本发明属于生物技术领域，涉及一种水稻nrt1.1a基因及其编码蛋白在提高植物产量育种中的应用。
背景技术：
植物需要多种矿质营养元素来维持其正常生长，其中氮是植物需求量最大的矿质营养元素。一般而言，氮元素能占植物体干重的1.5-2％。氮是蛋白质、核酸、磷脂以及植物生长发育所必需的有机氮化合物的构成成分，而这些物质是活细胞赖以生存的结构或功能成分，因此氮元素也被称为生命元素。为了追求作物的高产，在农业生产中往往施加大量氮肥。其中，水稻的氮肥施用量又远远超过其他任何农作物，氮肥的损失量占化肥总施用量的70％。我国普遍存在氮肥使用过量、氮利用效率低以及氮肥损失导致的环境恶化等一系列问题。
通过提高农作物的氮利用效率以及减少氮肥施用则是解决该严重环境问题的关键。硝酸盐是土壤中最为重要的氮源之一，植物对硝酸盐的吸收和利用在很大程度上决定了农作物的氮利用效率。而硝酸盐转运蛋白则是植物吸收、转运和储存硝酸盐的最直接功能执行者。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种水稻nrt1.1a基因及其编码蛋白的新用途。
本发明所提供的新用途具体为蛋白质或其编码基因在调控植物生长发育中的应用；所述生长发育体现为单株产量(包括生物量)和/或株高和/或穗粒数和/或开花时间和/或抽薹时间和/或莲座叶大小；
其中，所述开花时间为开始开花的时间点的早晚；所述抽薹时间为开始抽薹的时间点的早晚。
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质(即nrt1.1a蛋白)；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控植物生长发育相关的由序列1衍生的蛋白质。
所述蛋白质或其编码基因调控植物生长发育具体体现在：所述蛋白质在所述植物中的表达量越高，所述植物的单株产量(包括生物量)越高、株高越高、穗粒数越多、开花时间越早抽薹时间越早和/或莲座叶越大；所述蛋白质在所述植物中的表达量越低，所述植物的单株产量(包括生物量)越低、株高越低、穗粒数越少、开花时间越晚、抽薹时间越晚和/或莲座叶越小。
蛋白质或其编码基因在选育单株产量(包括生物量)增加和/或株高增高和/或穗粒数增加和/或开花时间提前和/或抽薹时间提前和/或莲座叶增大的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围；
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质(即nrt1.1a蛋白)；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控植物生长发育相关的由序列1衍生的蛋白质。
在实际应用中，当所选育单株产量(包括生物量)增加和/或株高增高和/或穗粒数增加和/或开花时间提前和/或抽薹时间提前和/或莲座叶增大的植物品种时，需将所述蛋白质表达量较高的植株作为亲本进行杂交。
本发明的再一个目的是培育单株产量(包括生物量)增加和/或株高增高和/或穗粒数增加和/或开花时间提前和/或抽薹时间提前和/或莲座叶增大的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育单株产量(包括生物量)增加和/或株高增高和/或穗粒数增加和/或开花时间提前和/或抽薹时间提前和/或莲座叶增大的转基因植物的方法，可包括使目的植物表达或超量表达蛋白质的步骤，或者包括使目的植物中蛋白质活性提高的步骤；
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控植物生长发育相关的由序列1衍生的蛋白质；
进一步，所述方法具体可包括如下a)和b)的步骤：
a)向所述目的植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，单株产量(包括生物量)增加和/或株高增高和/或穗粒数增加和/或开花时间提前和/或抽薹时间提前和/或莲座叶增大的转基因植物。
蛋白质或其编码基因在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)促进硝酸盐吸收或转运；
(b)促进硝酸盐代谢相关基因的表达；所述硝酸盐代谢相关基因选自如下中任一种：nrt1.1b、nrt2.1、nrt2.3a、nar1和nar2；
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质(即nrt1.1a蛋白)；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与硝酸盐转运相关的由序列1衍生的蛋白质。
在本发明中，所述(a)中的所述促进硝酸盐吸收或转运具体为促进爪蟾卵母细胞中硝酸盐的吸收或转运，或者为促进水稻中硝酸盐的吸收或转运；所述(b)中的所述促进硝酸盐代谢相关基因的表达具体为促进水稻中硝酸盐代谢相关基因的表达；所述硝酸盐代谢相关基因选自如下中任一种：osnrt1.1b、osnrt2.1、osnrt2.3a、osnar1和osnar2。
蛋白质或其编码基因在如下(c)或(d)中的应用也属于本发明的保护范围：
(c)选育对硝酸盐的吸收或转运能力提高的植物品种；
(d)选育硝酸盐代谢相关基因的表达量提高的植物品种；所述硝酸盐代谢相关基因选自如下中任一种：nrt1.1b、nrt2.1、nrt2.3a、nar1和nar2；
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质(即nrt1.1a蛋白)；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与硝酸盐转运相关的由序列1衍生的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种培育对硝酸盐的吸收或转运能力提高和/或硝酸盐代谢相关基因的表达量提高的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育对硝酸盐的吸收或转运能力提高和/或硝酸盐代谢相关基因的表达量提高的转基因植物，可包括使目的植物表达或过表达蛋白质的步骤，或者包括使目的植物中蛋白质活性提高的步骤；
所述蛋白质为如下中任一种：
(1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与调控植物生长发育相关的由序列1衍生的蛋白质；
进一步，所述方法具体可包括如下c)和d)的步骤：
c)向所述目的植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对硝酸盐的吸收或转运能力提高和/或硝酸盐代谢相关基因的表达量提高的转基因植物；
所述硝酸盐代谢相关基因选自如下中任一种：nrt1.1b、nrt2.1、nrt2.3a、nar1和nar2。
上述各应用和方法中，所述编码基因均可为如下(1)至(4)中任一所述的dna分子：
(1)序列表中序列2的dna分子；
(2)序列表中序列3的dna分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)所限定的dna分子杂交且编码氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的dna分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的dna分子具有90％以上同源性且编码氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的dna分子。
上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。
其中，序列2由8143个核苷酸组成，为基因组序列；序列3由1812个核苷酸组成，为cdna序列；序列2和序列3编码序列表中序列1所示的蛋白质，序列1由603个氨基酸残基组成。
在以上所述的两种方法中，所述编码基因均可通过含有所述编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pgreen0029、pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为actin1启动子或水稻nrt1.1a基因的自身内源启动子(序列9)。更加具体的，所述重组表达载体为将pcambia2300-actin载体的酶切位点xbai和psti之间的小片段替换为序列表中序列3所示dna片段后得到的重组质粒；或者为在pcambia2300载体的酶切位点kpni和ecori之间插入序列表中序列9的第1-1814位所示dna片段，且在酶切位点ecori和xmai之间插入序列表中序列3所示dna片段后所得的重组质粒；或者为将pcambia2300-35s-ocs载体的酶切位点bamhi和sali之间的小片段替换为序列表中序列3所示dna片段后所得的重组质粒。
在以上所述的两种方法中，将所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在以上各应用和方法中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻；所述双子叶植物具体可为拟南芥。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为水稻品种东津。在本发明的另一个实施例中，所述植物具体为拟南芥columbia-0。
在以上各应用和方法中，当所述植物具体为水稻时，所述硝酸盐代谢相关基因选自如下中任一种：osnrt1.1b、osnrt2.1、osnrt2.3a、osnar1和osnar2。
在本发明中，所述osnrt1.1b的核苷酸序列为序列表中序列4；所述osnrt2.1的核苷酸序列为序列表中序列5；所述osnrt2.3a的核苷酸序列为序列表中序列6；所述osnar1的核苷酸序列为序列表中序列7；所述osnar2的核苷酸序列为序列表中序列8。
本发明通过利用爪蟾卵母细胞的体外转运系统证明nrt1.1a蛋白能够转运硝酸盐。转基因实验表明，nrt1.1a在水稻野生型中过量表达能够表现出明显的生长优势，并且显著提升穗粒数和株高，进而提高水稻产量nrt1.1a在拟南芥野生型中过量表达幼苗期就表现出一定的生长优势，莲座叶明显大于野生型对照；进入抽薹期后，过表达株系抽薹显著早于野生型对照。以上结果暗示nrt1.1a蛋白在提高植物产量具有极大的应用潜力。
附图说明
图1为nrt1.1a基因在水稻各组织中的表达情况分析。
图2为nrt1.1a蛋白在爪蟾卵母细胞中表现出15no3-转运活性。
图3为水稻nrt1.1a突变体表现出硝酸盐转运的抑制。其中，a为转入新营养液后3h的结果；b为转入新营养液后24h的结果。wt表示野生型对照。
图4为水稻nrt1.1a突变体背景下其他硝酸盐转运蛋白基因的表达水平受到抑制。wt表示野生型对照。
图5为nrt1.1a过量表达的水稻转基因株系ox1-1、ox2-6表现出明显的生长优势。其中，a为幼苗期表型；b为生殖生长时期表型。wt表示野生型对照。
图6为在nrt1.1a过量表达水稻转基因株系ox1-1、ox2-6背景下硝酸盐利用相关基因表达水平显著上调。wt表示野生型对照。
图7为nrt1.1a过量表达水稻转基因株系pna-2和pna-4在田间低氮/高氮条件下表现出产量优势。其中，a为田间高氮条件；b为田间低氮条件。
图8为nrt1.1a过量表达拟南芥转基因株系ox-3和ox-17表现出明显的生长优势。其中，a为wt、ox-3和ox-17中nrt1.1a基因表达水平检测结果；b为幼苗期表型；c为抽薹期表型。wt表示野生型对照(columbia-0)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pcambia2300-actin载体：记载于“wang,k.j.,tang,d.,wang,m.,lu,j.f.,yu,h.x.,liu,j.f.,qian,b.x.,gong,z.y.,wang,x.,chen,j.m.,gu,m.h.andcheng,z.k.(2009)mer3isrequiredfornormalmeioticcrossoverformation,butnotforpresynapticalignmentinrice.jcellsci,122,2055-2063.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。
水稻品种东津：记载于“jakyungyi,gynheungan.utilizationoft-dnatagginglinesinrice.j.plantbiol.(2013)56:85-90”一文的“dongjin”，公开可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
水稻nrt1.1a突变体：来自韩国水稻突变体库(cropbiotechinstitute,kyungheeuniversity,republicofkorea,http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd)，订购网址为http://signal.salk.edu/cgi-bin/ricege5，该水稻nrt1.1a突变体的对应编号为pfg_1e-00433.l。具体构建方法记载于“jakyungyi,gynheungan.utilizationoft-dnatagginglinesinrice.j.plantbiol.(2013)56:85-90”一文。
爪蟾卵母细胞(xenopusoocyte)：记载于“suhongxu,fengcheng,juanliang,etal.maternalxnorrin,acanonicalwntsignalingagonistandtgf-βantagonist,controlsearlyneuroectodermspecificationinxenopus.plosbiology,2012.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。
pcs2+载体：记载于“suhongxu,fengcheng,juanliang,etal.maternalxnorrin,acanonicalwntsignalingagonistandtgf-βantagonist,controlsearlyneuroectodermspecificationinxenopus.plosbiology,2012.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。
pcambia2300-35s-ocs载体：记载于“咸洋,夏阳,张金文等.pcambia2300-beta-badh双价植物表达载体的构建.中国农学通报,2009年09期”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验。
实施例1、nrt1.1a在水稻各组织中表达情况分析
本实施例中所涉及的nrt1.1a基因来源于水稻(oryza.satival.)，其基因组序列如序列表中序列2所示，序列2由8143个核苷酸组成，其cdna序列为序列表中序列3，序列3由1812个核苷酸组成。序列2和序列3编码序列表中序列1所示的蛋白质(nrt1.1a蛋白)，序列1由603个氨基酸残基组成。
从水稻品种东津的根、茎、叶鞘、叶和穗中分别提取总rna并反转录得到cdna。进而以所得cdna为模板，针对nrt1.1a基因进行实时定量荧光pcr，检测水稻各组织中nrt1.1a基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。
用于检测nrt1.1a基因的引物序列如下：
qnrt1.1a-f：5’-ccgtcttcttcgtcggctccatcct-3’(序列3的第1187-1211位)；
qnrt1.1a-r：5’-cccgtgctcatcgtcttcatcccct-3’(序列3的第1514-1538位的反向互补序列)。
以osactin1作为内参基因，其引物序列为：
osactin1-f：5’-accattggtgctgagcgttt-3’；
osactin1-r：5’-cgcagcttccattcctatgaa-3’。
将内参基因的表达量视为1，计算nrt1.1a基因的相对表达量。
qrt-pcr分析表明，nrt1.1a基因在水稻各组织中均有较高水平表达(见图1)而在根中表达最高其次是叶、叶鞘和茎，穗中表达量最低。这种组成型表达结果暗示，nrt1.1a可能参与了植物体的基础生理功能的维持。
实施例2、nrt1.1a体外转运硝酸盐活性验证
本实施例中所涉及的nrt1.1a基因来源于水稻(oryza.satival.)，其基因组序列如序列表中序列2所示，序列2由8143个核苷酸组成，其cdna序列为序列表中序列3，序列3由1812个核苷酸组成。序列2和序列3编码序列表中序列1所示的蛋白质(nrt1.1a蛋白)，序列1由603个氨基酸残基组成。
一、爪蟾重组表达载体pcs2+/nrt1.1a的构建
提取粳稻品种东津的总rna，反转录为cdna。以获得的cdna为模板，采用下述引物序列分别对nrt1.1acdna进行pcr扩增。扩增采用的引物两端分别引入限制性内切酶bamhi和ecori的识别位点(如下划线所示)，引物序列：
f：5’-ggatccatggtggggatgttgccgga-3’(下划线部分为bamhi的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1-20位)；
r：5’-gaattctcagtggaggcatggctcgg-3’(下划线部分为ecori的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1793-1812位的反向互补序列)。
将扩增的目的片段连接入爪蟾卵母细胞表达载体pcs2+中，并通过测序进行验证。
将经测序表明将pcs2+载体的酶切位点bamhi和ecori之间的小片段替换为序列表中序列3所示dna片段后所得的重组载体命名为pcs2+/nrt1.1a。
二、体外转录nrt1.1amrna并注射爪蟾卵母细胞验证转运硝酸盐活性
将步骤一构建获得的重组载体pcs2+/nrt1.1a用限制性内切酶apai进行线性化，然后采用体外转录试剂盒(mmessage
将所得crna注射爪蟾卵母细胞(xenopusoocyte)。注射后，在nd96溶液(配方：96mmnacl，2mmkcl，1mmmgcl2，1.8mmcacl2，5mmhepes，ph7.4)中培养两天后，转移入含有10mmk15no3的吸收溶液(配方：10mmk15no3(98％atom15n-kno3,sigma-aldrich,335134)，230mmmannitol，0.3mmcacl2，10mmmes-tris，ph5.5)中，再培养3h，采用元素质谱分析仪(icp-ms)测定爪蟾卵母细胞的15n含量(具体方法参见“kun-hsiangliu,chi-yinghuang,yi-fangtsay,etal.chl1isadual-affinitynitratetransporterofarabidopsisinvolvedinmultiplephasesofnitrateuptake.theplantcell,1999”一文)。实验设3次重复，测定结果取均值。
实验同时设置注射相同体积ddh2o的对照。
测定结果显示，注射有nrt1.1acrna的爪蟾卵母细胞的15n含量显著高于注射相同体积ddh2o对照(p<0.01，见图2)。该结果表明nrt1.1a在体外具有转运硝酸盐活性。
实施例3、水稻nrt1.1a突变体的获得及功能验证
本实施例中所涉及的nrt1.1a基因来源于水稻(oryza.satival.)，其基因组序列如序列表中序列2所示，序列2由8143个核苷酸组成，其cdna序列为序列表中序列3，序列3由1812个核苷酸组成。序列2和序列3编码序列表中序列1所示的蛋白质(nrt1.1a蛋白)，序列1由603个氨基酸残基组成。
一、水稻nrt1.1a突变体的获得及鉴定
水稻nrt1.1a突变体：来自韩国水稻突变体库(cropbiotechinstitute,kyungheeuniversity,republicofkorea,http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd)，订购网址为http://signal.salk.edu/cgi-bin/ricege5，该水稻nrt1.1a突变体的对应编号为pfg_1e-00433.l。具体构建方法记载于“jakyungyi,gynheungan.utilizationoft-dnatagginglinesinrice.j.plantbiol.(2013)56:85-90”一文。
水稻突变体nrt1.1a的鉴定采用“三引物法”进行。所用引物的序列如下：
pga2715l：5’-ctagagtcgagaattcagtaca-3’；
narm14f：5’-aatccgcaaatgtgtcttgt-3’；
narm14r：5’-ctagggccatcttgtcttca-3’。
经证实，水稻突变体nrt1.1a中nrt1.1a基因确实发生了突变，不能正常表达有功能的nrt1.1a蛋白。
二、水稻nrt1.1a突变体的硝酸盐转运功能验证
为了具体了解nrt1.1a的体内功能，本发明的发明人进行了15n示踪的硝酸盐转运实验。首先，将野生型水稻东津和nrt1.1a突变体的幼苗在改良的kimurab营养液(配方：2mmkno3，1.8mmkcl，0.36mmcacl2，0.54mmmgso4·7h2o，0.18mmkh2po4，40μmna2edta-fe(ii)，13.4μmmncl2·4h2o，18.8μmh3bo3，0.03μmna2moo4·2h2o，0.3μmznso4·7h2o，0.32μmcuso4·5h2o和1.6mmna2sio3·9h2o)中培养10天，然后转入含有5mmk15no3的改良kimurab营养液中培养24h。在转入新营养液后3h和24h分地上和地下部分取材，采用元素质谱分析仪(icp-ms)测定15n含量(具体方法参见“kun-hsiangliu,chi-yinghuang,yi-fangtsay,etal.chl1isadual-affinitynitratetransporterofarabidopsisinvolvedinmultiplephasesofnitrateuptake.theplantcell,1999”一文)。实验设4次重复，测定结果取均值。
通过计算野生型水稻东津和nrt1.1a突变体地上部与根中15n含量比值发现，在两个取样时间点，nrt1.1a突变体地上部与根中15n含量的比值显著低于野生型(p<0.01，见图3)，说明nrt1.1a突变体内硝酸盐由地下向地上部的转运受到严重影响。
三、水稻nrt1.1a突变体中硝酸盐代谢相关基因表达测定
通过qrt-pcr检测水稻中如下硝酸盐利用相关基因的表达水平：(1)osnrt1.1b基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列4，主要负责硝酸盐的吸收和转运，以及参与硝酸盐信号的调节；(2)osnrt2.1基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列5，主要负责硝酸盐吸收；(3)osnrt2.3a基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列6，负责硝酸盐向地上部分转运；(4)osnar1基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列7，osnrt2.1执行功能的辅因子；(5)osnar2基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列8，osnrt2.1执行功能的辅因子。
分别取野生型水稻东津和nrt1.1a突变体幼苗叶片，提取总rna，并反转录得到cdna，然后采用如下各引物对对上述五种硝酸盐利用相关基因进行qrt-pcr检测。
用于检测osnrt1.1b基因的引物对：
osnrt1.1b-f：5’-ggcaggctcgactacttcta-3’；
osnrt1.1b-r：5’-aggcgcttctccttgtagac-3’。
用于检测osnrt2.1基因的引物对：
osnrt2.1-f：5’-cttcacgtcgtcgaggtact-3’；
osnrt2.1-r：5’-cactcggagccgtagtagtg-3’。
用于检测osnrt2.3a基因的引物对：
osnrt2.3a-f：5’-cgctgctgccgctcatccg-3’；
osnrt2.3a-r：5’-ccgtgcccatggccagac-3’。
用于检测osnar1基因的引物对：
osnar1-f：5’-gttcaagagcgtgaaggtga-3’；
osnar1-r：5’-caccacgtagtcgaacctg-3’。
用于检测osnar2基因的引物对：
osnar2-f：5’-tcgtcctcgagaacaagaag-3’；
osnar2-r：5’-tccgttggttttgtaggttg-3’。
以osactin1为内参基因，其检测引物对：
osactin1-f：5’-accattggtgctgagcgttt-3’；
osactin1-r：5’-cgcagcttccattcctatgaa-3’。
将内参基因的表达量视为1，计算各基因的相对表达量。
结果表明，在nrt1.1a突变体背景下，与野生型水稻东津相比，上述五种硝酸盐利用相关基因的表达均受到显著抑制(p<0.05，见图4)，暗示nrt1.1a可能参与了对这些基因转录水平的调控。
实施例4、nrt1.1a转基因水稻的获得及功能验证(异源启动子)
一、重组植物表达载体pcambia2300-actin/nrt1.1a的构建
提取粳稻东津的总rna，反转录为cdna。以获得的cdna为模板，采用下述引物序列对nrt1.1a的cds进行pcr扩增。扩增采用的引物两端分别引入限制性内切酶xbai和psti的识别位点(如下划线所示)，引物序列如下：
f：5’-tctagaatggtggggatgttgccgga-3’(下划线部分为xbai的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1-20位)；
r：5’-ctgcagtcagtggaggcatggctcgg-3’(下划线部分为psti的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1793-1812位的反向互补序列)。
以水稻品种东津的cdna为模板扩增nrt1.1a的cds区域(包含终止密码子)。pcr产物连接t载体peasy-blunt(transgene)后，经xbai和psti双酶切验证后连入植物表达载体pcambia2301-actin中。
将经测序表明将pcambia2300-actin载体的酶切位点xbai和psti之间的小片段替换为序列表中序列3所示dna片段后所得的重组载体命名为pcambia2300-actin/nrt1.1a。
二、nrt1.1a转基因水稻的获得
将步骤一构建的重组植物表达载体pcambia2300-actin/nrt1.1a转入农杆菌agl1(来自atcc)中，再侵染粳稻品种东津的愈伤组织，具体的转化筛选方法参见文献“易自力,曹守云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文。同时设置转入pcambia2300-actin空载体的对照。最终获得两种转基因苗，即转入pcambia2300-actin/nrt1.1a的水稻植株和转入pcambia2300-actin空载体的水稻植株(t0)。
三、nrt1.1a转基因水稻的鉴定
(1)pcr初步鉴定
从步骤二获得的t0代转入pcambia2300-actin/nrt1.1a的转基因水稻，以及转入pcambia2300-actin空载体的对照植株中分别提取基因组dna。用针对nptii基因的引物f1和r1(引物序列如下)进行pcr鉴定，经鉴定表明含有nptii基因的(pcr产物大小约为500bp)植株即为转基因阳性的植株。
f1：5’-tccggccgcttgggtggagag-3’；
r1：5’-ctggcgcgagcccctgatgct-3’。
经上述pcr分子鉴定，从鉴定阳性的转入pcambia2300-actin/nrt1.1a的转基因水稻株系中随机选取2个分别记作ox1-1、ox2-6。
(2)转录水平分析(rna表达量)
以步骤(1)获得的t0代nrt1.1a转基因水稻株系ox1-1、ox2-6，转入pcambia2300-actin空载体的对照植株，以及野生型水稻品种东津为实验材料。提取各材料的总rna并反转录得到cdna。进而以所得cdna为模板，针对nrt1.1a基因进行实时定量荧光pcr，检测各材料中nrt1.1a基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。
用于检测nrt1.1a基因的引物序列如下：
qnrt1.1a-f：5’-ccgtcttcttcgtcggctccatcct-3’(序列3的第1187-1211位)；
qnrt1.1a-r：5’-cccgtgctcatcgtcttcatcccct-3’(序列3的第1514-1538位的反向互补序列)。
以osactin1作为内参基因，其引物序列为：
osactin1-f：5’-accattggtgctgagcgttt-3’；
osactin1-r：5’-cgcagcttccattcctatgaa-3’。
将内参基因的表达量视为1，计算nrt1.1a基因的相对表达量。
各实验材料中nrt1.1a基因表达量的实时定量荧光pcr检测结果显示，相比未转基因的野生型水稻品种东津，步骤(1)获得的t0代nrt1.1a转基因水稻株系ox1-1、ox2-6中nrt1.1a基因的表达量在转录水平上显著提高，而对于转入pcambia2300-actin空载体的对照植株，其nrt1.1a基因的表达量在转录水平与未转基因的野生型水稻东津相比基本一致，无统计学差异。
四、nrt1.1a转基因水稻的功能验证
1、实验方法
以步骤三鉴定阳性的t2代nrt1.1a转基因水稻株系ox1-1、ox2-6，转入pcambia2300-actin空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻东津为实验材料。从以下几方面鉴定其功能：
(1)表型观察
于幼苗期观察并记录各遗传材料的株高，进入生殖生长时期后再次观察并记录各遗传材料的株高。实验中，每个转基因株系至少选择30个单株进行统计。
(2)qrt-pcr分析硝酸盐代谢相关基因的转录水平
硝酸盐代谢相关基因具体涉及：
osnrt2.1基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列5；
osnrt2.3a基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列6；
osnia2基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列8；
osnir1基因，其cdna的核苷酸序列为序列表中序列7。
具体测定方法参见实施例2步骤三进行。
实验中，每个转基因株系至少选择5株进行实验。
2、实验结果
(1)表型观察结果
t2代nrt1.1a转基因水稻株系ox1-1、ox2-6在幼苗期就表现出一定的生长优势，株高显著高于野生型对照；进入开花期，过表达株系表现出开花期提早的表型(见图5)。而转入pcambia2300-actin空载体的对照植株其株高和开花时间与野生型对照相比均基本一致，无统计学差异。这些结果说明，nrt1.1a在农业生产上具有一定的应用潜力，适度提高nrt1.1a的表达水平可能提高水稻的产量。
(2)qrt-pcr分析硝酸盐代谢相关基因的转录水平
qrt-pcr分析表明，步骤三鉴定阳性的t0代nrt1.1a转基因水稻株系ox1-1、ox2-6中，其上述四种硝酸盐代谢相关基因的转录水平相比于野生型对照均得到显著上调(p<0.01，见图6)。
实施例5、nrt1.1a转基因水稻的获得及功能验证(内源启动子)
为了确认nrt1.1a能达到水稻增产的效果，并避免组成型启动子对水稻农艺性状产生的负效应，本发明的发明人构建了自身启动子驱动的nrt1.1a过量表达转基因植株，并进一步对其功能进行了验证。
一、重组表达载体pcambia2300/nrt1.1a的构建
提取水稻品种东津的基因组dna和总rna，并将总rna反转录为cdna。以东津基因组dna为模板扩增nrt1.1a的启动子区域(序列9)，扩增采用的引物两端分别引入限制性内切酶kpni和ecori的识别位点(如下划线所示)，采用的引物序列如下：
nrt1.1ap-f：5’-ggtaccttcgatctcccacgtaagac-3’(下划线部分为kpni的识别序列，其后的序列为序列9的第1-20位)；
nrt1.1ap-r：5’-gaattctctctctctcttcttcttcttcctc-3’(下划线部分为ecori的识别序列，其后的序列为序列9的第1790-1814位的反向互补序列)。
同时，以水稻品种东津的cdna为模板扩增nrt1.1a的cds区域，扩增采用的引物两端分别引入限制性内切酶ecori和xmai的识别位点，引物的序列如下：
nrt1.1acds-f：5’-gaattcatggtggggatgttgccgga-3’(下划线部分为ecori的识别序列，其后的序列为序列3的第1-20位)；
nrt1.1acds-r：5’-cccggggtggaggcatggctcgg-3’(下划线部分为xmai的识别序列，其后的序列为序列3的第1793-1809位的反向互补序列)。
将以上两步扩增出的两个pcr片段分两次分别连入pbluescriptks(+)(stratagene，212205)载体的对应酶切位点处。经测序验证后，采用kpni和bamhi双酶切并将含有内源启动子及nrt1.1acds的片段连入双元载体pcambia2300的对应酶切位点处，将所得经测序验证正确的重组载体命名为pcambia2300/nrt1.1a。
二、nrt1.1a转基因水稻的获得
将步骤一构建的重组植物表达载体pcambia2300/nrt1.1a转入农杆菌agl1(来自atcc)中，再侵染粳稻品种东津的愈伤组织具体的转化筛选方法参见文献“易自力,曹守云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文。同时设置转入pcambia2300空载体的对照。最终获得两种转基因苗，即转入pcambia2300/nrt1.1a的水稻植株和转入pcambia2300空载体的水稻植株(t0)。
三、nrt1.1a转基因水稻的鉴定
(1)pcr初步鉴定
从步骤二获得的t0代转入pcambia2300/nrt1.1a的转基因水稻，以及转入pcambia2300空载体的对照植株中分别提取基因组dna。用引物f1和r1(引物序列如下)进行pcr鉴定，经鉴定表明含有nptii基因的(pcr产物大小约为500bp)植株即为转基因阳性的植株。
f1：5’-tccggccgcttgggtggagag-3’；
r1：5’-ctggcgcgagcccctgatgct-3’。
经上述pcr分子鉴定，从鉴定阳性的转入pcambia2300/nrt1.1a的转基因水稻株系中随机选取2个分别记作pna-2和pna-4。
(2)转录水平分析(rna表达量)
以步骤(1)获得的鉴定阳性t0代nrt1.1a转基因水稻株系pna-2和pna-4，转入pcambia2300空载体的对照植株，以及野生型水稻品种东津为实验材料。提取各材料的总rna并反转录得到cdna。进而以所得cdna为模板，针对nrt1.1a基因进行实时定量荧光pcr，检测各材料中nrt1.1a基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。
用于检测nrt1.1a基因的引物序列如下：
qnrt1.1a-f：5’-ccgtcttcttcgtcggctccatcct-3’(序列3的第1187-1211位)；
qnrt1.1a-r：5’-cccgtgctcatcgtcttcatcccct-3’(序列3的第1514-1538位的反向互补序列)。
以osactin1作为内参基因，其引物序列为：
osactin1-f：5’-accattggtgctgagcgttt-3’；
osactin1-r：5’-cgcagcttccattcctatgaa-3’。
将内参基因的表达量视为1，计算nrt1.1a基因的相对表达量。
各实验材料中nrt1.1a基因表达量的实时定量荧光pcr检测结果显示，相比未转基因的野生型水稻品种东津，步骤(1)获得的t0代nrt1.1a转基因水稻株系pna-2和pna-4中nrt1.1a基因的表达量在转录水平上显著提高，而对于转入pcambia2300空载体的对照植株，其nrt1.1a基因的表达量在转录水平与未转基因的野生型水稻品种东津相比基本一致，无统计学差异。
四、nrt1.1a转基因水稻的功能验证
以步骤三鉴定阳性的t2代nrt1.1a转基因水稻株系pna-2和pna-4，转入pcambia2300空载体的对照植株，以及未转基因的野生型水稻东津为实验材料。田间试验设置两个氮肥梯度(高氮和低氮)。其中高氮按照每100平方米4.28kg尿素施肥，低氮按照每100平方米1.07kg尿素施肥。每个氮肥梯度下设置3个小区。在田间观察和记录其表型(包括分蘖数、千粒重、穗粒数以及单株产量)，每个株系在各个小区随机选择至少10个单株进行表型统计，总计每个株系不少于30个单株。
田间的氮肥测试结果显示，在低氮和高氮条件下，nrt1.1a过表达的转基因株系pna-2和pna-4均表现为穗粒数以及单株产量的显著增加(p<0.05)。尤其是在低氮条件下，过表达转基因株系的单株产量增加尤为明显(p<0.01)详见图7。
实施例6、nrt1.1a转基因拟南芥的获得及功能验证(异源启动子)
一、重组植物表达载体pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a的构建
提取粳稻东津的总rna，反转录为cdna。以获得的cdna为模板，采用下述引物序列对nrt1.1a的cds进行pcr扩增。扩增采用的引物两端分别引入限制性内切酶bamhi和sali的识别位点(如下划线所示)，引物序列如下：
f：5’-ggatccatggtggggatgttgccgga-3’(下划线部分为bamhi的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1-20位)；
r：5’-gtcgactcagtggaggcatggctcgg-3’(下划线部分为sali的识别序列，其后的序列为序列表中序列3的第1793-1812位的反向互补序列)。
以水稻品种东津的cdna为模板扩增nrt1.1a的cds区域(包含终止密码子)。pcr产物连接t载体peasy-blunt(transgene)后，经bamhi和sali双酶切验证后连入植物表达载体pcambia2300-35s-ocs中。
将经测序表明将pcambia2300-35s-ocs载体的酶切位点bamhi和sali之间的小片段替换为序列表中序列3所示dna片段后所得的重组载体命名为pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a。
二、nrt1.1a转基因拟南芥的获得
将步骤一构建的重组植物表达载体pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a通过农杆菌gv3101(来自atcc)介导的遗传转化转入拟南芥columbia-0(参考文献：“stevenj.cloughandandrewf.bent.floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.theplantjournal.(1998)16(6),735-743”)。同时设置转入pcambia2300-35s-ocs空载体的对照。最终获得两种转基因苗，即转入pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a的拟南芥植株和转入pcambia2300-35s-ocs空载体的拟南芥植株(t0)。
三、nrt1.1a转基因拟南芥的鉴定
从步骤二获得的t0代转入pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a的转基因拟南芥中随机选取两株，分别记为为ox-3和ox-17。将ox-3和ox-17、转入pcambia2300-35s-ocs空载体的对照植株以及未转基因的野生型拟南芥columbia-0中分别提取总rna并反转录得到cdna。进而以所得cdna为模板，针对nrt1.1a基因进行实时定量荧光pcr，检测各材料中nrt1.1a基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。
用于检测nrt1.1a基因的引物序列如下：
qnrt1.1a-f：5’-ccgtcttcttcgtcggctccatcct-3’(序列3的第1187-1211位)；
qnrt1.1a-r：5’-cccgtgctcatcgtcttcatcccct-3’(序列3的第1514-1538位的反向互补序列)。
以atactin2作为内参基因，其引物序列为：
qatactin2-f：5’-gcaccacctgaaaggaagtaca-3’；
qatactin2-r：5’-cgattcctggacctgcctcatc-3’。
将内参基因的表达量视为1，计算nrt1.1a基因的相对表达量。
各实验材料中nrt1.1a基因表达量的实时定量荧光pcr检测结果显示，相比未转基因的野生型拟南芥，步骤二获得的t0代转入pcambia2300-35s-ocs/nrt1.1a的转基因拟南芥株系ox-3和ox-17中nrt1.1a基因的表达量在转录水平上显著提高(见图8中a)。而对于转入pcambia2300-35s-ocs空载体的对照植株，其nrt1.1a基因的表达量在转录水平与未转基因的野生型植株相比基本一致，无统计学差异。
四、nrt1.1a转基因拟南芥的功能验证
1、实验方法
以步骤三鉴定阳性的t2代nrt1.1a转基因拟南芥株系ox-3和ox-17，转入pcambia2300-35s-ocs空载体的对照植株，以及未转基因的野生型拟南芥columbia-0为实验材料。于幼苗期观察各遗传材料的莲座叶大小，进入抽薹期后观察各遗传材料的抽薹时间。实验中，每个转基因株系至少选择30个单株进行观察。
2、实验结果
t2代nrt1.1a转基因拟南芥株系ox-3和ox-17在幼苗期就表现出一定的生长优势，莲座叶明显大于野生型对照(见图8中b)，进入抽薹期后，过表达株系抽薹显著早于野生型对照(见图8中c)。而对于转入pcambia2300-35s-ocs空载体的对照植株，其幼苗期莲座叶大小以及抽薹时间与未转基因的野生型植株相比基本一致。