本发明属中药制药领域，涉及一种源自堇菜科植物天山堇菜(violatianshanicamaxim.)的维吾尔药材天山堇菜中分离得到甾体类化合物及其在制备抗补体药物中的新用途。
背景技术：
：现有技术公开了补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种重大疾病。抗补体药物研究多年来一直是世界药学研究的热点和重点。然而目前对此类疾病尚缺乏较为理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。从天然产物中研究开发补体抑制剂是近年来一个受到越来越多关注的重要研究领域，其具有成本低、毒性低等特点。国内外学者已从包括海洋生物等在内的多种天然产物中分离得到大量具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补体药物的研究与开发提供了广阔的前景。天山堇菜(维药名比乃非谢吉)为堇菜科植物天山堇菜（violatianshanicamaxim.）和双花堇菜（violabifloral.）的全草，是新疆特色药物中清热解毒药材的著名代表之一。主要用于轻泻异常胆液质，调节血液热性过盛，生津止渴，发汗退烧。临床用于热性感冒，发烧，头痛，咽痛，肢肿，小儿惊厥，也可外用于疔疮肿痛等症。早期对天山堇菜的化学成分有粗略的报道，从其大极性部分主要分离得到山柰酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷、异鼠李素3-o-葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素、烟花苷和七叶内酯等黄酮类和香豆素类化合物；药理实验表明天山堇菜的水煎剂和挥发油分别显示出抗菌和抗氧化等生物活性。在2003年我国sars(非典)爆发期间，维医药将天山堇菜及其复方作为首推的药物对该类重症感染性疾病进行防治，如天山堇菜糖浆、天山堇菜小丸、天山堇菜汤(维药名分别为：谢日比提比乃非谢、艾比比乃非谢、买提布合比乃非谢)等。迄今为止尚未见天山堇菜中甾体类化合物对补体系统具有抑制作用的的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供新的具有抗补体活性的物质，具体涉及从维药天山堇菜中分离得到的甾体类化合物，为豆甾-4-烯-3β,6β-二醇(1)和24s-豆甾-4,28-二烯-24-醇-3-酮(2)。本发明的进一步目的是提供上述维药天山堇菜中甾体类化合物在制备抗补体药物中的用途。本发明应用现代药理筛选方法，对分离得到的单体化合物进行抗补体活性评价研究，从维药天山堇菜干燥全草乙醇提取物的石油醚萃取部位分离得到2个甾体类化合物，并证实其对补体系统经典途径有活性。本发明的抗补体活性甾体类化合物具有下述结构通式：其中，r1=oh,o；r2=oh,h；r3=h,oh。当r1=oh、r2=oh、r3=h时，双键为△4,5，化合物为豆甾-4-烯-3β,6β-二醇(1)。当r1=o、r2=h、r3=oh时，双键为△4,5和△28,29，化合物为24s-豆甾-4,28-二烯-24-醇-3-酮(2)。本发明所述的甾体类化合物通过下述方法制备：干燥的维药天山堇菜全草，粉碎，用95%乙醇室温冷浸3次，合并提取液并浓缩至无醇味，浸膏加水稀释，依次以等体积（60~90℃）、乙酸乙脂、正丁醇萃取3次，得到石油醚、乙酸乙脂和正丁醇部位。对三个部位进行活性检测，发现石油醚部位活性良好。取石油醚部位，依次以石油醚-丙酮(50:1，30:1，15:1，9:1，7:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1)梯度洗脱，得9个流份。所得流份近反复硅胶柱色谱、sephadexlh-20和制备色谱，分离得到,2个甾体类化合物豆甾-4-烯-3β,6β-二醇(1)和24s-豆甾-4,28-二烯-24-醇-3-酮(2)本发明中，化合物1（豆甾-4-烯-3β,6β-二醇）：无色晶体；1h-nmr(cdcl3,400mhz)数据：δh0.69(3h,sh-18);0.77~0.86(m,9h,h-26,h-27,h-29);0.90~0.92(3h,d,j=6.5hz,h-21);1.00(3h,s,h-19);13c-nmr(cdcl3)数据：δc149.3(c-5),119.7(c-4),68.6(c-6),67.9(c-3),56.0(c-17),55.8(c-14),54.2(c-9),45.8(c-24),42.5(c-7),42.1(c-13),39.6(c-12),37.9(c-10),36.2(c-1),35.9(c-20),34.3(c-8),33.8(c-22),29.1(c-2),29.1(c-25),28.1(c-16),26.0(c-23),24.2(c-15),23.0(c-28),21.0(c-19),19.8(c-11),19.7(c-26),19.0(c-21),18.7(c-27),11.9(c-18),11.9(c-29)。化合物2（24s-豆甾-4,28-二烯-24-醇-3-酮）：无色针晶；化合物5无色针状针晶（石油醚-丙酮）；分子式为c29h46o2;1h-nmr(400mhz,cdc13)数据：δh0.70(3h,sh-24);0.87~0.89(d,6h,h-23,h-24);0.95(3h,s,h-25);1.00~1.01(6h,d,j=2.6hzh-26,h-27);1.05(3h,s,h-30);1.18(3h,s,h-29);13c-nmr(cdcl3)数据：δc199.6(c-3),171.6(c-5),142.5(c-28),123.7(c-4),112.9(c-29),77.6(c-5),77.6(c-24),55.8(c-17),55.8(c-14),53.8(c-9),42.4(c-13),39.6(c-12),38.6(c-10),36.1(c-20),36.0(c-25),35.9(c-1),35.7(c-8),35.6(c-23),34.0(c-2),32.9(c-6),32.0(c-7),29.0(c-22),28.1(c-16),24.1(c-15),21.0(c-11),18.7(c-21),18.7(c-26),17.5(c-19),17.4(c-26),16.4(c-27),11.9(c-18)。本发明上述的甾体类化合物通过经典途径和旁路途径体外抗补体活性试验测定，结果表明上述甾体化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有抑制作用(如表1所示)。表1.化合物1-2对补体系统经典和旁路途径的抑制作用（mean±sd，n=3）化合物化合物名称ch50(mg/ml)ap50(mg/ml)1豆甾-4-烯-3β,6β-二醇0.03±0.060.53±0.04224s-豆甾-4,28-二烯-24-醇-3-酮0.05±0.040.61±0.03阳性对照肝素钠0.08±0.020.11±0.04其中，ch50是对经典途径50%抑制溶血所需供试品的浓度；ap50是对旁路途径50%抑制溶血所需供试品的浓度。本发明的甾体类化合物可制备抗补体药物。本发明的甾体类化合物可进一步制备治疗与补体相关疾病的药物；所述的与补体相关疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。附图说明:图1.维药天山堇菜醇提物石油醚萃取部位甾体类化合物1和2的提取分离流程图。具体实施方式实施例1制备甾体类化合物取干燥的维药天山堇菜全草10kg，粉碎，用95%乙醇（60l）室温冷浸3次，合并提取液并浓缩至无醇味得总浸膏1.3kg，浸膏加水（3500ml）混悬，依次以等体积石油醚（60~90℃）、乙酸乙脂和正丁醇萃取3次，得到石油醚部位（342g）、乙酸乙脂部位（144g）和正丁醇部位（80g）。对三个部位进行活性检测，发现石油醚部位活性良好。取石油醚部位，依次以石油醚-丙酮(50:1，30:1，15:1，9:1，7:1，5:1，4:1，3:1，2:1，1:1)梯度洗脱，得9个流份(fr.1-9)。fr7（2.5g）经石油醚-丙酮(20:1)反复硅胶柱层析洗脱得到化合物1（4mg）。流份fr.8(6.2g)，经石油醚-丙酮(10:1)反复硅胶柱层析洗脱，接着用葡聚糖凝胶sephadexlh-20甲醇-水(80:20)柱层析，还是没有完全分离，再经石油醚-丙酮(10:1)薄层色谱制备，得到化合物2（6mg）。实施例2体外抗补体经典途径试验取补体（豚鼠血清）0.1ml，加入巴比妥缓冲液（bbs）配制成1:5的溶液，用bbs对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液；取1:1000溶血素、各浓度补体及2%羊红细胞(srbc)各0.1ml溶于0.3mlbbs中，混匀，37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min，分别取每管上清0.2ml于96孔板,在405nm测定其吸光度，实验同时设置全溶血组(0.1ml2%srbc溶于0.5ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度为x轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为y轴作图，选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入适量bbs、溶血素和2%srbc。将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定吸光度，实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组，将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图，计算50%抑制溶血所需供试品的浓度(ch50;体外抗补体经典途径试验结果如表1所示。实施例3体外抗补体旁路途径试验取补体(人血清)0.2ml，加入ap稀释液(巴比妥缓冲液，ph7.4，含5mmg2+，8mmegta)配制成1:5的溶液，并对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的溶液，取各浓度补体0.15ml、ap稀释液0.15ml及0.5%兔红细胞(re)0.20ml，混匀，37℃水浴30min后置于低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min，分别取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度，实验同时设置全溶血组(0.20ml0.5%re溶于0.3ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度为x轴，各稀释浓度补体造成的溶血百分率为y轴作图，选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度，取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，于37℃预水浴10min后，加入0.,2ml0.5%re，将每管37℃水浴30min后置于低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后，分别取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下测定其吸光度，实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组，将供试品吸光度值扣除相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图，计算50%抑制溶血所需供试品的浓度(ap50)；体外抗补体旁路途径试验结果如表1所示。表1显示了本发明的化合物1-2对补体系统经典途径和旁路途径的抑制作用(mean士sd，n=3)。本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。当前第1页12