一种稗草原生质体的提取方法与流程

本发明涉及农业技术领域，更具体涉及一种稗草原生质体的提取方法。

背景技术：

植物原生质体(protoplast)是指去除细胞壁以后，由细胞膜包被的单个细胞，可应用于远缘亲本间的融合，易于导入外源基因，同时也是分离各种细胞器(细胞核、叶绿体、线粒体、液泡等)的良好材料，并可为细胞间的物质运输、信息交换等研究提供技术支撑。稗草[Echinochloa crusgalli(L.)Beauv]属于一年生禾本科植物，是全球农业生产中的主要恶性杂草之一，广泛分布于水稻田中，在生长势、抗逆性及对资源的竞争上远强于水稻等C₃植物，严重危害世界粮食生产安全。除草剂的开发大多以稗草为首要目标。然而，近年来因化学除草剂的大面积推广应用，稗草的抗药性水平越来越高。离体的原生质体在适当的条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力，因此利用原生质体瞬时表达技术是开展抗性基因功能研究的有效手段之一，而原生质体的成功制备是原生质体瞬时表达技术的关键所在。目前针对稗草的生物学研究开展较晚，其原生质体的制备工作尚未见报道，因此，采用一种高效经济的方法制备稗草原生质体可为稗草体细胞杂交、基因工程研究奠定一定的技术基础。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题就是如何以高效经济的方法制备稗草原生质体，而提供一种稗草原生质体的提取方法。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种稗草原生质体的提取方法，该提取方法包括如下步骤(所用原料均为市购获得)：

步骤一：种植幼苗：选取饱满、成熟度一致的稗草种子，经重量浓度2％的硝酸钾浸种过夜处理，然后直播于培养基质中；

步骤二：选取材料：待步骤一获得的幼苗长至3-5叶期，切取主茎及主茎上幼嫩的叶片，蒸馏水冲洗2-5次，待用；

步骤三：获得原生质体：将步骤二获得的茎段及叶片擦干，横切茎段、沿叶片主脉纵切叶片，将茎段及叶片切成0.5-1.5mm的细丝，快速、轻柔地将细丝转移至盛有酶解液的10mL离心管中，并使试验细丝完全浸没于酶解液中，在25℃黑暗条件下振荡酶解3-6h，转速为50-80r/min；

步骤四：纯化原生质体：经步骤三酶解后，将装有试验细丝的离心管放入25℃的离心机中，以转速800-1200r/min离心2-5min，吸取，去掉上清液，收集原生质体；而后加入预冷的5mL洗液，将所得的沉淀重悬，以转速500-800r/min离心2-5min，再弃上清液，最后再用2mL洗液重悬，得到的溶液即为纯的原生质体。

优选地，在步骤一中，所述的培养基质为稻田土。

优选地，在步骤二中，所述的幼苗长至4叶期。

优选地，在步骤三中，所述酶解液的制备方法：以水为溶剂，将体积浓度2.0％纤维素酶R-10(购于BIOSHARP公司)，体积浓度0.75％离析酶R-10(购于BIOSHARP公司)，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L氯化钾和pH＝5.7的20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)均匀混合，用50-60℃水浴加热8-15min，冷却至室温后再加入10mmol/L氯化钙，体积浓度0.2％β-巯基乙醇，体积浓度0.1％牛血清蛋白，即得。

优选地，在步骤四中，所述洗液的配制方法：以水为溶剂，将体积浓度8％甘露醇和2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，pH值为5.7。

优选地，上述提取方法包括如下步骤：

步骤一：种植幼苗：选取饱满、成熟度一致的稗草种子，经重量浓度2％的硝酸钾浸种过夜处理，然后直播于培养基质稻田土中；

步骤二：选取材料：待步骤一获得的幼苗长至4叶期，用刀片切取主茎及主茎上幼嫩的叶片，蒸馏水冲洗3次，待用；

步骤三：获得原生质体：将步骤二获得的茎段及叶片用滤纸擦干，横切茎段、沿叶片主脉纵切叶片，将茎段及叶片切成1.0mm的细丝，快速、轻柔地将细丝转移至盛有酶解液的10mL离心管中，并使试验细丝完全浸没于酶解液中，在25℃黑暗条件下振荡酶解3-6h，转速为60r/min；

步骤四：纯化原生质体：经步骤三酶解后，将装有试验细丝的离心管放入25℃的离心机中，以转速1000r/min离心3min，吸取，去掉上清液，收集原生质体；而后加入预冷的5mL洗液，将所得的沉淀重悬，以转速600r/min离心3min，再弃上清液，最后再用2mL洗液重悬，得到的溶液即为纯的原生质体。

本发明还提供了所述的稗草原生质体的提取方法所制得的稗草原生质体。

(三)有益效果

本发明的稗草原生质体的提取方法的分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多，得率高，完整性好，为原生质体转染及原生质体融合奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是叶片经过酶解纯化后得到的原生质体。

图2是茎段经过酶解纯化后得到的原生质体。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例1：

1、选取饱满、成熟度一致的稗草种子，经重量浓度2％KNO₃浸种过夜处理后直播于培养盆中(直径28cm，高度17cm)，培养基质为稻田土；

2、待步骤(1)获得的幼苗长至4叶期，用刀片切取主茎上较为幼嫩的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用；

3、将步骤(2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵切将叶片切成约为1.0mm的细丝，快速、轻柔地将材料转移至盛有酶解液的10mL离心管中，并使试验材料完全浸没于酶解液中，25℃黑暗条件下振荡酶解，酶解6h，转速为60r/min；

酶解液配制：以水为溶剂，将体积浓度2.0％纤维素酶R-10，体积浓度0.75％离析酶R-10，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L氯化钾和pH＝5.7的20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，用55℃水浴加热10min，冷却至室温后再加入10mmol/L氯化钙，0.2％β-巯基乙醇，0.1％牛血清蛋白，0.4M甘露醇，20mM氯化钾，20mM MES(pH＝5.7)，加入以上试剂后55℃水浴加热10min，冷却至室温后再加入10mM氯化钙，体积浓度0.2％β-巯基乙醇，体积浓度0.1％牛血清蛋白，酶解液现配现用；

(4)原生质体的纯化：在步骤(3)酶解后，将装有试验材料的10mL离心管放入25℃的离心机1000r离心2min，用移液枪移除上清液，收集原生质体。而后加入预冷的5mL洗液，将所得的沉淀重悬，500r离心2min，再弃上清，最后用2mL洗液重悬，此时得到的溶液即为纯的原生质体；

洗液配制：以水为溶剂，将体积浓度8％甘露醇，2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，pH为5.7。

(5)原生质体产量的测定：轻柔晃动步骤(4)所述原生质体，使其分布均匀，倒置显微镜下观察，结果发现：酶解6h后可得到大量较为理想的原生质体，质膜完整，受损小，杂质少，数量多，纯度高。然后用移液枪吸取一滴原生质体溶液在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克材料得到的原生质体产量，计算结果为4.283×10⁶个/g。

实施例2：

1、选取饱满、成熟度一致的稗草种子，经重量浓度2％KNO₃浸种过夜处理后直播于培养盆中(直径28cm，高度17cm)，培养基质为稻田土；

2、待步骤(1)获得的幼苗长至4叶期，用刀片切取主茎上较为幼嫩的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用；

3、将步骤(2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵切将叶片切成约为1.0mm的细丝，快速、轻柔地将材料转移至盛有酶解液的10mL离心管中，并使试验材料完全浸没于酶解液中，25℃黑暗条件下振荡酶解8h，转速为60r/min；

酶解液配制：以水为溶剂，将体积浓度2.0％纤维素酶R-10，体积浓度0.75％离析酶R-10，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L氯化钾和pH＝5.7的20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，用55℃水浴加热10min，冷却至室温后再加入10mmol/L氯化钙，体积浓度0.2％β-巯基乙醇，体积浓度0.1％牛血清蛋白，酶解液现配现用；

(4)原生质体的纯化：在步骤(3)酶解后，将装有试验材料的10mL离心管放入25℃的离心机1000r离心2min，用移液枪移除上清液，收集原生质体。而后加入预冷的5mL洗液，将所得的沉淀重悬，500r离心2min，再弃上清，最后用2mL洗液重悬，此时得到的溶液即为纯的原生质体；

洗液配制：以水为溶剂，将体积浓度8％甘露醇，2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，pH为5.7。

(5)原生质体产量的测定：轻柔晃动步骤(4)所述原生质体，使其分布均匀，倒置显微镜下观察，结果发现：酶解8h后得到的原生质体质膜受损，碎片多，数量少，纯度不高。然后用移液枪吸取一滴原生质体溶液在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克材料得到的原生质体产量，计算结果为2.196×10⁶个/g。

实施例3：

1、选取饱满、成熟度一致的稗草种子，经重量浓度2％KNO3浸种过夜处理后直播于培养盆中(直径28cm，高度17cm)，培养基质为稻田土；

2、待步骤(1)获得的幼苗长至4叶期，用刀片切取幼嫩的主茎，蒸馏水冲洗三次，待用；

3、将步骤(2)获得的主茎用滤纸擦干，用刀片横切主茎将其切成约为1.0mm的细丝，快速、轻柔地将材料转移至盛有酶解液的10mL离心管中，并使试验材料完全浸没于酶解液中，25℃黑暗条件下振荡酶解3h，转速为60r/min；

酶解液配制：以水为溶剂，将体积浓度2.0％纤维素酶R-10，体积浓度0.75％离析酶R-10，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L氯化钾和pH＝5.7的20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，用55℃水浴加热10min，冷却至室温后再加入10mmol/L氯化钙，体积浓度0.2％β-巯基乙醇，体积浓度0.1％牛血清蛋白，酶解液现配现用；

(4)原生质体的纯化：在步骤(3)酶解后，将装有试验材料的10mL离心管放入25℃的离心机1000r离心2min，用移液枪移除上清液，收集原生质体。而后加入预冷的5mL洗液，将所得的沉淀重悬，500r离心2min，再弃上清，最后用2mL洗液重悬，此时得到的溶液即为纯的原生质体；

洗液配制：以水为溶剂，将体积浓度8％甘露醇，2mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸均匀混合，pH为5.7。

(5)原生质体产量的测定：轻柔晃动步骤(4)所述原生质体，使其分布均匀，用移液枪吸取一滴原生质体溶液在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液中茎段的多少计算出每克材料得到的原生质体产量，计算结果为1.006×10⁷个/g。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。