技术领域本发明涉及一种碱性果胶酶分泌增强型菌株及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母表达蛋白易于纯化，产量高，但异源蛋白过量表达会导致生长胁迫压力引起未折叠蛋白效应(UPR)，导致碱性果胶酶的产量不能进一步提高，限制了碱性果胶酶的工业化生产。
技术实现要素：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种碱性果胶酶分泌增强型菌株。所述碱性果胶酶分泌增强型菌株通过将毕赤酵母HAC1、ERO1、BMH2、GCN4、UBC1、HRD1、SSO2、SEC53、PDI或GSH2基因连接到毕赤酵母表达载体pGAPZA，并转化至重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母中。所述重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL是将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的碱性果胶酶基因，连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母GS115中得到的。本发明还提供上述碱性果胶酶分泌增强型菌株的构建方法，步骤如下：(1)以毕赤酵母GS115反转录cDNA为模板，通过PCR方法获得目的基因；(2)将步骤(1)获得的目的基因连接到毕赤酵母表达载体pGAPZA上，得到重组质粒；(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母得到分泌增强型基因工程菌株。本发明还提供应用所述重组菌发酵生产碱性果胶酶的方法。在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组菌活化后接种至生长培养基BMGY中于30℃、220rpm条件下培养24h，然后再转接入诱导培养基BMMY中，于23℃、220rpm下每24h添加1.5％的甲醇诱导碱性果胶酶的表达。所述生长培养基BMGY(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液调pH至pH6.0。所述诱导培养基BMMY(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甲醇9％，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液调pH至pH6.0。有益效果：相对于现有的基因工程菌株PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL而言，本发明的基因工程菌株PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-HAC1酶活提高了24.1％，PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-ERO1酶活提高了35.5％，PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-UBC1酶活提高了22.3％。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。附图说明图1：克隆表达质粒示意图。图2：碱性果胶酶SDS-PAGE分析；1-5泳道分别代表GS115-pPIC9K空、GS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-HAC1、GS115-pPIC9K-PGL、GS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-UBC1、GS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-ERO1。图3：共表达重组菌株发酵生产碱性果胶酶的性能对比。具体实施方式：培养基：种子培养基YPD：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L。生长培养基BMGY(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液调pH至pH6.0。诱导培养基BMMY(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甲醇9％，YNB13.4g，以pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液调pH至pH6.0。碱性果胶酶酶活测定：采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。实施例1：重组菌的构建及鉴定提取毕赤酵母GS115RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物，通过PCR的方法获得UPR相关基因(HAC1、ERO1、SLY1、BMH2、GCN4、UBC1、HRD1、SSO2、SEC53、BIP、PDI、GSH2)，将其克隆至表达载体pGAPZA上，获得重组质粒pGAPZA-X(克隆表达质粒示意图见附图1，X代表HAC1、ERO1、SLY1、BMH2、GCN4、UBC1、HRD1、SSO2、SEC53、BIP、PDI或GSH2)，将重组载体转化PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL，经筛选鉴定获得共表达重组菌株PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL/pGAPZA-X。所述重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL是将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的碱性果胶酶基因，连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母宿主菌株GS115中得到的。引物如下：毕赤酵母的转化采用电转化法。具体步骤如下：挑取酵母受体菌的单菌落接种于25mLYPD液体培养基中，30℃摇床过夜；以5％接种量转接50mLYPD液体培养基，30℃摇床培养至OD＝1.3-1.5；4℃离心，5000rpm，5min，弃上清；用50mL冰预冷无菌水将菌体重悬；4℃离心5000rpm，5min，弃上清；用25mL冰预冷无菌水将菌体重悬；4℃离心5000rpm，5min，弃上清；再用5mL1mol/L的冰预冷的山梨醇洗涤1次，重悬，4℃，5000rpm离心5min，弃上清；加入适量体积1mol/L的冰预冷的山梨醇，重悬；分装至无菌EP管中，每管80μl，以备转化。将提取的共表达载体pGAPZA-X用酶AvrII线性化，在80μl酵母感受态细胞中加入用合适酶切位点线性化的质粒1-5μg冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中(冰预冷)，1500v电击，迅速加入1ml冰预冷的山梨醇，涂含有200μg/mlZeocin的YPDS平板，培养3-4天后挑取单克隆。实施例2：共表达基因工程菌株的酶活测定及蛋白电泳培养方法：菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基YPD，于30℃、220rpm条件下培养14h，转接至优化后的生长培养基BMGY培养基于30℃、220rpm条件下培养24h，再将菌株转入诱导培养基BMMY中23℃、220rpm每24h添加1.5％的甲醇，诱导碱性果胶酶的表达。酶活测定条件为：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。选用碧云天SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒配制12％分离胶和5％浓缩胶，具体操作方法见产品说明书。样品与5×上样缓冲液以体积比4:1混合，沸水浴10min，冷却后上样。电泳时，80V恒压电压，待指示剂进入分离胶后，电压调至150V，待指示剂至胶底时结束电泳。用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，染色1h后脱色(SDS-PAGE图谱见附图2)。实施例3：碱性果胶酶的纯化将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，加硫酸铵进行梯度盐析，低温离心收集30～50％硫酸铵沉淀部分，将盐析沉淀的酶溶解在甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH7.5)中，用20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液透析处理24h。离心所得上清液经阳离子交换层析进行进一步分离纯化。相比于比共表达UPR相关基因前的出发菌株PichiapastorisGS115-pPIC9K-PGL摇瓶诱导发酵96h酶活为301.32U/ml，本发明中分泌增强型重组菌PichiapastorisGS115-PGL/pGAPZA-HAC1酶活为373.94U/ml提高了24.1％，PichiapastorisGS115-PGL/pGAPZA-ERO1酶活408.27U/ml提高了35.5％，PichiapastorisGS115-PGL/pGAPZA-UBC1酶活368.54U/ml提高了22.3％，其他的一些共表达重组菌株也有一定的提高或降低效果(共表达重组菌株发酵生产碱性果胶酶的性能对比见附图3)。