一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术：

光动力学疗法(photodynamictherapy，pdt)是近20年发展起来的的一种新的治疗恶性肿瘤的方法。其对肿瘤有相对的选择特异性，能定向地消灭原发和复发肿瘤，具有毒副作用小、不产生疤痕、易于操作和控制等诸多优点法。同时也使患者免受全身麻醉的危险性、以及用简单的局部麻醉下就实施手术，简单易行。光敏剂是光动力治疗中的核心组成部分，光敏剂的性能和特点决定了光动力治疗效果的大小，用于光动力治疗的理想光敏剂应具备以下特性：1)在光疗窗口600-800nm有较强的吸收；2)高的单线态氧产率；3)光毒性强而暗度性低；4)具有一定的肿瘤靶向性；5)组分确定。目前研究的苯并吩噁嗪类光敏剂是由含硒原子的吩嗯嗪类染料发展而成的，具有吸收波长在650纳米以上和吸收强度大等优点，但是其作为一种直接由工业染料发展而来的具有光敏作用的分子，在用于人体光动力治疗的过程中，也存在一定问题。如：论文(方倩.苯并吩恶嗪类(o、s、se)水溶性光敏剂的合成与光学性能研究[d].中南大学，2012.)中研究的含硒原子光敏剂虽然具有高效的光动力效应，但并没有结合生物体或者肿瘤的代谢、摄取特点进行进一步设计优化。

德国生物化学家奥托·沃伯格提出，肿瘤细胞的生化特征是糖代谢从氧化磷酸化向有氧酵解转变，即沃伯格效应。糖酵解这样的代谢途径有利于肿瘤细胞的快速增殖，肿瘤细胞可通过糖酵解获取中间代谢产物，以满足自身活跃的合成需要。论文(孙洁,孟祥军.肿瘤细胞的异常糖代谢[j].国际肿瘤学杂志,2013,(12):883-885.)也阐述了：肿瘤细胞对碳水化合物有特殊的摄取倾向，即在肿瘤组织的代谢过程中，葡萄糖、半乳糖等单糖的摄取量增加、糖有氧酵解增强的观点。肿瘤细胞对糖类物质的摄取倾向和代谢特点为肿瘤的治疗和抗肿瘤药物的研制提供了全新的思路。

同时，wnt信号途径能引起胞内β-连锁蛋白(β-catenin)积累。β-catenin(在果蝇中叫做犰狳蛋白armadillo)是一种多功能的蛋白质，在细胞连接处它与钙粘素相互作用，参与形成粘合带，而游离的β-catenin可进入细胞核，调节基因表达。β-catenin蛋白无法被磷酸化和泛素化降解，致使β-catenin在胞浆内大量聚集，从而进入细胞核并激活与细胞分裂和生长调控相关的基因(如c-myc和cyclind1等基因)，导致细胞增殖失控而致癌。因此，人们开始尝试把wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白作为药物靶点，筛选分子药物治疗癌症。细胞内信号通路相互协同机制的研究，能够为我们设计更加有效的抗癌药物提供更多的理论基础。

技术实现要素：

针对上述技术问题和基于肿瘤细胞的特殊代谢特点，本发明将高效的含硒苯并吩恶嗪类光敏剂进行双糖化修饰，使其在化学结构上符合肿瘤细胞的摄取、代谢特点，从而更好地集聚于肿瘤细胞当中，增加光动力治疗的效果和靶向性。本发明的目的在于提供一种更加适应于皮肤肿瘤治疗、靶向性更强的双糖基化苯并吩噁嗪类光敏剂及其制备方法。

本发明的技术方案是，提供一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂，其结构式为：

其中，et表示乙基。

本发明还提供上述双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)将半乳糖与含硒化合物在65℃-68℃的乙醇溶剂中反应，得到糖基化含硒化合物，其反应过程如下：

(2)以丙酮为溶剂，将与步骤(1)得到的糖基化含硒化合物在160℃-165℃的条件下进行反应，得到中间产物a，反应式为：

将1-萘胺与步骤(1)中得到的糖基化含硒化合物在乙醇溶剂中加热回流反应，得到中间产物b，反应式为：

(3)将步骤(2)所得中间产物a与中间产物b在85℃-90℃的条件下，以甲苯作为溶剂进行反应，反应式为：

优选地，步骤(1)中，半乳糖与含硒化合物的摩尔比为1-1.5:3-34；反应时间为5-8分钟。

优选地，步骤(2)制备中间产物a的反应中，反应时间为25-35分钟；与含硒化合物的摩尔比为：1：2.5-3.6。

优选地，步骤(2)制备中间产物b的反应中，乙醇溶剂的温度为65℃-70℃。

优选地，步骤(2)制备中间产物b的反应中，1-萘胺与糖基化含硒化合物的摩尔比为2-2.5:1-1.5。

优选地，步骤(3)中，反应时间为5-6分钟；中间产物a与中间产物b的摩尔比为1:1。

本发明还提供双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂在制备抗肿瘤药物上的应用。

本发明的光敏剂可以通过wnt/β-catenin信号通路抑制鳞癌细胞的增殖，从而有效地杀死、抑制鳞癌细胞。在人体皮肤肿瘤的过程中，本发明涉及的一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的使用剂量为5～35mg/kg，用于激发该光敏剂的激发光源波长范围是550～780nm，优选625nm，用于激发该光敏剂的激发光源的光强度是5～25j/cm^2，，优选8.5j/cm²。所用光源为：超音波照射发生器、光发射电子管、激光电子管、燃料激光、卤族金属灯、闪光灯、机械滤过的荧光光源、日光或机械滤过的日光、或白热线光源中的一种或多种，优选使用激光电子管。

本发明的有益效果是，本发明充分利用了肿瘤细胞的代谢特点，即：肿瘤细胞对糖类化合物的摄取增强和糖酵解反应增强，通过对含硒苯并吩恶嗪类化合物的糖基化，大大提高了光敏剂在肿瘤细胞中的富集浓度，从而提高利用本发明涉及的一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂在皮肤肿瘤治疗过程中的靶向性，也使光动力治疗的毒副作用大大降低。本发明能高效快速地抑制皮肤鳞癌细胞的增殖，且基本不损伤正常细胞。

附图说明

图1表示双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的结构式。

图2表示双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的氢谱图。

图3表示双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的碳谱图。

图4表示光敏剂外理后肿瘤组织病理切片图。

图5表示光敏剂处理后细胞增殖信号蛋白westernblot结果图。

图6表示光敏剂处理后细胞增殖相关蛋白westernblot结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的合成

(1)将半乳糖与含硒化合物在65℃-68℃的乙醇溶剂中反应5-8分钟，半乳糖与含硒化合物的用量比为1-1.5:3-34；其反应过程如下：

(2)将(1)所得糖基化含硒化合物与在160℃-165℃的条件下，以丙酮作为溶剂反应30分钟，所述的反应过程为：

(3)1-萘胺与(1)中得到的糖基化含硒化合物在85℃-87℃的乙醇溶剂中，反应15-20分钟，1-萘胺与糖基化含硒化合物的用量比为2-2.5:1-1.5，所述的反应过程为：

(4)将步骤(3)所得产物同步骤(2)所的产物，在160℃-170℃的条件下，以丙酮或者甲苯作为溶剂，反应5-6分钟，两反应物的用量比为1:1，所述的反应过程为：

上述双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂的氢谱和碳谱分别如图2和图3所示。可以确认本发明成功合成了上述目标产物。

实施例2：一种双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂抑制皮肤鳞癌细胞增殖

mtt法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，分别加入蒸馏水、100nm、200nm、400nm、600nm和800nm的本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16h后用mtt法检测细胞存活和生长的状态。

(2)实验结果

mtt实验结果显示，本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂能明显抑制a-431细胞的增殖，并且随着光敏剂剂量的加大对细胞增殖的抑制效果增加，在加入本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂800nm时增殖抑制效果能达到80％。同时病理检测结果显示，本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂可以特异性地在鳞癌细胞中富集，且较多地聚集在细胞核膜、内质网膜等重要细胞器膜结构上(图4)。

实施例3：双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂抑制a-431细胞增殖通过抑制wnt信号

wnt信号通路主要指的是由β-catenin介导的经典wnt信号通路。在没有wnt信号时，gsk3β能将磷酸基团加到β-cateninn端的丝氨酸/苏氨酸残基上，磷酸化的β-catenin经β-trcp泛素化共价修饰后，被蛋白酶体(proteasome)降解。而pp2a在wnt通路中脱去gsk3β的磷酸化，能明显促进wnt信号。因此通过测定gsk3β、β-catenin和pp2a的磷酸化状态能直接了解wnt信号是否活化。c-myc和cyclind1作为源癌基因，能促进鳞癌细胞分裂和翻译，最终促进细胞增殖。观察c-myc和cyclind1能清晰了解本发明涉及的光敏剂对a-431细胞增殖的抑制作用。

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每孔中分别加入本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂药剂，使终浓度分别为0nm，100nm，200nm，400nm，800nm，孵育1h后，用20j/cm2的红光照射15min，分别于0.5h后和16h后收集细胞提取总蛋白用westernblot法检测细胞中p-gsk3β,p-pp2a、p-β-catenin、c-myc、cyclind1和β-catenin。

(2)实验结果

梯度剂量的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂处理a-431细胞对其gsk3β,pp2a、β-catenin磷酸化westernblot结果分析发现，200到800nm的光敏剂剂量能明显抑制pp2a和gsk3β的磷酸化。而100nm和400到800nm的本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂能明显促进β-catenin的磷酸化(图5)。

梯度剂量的本发明涉及的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂处理a-431细胞对其β-catenin、cyclind1和c-myc表达量westernblot结果分析发现，β-catenin、cyclind1和c-myc的表达量在100到400nm的剂量处理后轻微增加，而在600和800nm剂量处理后显著下降。结果说明600和800nm的双糖基化苯并吩恶嗪类光敏剂能明显抑制a-431细胞的增殖(图6)。