一种具有抗癌作用的化合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有抗癌作用的化合物及其制备方法，属于医药领域。

背景技术：

近半个世纪以来，癌症已逐步成为人类死亡第一、二位的病因，成为严重威胁人类身体健康的常见病、多发病，我国的癌症发病率、死亡率呈逐年升高的态势。中国癌症中心肿瘤注册数据库的数据显示，中国2015年约有四百万例新增癌症患者，约二百万例因癌症死亡。目前，几乎世界范围的科研工作者都在探寻有效的治疗癌症的方法和药物。

峨参Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm.是伞形科峨参属植物。性微温，味甘辛，无毒。入脾、胃、肺三经。药用根部，具有补中益气，消肿祛瘀，补肺平喘之功，是著名的川产道地药材之一，具有无明显毒、副作用，价格低廉，药源充足等优点。

近年来的研究表明，峨参新鲜和干燥的花、叶、果实与根部含有木脂素类、黄酮类、苯丙素类、香豆素类以及挥发油等多种类型的化合物。其中，部分化合物已被证实具有明显的生理活性。比如，峨参所含的木脂素类化合物(如峨参内酯)具有抗癌、抗炎活性，黄酮类成分则具有抗氧化作用。

然而，目前对峨参化学成分生理活性的研究还不够深入，比如，苯丙素类化合物、香豆素类以及挥发油等成分的生理活性均鲜有报道，导致其开发利用不尽如人意，造成了较大的资源的浪费。因此，有必要对其化学成分进行进一步研究，以便开发出更多可供临床选择的潜在药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗癌作用的化合物及其制备方法。

本发明提供了式Ⅰ所示化合物、顺式异构体或其药学上可接受的盐、溶剂合物、晶型：

其中，R₁选自氢、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、羟基、氨基或烷基取代的氨基；n选自1～6的整数。

进一步的，R₁选自羟基或C1～C3烷氧基。

优选的，R₁为甲氧基。

进一步的，n选自1、2或3。

优选的，n＝1。

优选的，所述的化合物结构如式Ⅱ所示：

本发明提供了一种所述化合物的制备方法，包括如下步骤：

a、取峨参，粉碎，用乙醇提取，浓缩提取液，得到乙醇总浸膏；

b、用石油醚萃取乙醇总浸膏，浓缩萃取液，得到石油醚部位；

c、石油醚部位经硅胶柱层析，以石油醚:乙酸乙酯溶剂系统依次采用100:0,20:80,40:60,60:40,80:20,V:V进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2倍柱体积，收集石油醚:乙酸乙酯＝80:20的洗脱液，浓缩，得到A4段；

d、混合物A4经硅胶柱层析，以石油醚:丙酮溶剂系统依次采用100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,V:V进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2倍柱体积，收集石油醚:丙酮＝60:1、40:1及20:1的洗脱液，浓缩，得到A4B3段；

e、混合物A4B3经硅胶柱层析，以石油醚:乙酸乙酯溶剂系统依次采用100:1,80:1,50:1,V:V进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2倍柱体积，收集石油醚:乙酸乙酯＝50:1的洗脱液，浓缩，得到A4B3C4段；

f、混合物A4B3C4经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，以氯仿:甲醇溶剂系统1:1,V:V洗脱2倍柱体积，收集洗脱液，浓缩，得到A4B6C4D3段；

g、混合物A4B6C4D3经半制备HPLC，以甲醇:水溶剂系统72:28,V:V洗脱，硅胶板薄层分离，以二氯甲烷为展开剂，收集并浓缩Rf＝0.9375的洗脱液；或以石油醚:乙酸乙酯＝15:5为展开剂，收集并浓缩Rf＝0.8387的洗脱液；或以石油醚:丙酮＝15:4为展开剂，收集并浓缩Rf＝0.9375的洗脱液，即得式Ⅱ化合物。

优选的，a步骤取峨参块根为提取原料；用95％％v/v乙醇水溶液依次进行冷浸、渗漉提取及闪式提取，合并不同提取方法得到的提取液，浓缩得到乙醇总浸膏。

本发明提供了所述化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

优选的，所述的药物是治疗和/或预防神经肿瘤、结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤中一种或几种癌症的药物。

本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物组合物，它是以有效量的所述化合物、顺式异构体或其药学上可接受的盐、溶剂合物、晶型为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

所述药学上可接受的盐指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐，包括所述化合物的盐酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苦味酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、天冬氨酸盐或谷氨酸盐。

所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明化合物或药物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述化合物或衍生物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明化合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种结构新颖的化合物。抑瘤实验表明，本发明化合物具有显著的抗癌作用，能有效抑制神经、结肠癌、胰腺癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞增殖，可作为癌症的潜在治疗药物，为临床用药提供了一种新的选择。

另外，本发明还提供了一种所述化合物的制备方法。前期研究表明，峨参的花，叶，根以及全株中的成分大体相同，但其根部含大量苯丙素类化合物，因此以峨参块根为原料进行提取，可提取出更多的目标化合物；而且，由于峨参浸膏的提取率较低，本发明采用冷浸、渗漉及闪式提取法进行提取，可显著提高提取率。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明提取流程图；

图2为式Ⅱ化合物的IR谱图；

图3为式Ⅱ化合物的HR-ESI-MS谱图；

图4为式Ⅱ化合物的¹H NMR谱图；

图5为式Ⅱ化合物的¹³C NMR谱图；

图6为式Ⅱ化合物的DEPT谱图(θ＝90°)；

图7为式Ⅱ化合物的HMBC谱图；

图8为式Ⅱ化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图9为式Ⅱ化合物对神经细胞PC12生长的抑制作用图；

图10为式Ⅱ化合物对结肠癌细胞HT29生长的抑制作用图；

图11为式Ⅱ化合物对胰腺癌细胞PANC-1生长的抑制作用图；

图12为式Ⅱ化合物对黑色素瘤细胞B16生长的抑制作用图；

图13为式Ⅲ化合物对神经细胞PC12生长的抑制作用图；

图14为式Ⅲ化合物对结肠癌细胞HT29生长的抑制作用图；

图15为式Ⅳ化合物对神经细胞PC12生长的抑制作用图；

图16为式Ⅳ化合物对结肠癌细胞HT29生长的抑制作用图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1 本发明化合物的制备及结构鉴定

1、制备方法

峨参干燥块根10kg，粉碎后用95％v/v乙醇水溶液于15～25℃冷浸12天，再将药材放入渗漉筒中用95％v/v乙醇水溶液进行渗漉提取，待渗漉液颜色变为浅黄色后，将药材用95％v/v乙醇水溶液进行闪式提取，将不同提取方法得到的滤液合并，减压浓缩提取液后得到乙醇总浸膏0.71kg。将提取后的乙醇总浸膏加入5倍体积量水于50℃悬浮24h，用等量石油醚(每次0.7L)萃取5次，浓缩萃取液，得到石油醚部位159.4g。具体流程见图1。

石油醚部位经硅胶柱层析，分别采用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇双系统梯度洗脱(两个系统均采用100:0,20:80,40:60,60:40,80:20,0:100,V:V依次洗脱，每个梯度洗脱剂的体积均是2倍柱体积)，收集石油醚：乙酸乙酯＝80:20的洗脱液，减压浓缩，得到A4段29.7g。

混合物A4经正相硅胶，以石油醚-丙酮溶剂系统(100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1,5:1,3:1,2:1,1:1,V:V)梯度洗脱，每个梯度洗脱剂的体积均是2倍柱体积，收集石油醚：丙酮＝60:1、40:1及20:1的洗脱液，减压浓缩，得到A4B3段9.8g。

混合物A4B3经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统(100:1,80:1,50:1,20；1,10:1,5:1,3:1,2:1,1:1,V:V)梯度洗脱，每个梯度洗脱剂的体积均是2倍柱体积，收集石油醚：乙酸乙酯＝50:1的洗脱液，减压浓缩，得到A4B3C4段。

混合物A4B3C4经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，以氯仿-甲醇溶剂系统(1:1,V:V)洗脱2倍柱体积，收集洗脱液，减压浓缩，得到A4B6C4D3段。

混合物A4B6C4D3经半制备HPLC，以甲醇-水(72:28,V:V)溶剂系统等度洗脱，浓缩，得到式Ⅱ化合物12mg(展开剂为石油醚:丙酮＝15:4，Rf＝0.9375；或，石油醚：乙酸乙酯＝15:5，Rf＝0.8387；或，二氯甲烷，Rf＝0.9375)。

上述式Ⅱ化合物经芳环上脱甲基可得到相应的酚类结构(R₁为羟基)，进一步与C1～C6卤代烷烃反应可得到相应的烷氧基取代产物(R₁为相应的烷氧基)。

2、式Ⅱ化合物的结构鉴定：

该化合物为浅黄色油状液体，比旋光度+0.833°(c＝0.1,CH₂Cl₂)，IR图(图2)显示在1608cm^-1，1509cm^-1，1627cm^-1，1649cm^-1，1137cm^-1，1093cm^-1有吸收，分别表明化合物含有苯环、烯基和醚的结构。高分辨质谱HR-ESI-MS(图3)给出精确分子离子峰m/z＝259.09555[M+Na]⁺(提示其分子式为C₁₃H₁₆O₄Na，计算值为259.09408)，从而确定其分子式为C₁₃H₁₆O₄，分子量为236，不饱和度为6。

在¹H NMR(图4)中δ_H6.64(1H,d,J＝1.2Hz)，6.57(1H,d,J＝1.2Hz)分别为苯环上间位耦合的2个质子信号；δ_H5.98(2H,s)表明有1个二氧亚甲基(-OCH₂O-)的信号；δ_H 3.92(3H,s)表明有1个甲氧基(-OCH₃)信号；δ_H6.51(1H,d,J＝15.6Hz)，6.17(1H,dt,J＝16.0Hz,6.4Hz,6.0Hz)表明含有反式环外烯烃信号。化合物的¹³C NMR和DEPT(θ＝90°)(图5，6)中有13个碳原子，其中在低场能看到4个苯环季碳信号：δ_C149.1，143.6，135.0，131.5；2个苯环碳信号：δ_C106.7，100.2；2个烯碳信号：δ_C132.0,125.1；一个甲氧基信号：δ_C56.5；一个二氧亚甲基碳信号：δ_C101.5；1个甲基信号：δ_C15.2；2个亚甲基信号：δ_C71.1,65.7。以上数据可以推测出该化合物含有1个苯环、1个二氧亚甲基、1个甲氧基、1个环外双键。结合HMBC(图7)和¹H-¹H COSY(图8)的波谱数据，H-1(δ_H6.51)和H-2(δ_H6.17)相关；H-2(δ_H6.17)和H-3(δ_H4.13)相关；H-1”和H-2”相关，确定了部分环外结构；H-2’(δ_H6.57),H-6’(δ_H 6.64)和C-4’(δ_C 135.0)远程相关，确定了苯环的结构；而H-1”(δ_H 3.57)和C-3(δ_C 71.1)远程相关，H-3(δ_H 4.13)和C-1”(δ_C 65.7)远程相关，结合质谱与氢谱的波谱数据，与文献进行对比，确定了醚的结构；H-1(δ_H 6.51)和C-3(δ_C 71.1)远程相关，结合上述的波谱数据，可以确定苯环的侧链结构；而-OCH₃(δ_H 3.92)和C-3’(δ_C 143.6)相关，确定了甲氧基取代在苯环的C-3’位；-OCH₂O-(δ_H 5.98)和C-4’(δ_C 135.0),C-5’(δ_C 149.1)远程相关，确定了二氧亚甲基在苯环上的取代位置；H-1(δ_H 6.51)和C2’(δ_C 106.7),C6’(δ_C 100.2)、H-2(δ_H 6.17)和C-1’(δ_C131.8)远程相关，确定了苯环侧链的取代位置在C-1’位上。通过与文献对比，式Ⅱ化合物的结构被最终确定，命名为Anthriscinol ethyl ether，其核磁数据归属见表1。

表1 式Ⅱ化合物的NMR数据

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1 本发明化合物对神经细胞PC12、结肠癌细胞HT29、胰腺癌细胞PANC-1、黑色素瘤细胞B16生长的抑制作用

1、实验药物、细胞、仪器及试剂

实验药物：本发明式Ⅱ化合物，其侧链结构进行改造后所得式Ⅲ、Ⅳ化合物，结构如下所示：

实验细胞：神经细胞PC12、结肠癌细胞HT29、胰腺癌细胞PANC-1、黑色素瘤细胞B16均受赠于四川大学华西国家重点实验室。

实验仪器及试剂

2、实验方法

2.1细胞复苏及传代

将冻存的细胞从液氮中取出，在37℃温水中水浴至融化。在超净工作台中将冻存管中的细胞冻存液快速转移至离心管中，加入含血清的培养基2mL，将细胞液吹打均匀后，放入离心机，1000rpm，5min离心，弃去上清液，加入3mL含血清培养基，吹打均匀，移入培养瓶中。再往培养瓶中加入2mL含血清培养基混匀。将培养瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后换液，待细胞长到对数生长期时对其进行传代。将需要传代的细胞的培养基弃去，用PBS 2mL进行冲洗，弃去洗液，再加入1mL 0.25％胰酶消化细胞，1-3min后观察细胞形态确定消化结果，再往培养皿中加入2mL含血清培养基终止消化，轻轻吹打细胞使之悬浮。将细胞悬浮液移入离心管中，1000rpm，5min离心，弃去上清液，加入3mL含血清培养基，吹打均匀，移入培养瓶中。

2.2MTT法检测化合物对肿瘤细胞增殖的影响

用胰酶消化对数生长期的细胞，用细胞计数板计数，再将细胞悬液稀释至6000个/孔，将稀释好的细胞悬液加入96孔板，每孔接种200μL，将培养板放入培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，加入化合物，每孔加入200μL具有浓度梯度的含药培养基，每个浓度设置5个复孔，并设置空白组，加入等体积DMSO，继续培养24h；每孔加入20μL 5mg/mL MTT，放入培养箱孵育4h；吸弃96孔板中的液体，每孔加入100μL DMSO染色，避光振摇10min，用酶标仪在490nm处测吸收值。计算每孔细胞生长抑制率，抑制率(％)＝(1-药物处理吸光度值/对照组吸光度值)；使用SPSS 19.0计算软件计算药物的IC₅₀值。

2.3实验结果

2.3.1式Ⅱ化合物对肿瘤细胞增殖的影响结果

按实验方法检测式Ⅱ化合物对神经细胞PC12、结肠癌细胞HT29的生长抑制率，浓度梯度为：0.16、0.8、4、20、100μg/mL，检测波长为490nm。计算出其IC₅₀值为158.13μg/mL、159.27μg/mL。结果如图9、10。

按实验方法检测式Ⅱ化合物对胰腺癌细胞PANC-1、黑色素瘤细胞B16的生长抑制率，浓度梯度为：6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL，检测波长为490nm。计算出其IC₅₀值为113.51μg/mL、556.40μg/mL。结果如图11、12。

2.3.2式Ⅲ化合物对肿瘤细胞增殖的影响结果

按实验方法检测式Ⅲ化合物对神经细胞PC12、结肠癌细胞HT29的生长抑制率，浓度梯度为：0.16、0.8、4、20、100μg/mL，检测波长为490nm。结果显示该化合物没有明显的抗肿瘤活性。结果如图13、14。

2.3.3式Ⅳ化合物对肿瘤细胞增殖的影响结果

按实验方法检测式Ⅳ化合物对神经细胞PC12、结肠癌细胞HT29的生长抑制率，浓度梯度为：0.16、0.8、4、20、100μg/mL，检测波长为490nm。结果显示该化合物对PC12和HT29均没有明显的抗肿瘤活性。结果如图15、16。

综合以上实验结果，表明本发明式Ⅱ化合物具有显著的抗癌活性，能有效抑制神经、结肠癌、胰腺癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞增殖；而将其侧链烷氧基或碳碳双键进行结构改造后，所得化合物则无抗癌作用。