一种葡萄糖衍生物RG及其制备方法与制备天冬氨酸荧光检测试剂上的应用与流程

本发明涉及识别结合和用于光学检测天冬氨酸的分子检测技术领域，特别涉及一种葡萄糖衍生物rg及其制备方法与制备天冬氨酸荧光检测试剂上的应用。

背景技术：

天冬氨酸是人体所需的一种重要氨基酸，对健康新陈代谢具有关键作用，在能量产生方面也担负着重要角色。人体天冬氨酸的合理表达支配着其它生化物质和氨基酸的合成（galili,g.,2011.plantsignal.behav.6,192–195）。天冬氨酸在治疗慢性疲劳(marquezi,m.l.,roschel,h.a.,costa,a.d.,etal.internationaljournalofsportnutritionandexercisemetabolism,2003,13,65–75.)和增强免疫力方面也有明显的效果(li,p.,yin,y.l.,li,d.f.,etal.britishjournalofnutrition,2007,98,237–252.)。发展简便快捷灵敏的分析方法检测天冬氨酸十分重要。目前检测天冬氨酸的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、荧光法等。其中荧光法操作简单灵敏度高。然而这些方法中所用于识别天冬氨酸的化合物水溶性差、选择性低而相应发展缓慢。

技术实现要素：

为了克服以上方法的缺陷，尤其是关于水溶性和选择性的问题，本发明提供了一种葡萄糖衍生物rg及其制备方法与制备天冬氨酸荧光检测试剂上的应用。

本发明采用的技术解决方案是：一种葡萄糖衍生物rg，所述的葡萄糖衍生物rg的结构式如下：

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一种葡萄糖衍生物rg的制备方法，包括以下步骤：

（1）罗丹明衍生物合成：将479mg的罗丹明溶于20-40ml热的醇溶液，将0.33-0.6ml的乙二胺溶液逐滴滴入到上述溶液中，搅拌回流10-15h至溶液荧光消失，溶液冷至室温，于通风橱挥发至溶剂几乎全无，用三氯化碳与水的混合溶剂萃取罗丹明衍生物三次，得到产物罗丹明衍生物；

（2）葡萄糖衍生物rg合成：将230-450mg的葡萄糖酸溶于100ml乙醇中室温下搅拌24h至全部溶解，将0.1-0.2ml的n-羟基琥珀酰亚胺加入到溶解的葡萄糖酸溶液中，放置30-60min后，逐滴加入上述合成的罗丹明衍生物，于50-60ºc水浴加热回流5h后室温再搅拌24h，结果的溶液被旋转蒸干，其产物用乙醇再过滤，得到所述的葡萄糖衍生物rg。

所述的混合溶剂中三氯化碳与水的体积比为4-5:1。

一种葡萄糖衍生物rg在制备天冬氨酸荧光检测试剂上的应用。

所述的天冬氨酸荧光检测试剂通过以下步骤制备：将权利要求1所述的葡萄糖衍生物rg，溶于水或醇水溶液，并调至ph值至3.5，配成葡萄糖衍生物rg物质的量浓度为1*10^-5mol/l的天冬氨酸荧光检测试剂溶液。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种葡萄糖衍生物rg及其制备方法与制备天冬氨酸荧光检测试剂上的应用，将糖基引入到荧光发色基团，具体地说是将葡萄糖酸引入到罗丹明衍生物上，获得了水溶性极好、对天冬氨酸选择性强的糖基罗丹明类荧光显色剂，其合成方法简单、条件温和、产物易得，将该化合物用于本发明的天冬氨酸检测获得良好效果，不受其它共存生物分子，例如甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的影响，具有高选择性。由于在水中测试，使用方便，荧光强度高。

附图说明

图1为实施例1的化合物在ph3的水溶液中对天冬氨酸的荧光强度响应。

图2为实施例1的化合物在ph3的水溶液中于5倍干扰物质存在下对天冬氨酸的荧光响应；其中1为空白，2为组氨酸，3为半胱氨酸，4为苯丙氨酸，5为蛋氨酸，6为精氨酸，7为赖氨酸，8为亮氨酸，9为丝氨酸，10为组氨酸，11为异亮氨酸，12为缬氨酸，13为苏氨酸，14为谷氨酰胺，15为甘氨酸，16为氨基葡萄糖，17为葡萄糖，其中图中每组中，棒状标低的为干扰物质的响应，高的为加入天冬氨酸后的响应。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明内容，用具体实施例说明如下，具体实施例不限定本发明内容范围。

实施例1（化合物rg的合成）

（1）化合物rg的合成

将479mg的罗丹明溶于20ml热的甲醇溶液，将0.33ml的乙二胺溶液逐滴滴入到上述溶液中，搅拌回流15h至溶液荧光消失，溶液冷至室温，于通风橱挥发至溶剂几乎全无。用三氯化碳与水的混合溶剂（体积比为5:1）萃取罗丹明衍生物三次，得到产物罗丹明衍生物。将230mg的葡萄糖酸溶于100ml乙醇中室温下搅拌24h至全部溶解，将0.2ml的n-羟基琥珀酰亚胺加入到溶解的葡萄糖酸溶液中。放置30min后，逐滴加入上述合成的罗丹明衍生物，于60ºc水浴加热回流5h后室温再搅拌24h，结果的溶液被旋转蒸干，其产物用乙醇再过滤，得到目标化合物rg。

（2）化合物rg的合成

将479mg的罗丹明溶于40ml热的甲醇溶液，将0.6ml的乙二胺溶液逐滴滴入到上述溶液中，搅拌回流10h至溶液荧光消失，溶液冷至室温，于通风橱挥发至溶剂几乎全无。用三氯化碳与水的混合溶剂（体积比为4:1）萃取罗丹明衍生物三次，得到产物罗丹明衍生物。将450mg的葡萄糖酸溶于100ml乙醇中室温下搅拌24h至全部溶解，将0.1ml的n-羟基琥珀酰亚胺加入到溶解的葡萄糖酸溶液中。放置60min后，逐滴加入上述合成的罗丹明衍生物，于50ºc水浴加热回流5h后室温再搅拌24h，结果的溶液被旋转蒸干，其产物用乙醇再过滤，得到目标化合物rg。

实施例2（荧光强度曲线）

称取实施例1的化合物100mg溶解于水中，配置成1*10^-5m的标准储备液，调至溶液ph值为3.5。称取100mg的天冬氨酸，配成储备液，并调至ph值为3.5。生物分子选用组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸等物质，所有实验用的溶液都为新配置且溶液ph值为3.5，并立即开始实验。量取实施例1的储备液2ml，加入计算量的天冬氨酸，得到荧光强度曲线。

实施例3干扰物质共存检测天冬氨酸实验

荧光实验中化合物rg配成10^-5m的醇水溶液，调至溶液ph值为3.5。天冬氨酸配成10^-2m的标准储备液，调至溶液ph值为3.5。作为生物分子选用组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸等物质，调至溶液ph值为3.5。所有实验用的溶液都为新配置，并立即实验。干扰物质实验中，先在10^-5m的rg的水溶液中加入5倍的干扰物质，测其荧光，再加入天冬氨酸,测其荧光变化。于554nm处检测荧光变化。

本发明的方法测试天冬氨酸，不受其它共存生物分子，例如甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的影响，具有高选择性。由于在水中测试，使用方便，荧光强度高。综上所述，本发明的技术效果是显著的，提供了一种高选择性高灵敏度测试天冬氨酸的方法。

本发明机理：由于天冬氨酸与该化合物氢键作用，引起分子中电子分布的变化导致荧光强度的显著上升，达到检测天冬氨酸的目的。而半胱氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸等物质不能与其作用产生荧光强度的变化。表明该化合物rg对天冬氨酸具有高选择性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。