一种用于野山参基因组DNA的提取方法与流程

本发明涉及一种植物DNA的提取方法，具体涉及野山参的基因组DNA提取方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

人参为五加科多年生草本植物,是我国常用的珍贵药材。人参种质资源主要包括野山参和栽培人参,野山参为国家珍稀濒危物种。近年来,栽培人参品质下降、品种混乱、参地连作障害、生产滞销等原因严重破坏了人参种质资源。急需构建野山参种质基因库,收集和整理人参宝贵的种质资源。野山参中含有丰富的多糖、蛋白质、皂苷等次生物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。采用分子标记技术进行野山参种质资源遗传多样性研究，揭示其遗传多样性水平和遗传结构状况，对于高效地建立野山参种质资源基因库、野山参遗传育种以及野山参种质的进一步开发利用具有非常重要的指导意义。

基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，常用的基因组DNA提取方法有：CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高盐沉淀法、试剂盒等。采用上述几种方法提取野山参基因组DNA时都出现研磨样加入提取液后变得非常粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，缠搅在其中的粘性物致使DNA检测时上样困难、电泳困难，DNA得率低。

罗志勇等在高质量植物基因组DNA的分离[J]，湖南医科大学学报，2001, 26(2)，178-180中描述了一种人参基因组DNA的提取方法，其对传统CTAB方法进行了改良，包括提高CTAB浓度及β-巯基乙醇，以提高提取的基因组DNA的质量及收率，但其得到的基因组DNA有部分降解并且得率不高，不适用于样品稀少且较昂贵的野山参样品的基因组DNA的提取。

为了解决野山参中次生物含量高导致的高质量DNA提取困难及收率较低的问题，本发明对常用的CTAB方法加以改良，获得了一种用于野山参基因组DNA提取的有效方法。该方法适用于提取昂贵的野山参样品，可利用微量的人参样品，提取出适合于进行分子鉴定及后续测序所需的高质量高浓度的基因组DNA。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供了一种用于野山参基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

(1) 将野山参样品用液氮研磨成粉末，加入2％CTAB提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴1-3h，13000转/分离心10-15min，取上清液置于新的离心管中；

(2) 向步骤（1）中得到的上清液中加入氯仿与异戊醇混合液颠倒混匀，其中氯仿：异丙醇的体积比为24:1，13000转/分离心10-15min，取上清液置于新的离心管中；

(3) 向步骤（2）中得到的上清液中加入氯仿，颠倒混匀，13000转/分离心10-15min，取上清液置于新的离心管中；

(4) 向步骤（3）中得到的上清液中加入预冷异戊醇，颠倒混匀，-20℃放置1-3h，4℃ 13000转/分离心15min，去上清液；

(5)用75%乙醇清洗步骤（4）得到的DNA沉淀两次，室温下干燥3min，用50-100μl重蒸水溶解，-20℃保存备用。

其中，步骤（1）中所述的2％CTAB提取液由2％CTAB、100mmol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及2%PVP组成，所述TrisHCl的pH值为8.0；所述的水浴时间优选为3h。

其中，步骤（2）中所述的氯仿与异戊醇的混合液与上清液的体积配比为1:2。

其中，步骤（3）中所述的氯仿与上清液的体积配比优选为1:2。

其中，步骤（4）中所述的预冷异戊醇与上清液的体积比为5: 2-5:4；进一步地，优选为5: 3。

其中，步骤（4）中所述的-20℃放置的时间优选为1.5-3h。

其中，步骤（1）-步骤（3）中所述的离心时间优选为15min。

本发明的野山参基因组DNA的提取方法的优点在于：

1、在步骤(1)中加入了2％体积的PVP，PVP是一种抗氧化剂，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚类物质，这对于含有较多酚类物质的干制材料具有非常明显的除酚作用，从而能够有效地减少提取DNA过程中酚的污染；

2、在步骤(2)进行抽提时所加入的氯仿-异戊醇混合液，氯仿可使蛋白质变性，并有助于液相和有机相的分离，而异戊醇则可以消除抽提过程中出现的气泡；

3、步骤(3)在步骤(2)的第一次抽提之后使用氯仿再进行二次抽提，并且能够进一步提高DNA的纯度，并且大幅提高DNA提取率，并保证后续程序的可靠性。

采用本发明的DNA提取方法能有效去除人参中的次生产物，提取野山参样品的DNA具有含量大、纯度高等优点。

附图说明

图1野山参DNA电泳检测结果

图2为PCR电泳检测结果，从左至右分别为DL2000 marker，实施例1提取的野山参基因组DNA样品，实施例2提取的野山参基因组DNA样品，实施例3提取的野山参基因组DNA样品。

具体实施方式

实施例1

(1)、取0.2g野山参样品放入研钵中，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的1ml 2％CTAB提取缓冲液溶解，2％CTAB提取液由2％CTAB、100mmol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及2%PVP组成，所述TrisHCl的pH值为8.0，总体积约为1ml；放入水浴锅中65℃温浴1h，13000g离心10min，取上清液至于新的离心管中；

(2)、再加入约0.5ml的氯仿与异戊醇混合液后混合，氯仿与异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，13000g离心10min；取上清液置于新的离心管中；

(3)、向上清液中加入0.5ml氯仿，颠倒混匀，13000g离心10min；取上清液至于新的离心管中；

(4)、向上清液中加入0.8ml的预冷异戊醇后混合，颠倒混匀，-20℃条件下放置1h；4℃ 13000g离心15min，去上清液；

(5)、回收沉淀，用75％乙醇清洗2次，室温下干燥3min，用50μl重蒸水溶解，置于-20℃条件下保存备用。

实施例2

(1)、取0.2g野山参样品放入研钵中，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的1ml 2％CTAB提取缓冲液溶解，2％CTAB提取液由2％CTAB、100mmol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及2%PVP组成，所述TrisHCl的pH值为8.0；总体积约为1ml；放入水浴锅中65℃温浴3h，13000g离心15min，取上清液置于新的离心管中；

(2)、再加入约0.5ml的氯仿与异戊醇混合液后混合，氯仿与异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，13000g离心15min；取上清液至于新的离心管中；

(3)、向上清液中加入0.5ml氯仿，颠倒混匀，13000g离心15min；取上清液至于新的离心管中；

(4)、向上清液中加入1.6ml的预冷异戊醇后混合，颠倒混匀，-20℃条件下放置3h；4℃ 13000g离心15min，去上清液；

(5)、回收沉淀，用75％乙醇清洗2次，室温下干燥3min，用100μl重蒸水溶解，置于-20℃条件下保存备用。

实施例3

(1)、取0.2g野山参样品放入研钵中，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的1ml 2％CTAB提取缓冲液溶解，2％CTAB提取液由2％CTAB、100mmol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及2%PVP组成，所述TrisHCl的pH值为8.0；总体积约为1ml；放入水浴锅中65℃温浴3h，13000g离心15min，取上清液至于新的离心管中；

(2)、再加入约0.5ml的氯仿与异戊醇混合液后混合，氯仿与异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，13000g离心10min；取上清液置于新的离心管中；

(3)、向上清液中加入0.5ml氯仿，颠倒混匀，13000g离心10min；取上清液至于新的离心管中；

(4)、向上清液中加入1.2ml的预冷异丙醇后混合，颠倒混匀，-20℃条件下放置3h；4℃ 13000g离心15min，去上清液；

(5)、回收沉淀，用75％乙醇清洗2次，室温下干燥3min，用50μl重蒸水溶解，置于-20℃条件下保存备用。

实施例4 DNA质量检测分析

将采用实施例1-3方法提取的野山参样品的基因组DNA进行DNA电泳检测和NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测。

另外，采用Jin D C等在Variat io n of RAPD patterns between Male and Female Genomic DNAs in Dioecio us Rumex acetosa L[J] ，Korean J. Plant . Res，2003, 16(1) : 55- 60.中描述的方法（对比例1）及罗志勇等在高质量植物基因组DNA的分离[J]，湖南医科大学学报，2001，26( 2)，178-180中描述的方法（对比例2）做为对比。

结果见图1和表1：

从图1中可以观察到清晰的条带（以实施例1为例），从表1中可以看出采用上述实施例的方法提取的DNA OD260/280比值在1.8左右，说明提取的DNA纯度较高，另外DNA的含量分别为71.0μg、75.3μg和76.3μg，明显高于对比例1和2的35μg和41μg，说明本发明的提取方法提取的野山参基因组DNA得率较高。

表1 用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测人参DNA结果

实施例5 PCR分析

采用实施例2中的DNA提取液进行实施荧光PCR。

结果见图2：

从图2可以看出，DNA条带清晰，重复性强，可以做进一步分析。

以上实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的范围。应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。