本发明涉及一种1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物即1,2,4-三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑硫醚衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
如今，1,2,4-三唑，1,3,4-噻二唑和吡啶衍生物常常表现出广泛和多样的活性。一些报道表明稠杂环衍生物由于其非常有价值生物活性，所以和单杂环一样有非常重要的应用。通过向1,2,4-三唑环中引入1,3,4-噻二唑环视一个有效的方法，并具有很好的活性，例如抗癌活性、抗SIRT1活性、抗炎症活性和杀菌活性等。吡啶结合单1,2,4-三唑或1,3,4-噻二唑常常出现在文献中，但是具有生物活性的吡啶结合1,2,4-三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑却很少报道。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物及其制备方法和应用，它通过在微波辅助合成下用较简便的方法合成了一系列新化合物，并这些化合物有些具有良好杀菌活性，为新农药的合成探索了方法和制备技术。
所述的一种1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物，其特征在于所述1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物为3-(4-吡啶基)-[1,2,4]-三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-硫醚类化合物，其结构式如式(I)所示：
式(I)中：R为C1～C14烷基、苄基、取代苄基、噻唑、取代噻唑、吡啶或取代吡啶，所述取代苄基的取代基为卤素、甲基或腈基，取代吡啶、取代噻唑的取代基均为卤素。
所述的一种1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物，其特征在于R选自十一烷基、2-甲基苄基、3,4-二氯苄基、3-氯苄基、4-溴苄基、4-氯苄基、4-腈基苄基、2-氯噻唑、6-氯吡啶、2-氯苄基。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将异烟酸，硫酸和无水甲醇混合，加热回流反应，生成如式(Ⅱ)所示的异烟酸甲酯，异烟酸、硫酸和无水甲醇的物质的量之比为：1:1～2:1～2，优选为1：1.2：1.2；
2)将步骤1)得到的异烟酸甲酯与质量浓度80％的水合肼回流反应，反应结束后，将反应液冷却到室温，过滤、用冰乙酸乙酯洗涤、干燥得到如式(Ⅲ)所示的异烟肼，异烟酸甲酯与水合肼的物质的量之比为1:2.5～4.0，优选为1:3.5；
3)将式(Ⅲ)异烟肼(10mmol)、二硫化碳(12mmol)和氢氧化钾(12mmol)混合回流反应，反应结束后旋干溶剂得到式(Ⅳ)所示的4-吡啶二硫代酰腙的钾盐；
4)将步骤3)得到的4-吡啶二硫代酰腙的钾盐与水合肼回流反应5小时，反应完毕后加水稀释，再用稀盐酸酸化，过滤，水洗三次，干燥得到如式(Ⅴ)所示的4-氨基-5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3- 巯基；
5)将步骤4)得到的4-氨基-5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-巯基和二硫化碳溶于有机溶剂A中，再加入2滴三乙胺，加热回流，回流搅拌过夜，反应完毕后将混合液倒入碎冰中，用稀盐酸酸化至pH值为1，析出沉淀过滤，干燥得如式(Ⅵ)所示的3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基，本发明加入的三乙胺2-5滴；
6)将步骤5)得到的3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基与RCH2Cl、有机溶剂B和无机碱B混合加入到压力瓶中用微波辅助反应，反应结束后，反应液冷却至室温，冰浴沉淀，过滤，滤液用重结晶溶剂进行重结晶，获得目标产物如式(I)所示的3-(4-吡啶基)-[1,2,4]-三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-硫醚类化合物，RCH2Cl中的R为苯环或取代苯环、吡啶或取代吡啶、噻唑或取代噻唑，取代基为卤素、甲基或腈基；
各化合物的结构式如下所示：
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于步骤3)中的异烟肼、二硫化碳和无机碱A的物质的量之比为1:1～ 2:1～2，优选为1:1.2:1.2；所述无机碱A为碳酸钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾或氢化钠中的一种或多种混合物，优选为氢氧化钾。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于步骤4)中的4-吡啶二硫代酰腙的钾盐与水合肼的物质的量之比为：1:1～2，优选为1:1.5；水的用量以4-吡啶二硫代酰腙的钾盐的物质的量计为1～10ml/mmol，优选为5ml/mmol，所述水合肼水溶液的用量以水合肼物质的量计。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于步骤5)中的4-氨基-5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-巯基和二硫化碳的物质的量之比为：1:1～3，优选为1:2.4；所述有机溶剂A为甲醇、乙醇、DMF和吡啶中的一种或多种混合物，优选为吡啶，有机溶剂A的用量以4-氨基-5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-巯基的物质的量计为1～10ml/mmol，优选4ml/mmol。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于步骤6)中的重结晶溶剂为石油醚、甲醇、正己烷或乙醇中的一种或多种，优选为乙醇；有机溶剂B为甲醇、乙醇、DMF和吡啶中的一种或多种混合物，优选为DMF，有机溶剂B的体积用量以3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基的物质的量计为3～9ml/mmol，优选5ml/mmol；；无机碱B为碳酸钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾或氢化钠中的一种或多种混合物，优选为氢氧化钠；3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基和RCH2Cl的物质的量之比为1：1～1.5，优选为1:1.1。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物的制备方法，其特征在于步骤6)中微波辅助条件为：150W、90℃、200psi下微波照射15分钟。
所述的1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物在制备杀菌剂中的应用。
所述的应用，所述杀菌剂为防治终极腐霉菌、致病疫霉菌、棒孢霉、灰霉菌和立枯丝核菌的杀菌剂，1,2,4-三唑并噻二唑硫醚衍生物在杀菌剂中的浓度为100ppm。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种3-(4-吡啶基)-[1,2,4]-三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-硫醚衍生物及其制备方法与制备杀菌剂中的应用，本发明所述化合物在100μg/mL浓度下对终极腐霉(比如番茄猝倒病菌)表现出了较好的抑制性，抑制率高达100％，如本发明得到的化合物I-1、化合物I-3及化合物I-4制得的杀菌剂对防治终极腐霉菌有明显抑制效果，本发明所述化合物为具有杀菌活性的新化合物，为新农药的研发提供了基础。
本发明的反应方程式如下：
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
(1)异烟酸乙酯式(Ⅱ)的合成：
将异烟酸(0.1mol)、硫酸(0.12mol)和无水甲醇(0.12mol)加入到150ml单口烧瓶中，加热回流反应，反应结束后萃取，旋掉溶剂，水洗烘干，制得式(Ⅱ)所示异烟酸甲酯12.08g,产率80％。
(2)异烟肼式(Ⅲ)的合成：
式(Ⅱ)(1.37g，10mmol)和质量浓度80％水合肼水溶液(2mL，35mmol)加热回流6h，冷却到室温，过滤，滤饼用冰乙酸乙酯洗涤，干燥得到式(Ⅲ)所示异烟肼，产率(1.0g，73％)。
(3)4-吡啶二硫代酰腙钾盐式(Ⅳ)的合成：
式(Ⅲ)异烟肼(10mmol)、二硫化碳(12mmol)和氢氧化钾(12mmol)混合回流反应，反应结束后旋干溶剂得到式(Ⅳ)所示的4-吡啶二硫代酰腙的钾盐。
(4)4-氨基-5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三唑-3-巯基式(Ⅴ)的合成：
将上述制得的(Ⅳ)(10mmol)和水合肼(15mmol)混合，加热回流反应5h，反应完毕后向反应液中加入50ml水，稀盐酸酸化，有沉淀析出，过滤，滤饼用水洗(10ml*3)，干燥得白色固体(Ⅴ)。
(5)3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基式(Ⅵ) 的合成：
将上述制得的(Ⅴ)(5mmol)、二硫化碳(12mmol)和几滴三乙胺加入到20ml吡啶中，加热回流，搅拌过夜。然后将混合液倒入100g碎冰中，盐酸酸化至pH＝1，析出沉淀，过滤重结晶得式(Ⅵ)，产率35％。
(6)目标化合物式(I)的合成：
将DMF(5mL)，式(Ⅵ)(步骤(5)方法合成0.25g，1mmol)，2-甲基氯苄(1.1mmol)和NaOH(0.05g，1.2mmol)加入CEM压力罐中，然后微波合成仪在(150W,90℃,200psi,15minutes)条件下工作，完成后微波仪通过压缩空气将其冷却至室温。而后将混合物倒入(40mL)碎冰中形成沉淀后过滤。粗产物(滤液)经乙醇重结晶，制得目标化合物式(I-1)所示6-((2-甲基氯苄)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑。产率57.8％。
(I-1)
6-((2-甲基氯苄)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑m.p.130-133℃,Yield 57.8％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.71(d,J＝6.2Hz,2H,py-H),7.99(d,J＝6.1Hz,2H,py-H),7.27-7.20(m,2H,Ar-H),7.11-7.01(m,2H,Ar-H),4.19(s,2H,SCH2-),2.43(s,3H,-CH3)；ESI-MS:360[M+H]+；Elemental anal.For C16H13N5S2(％),calculated:C,56.62；H,3.86；N,20.63；found:C,56.77；H,3.98；N,20.65.
实施例2
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的CH3(CH2)10Cl，其他操作同实施例1，获得3-(吡唑-4-基)-6-(十一烷基巯基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(Ⅰ-2)，产率102.3％。
(Ⅰ-2)
3-(吡唑-4-基)-6-(十一烷基巯基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑White solid,m.p.120-122℃,yield 102.3％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.74(d,J＝6.1Hz,2H,Py-H),8.10(d,J＝6.1Hz,2H,py-H),4.76(s,2H,SCH2-),1.26-1.45(m,18H,CH2),0.89(t,3H,CH3)；ESI-MS:390[M+H]+；Elemental anal.For C19H27N5S2(％),calculated:C,58.58；H,6.99；N,17.98；found:C,58.65；H,7.12；N,17.88.
实施例3
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的3,4-二氯氯苄，其他操作同实施例1，获得6-((3,4-二氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(Ⅰ-3)，产率61.1％。
(Ⅰ-3)
6-((3,4-二氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑White solid,yield 61.1％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.76(d,2H,py-H),8.06(d,2H,py-H),7.52(d,1H,Ar-H),7.40(d,1H,Ar-H), 7.29-7.28(m,1H,Ar-H),4.46(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:326[M+H]+；Elemental anal.For C15H9Cl2N5S2(％),calculated:C,45.69；H,2.30；N,17.76；found:C,45.45；H,2.28；N,17.65.
实施例4
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的3-氯氯苄，其他操作同实施例1，获得6-((3-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(Ⅰ-4)，产率58.5％。
(Ⅰ-4)
6-((3-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid,yield 58.5％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.74(d,J＝5.9Hz,2H,py-H),8.05(d,J＝6.0Hz,2H,py-H),7.35(s,1H,Ar-H),7.32-7.28(m,1H,Ar-H),7.25(d,J＝6.3Hz,2H,Ar-H),4.42(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:326[M+H]+；Elemental anal.For C15H10ClN5S2(％),calculated:C,50.07；H,2.80；N,19.46；found:C,49.89；H,2.88；N,19.65.
实施例5
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的4-溴氯苄，其他操作同实施例1，获得6-((4-溴苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(I-5)，产率79.4％。
(I-5)
6-((4-溴苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid,yield 79.4％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.75(d,J＝6.2Hz,2H,py-H),8.05(d,J＝6.2Hz,2H,py-H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),4.42(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:405[M+H]+；Elemental anal.For C15H10BrN5S2(％),calculated:C,44.56；H,2.49；N,17.32；found:C,44.59；H,2.23；N,17.32.
实施例6
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的4-氯氯苄，其他操作同实施例1，获得6-((4-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(I-6)，91.9％。
(I-6)
6-((4-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid,yield 91.9％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.76(d,2H,py-H),8.06(d,2H,py-H),7.34-7.28(m,4H,Ar-H),4.36(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:326[M+H]+；Elemental anal.For C15H10ClN5S2(％),calculated:C,50.07；H,2.80；N,19.46；found:C, 49.99；H,2.68；N,19.31.
实施例7
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的4-苄甲腈，其他操作同实施例1，获得4-((3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基)基)苄甲腈(I-7)，产率91.9％。
(I-7)
4-((3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑-6-巯基)基)苄甲腈Yellow solid,yield 91.9％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.76(d,2H,py-H),8.06(d,2H,py-H),7.34-7.28(m,4H,Ar-H),4.36(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:351[M+H]+；Elemental anal.For C16H10N6S2(％),calculated:C,54.84；H,2.88；N,23.98；found:C,54.87；H,2.97；N,24.11.
实施例8
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的2-氯噻唑，其他操作同实施例1，获得6-(((2-氯噻唑-5-基)甲基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(I-8)，产率23％。
(I-8)
6-(((2-氯噻唑-5-基)甲基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4] 三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid,m.p.160-162℃，yield 23.0％, 1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.75(d,J＝6.1Hz,2H,py-H),8.07(d,J＝6.3Hz,2H,py-H),7.51(s,1H,thiazole-H),4.68(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:368[M+H]+；Elemental anal.For C12H7ClN6S3(％),calculated:C,39.29；H,1.92；N,22.91；found:C,39.43；H,1.88；N,22.79.
实施例9
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的6-氯吡啶，其他操作同实施例1，获得6-(((6-氯吡啶-3-基)甲基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(I-9)，产率74.4％。
(I-9)
6-(((6-氯吡啶-3-基)甲基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid,m.p.199-200℃，Yield 74.4％,1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.76(d,J＝6.0Hz,2H,Py-H),8.48(d,J＝2.2Hz,1H,Py-H),8.06(d,J＝6.1Hz,2H,Py-H),7.84(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H,Py-H),7.30(s,1H,Py-H),4.52(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:361[M+H]+；Elemental anal.For C14H9ClN6S2(％),calculated:C,46.60；H,2.51；N,23.29；found:C,46.75；H,2.37；N,23.42.
实施例10
将实施例1步骤(6)中的2-甲基氯苄换成1.1mmol的2-氯氯苄，其他操作同实施例1，获得6-((2-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基) -[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑(I-10)，产率75.2％。
(I-10)
6-((2-氯苄基)巯基)-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑Yellow solid，yield 75.2％.1H NMR(CDCl3,500MHz),δ:8.74(d,2H,py-H),8.01(d,2H,py-H),7.43-7.39(m,2H,Ar-H),7.24-7.18(m,2H,Ar-H),4.58(s,2H,SCH2-)；ESI-MS:326[M+H]+；Elemental anal.For C15H10ClN5S2(％),calculated:C,50.07；H,2.80；N,19.46；found:C,50.21；H,2.88；N,19.33.
实施例11杀菌活性测试
试验对象：极腐霉菌(Pythium ultimum)、致病疫霉菌(Phytophthora infestans)、棒孢霉(Corynespora cassiicola)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
试验方法：采用盆栽试验法。将黄瓜或番茄种子经过50℃浸泡，催芽后播种于育苗钵中，待生长至2片真叶的幼苗，供试验。实验重复4次。接种病菌后，植物被维持在18-30℃[平均温度24℃，80％以上的相对湿度(RH)]。
药剂准备：取实施例1-10制备的(I-1)-(I-10)化合物各5mg，加0.5ml丙酮溶解后再加0.05ml 10％土温80，最后加50ml水充分溶解，获得100ppm样品药剂。因100ppm为100mg/L所以加水量＝5mg*1000/100mg＝50ml，因有机溶剂最终含量≤1％所以加丙酮的量 ＝50ml*1％＝0.5ml(溶解)，因吐温最终含量为0.1％所以50ml水里应有吐温0.05ml，即：应加10％吐温0.05ml。
对照药剂：中生菌素(zhongshengmycin)、烯酰吗啉(dimethomorph)、百菌清(chlorothalonil)、咯菌腈(fludioxoni)和井冈霉素(Validamycin)。
接种方法：
采用菌悬液喷雾法接种：将试验对象的病菌经种子培养后，取种子液用蒸馏水稀释成3×107cfu/ml菌悬液，采用用喷壶喷雾接种至相应的植株。接种后18-30℃保湿培养。
施药方法：待接种病菌的幼苗长出两片复叶时，用喷壶将样品药剂与对照药剂均匀喷施在供试植株的茎叶上，以清水代替样品药剂作为空白对照。
待清水(空白实验)喷施植株充分发病后进行杀菌情况调查，并计算杀菌指数和防治效果。
公式(1)中：EF:相对防治效果；CK:对照区终期平均病情指数；PT:处理区终期平均病情指数。
活性测试结果见表1
表1 100ppm下各化合物的杀菌活性(％防效)
从表1可以得出，化合物(I-1)对极腐霉菌(Pythium ultimum)有非常好的活性，100ppm浓度下抑制率达到100％，另外化合物(I-3)和(I-4)也表现出较好的活性，抑制率分别达到55.56％和66.67％。其他化合物对极腐霉菌(Pythium ultimum)都没有活性。除了(I-6)表现出微弱的活性，其他所有化合物对棒孢霉(Corynespora cassiicola)和灰霉菌(Botrytis cinerea)几乎没有活性。所有化合物对致病疫霉菌(Phytophthora infestans)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)都没有活性。