGGATACTGGAAAGCAAAACAATATAACTATTAATCAAGCTTCTGGATTATCAGAAGAAGAAATTAATAAGATAATCCGAGAAGCTGAAGAAAATCTTGAACAAGATAAGAAGGTTAAGGAAGAAATAGAAATTAAGAATGAAGCTGAATCTTGGATTTCTATGCTAGAAAACCAAATGAAGGATGATTCTTCAAAGATTCCTGAAGCAAGTATAGAAGAAACTAAGAAGTTAATTGAAGAATTTAAGAAACTTCTTGAAGAAAAGAAGTATGATGAACTTAAGGCTAAGATGAATCAACTAAAAGAAATGAGTCAAAAAATGATGCAAGAAGTTTATCAACAACAACAAGCTGCTGGAGGACAAGCTGCATCAGAAGAAAAAGGTCCTGAAGGAGAAGACATCAAAGAAGTAGAACTTAATGAAGAAAGTAATTAG1.6HspA1表位区原核表达载体的构建1.6.1a1-epi基因的扩增根据a1-epi序列，用PrimerPremier5.0软件设计1对特异性引物：上游引物(SEQIDNo.3)：5’-CGGGATCCATGAGAAATAGTACTATTCCAATTG-3’；下游引物(SEQIDNo.4)：5’-CGGAATTCCTAATTACTTTCTTCATTAAGTTCTAC-3’；引物由上海华大生物技术有限公司合成。所用菌株实际为上海地区的分离株(长宁126分离株)，因为长宁126分离株的a1基因序列与GenBank中德国54/96分离株的a1基因序列相似性最高，相似性为99.89％。以与德国54/96分离株a1基因序列在同一簇上的猪附红细胞体CN126株DNA为模板进行扩增，PCR体系为：PrimeSTARGXLDNAPolymerase(1.25U/μL)0.2μL，5×PrimeSTARGXLBuffer(Mg2+plus)5μL，上、下游引物(100μmol/L)各0.2μL，2.5mmol/LdNTP4μL，模板DNA4μL，加灭菌ddH2O至25μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，37个循环；72℃延伸10min。1.6.2a1-epi克隆载体的构建将a1-epi的胶回收产物分别与pMD18-T载体连接，经PCR鉴定为阳性的连接产物转化菌液被送至上海华大生物技术有限公司进行测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD18-T-a1-epi。1.6.3a1-epi原核表达载体的构建：对pMD18-T-a1-epi质粒和pColdⅠ质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，酶切产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳和胶回收。将a1-epi的胶回收产物与酶切pColdⅠ的胶回收产物进行连接。将经PCR鉴定为阳性的连接产物转化菌液送至上海华大生物技术有限公司测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pColdⅠ-a1-epi。结果，由于从GenBank获得的信息表明，a1基因均不含内含子，因此，采用猪附红细胞体的CN126株DNA进行扩增，a1-epi序列扩增产物大小为672bp(包括ATG)(图7)。测序结果进行BLAST在线比对，扩增的a1-epi与GenBank中的相似性为100％。对构建的a1-epi原核表达载体转化菌液进行PCR鉴定，结果显示，扩增产物大小与插入片段大小一致(图8)。测序结果表明a1-epi基因序列与插入序列一致，原核表达载体构建成功。1.7rHspA1蛋白的诱导表达、纯化、含量的测定和检测1.7.1重组HspA1(recombinantHspA1,rHspA1)蛋白的诱导表达、纯化和含量的测定将pColdI-a1-epi-E.coliBL21菌株接种于LB液体培养基在37℃、200r/min条件下培养至对数生长期，然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，IPTG的最终浓度为1mmol/L。在16℃培养箱中以200r/min摇菌，诱导表达10h后收集菌体，超声裂解，离心后收集上清。利用His-tagged镍柱对rHspA1蛋白进行亲和层析纯化，并按照BCAProteinAssayKit说明书对纯化后的蛋白进行含量测定，纯化后的蛋白于-20℃保存。1.7.2rHspA1蛋白的SDS-PAGE检测利用SDS-PAGE对纯化前和纯化后的蛋白进行检测。分别取16μL与4μL5×SDS凝胶上样缓冲液混匀，100℃水浴加热5min，瞬间离心后取10μL上样。80V电泳30min，然后120V电泳1h，用考马斯亮蓝染色液进行染色，然后用脱色液进行脱色，脱色后分析电泳结果。结果显示，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，在31kDa处有明显的条带，与预期目的条带相符合(图9)，最高浓度为758.035μg/μL。1.7.3rHspA1蛋白的Westernblot检测用Westernblot技术对纯化后的rHspA1进行反应原性检测，所用抗体为His-Tag(27E8)MousemAb(HRPConjugate)(1:1000稀释)，ECL显色。结果显示，rHspA1蛋白能与His-Tag(27E8)MousemAb(HRPConjugate)反应，而pColdⅠ空表达载体的超声裂解液不能与His-Tag(27E8)MousemAb(HRPConjugate)反应(图10)。1.8间接ELISA检测方法的建立1.8.1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的选择采用棋盘法测定，用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)将重组抗原依次稀释成0.5、1.0、2.0、4.0μg/mL，分别包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min，然后用5％脱脂奶粉37℃封闭2h。再用PBST洗涤酶标板3次，以1:50、1:100、1:200、1:400稀释的阳性血清以及阴性血清为一抗，37℃作用1h。PBST洗涤3次后，加入100μLHRP标记的兔抗猪IgG(1:5000稀释)，37℃作用1h。每孔加入100μLTMB-H2O2避光显色15min，再加入50μL2mol/L硫酸终止反应，测定450nm波长处的光密度值(OD450)，选择阳性OD450>1.0、阴性OD450较小、P/N值较大的抗原包被浓度、血清稀释度组合作为最适包被浓度和血清最佳稀释度。结果见表1，选定阳性血清OD值接近1.0并大于1.0，而P/N值较大时的反应孔的抗原及血清的稀释倍数作为两者最佳工作条件。在此基础上测定抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL，而血清最佳稀释倍数为1∶400。表1：最佳包被浓度和最佳血清稀释度的选择1.8.2最佳封闭时间的选择以最适抗原浓度包被酶标板，用封闭液进行封闭，封闭时间分别为1h、2h和3h，然后阳性血清按1.8.1中确定的稀释倍数稀释，其他ELISA测定步骤同1.8.1。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的封闭时间。结果见表2，表明在37℃的温度下封闭2h测出的P/N值最大，所以选择37℃2h为最佳封闭时间。表2：最佳封闭时间的选择1.8.3最佳待检血清作用时间的选择酶标板按照优化的条件包被、封闭后，加入待检血清，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h和2h，进行ELISA测定，其他步骤同1.8.1。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的血清作用时间。结果见附表3，表明在37℃的温度下血清作用1h时，P/N值达到最大。所以选择1.5h为最佳血清作用时间。表3：最佳待检血清作用时间的选择1.8.4最佳酶标抗体工作浓度的选择待检血清按确定的时间作用后，将酶标抗体分别按1:2000、1:3000、1:4000和1:5000稀释，100μL/孔，其他步骤同1.8.1，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的酶标抗体工作浓度。结果见附表4，表明酶标抗体浓度在1∶5000时P/N值达到最大，所以1∶5000的浓度为最佳酶标抗体工作浓度。表4：最佳酶标抗体工作浓度的选择1.8.5最佳酶标抗体作用时间的选择将酶标抗体按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h,其他步骤同1.8.1，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的酶标抗体作用时间。结果见附表5，表明酶标抗体作用1h时P/N值达到最大，所以选择1h的酶标抗体作用时间。表5：最佳酶标抗体作用时间的选择1.8.6底物最佳显色时间的选择酶标抗体按优化好的时间作用、洗涤、加入底物后，37℃分别作用10min、15min和20min，用2mol/L硫酸50μL/孔终止后读数，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的底物显色时间。结果见附表6，显色15min时，阳性值达到并接近1.0，P/N值达到最大，所以选择15min为最佳显色时间。表6：底物最佳显色时间的选择1.9临界值确定取18份阴性猪血清，1∶400稀释，在选择好的条件下进行间接ELISA测定，这些血清数据经统计学分析，得到OD450平均值和标准差S。根据统计学原理，OD450值时，判为阳性。OD450值时，判为阴性，介于两者之间者判为可疑，需重新检测样本，重检时OD450(样本)值时判为阳性，OD450(样本)值时判为阴性。结果，18份健康猪血清的检测结果最高值是0.1965,最低值是0.117,其平均值为0.141759,标准偏差SD为0.031305，当样品OD450值x≥0.266979时判为阳性；当样品OD450值x＜0.235674时判为阴性；当样品OD450值介于0.235674(含0.235674)与0.266979之间则判为疑似。对可疑样本重检时，当OD450值为阳性，OD450值为阴性。2.0交叉反应试验分别取隐孢子虫感染猪血清、弓形虫感染猪血清、猪瘟病毒感染猪血清、猪蓝耳病病毒感染猪血清，1:400稀释，用已优化的间接ELISA方法检测，同时设立阴、阳性血清对照，每份血清平行做3个重复，观察各血清与系统是否有交叉反应。结果见附表7，以rHspA1蛋白包被酶标板，与隐孢子虫感染猪血清、弓形虫感染猪血清、猪瘟病毒感染猪血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪血清反应，OD45分别为0.077333、0.2245、0.04、0.230，均低于0.235674。阳性对照OD450为1.454667，阴性对照OD450为0.196667。表7：交叉性试验猪瘟猪弓形虫猪蓝耳猪隐孢子虫阳性对照阴性对照OD4500.040.220.230.081.450.202.1重复性试验2.1.1批内重复性试验取8份血清在选择好的条件下进行间接ELISA测定，每份血清样品平行做12个重复，按以下公式计算变异系数(coefficientofvariance，CV)：CV＝[样本OD450值标准差(s)/样本OD450值平均数]×100％。2.1.2批间重复性试验取4份不同批次的rHspA1蛋白包被，在选择好的条件下对8份血清进行间接ELISA测定。每份样品重复3次，取平均值，同2.1.1观察其CV值。结果如附表8所示，用同一批制备的rHspA1蛋白包被ELISA板，对8份样品进行检测，重复12孔，批内重复试验的变异系数均值为4.2％。用4个不同批次的蛋白对4份样品进行检测，批间重复试验的变异系数均值为7.94％，表明重复性较好。表8：重复性试验结果血清批内变异系数(CV，n＝12)(％)批间变异系数(CV，n＝4)(％)S13.973.37S22.773.90S33.195.50S42.046.86S53.354.16S64.206.35S71.477.94S81.514.242.2ELISA方法的初步应用以确定的各种最佳条件进行试验，对上海市的75份猪血清样品进行检测，分别与WATANABE等(2012)报道的种特异性PCR、中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品生物安全实验室建立的附红细胞体MSA荧光定量PCR结果进行比较，计算其符合率。结果，用rHspA1蛋白建立的间接ELISA检测75份田间猪血清样品，结果显示阳性样品占54份，阳性率为72.0％。与种特异性PCR和MSA荧光定量PCR进行比较，其阳性复合率分别为64.81％、62.96％，阴性符合率分别为66.67％和100％(附表9)。表9：三种检测结果的比较样品数阳性数阳性率(％)阳性符合率(％)阴性符合率(％)rHspA1间接ELISA755472.0普通PCR754256.064.8166.67MSA荧光定量PCR753445.3362.96100由于猪附红细胞体无法体外培养，对猪附红细胞体的研究进展较为缓慢，给实验室诊断造成一定困难。目前，猪附红细胞体的血清学检测主要采用ELISA，该方法具有简单、快速、灵敏性高、检测样品量多、易标准化等特点。本研究的包被抗原是原核表达的重组HspA1表位区蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化重组HspA1表位区蛋白，从而使抗原来源不再受约束。此外，使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒可以显著提高不同批次间抗原的稳定性。由于原核表达的重组蛋白即使经过纯化回收也难以完全排除大肠杆菌菌体蛋白成分的干扰，而且在生长过程中猪群可能多次感染大肠杆菌，其血清样本中可能含有大肠杆菌成分的抗体，很可能造成假阳性结果而降低间接ELISA检测方法的特异性，为避免这一影响，本试验在血清样品与包被抗原反应前，先采用大肠杆菌裂解物和血清样品在37℃作用1h。本研究所建立的间接ELISA方法与种特异性PCR和MSA荧光定量PCR的阳性符合率分别为64.81％、62.96％，阴性符合率分别为66.67％、100％。提示本研究所建立的间接ELISA与种特异性PCR和MSA荧光定量PCR具有较高的阴阳性符合率。此外，该间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3