本申请是申请日为2012年8月30日，申请号为201280051483.7、发明名称为“生物产物的单一容器制造”的发明专利申请的分案申请。技术领域本申请涉及生物产物的单一容器制造。
背景技术：
已用多种形式生产生物反应器，其通常是细胞培养物在其中生长的室。通常，使用生物反应器使哺乳动物细胞培养物生长，其中细胞产生细胞外组份，例如抗体或重组蛋白质。还使用生物反应器进行病毒产生。执行分离工艺以从生物反应器浓缩并纯化所需组份，其可用作(例如)治疗剂或诊断剂。生物反应器是复杂的机械装置，其主要提供液体的混合与气化以使生物培养物生长；在这个步骤后实施若干个其它单元处理，包括分离细胞、硝化以减少营养培养基的体积、加载到色谱柱上以及若干个分离步骤。近年来，人们已逐渐了解到在较短周转时间中产生多种生物产物，特别是因为其涉及对抗恐怖主义相关需求所需的产物；这还包括对快速研发并制造疫苗和抗体的需求。当前方法需要利用无尘室、较大资本投资和冗长繁琐的工艺来制造这些产物。业内非常需要创造生物反应器系统，其将能在最适条件下产生生物产物，能将生物产物制造的所有步骤组合在同一容器内，且购买及操作成本最低。另外，其将是一个封闭系统，可在任何地方安装并使用而无需无尘室，且其中将保护操作者免受产品侵袭。此一发明将改变药物发现和制造过程，从而使得可能以可承受的成本向人类提供新就生药物。独立地，所述发明将满足许多反恐怖主义行动以及传染病控制的重要需求。混合和气化是当今每种可用生物反应器执行的主要功能。一般来说，提供单独的机械装置来执行这些功能，但在一些情况下，使用鼓泡反应器，其中向上移动的气团也提供混合功能。由于气化要求与混合功能之间的不平衡，不可能理想地将两种功能组合成一种，也就是使用气化来混合流体。生物反应器中的多种反应需要在可保护产物免受环境侵袭并保护人员免受产物侵袭的环境中执行；这要求建立无尘室设施，其构筑和验证可耗费数百万美元。另外，生物药物纯化中需要的许多步骤是独立于产生生物产物时的阶段执行，例如从分泌产物的CHO细胞或以包涵体形式产生产物的细菌纯化。将生物产物制造中的所有步骤(从细胞生长以分泌生物产物到分离并纯化生物产物)组合在在整个操作期间保持封闭的同一容器内的系统将改变研发并制造生物药物的方式。因为这个系统将容许快速部署所述制造，所以所述系统将最适于需要快速制造产物的情况，例如在反恐怖主义行动中以及在保护公众免受传染病侵袭时。在不受控环境中制造生物药物的能力将使得可能以其当前成本的一部分来制造多种产物，增加其可用性，且封闭系统提供的保护将允许制造原本无法安全制造的生物产物。关于将产物的采集和纯化组合在生物反应器内的方面是新颖的突破性技术。尽管生物反应器仅用于使细菌或其它细胞生长的目的，但可将其作用扩展到包括其它可在生物反应器内完成的工艺。业内需要研发生物反应器用于表达生物产物并将其与营养培养基中的其它组份分离，通过使生物产物与色谱介质在生物反应器内结合将表达和分离步骤组合在生物反应器内，弃去营养培养基并洗脱呈浓缩溶液形式的生物产物；这将消除生物产物的分离和纯化中的至少三个步骤，即过滤或离心以移除细胞培养物，执行超滤以减小体积，和通过从生物反应器选择性洗脱以纯化生物产物；最后一个步骤使生物反应器成为色谱柱。过滤、色谱和纯化的耗时且昂贵的步骤减慢制造工艺，且为了建立cGMP级制造操作，特别是无尘室环境而显著增加资本成本要求。
技术实现要素：
本发明在一个方面中提供制备多种生物产物的方法。所述方法包含提供生物反应器，所述生物反应器适于容纳预定体积的营养培养基且包含：(a)容器，其具有至少一个内壁；(b)隔膜，其定位在所述容器内并界定下部室和上部室；(c)所述隔膜具有多个孔以在所述下部室与所述上部室之间提供流体连通；(d)至少一个营养培养基入口；(c)至少一个营养培养基出口；(d)至少一个气体入口；(e)至少一个气体出口。所述生物反应器是通过以下方式操作：(f)添加营养培养基和(g)生物培养物，(h)调节营养培养基的温度，(i)开始气体流动以搅动营养培养基并将气体吸收到营养培养基中，且将生物反应器操作足够长时间以容许生物培养物产生所需生物产物。尽管可在此时停止所述工艺，但其可通过以下方式继续进行：(j)在生物反应器中添加色谱介质以结合所分泌的生物产物，然后(k)使其经受若干个洗涤和纯化步骤以通过仅使用一个封闭容器获得纯净形式的生物产物。上述制备生物产物的方法是在密封容器、优选地二维柔性袋内部执行，这将容许在较不受控的环境中实施这些操作。此外，这可保护操作者免受生物产物侵袭以免所述产物对人类具有任何有害效应。附图说明图1是本发明优选实施例的生物反应器的侧面剖视图。图2是本发明优选实施例的生物反应器中隔膜的局部视图。具体实施方式在一个方面中，本发明提供适于从预定体积的营养培养基制备纯化生物产物的生物反应器，以及其相关使用方法。首先看图1，其展示本发明生物反应器的优选实施例的侧视图。在此实施例中提供容器4，其具有至少一个内壁和任选地附加在垂直结构15上的容器4的载体16。容器4提供贮器，营养培养基处于其中，且在其中进行所需生物产物的生长。容器具有隔膜13，其定位在容器内并界定下部室12和上部室20，所述隔膜具有多个孔5，所述孔在下部室与上部室之间提供流体连通。另外，隔膜13分成簇17达到容器底部以防止其在加压期间鼓胀。容器4包含若干个端口，包括气体入口9，该气体入口进一步包含消毒过滤器7和阀8。气体入口9连接到压缩气体源。一旦打开气体源，气体立即经由气体入口9在通过消毒过滤器7后进入下部室12。由于隔膜13中的多个孔5具有较小直径，使得气体穿过隔膜13的流动受阻，从而导致下部室12内部积累压力。一旦下部室中达到临界压力，气体就穿透多个孔5并进入上部室20中，且横穿通过容器4的内容物，最终打破容器中液体14的表面并最终经由气体出口2离开容器。容器还包括阀10，其控制经由液体出口11移除营养培养基和生物培养物。上部室20进一步包含液体入口1以将营养培养基和生物培养物引入容器4中，且具有歧管19以容许连接件18连接到缓冲液、营养培养基、生物培养物和色谱介质；任选地提供采样端口3以定期移除营养培养基来分析其内容物。仍参见图1，容器4、特别是如本文进一步阐述的柔性容器需要载体来支撑，后者优选地包含平台16和侧壁15。平台和侧壁可包括任何适宜材料，例如金属或坚硬聚合物，只要其足够坚硬以支撑柔性容器即可。合意地且如图1中所展示，平台(和容器)相对于底板或其它表面有所上升。这允许入口和出口位于侧面上或是容器支撑在平台上。例如且如此实施例中所阐释，需要容器4的至少一个气体入口9位于容器中可与平台共同延伸的部分上，其中平台包括开口，经过所述开口允许气体经过气体入口9通过平台并进入容器4中。如果需要，容器4支撑在平台表面16上，所述平台表面16又是由垂直结构15来支撑。载体表面16的下表面另外包括用于容器4的加热或冷却构件6。气体入口9具有另一控制阀8，其位于容器4与消毒过滤器7之间；控制阀8位于压缩气体源与消毒过滤器7之间。硬质载体平台16另外含有加热元件6，其附接到与接触容器4的一侧相对的一侧，以容许将营养培养基保持在所需温度下，最有可能在37℃下。图2显示隔膜13的局部视图，其中多个孔5均匀地或以特定图案分布在隔膜13的整个水平表面上。更特定来说，隔膜13包含大小与容器4的底部尺寸大致相同的柔性塑料片，且所述塑料片已通过机械构件(例如使用激光束)打孔以产生按比例遍布整个表面的孔。隔膜夹在柔性袋的顶部层与底部层之间，且以成簇形式17附接到底部表面以防止两个层在加压期间分离。下部室中的压力将气体从孔5迫出成为营养培养基内部的小气泡；应理解，营养培养基将存在于容器4的两个室中。一般实施例在第一实施例中，本发明提出不管气化要求如何，不向容器施加任何外侧运动且不将任何机械装置附接到容器(在袋的内部或外部)，都能使所有类型的细胞和生物体生长的生物反应器。在第二实施例中，本发明通过提供在生物反应器中通过将生物产物结合到色谱介质来捕获所述生物产物以采集生物产物的便捷方式，从而提出生物反应器的另一功能。不需要机械装置。因此，本发明将药物的生物制造中的至少一个重要步骤与上游处理组合。在第三实施例中，本发明提出在生物反应器内从营养培养基和生物培养物分离生物产物的方法，从而消除了离心营养培养基以移除生物培养物和过滤营养培养基以减小其体积的需要。在第四实施例中，本发明提出在生物反应器中纯化生物产物的方法，其中将生物产物选择性结合到色谱介质并逐渐将其洗脱执行的是通常在色谱柱中执行的相同功能。因此，在所述情况下，本发明起类似色谱柱的作用。在第五实施例中，本发明通过消除一些最昂贵且耗时的步骤来提供显著降低重组药物制造成本的方式。在第六实施例中，本发明提供制造危险生物物质的方式，其没有任何特殊限制且还保护生物产物免受环境和人员侵袭。现有技术本发明是鼓泡反应器类型，其还用作分离式生物反应器。授予富里(Furey)的美国专利7,875,448教示一次性生物反应器，其包含：容器，其用于容纳流体培养物；第一扩散器，其安置在所述容器内；出口管，其用于从所述容器的底部吸取培养物；入口管，其用于使至少一部分培养物从出口管经由所述扩散器返回所述容器，所述第一扩散器安置在所述容器底部上方且在所述容器容纳流体培养物时完全安置在培养物内，其中所述第一扩散器将返回所述容器的所述培养物分散成比无所述第一扩散器情况下使用所述入口管所出现更宽的分布流，其中所述第一扩散器将来自容器外部来源的气体与在所述分散到所述容器中之前的所述返回的培养物组合。本发明权利要求书对这种生物反应器没有文义侵害，因为没有流体培养物(本发明的营养培养基和生物培养物混合物)的再循环；扩散器在美国专利7,875,448中被描述为筛网，而本发明使用多孔隔膜来产生压力以将气体转移到容器中。另外，现有技术仅阐述使细胞在营养培养基中生长的方法，而本发明使用多孔隔膜充当过滤器来执行若干种其它功能。授予贺治(Hodge)的美国专利7,629,167教示生物反应器系统，其包含：一次性容器，其用于容纳用于处理的生物材料，所述一次性容器包含包括至少一个输入端口的单一室；配件，其包含与输入端口相连的多孔表面且所述表面经配置以容许入口气体流通过并在将入口气体流添加到单一室内部之前控制气泡的大小和分布，其中多孔表面的孔径选自大孔、微米孔、亚微米孔、纳米孔和其组合；一次性混合系统，其包含定位于多孔表面上方并在单一室内在单一室的下部的叶轮，所述叶轮经配置以通过磁性耦合到叶轮且在单一室的下部外部的电动机驱动，从而使得含于单一室内的生物材料得到混合且增加气泡循环；至少一个排出端口；至少一个采集端口；用于支撑一次性容器的结构；一个或一个以上传感器，其用于感测容器内生物材料的一个或一个以上参数；和加热器，其用于加热一次性容器的内容物，所述加热器具有恒温器。这个专利不构成本发明的现有技术，因为此处提供的多孔表面与气体入口相连且不提供如本发明所主张的分散遍布容器底部的物流。授予戈格莱(Gaugler)等人的美国专利6,432,698教示提供用于培养微生物和细胞的一次性生物反应器。所述生物反应器适合不熟悉微生物学或无菌技术的个体使用。其是由柔性或半柔性防水片形成容器来构造，所述容器经设计以向在其中培养的微生物提供混合和气体交换。混合和气体交换是通过使气体从具有楔形或圆形底部的容器的最低顶点处的单一位置或从横跨平底容器的多个位置鼓泡穿过培养物来实现。这个专利不构成现有技术，因为本发明提供气体从整个容器底部的扩散。美国专利5,081,036教示：1.气升式生物反应器，其用于使在液体生长培养基中释放生物产物的细胞生长，所述生物反应器包含：a.生长室，其用于接收细胞和液体生长培养基并提供用于细胞生长的环境，所述生长室具有界定中间区域的内侧壁；b.构件，其用于将气体流温和鼓泡向上穿过所述生长室的中间区域，由此使液体生长培养基温和向上循环穿过所述生长室的中间区域，且随后沿所述生长室的内侧壁向下返回；和c.不锈钢细丝海绵，其位于所述生长室内以在所述生物反应器正在操作中时切断存于所述生物反应器中的液体生长培养基的温和循环的至少一部分，所述不锈钢海绵的表面积和细丝间隔足以促进将气体流的至少一部分吸收到液体生长培养基中并使细胞陷入或附着在海绵内，且维持液体培养基的温和循环。这篇关于气升式生物反应器的参考文献不构成本发明的现有技术。在美国专利数据库中检索提供\制备式\功能的鼓泡反应器找到一篇参考文献。授予唐斯(Downs)的美国专利6,723,555教示发酵设备，其经构筑以使用多个发酵器皿产生已知且可重复量的无污染发酵产物。为有助于与其它产物处理步骤相容的进一步处理，发酵设备具有在容器框架中排列的样品器皿阵列。容器框架经配置以在发酵期间容纳样品器皿并将器皿阵列输送到另一处理站或从另一处理站输送器皿阵列。对应于样品器皿阵列中的样品器皿数目，套管阵列经配置以使得可将每一套管置于样品器皿内部。将套管阵列附接到气体分布器，其将氧和/或一种或一种以上其它气体从气体源经过套管递送到样品器皿中。由于每一个别样品器皿的发酵体积小于整体发酵设备，所以发酵产物产率可预测且可有效优化细胞生长速率、这篇参考文献不构成本发明的现有技术。授予汉森(Hansen)等人的美国专利7,699,976教示上流式生物反应器，其包括具有经配置用于上流式操作的入口和出口的器皿。隔膜定位在器皿内且界定下部室和上部室。隔膜包括在上部室与下部室之间提供流体连通的孔隙。生物反应器还包括用于释放下部室中的压力积累的构件。在一种配置中，隔膜包括可释放部分，其具有打开位置和关闭位置。可释放部分经配置以响应下部室中的压力积累而移动到打开位置。在打开位置中，下部室与上部室之间的流体连通增加。或者，下部室可包括由压力积累选择性开动的压力释放管线。压力释放机构可防止生物反应器阻塞和/或防止高压对生物反应器造成灾难性损坏。这篇参考文献不构成本发明的现有技术，因为本发明中提供的隔膜在使用期间未被突破。在美国专利数据库中检索提供\分离式\功能的鼓泡反应器未找到参考文献。阿贡实验室(Argonne)的科学家(www.anl.gov)最近使用电动力输送有机酸离开生物催化剂跨越离子交换膜并进入浓缩室中，与用于处理酸的正常代谢过程极为类似。为了以成本有效的方式提供电流，研究者转向电脱离子(EDI)。EDI是公认的用于产生高纯水的商业技术。先前，阿贡实验室的科学家改良EDI以使得其可用于对化学和农业产物进行脱盐。为此，研究者将松散的离子交换色谱介质珠粒模制成多孔色谱介质晶片，从而使得与常用处理相比，能在稀释水平下以高能效捕获带电盐和酸，且显著减少废物流。这成为阿贡实验室的分离式生物反应器的基础。研究者还认识到，尽管将酶直接固定在膜上可提供极佳产物分离，但酶密度不足会限制总体性能。为增大密度，科学家将酶固定技术整合到多孔色谱介质晶片中并创造出可有效产生并移除有机酸的材料。在阿贡实验室设计它的分离式生物反应器时，研究者将酶捕获色谱介质珠粒纳入色谱介质晶片中。所固定生物催化剂将糖转化为目标酸，且将产物以电学方式输送到浓缩槽中。这使得在没有缓冲或中和的情况下进行反应。阿贡实验室的固定技术还使得可不拆卸系统就原位剥除并更换已降解的酶。阿贡实验室关于分离式生物反应器的发明阐述于以下文献中：US6797140中(电脱离子方法(Electrodeionizationmethod))、US6495014(电脱离子衬底和用于电脱离子处理的装置(Electrodeionizationsubstrate,anddeviceforelectrodeionizationtreatment))、US24060875A1(电脱离子方法)、US24115783A1(电脱离子中的固定生物催化酶(Immobilizedbiocatalyticenzymesinelectrodeionization))、US25056547A1(阳离子羧酸盐的使用电脱离子的单级分离和酯化(Singlestageseparationandesterificationofcationsaltcarboxylatesusingelectrodeionization))。这些参考文献都不形成本发明的现有技术。阐述分离式生物反应器的美国专利包括：8,007,647，分离式生物反应器中抗衡离子的保留(Retentionofcounterionsintheseparativebioreactor)；7,981,261，用于分离带电载体并减少光腐蚀的整合装置和衬底以及用于光电化学产生电流和光催化产生氢的方法(Integrateddeviceandsubstrateforseparatingchargedcarriersandreducingphotocorrosionandmethodforthephotoelectrochemicalproductionofelectricityandphotocataiyticproductionofhydrogen)；7,141,154，阳离子羧酸盐的使用电脱离子的单级分离和酯化。这些专利都不构成本发明的现有技术。美国专利7,977,395，电子和离子传导性多孔材料和从其制造树脂晶片的方法(Electronicallyandionicallyconductiveporousmaterialandmethodformanufactureofresinwaferstherefrom)；7,799,548，从多孔固体离子交换晶片剥除加遗传标签的生物分子的方法(Methodofstrippinggeneticallytaggedbiomoleculesfromporoussolidionexchangewafer)；7,507,318，使用树脂晶片的装置和其应用(Devicesusingresinwafersandapplicationsthereof)；7,452,920，电子和离子传导性多孔材料和从其制造树脂晶片的方法；和7,306,934，用于固定生物分子的多孔固体离子交换晶片(Poroussolidionexchangewaferforimmobilizingbiomolecules)教示多孔固体离子交换晶片，其包含生物分子捕获色谱介质与离子交换色谱介质的组合，所述组合在所述晶片内形成含有+2价过渡金属阴离子的带电捕获色谱介质。另外，此申请案主张分离式生物反应器，其包含阳极和阴极、多个反应室，至少一些反应室是从多孔固体离子交换晶片形成，所述晶片具有在所述晶片内形成带电捕获色谱介质的生物分子捕获色谱介质与离子交换色谱介质的组合，且具有固定在所述带电捕获色谱介质上的加遗传标签的生物分子，所述多孔固体离子交换晶片中的每一者在其内具有插入阳离子交换膜与阴离子交换膜之间的带电捕获色谱介质，以及用于在阳极与阴极之间供应电位的机构。这些揭示内容都不是本发明所共有，且本发明中列举本发明的基本特征。总之，文献中没有现有技术可对本发明中作出的权利要求造成文义侵害。使用柔性多孔隔膜引入气体并混合液体以及使用色谱介质采集并纯化生物产物是新颖的、不明显的而且实用的。